CN102038720B - 一种桦褐孔菌降血糖有效部位及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桦褐孔菌降血糖有效部位及其制备方法和应用。该降血糖有效部位是按照下述方法制备得到的：以桦褐孔菌子实体为原料，分别用常温和高温水提取、过滤、浓缩，浓缩物加乙醇沉淀获得多糖，分别将常温和高温水提多糖过DEAE-52纤维素柱，分别用蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液分段洗脱，收集分段洗脱峰糖液。体内降血糖活性实验表明：常温粗多糖0.2mol/LNaCl段洗脱糖和高温粗多糖0.2mol/LNaCl段洗脱糖具有明显降血糖活性，这两种成分在相同条件下与降糖药盐酸二甲双胍具有相似的降血糖活性，并且未见明显的毒副作用。

Description

一种桦褐孔菌降血糖有效部位及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种桦褐孔菌降血糖有效部位及其制备方法与应用。

背景技术

桦褐孔菌学名为Fuscoporia obliqua或Inonotus obliquus，属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、褐卧孔菌属(纤孔菌属)，别名为白桦茸、桦孔茸、桦癌褐孔菌，生于白桦、榆树、赤杨等的树皮下或活立木的树皮下或砍伐后的枯干上。16-17世纪以来东欧、俄罗斯、波兰、芬兰等广泛利用其来防治各种疑难杂症，如各种癌症(胃癌、肝癌、肠癌等)、心脏病、糖尿病并能抑制艾滋病病毒，抗辐射抑制蛋白质生物合成抗有丝分裂及消除其活性等作用，被称作是上帝赐给苦难人类的一种神奇的礼物。

目前，国内对桦褐孔菌降血糖作用的研究较少，孙香花等人研究表明桦褐孔菌提取物对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠的胰岛、肝和肾组织损伤病变有一定的保护和修复作用。由于胰岛、肝肾与血糖及糖尿病并发症密切相关，因此一定程度上能够降低血糖。孙军恩等研究发现桦褐孔菌液体发酵液干粉对糖尿病小鼠有显著的降血糖和抗脂质过氧化作用，并且有突出的抗氧化作用。

从目前国内外开发桦褐孔菌的现状和行业来看，桦褐孔菌的活性普遍被认同，但都是以子实体煎服或水提为主的粗提物，未对其中活性物质进行富集和分离，并将活性组分开发成新型、高效的保健品或药品。桦褐孔菌含有数十种活性成分，因此，桦褐孔菌中降血糖有效部位的确定不仅为了解桦褐孔菌的降血糖机理提供理论基础，而且通过建立桦褐孔菌中降血糖活性物质的生产和分离技术，进一步发挥桦褐孔菌治疗糖尿病的作用，并可开发出新型的安全降糖药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种桦褐孔菌降血糖有效部位及其制备方法。

本发明所提供的桦褐孔菌降血糖有效部位包括高温多糖提取物中的有效组分和常温多糖提取物中的有效组分。制备方法包括下述步骤：

a)制备高温多糖提取物中的有效组分(桦褐孔菌降血糖活性成分)

1)将桦褐孔菌子实体粉碎后过20-60目筛，向粉碎过筛后的桦褐孔菌中加入20-40倍体积的水，静置提取24-72h，对提取液离心，收集残渣；

2)向步骤1)所述残渣中加入20-40倍体积的水，80-100℃提取3-5h，对提取液离心，收集上清液；将所述上清液浓缩，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％-85％，0-4℃静置过夜，离心、收集沉淀，得到高温提取桦褐孔菌粗多糖；

3)将所述高温提取桦褐孔菌粗多糖进行下述处理：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，用0-1.2mol/L NaCl溶液依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.15-0.3mol/L，3)0.45-0.6mol/L，4)0.8-1.2mol/L，洗脱速度100-140ml/h，每个梯度洗脱2-5倍柱体积，利用自动部分收集器收集各管，苯酚硫酸法检测多糖含量，合并同一洗脱梯度中有多糖的收集管，分别获得含量较高的多糖分离组分：高温粗多糖水段洗脱糖、高温粗多糖0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱糖、高温粗多糖0.8-1.2mol/L NaCl段洗脱糖；经试验验证，具有明显降糖作用的有效组分为高温粗多糖0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱糖。

b)制备常温多糖提取物中的有效组分(桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分)

