CN113980152B - 一种桦褐孔菌均一多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种桦褐孔菌均一多糖及其制备方法和应用，本发明采用水提醇沉法、Sevag法、透析获得桦褐孔菌多糖，获得的桦褐孔菌多糖糖含量≥23.26％，糖醛酸含量≥4.92％，蛋白含量≥3.24％，并进一步利用大孔树脂吸附法对桦褐孔菌粗多糖进行纯化，优化吸附工艺后的色素吸附率为83.15％，桦褐孔菌多糖的保留率为78.89％，并获得桦褐孔菌均一多糖，其糖含量提升为≥56.52％，蛋白质含量≦1.37％，糖醛酸含量≦3.76％，该桦褐孔菌均一多糖可通过调节肠道细胞增殖蛋白ki67的表达，改善糖尿病小鼠的糖脂代谢水平，具有显著降低血糖、血脂的生物活性。

Description

一种桦褐孔菌均一多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于天然产物开发与应用领域，具体涉及一种桦褐孔菌均一多糖及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一类代谢疾病，由于胰岛素的分泌不足、胰岛素抵抗(IR,insulinresistance)或两者协同作用而引发的慢性高血糖。高热量饮食、超负荷工作、运动量不足等生活习惯，造成糖尿病发病率呈现逐年增加的趋势。2013年全球范围内共有3.82亿人患有糖尿病，2017年增长至4.25亿，估计到2035年患者人数将增长到5.92亿，中国患者数量位列全球第一，90％的患者为胰岛素抵抗或相对胰岛素缺乏导致的2型糖尿病患者。桦褐孔菌的食用历史可追溯到16世纪，俄罗斯人将桦褐孔菌制为茶饮，用以预防及治疗各种消化道疑难杂症。桦褐孔菌多糖是其中重要的活性成分，被发现可预防及治疗糖尿病，具有降低糖尿病大鼠血糖，改善机体糖、脂代谢的活性，但是作用位点尚不清楚；并且，目前发现具有降血糖活性的桦褐孔菌多糖均为未经纯化的粗多糖，均一性较差，影响其作为保健食品及药品的开发应用。而多糖作为生物大分子，其药理活性与其结构息息相关，而其结构又受其提取、分离、纯化等制备过程的影响。因此，桦褐孔菌的制备、纯化方法及相关技术参数的选择至关重要，其不仅决定了桦褐孔菌多糖的均一性，而且也决定了生物活性的高低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种旨在通过靶向调节ki67蛋白表达，改善糖尿病糖脂代谢水平，从未实现降低高血糖、高血脂症状的桦褐孔菌均一多糖及其制备方法及应用方向。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种桦褐孔菌均一多糖，所述桦褐孔菌均一多糖含量≥56.52％，糖醛酸含量≦3.76％，蛋白含量≦1.37％；所述桦褐孔菌均一多糖相对分子量3.73×10⁵Da。

进一步地，所述桦褐孔菌均一多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成的α型呋喃糖。

进一步地，所述甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖摩尔质量比为14.19:6.46:3.76:9.15:29.85:20.70:9.07:3.84:2.98。

本发明还提供一种桦褐孔菌均一多糖的制备方法，包括以下步骤：

将桦褐孔菌菌粉与水以料液比1:41混合得到混合液，在75-85℃水浴条件下浸提1.5-3h，过滤，浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，醇沉处理，离心，烘干，得到桦褐孔菌粗多糖；所述桦褐孔菌粗多糖糖含量≥23.26％，糖醛酸含量≥4.92％，蛋白含量≥3.24％；

将桦褐孔菌粗多糖加水溶解得到桦褐孔菌粗多糖水溶液，然后与sevag溶液混合，搅拌，静置分层，重复操作，直至得到除蛋白桦褐孔菌粗多糖，然后透析处理，冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖，再与大孔树脂混合，在25-35℃条件下吸附24h进行纯化处理，得到桦褐孔菌均一多糖。

进一步地，所述浓缩是指将过滤后的上清液浓缩至混合液原体积的1/5。

进一步地，所述醇沉处理中无水乙醇添加至混合液原体积的5倍。

进一步地，所述桦褐孔菌粗多糖水溶液与sevag溶液的体积比为1:1。

进一步地，所述离心转速为7500r/min，离心时间为10min。

进一步地，所述纯化处理具体步骤：采用乙醇去除大孔树脂色素，将桦褐孔菌多糖溶解于蒸馏水中得到桦褐孔菌多糖溶液，然后加入大孔树脂，恒温培养得到桦褐孔菌均一多糖溶液，在450nm处检测色素吸光度，苯酚硫酸法490nm检测糖含量。计算公式如下：

式中：A₀为溶液初始色素吸光度；A₁为溶液吸附色素后的吸光度；M₀为溶液初始多糖含量；M₁为吸附色素后溶液中的多糖含量。

本发明还提供桦褐孔菌均一多糖在制备靶向调节ki67蛋白表达的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用水提醇沉法、Sevag法、透析获得桦褐孔菌多糖，获得的桦褐孔菌多糖糖含量≥23.26％，糖醛酸含量≥4.92％，蛋白含量≥3.24％，并进一步利用大孔树脂吸附法对桦褐孔菌粗多糖进行纯化，优化吸附工艺后的色素吸附率为83.15％，桦褐孔菌多糖的保留率为78.89％，并获得了桦褐孔菌均一多糖，其糖含量提升为≧56.52％，蛋白质含量下降至≦1.37％，糖醛酸含量下降至≦3.76％，获得了显著的纯化效果。

本发明提取的桦褐孔菌均一多糖可调节肠道细胞增殖蛋白ki67的表达，并影响肠道紧密连接蛋白ZO-1蛋白表达，使小肠腺细胞排列整齐，恢复糖尿病鼠肠道绒毛长度，改善糖尿病鼠肠道屏障通透性，阻止肠道内病原菌及其代谢产物进入肠道上皮细胞，从而改善肠道机械屏障完整性的活性，显著降低IgA、IL-6、TNF-α炎症因子水平，改善糖尿病鼠机体低度炎症，从而实现调节糖尿病鼠糖脂代谢水平，降低血糖、血脂的生物活性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为径高比对桦褐孔菌多糖纯化效果的影响；

图2为吸附时间对桦褐孔菌多糖纯化效果的影响；

图3为上样量对桦褐孔菌多糖纯化效果的影响；

图4为洗脱流速对桦褐孔菌多糖纯化效果的影响；

图5为桦褐孔菌均一多糖高效凝胶渗透色谱洗脱曲线；

图6为桦褐孔菌均一多糖单糖组成分析；

图7为桦褐孔菌均一多糖红外光谱；

图8为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠空腹血糖影响；

图9为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠口服糖耐量影响；

图10为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠线下血糖面积AUC影响；

图11为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清糖化血红蛋白影响；

图12为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清甘油三酯影响；

图13为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清总胆固醇影响；

图14为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠高密度脂蛋白影响；

图15为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠低密度脂蛋白影响；

图16为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠游离脂肪酸影响；

图17为桦褐孔菌均一多糖对小鼠肠道ki67 mRNA表达水平；

图18为桦褐孔菌均一多糖对小鼠肠道ZO-1mRNA表达水平；

图19为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清细胞因子IgA影响；

图20为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清细胞因子TNF-α影响；

图21为桦褐孔菌均一多糖对糖尿病小鼠血清细胞因子IL-6影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

精确称取干燥桦褐孔菌菌粉置于烧杯中，按照料液比为1：41的比例加入水后放入水浴锅中，在80℃下提取2h，过滤得上清液进行浓缩，浓缩至原体积的1/5。加入无水乙醇同时搅拌溶液，至原体积的5倍停止，进行醇沉，4℃封口过夜，在7500r/min下离心10min，取沉淀物进行烘干，得到桦褐孔菌粗多糖。

将所得桦褐孔菌粗多糖溶于水得到桦褐孔菌粗多糖水溶液，然后与sevag溶液以体积比1:1混合，去除蛋白，磁力搅拌器搅拌2h，静置分层，取上层桦褐孔菌粗多糖溶液再次与sevag溶液以体积比1:1混合，重复上次操作，烘干，得到除蛋白桦褐孔菌多糖。