1)将桦褐孔菌子实体粉碎后过20-60目筛，向粉碎过筛后的桦褐孔菌中加入20-40倍体积的水，静置提取24-72h，对提取液离心，收集上清液；将所述上清液1浓缩，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％-85％，0-4℃静置过夜，离心、收集沉淀，得到常温提取桦褐孔菌粗多糖；

2)将所述常温提取桦褐孔菌粗多糖进行下述处理：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，用0-1.2mol/L NaCl溶液依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.15-0.3mol/L，3)0.45-0.6mol/L，4)0.8-1.2mol/L，洗脱速度100-140ml/h，每个梯度洗脱2-5倍柱体积，利用自动部分收集器收集各管，苯酚硫酸法检测多糖含量，合并有多糖的组分，分别获得含量较高的多糖分离组分：常温粗多糖水段洗脱糖、0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱糖、常温粗多糖0.8-1.2mol/LNaCl段洗脱糖；经试验验证，具有降糖、降血脂作用的有效组分为常温粗多糖0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱糖。

对上述方法制备得到的分离多糖进行降血糖功效测试，小鼠利用STZ造模后随机分组，然后对链尿佐菌素(STZ)实验性糖尿病小鼠进行桦褐孔菌分离多糖灌胃4周，给药剂量分别为90mg/kg.d。4周后观察小鼠空腹血糖值、脏器指数、体重、血脂、胰岛素等指标的变化，动物实验结果表明，高温粗多糖0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱糖(E组)具有明显的降血糖效果，其血糖水平与造模起始时相比下降20％，显效率(与初始血糖相比血糖水平下降的小鼠数目/该组总的小鼠数目×100％)为76.92％；而阳性对照组血糖水平下降15％，显效率仅为58％。且常温多糖0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱多糖(B组)对高血糖小鼠高甘油三酯水平也有一定的改善，且对小鼠没有明显的降低体重的副作用。表明桦褐孔菌降血糖有效部位可作为降血糖药物与降血糖保健食品开发的原料。

本发明的再一个目的是提供上述桦褐孔菌多糖有效组分的应用。

本发明所提供的应用是褐孔菌多糖有效组分在制备降血糖产品(如药品或保健品)中的应用。

本发明利用桦褐孔菌这一药食兼用的野生资源，通过提取分离获得具有高活性降糖作用的多糖组分，可以降低临床用药毒性，减少西药带来的不良副作用，更具有市场竞争优势。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下述实施例中所用的桦褐孔菌子实体，购于通化市本土本特土特产销售有限公司。

实施例1、桦褐孔菌子实体活性多糖的提取分离

(1)将桦褐孔菌子实体粉碎后，过40目筛。

(2)常温提取粗多糖的制备：向粉碎过筛后的桦褐孔菌中加入30倍体积的水，静置提取48h，提取液离心(4000r/min)，留残渣，收集上清液，减压浓缩至原体积的1/10，加无水乙醇至乙醇终浓度为80％，4℃静置过夜，离心收集沉淀，50℃干燥称重，得到常温提取粗多糖。多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，计算得到多糖得率(多糖得率＝(粗多糖重量/材料重量)×100％)为5.3％。

(3)高温提取粗多糖的制备：将常温提取粗多糖剩余的残渣用水洗涤2遍后，加入原干粉重量30倍的水，90℃水浴提取3h，提取液离心(4000r/min)，留残渣，收集上清液，减压浓缩至适当体积，加无水乙醇至乙醇的终浓度为80％，4℃静置过夜，离心收集沉淀，50℃干燥称重，得到高温提取粗多糖，多糖得率为3.2％。

(4)桦褐孔菌粗多糖的柱层析分离：取两种水提法制备的粗多糖分别加适量蒸馏水溶解，过滤除去沉淀。将两种粗多糖过DEAE-52纤维素阴离子交换柱，分别用蒸馏水，0.2mol/L NaCl溶液，0.5mol/L NaCl溶液、1.0mol/L NaCl溶液分段洗脱，用自动部分收集器收集流出液，控制速度120ml/h，每个梯度洗脱4倍柱体积，苯酚硫酸法检测每管多糖浓度，洗脱至无糖流出。获得含量较高的多糖分离组分：常温粗多糖水段洗脱糖、0.2mol/LNaCl段洗脱糖、常温粗多糖1.0mol/L NaCl段洗脱糖、高温粗多糖水段洗脱糖、高温粗多糖0.2mol/L NaCl段洗脱糖、高温粗多糖1.0mol/L NaCl段洗脱糖。