除蛋白多糖加水溶解后置于透析袋中蒸馏水透析48h去除小分子物质，得到桦褐孔菌多糖溶液，冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖。

纯化：

取大孔树脂HPD500浸泡于95％乙醇中24h，然后用95％乙醇清洗大孔树脂直至乙醇清澈透明，再用蒸馏水洗直到完全无异味，蒸馏水浸泡备用；

称取500mg桦褐孔菌多糖，溶解于500mL蒸馏水中配成1mg/mL桦褐孔菌多糖溶液，称取3.0g处理后的大孔树脂HPD500于锥形瓶中，加入1mg/mL桦褐孔菌多糖溶液10mL，设置3组平行对照。将三角瓶置于恒温振荡培养箱中，30℃吸附24h后，取桦褐孔菌多糖溶液，450nm检测色素吸光度，苯酚硫酸法490nm检测糖含量。计算公式如下：

式中：A₀为溶液初始色素吸光度；A₁为溶液吸附色素后的吸光度；M₀为溶液初始多糖含量；M₁为吸附色素后溶液中的多糖含量。计算得出，本实施例制备的桦褐孔菌多糖中糖含量为23.26％，糖醛酸含量为4.92％，蛋白含量为3.24％。

一、1、将实施例1中的大孔树脂HPD500分别替换成16种不同型号的大孔树脂NKA-9、LSA-700B、LX-8、XDA-7、LX-19、DM130、LSA-10、AB-8、LX-10G、D101、LX-68、LX-T28、LX-60、LX-300C、LX-68G、LX-T5，其他方式操作相同，结果如表1。

表1 17种大孔树脂筛选实验结果

根据色素吸收率和多糖保留率，从17种不同型号的大孔树脂中筛选出的最佳大孔树脂为HPD500。

2、大孔树脂动态吸附条件优化

1)径高比优化

层析柱分别按径高比1:8、1:10、1:12装柱，平衡。10mg/mL桦褐孔菌多糖溶液上样于3个层析柱，每个层析柱加入1mL多糖溶液，吸附1h，蒸馏水为1.5mL/min洗脱，收集洗脱液，定容，测定色素与桦褐孔菌多糖含量。结果如图1所示，可以看出，径高比为1:10时综合评分最高，为最优条件。

2)吸附时间优化

层析柱按径高比1:8装柱，平衡。10mg/mL桦褐孔菌多糖上样于3个层析柱，每个层析柱加入1mL多糖溶液，样品于层析柱中分别吸附1、2、4h，蒸馏水1.5mL/min洗脱，收集洗脱液，定容，测定色素与桦褐孔菌多糖含量。结果如图2，可以看出，在吸附时间为1h时最高，随后逐渐降低，故选择吸附时间1h为最佳吸附时间。

3)上样浓度优化

按径高比1:8装柱，平衡。分别配制10、20、40mg/mL桦褐孔菌多糖溶液，分别上样于3个层析柱中，样品于层析柱中吸附1h，蒸馏水1.5mL/min洗脱，收集洗脱液，定容，测定色素与桦褐孔菌多糖含量。结果如附图3，在上样量为10mg时综合评分最高，随后逐渐降低。所以选择10mg为最佳上样量。

4)洗脱流速优化

层析柱按径高比1:8装柱，平衡。10mg/mL桦褐孔菌多糖溶液上样于3个层析柱，每个层析柱加入1mL多糖溶液，样品于层析柱中吸附1h，分别以流速为1.0、1.5、2.0mL/min进行洗脱，收集洗脱液，定容，测定色素与桦褐孔菌多糖含量。结果如附图4，确定1.5mL/min为最佳洗脱流速。