对比例1、桦褐孔菌粗提物的制备

将桦褐孔菌子实体粉碎后，过40目筛。取桦褐孔菌子实体粉末加入30倍体积水中，90℃提取3h，取提取液置50℃烘箱中干燥，即得到桦褐孔菌粗提物。

实施例2、桦褐孔菌各多糖组分的降血糖药理活性评价

(1)试验材料：

桦褐孔菌粗提物及桦褐孔菌各多糖组分按实施例1方法制备。阳性对照药物：盐酸二甲双胍片，北京药业有限公司，规格：0.25g×50片/盒。链脲佐菌素(STZ)：美国sigma公司。葡萄糖氧化酶试剂盒：北京九强生物技术有限公司。甘油三酯试剂盒：北京北化康泰临床试剂盒有限公司。酶法总胆固醇测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司。胰岛素放射免疫分析药盒：中国原子能所。

试验动物：SPF级ICR小鼠，雄性，体重18-22g。由军科院实验动物中心提供。动物许可证编号为SCXK(军)2002-001。

(2)试验方法：

①高血糖小鼠模型的制备和分组：小鼠适应性喂养一周，连续四天腹腔注射STZ 35mg/kg 4次(临用前用0.1mol/L柠檬酸缓冲盐缓冲液溶解)，第6天禁食不禁水6h，断尾取血测血糖值，取血糖值12mmol/L以上的高血糖小鼠随机分组，每组12只。另设正常对照、模型对照组、阳性对照组。具体分组如表1所示。

表1桦褐孔菌不同分离组分名称及动物实验剂量

连续灌胃21天。于给药0、7、14和21天测定空腹血糖值及体重。血糖测定方法为从尾尖部取血，血样离心(3000r/min)，分离血清，按葡萄糖试剂盒说明书操作测定血糖含量。末次给药后，小鼠麻醉摘眼球取血后，脱颈椎处死，分离血清，测定血糖、甘油三酯和胆固醇值。实验结果经SPSS12.0软件进行统计学处理，选用t检验法，比较各给药组与模型组之间的差异。

(3)试验结果：

①桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠体重的影响

0、7、14和21天时各组体重均无显著差异，桦褐孔菌各分离提取物组分对小鼠体重的影响与对照组比较无显著性差异，表明桦褐孔菌提取物各级组分不会对小鼠的生理状况产生不良影响(表2)。

表2桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠体重的影响

②桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖的影响

桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖的影响见表3。结果显示各造模组与正常对照组间初始0天空腹血糖值差异显著，判定高血糖模型造模成功。模型对照组在实验期间血糖水平先上升最后又回到起始水平。盐酸二甲双胍组血糖水平先上升后下降，其余各样品组也呈现相应趋势。相对于模型对照组：盐酸二甲双胍组各个阶段血糖水平均有不同程度的降低，且均具有显著性差异(p＜0.05)；A组、B组在灌胃14天时有显著性差异(p＜0.05)；E组灌胃21天时具有显著性差异(p＜0.05)，且效果优于二甲双胍，具有临床用药短期和长期效果。其余各种药品相对于模型组都呈现了降糖趋势，但与模型对照组比较，差异不显著(p＞0.05)。

表3桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖的影响

注：*为与空白组比较P＜0.05；**为与模型组比较P＜0.05

③桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖水平显效率的影响

桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖水平显效率的影响结果如表4。针对各组中的小鼠个体，研究了各组不同时间段的显效率，具体公式为：

由表4可知，在灌胃7d时，阳性盐酸二甲双胍表现出明显的降血糖效果，充分体现了西药见效快的优点。在灌胃14d时，血糖水平持续升高，阳性盐酸二甲双胍已不足以控制血糖水平；在灌胃7d时，E组相对于模型对照组显效率上升，在灌胃14d时，样品组A，E组显效率较大，对血糖有很好的控制作用。在灌胃21d，B组、E组、F组显效率都大于阳性组，其中E组显效率高达76.92％，显著高于盐酸二甲双胍组的效果。