优化吸附工艺后的色素吸附率为83.15％，桦褐孔菌多糖的保留率为78.89％，获得的褐孔菌纯化多糖糖含量提升为56.52％。

二、优化吸附工艺后的桦褐孔菌均一多糖分子量测定

采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC-ELSD)法对桦褐孔菌多糖进行分子量测定。

标准曲线绘制：取已知分子量(Mw)为10、40、70、100、200、500kDa的葡萄糖标准品，加入超纯水制成10mg/mL溶液，过0.22μm水相滤膜。分别进样20μL。以出峰时间t为x轴，分子量对数lgMw为y轴，绘制标准曲线。

样品溶液的测定：桦褐孔菌多糖用超纯水配成浓度为10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，去除小分子杂质，进样10μL，保存色谱。

色谱条件：Agilent1260InfinityELSD蒸发光散射检测器，TSK-gelG-3000PWXL色谱柱(7.8×300mm)，进样量10μL，以蒸馏水作为流动相，流速0.6mL/min，柱温35℃。如图12所示，得到分子量标准曲线方程y＝-0.2282x+7.8312，R²＝0.9922。根据保留时间和标准曲线，计算桦褐孔菌多糖分子量为3.73×10⁵Da(如图5所示)。

三、优化吸附工艺后的桦褐孔菌均一多糖单糖组成分析

采用离子交换色谱法对桦褐孔菌均一多糖进行单糖组成分析。在9mL无菌水中依次加入甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖各100mg，加水定容至10mL，配制为标准品母液。称取桦褐孔菌均一多糖样品5mg，加入配制好三氟乙酸(TFA)溶液，121℃加热2h，氮气吹干。加入甲醇，并使用氮气吹干，如此重复三次，加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。色谱条件：色谱柱：Dionex^TMCarboPac^TMPA20。流动相：A相：ddH₂O；B相：200mM NaOH；C相：200mM NaOH/500mM NaAC。流速：0.5mL/min。结果如图6。可以得出，桦褐孔菌均一多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖按摩尔质量比14.19:6.46:3.76:9.15:29.85:20.70:9.07:3.84:2.98组成。

四、优化吸附工艺后的桦褐孔菌均一多糖红外光谱分析

称取1.5mg榆黄蘑多糖与200mg色谱纯KBr充分混合，用玛瑙研钵进行研磨后压片，另取200mgKBr单独压片作为背景。用红外光谱仪在4000-500cm^-1范围内进行红外光谱扫描分析，结果如图7所示，经分析可以得出，本发明制备的桦褐孔菌多糖为α型呋喃糖。

试验例桦褐孔菌均一多糖对2型糖尿病小鼠糖脂代谢的影响

1、2型糖尿病小鼠模型的建立

80只昆明鼠适应性喂养1周，随机分成2组，空白组(10只，NC组)与模型组(70只)。随后对除模型组进行高脂饲料D12492饲养4w，并对空白组进行D12450B饲养4w，饲养期间观察小鼠精神状态，毛发光泽度，运动状态。

配制柠檬酸缓冲溶液：2.1g柠檬酸+100mL水→A液，2.94g柠檬酸钠+100mL水→B液，A:B＝1:1，pH为4.2-4.4，用柠檬酸缓冲溶液配制1％STZ。小鼠禁食不禁水12h后腹腔注射STZ 120mg/kg，立即灌胃50％葡萄糖溶液1mL以防小鼠出现低血糖死亡，空白组小鼠注射相同剂量柠檬酸缓冲溶液，并同样灌胃1mL蒸馏水。3d后测小鼠空腹血糖≥11.1mol/L为糖尿病模型建立成功，将2型糖尿病鼠随机分为5组，分别为模型组(MC组)、阳性对照组(PC组)、桦褐孔菌均一多糖低剂量组(L-IN组)、桦褐孔菌均一多糖中剂量组(M-IN组)、桦褐孔菌均一多糖高剂量组(H-IN组)进行5w给药治疗(n＝8)。阳性对照组灌胃150mg/kg二甲双胍，分别给低剂量组灌胃150mg/kg、中剂量组灌胃300mg/kg、高剂量组灌胃600mg/kg桦褐孔菌均一多糖，空白组及模型组灌胃相同剂量水，给药期间记录小鼠体重、饮水量及每周检测空腹血糖。五周后，小鼠禁食不禁水12h，取眼球血后脱颈处死，血液在4℃、2000r/min离心10min，取血清，于-80℃保存，取小鼠小肠组织置于4％多聚甲醛中固定，另一部分组织与粪便-80℃冷冻保存。