表4桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠空腹血糖水平显效率的影响

④桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠脂代谢的影响

高血糖常伴有高脂血症和脂代谢异常，因此在观察桦褐孔菌多糖对STZ诱导高血糖小鼠糖代谢影响的同时，通过检测血清甘油三酯和胆固醇水平进一步观察其对脂代谢的作用。由表5可看出，给药21天后，阳性对照盐酸二甲双胍对甘油三酯水平影响较小，而A组样品和E组样品对STZ诱导的高血糖小鼠血清甘油三酯水平影响比较明显，相较于模型组有显著性差异(P＜0.05)，这表明其在降低血糖的同时，对高血糖模型小鼠的脂代谢也有一定的调节作用。

表5桦褐孔菌提取物各样品对STZ诱导的高血糖小鼠脂代谢的影响

注：*为与空白组比较P＜0.05；**为与模型组比较P＜0.05

综上所述，桦褐孔菌多糖对STZ所致的高血糖具有不同程度的降糖作用，并且其降糖作用与阳性对照物相当甚至更强。以上的试验证明通过最佳工艺制备的高温粗多糖0.2mol/L NaCl段洗脱糖具有明显的降血糖活性，常温0.2mol/L NaCl段洗脱糖具有明显的降血脂活性，并且降糖效果比较明显，是桦褐孔菌降糖的有效部位之一。

Claims (10)

1.一种制备桦褐孔菌降血糖活性成分的方法，包括下述步骤：

1)将桦褐孔菌子实体粉碎后过20-60目筛，向粉碎过筛后的桦褐孔菌中加入20-40倍体积的水，静置提取24-72h，对提取液离心，收集残渣；

2)向步骤1)所述残渣中加入20-40倍体积的水，80-100℃提取3-5h，对提取液离心，收集上清液；将所述上清液浓缩，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％-85％，0-4℃静置过夜，离心、收集沉淀，得到高温提取桦褐孔菌粗多糖；

3)将所述高温提取桦褐孔菌粗多糖进行下述处理：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.15-0.3mol/L NaCl，洗脱速度100-140ml/h，每个梯度洗脱2-5倍柱体积，收集0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱组分，即得到所述桦褐孔菌降血糖活性成分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)为：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.2mol/L NaCl，洗脱速度120ml/h，每个梯度洗脱4倍柱体积，收集0.2mol/LNaCl段洗脱组分，即得到所述桦褐孔菌降血糖活性成分。

3.权利要求1或2所述方法制备得到的桦褐孔菌降血糖活性成分。

4.权利要求3所述的桦褐孔菌降血糖活性成分在制备降血糖和/或降血脂产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品为药品或保健品。

6.一种制备桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分的方法，包括下述步骤：

1)将桦褐孔菌子实体粉碎后过20-60目筛，向粉碎过筛后的桦褐孔菌中加入20-40倍体积的水，静置提取24-72h，对提取液离心，收集上清液；将所述上清液浓缩，然后加入无水乙醇至乙醇终浓度为70％-85％，0-4℃静置过夜，离心、收集沉淀，得到常温提取桦褐孔菌粗多糖；

2)将所述常温提取桦褐孔菌粗多糖进行下述处理：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.15-0.3mol/L NaCl，洗脱速度100-140ml/h，每个梯度洗脱2-5倍柱体积，收集0.15-0.3mol/L NaCl段洗脱组分，即得到桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中将所述常温提取桦褐孔菌粗多糖进行下述处理：加蒸馏水溶解，过滤除去沉淀，滤液过DEAE-52纤维素柱，依次按照下述梯度进行洗脱：1)水，2)0.2mol/L NaCl，洗脱速度120ml/h，每个梯度洗脱4倍柱体积，收集0.2mol/LNaCl段洗脱组分，即得到桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分。

8.权利要求6或7所述方法制备得到的桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分。

9.权利要求8所述的桦褐孔菌降血糖辅助降血脂的活性成分在制备降血糖辅助降血脂产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产品为药品或保健品。