(注：与正常组相比，*p<0.05为显著，**p<0.01为极显著；与模型组相比，#p<0.05为显著，##p<0.01为极显著。)

图8-11为桦褐孔菌均一多糖对2型糖尿病小鼠空腹血糖、口服糖耐量及线下血糖面积与糖化血红蛋白变化的影响结果。

可以看出，桦褐孔菌均一多糖可显著改善糖尿病小鼠口服糖耐量与糖化血红蛋白，呈剂量依赖性，高剂量组较阳性对照组效果更加显著。桦褐孔菌均一多糖可通过调节糖代谢，起到降血糖的功效。

图12-16为桦褐孔菌均一多糖对2型糖尿病小鼠血脂生化指标的影响结果。

可以看出，桦褐孔菌均一多糖可显著降低糖尿病鼠血清TG、TC、LDL水平，升高HDL水平，呈剂量依赖性。表明桦褐孔菌均一多糖可通过改善糖尿病小鼠脂代谢，达到降血糖功效。

图17-18为桦褐孔菌均一多糖对2型糖尿病小鼠肠道机械屏障影响结果。

可以看出，通过qRT-PCR实验发现桦褐孔菌均一多糖可调节肠道细胞增殖蛋白Ki67的表达，并影响肠道紧密连接蛋白ZO-1蛋白表达，使小肠腺细胞排列整齐，恢复糖尿病鼠肠道绒毛长度，改善糖尿病鼠肠道机械屏障完整性。

图19-21为桦褐孔菌均一多糖对2型糖尿病小鼠肠道免疫屏障影响结果。

可以看出，通过Elisa法检测血清生化指标，桦褐孔菌均一多糖能够显著降低IgA、IL-6、TNF-α水平，改善糖尿病鼠机体低度炎症，调节肠道免疫屏障。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种桦褐孔菌均一多糖在制备靶向调节ki67蛋白表达的药物中的应用；

所述桦褐孔菌均一多糖含量≥56.52％，蛋白质含量≦1.37％，糖醛酸含量≦3.76％；所述桦褐孔菌均一多糖相对分子量3.73×10⁵Da；

所述桦褐孔菌均一多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成的α型呋喃糖，摩尔质量比为14.19:6.46:3.76:9.15:29.85:20.70:9.07:3.84:2.98；

所述桦褐孔菌均一多糖的制备方法，包括以下步骤：

将桦褐孔菌菌粉与水以料液比1:41混合得到混合液，在80℃水浴条件下浸提1.5-3h，过滤，浓缩，在浓缩液中加入无水乙醇，搅拌，醇沉处理，离心，烘干，得到桦褐孔菌粗多糖；

将桦褐孔菌粗多糖加水溶解得到桦褐孔菌粗多糖水溶液，然后与sevag溶液混合，搅拌，静置分层，重复操作，直至得到除蛋白桦褐孔菌粗多糖，然后透析处理，冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖，再与大孔树脂混合，在25-35℃条件下吸附24h进行纯化处理，得到桦褐孔菌均一多糖；

所述浓缩是指将过滤后的上清液浓缩至混合液原体积的1/5；

所述醇沉处理中无水乙醇添加至混合液原体积的5倍；

所述桦褐孔菌粗多糖水溶液与sevag溶液的体积比为1:1；

所述离心转速为7500r/min，离心时间为10min；

所述纯化处理具体步骤：采用乙醇去除大孔树脂色素，将桦褐孔菌多糖溶解于蒸馏水中得到桦褐孔菌多糖溶液，然后加入大孔树脂，恒温培养得到桦褐孔菌均一多糖溶液，在450nm处检测色素吸光度，苯酚硫酸法490nm检测糖含量，计算公式如下：

式中：A₀为溶液初始色素吸光度；A₁为溶液吸附色素后的吸光度；M₀为溶液初始多糖含量；M₁为吸附色素后溶液中的多糖含量。

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