CN114621363A - 一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及功能食品制备技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖；是从肉苁蓉肉质茎中提取粗肉苁蓉多糖，再对粗肉苁蓉多糖进行纯化筛选所制备的；本发明通过提取具有抗疲劳功能的肉苁蓉多糖，使通过该肉苁蓉多糖制成的可食用的制品具有明显的抗疲劳功效。
Description
技术领域
本发明属于功能食品制备技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖。
背景技术
运动过后，一方面由于机体的氧消耗增大，机体得不到充分的能量而使肌肉乏力，另一方面，由于缺氧，机体产生大量的乳酸，使体内酸的积累，这样在细胞膜的氢钾交换泵的作用下细胞中的钾离子大量的外流。由于钾离子是细胞代谢不可或缺的，此时肌细胞的功能将会有影响，肌纤维可表现为收缩力下降。如果这时继续剧烈运动，对于可能产生的变化而言，就是上述的影响因素的继续积累，肌细胞缺氧增重，酸积累，钾离子外流增加，肌收缩无力，严重的造成肌细胞代谢障碍损伤。因此人们一直寻求抗疲劳的食品，以提高身体素质。
我国的抗疲劳功能食品尚处于起步阶段，以各种复方口服液、提取液、强化制剂为主，基本属于保健食品的范畴。日常饮食中所含的抗疲劳物质种类较少，且摄入量较低。但是能够获得普通消费者普遍欢迎的大众化抗疲劳食品，目前市场上还不多。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖，从肉苁蓉中提取具有抗疲劳功能的肉苁蓉多糖，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖，是从肉苁蓉肉质茎中提取粗肉苁蓉多糖，再对粗肉苁蓉多糖进行纯化筛选所制备的。
进一步的，所述的粗肉苁蓉多糖，是将肉苁蓉肉质茎鲜样切片后，经蒸馏水煮沸提取后，再过滤合并滤液，用75％乙醇静置过夜，离心所制备的。
进一步的，所述煮沸，是按1:4的料液比加入蒸馏，再进行煮沸。
更进一步的，所述的煮沸，煮沸时间为4h。
进一步的，所述的离心，是用离心机5000r/min进行离心25min。
进一步的，所述的提纯，是将离心上清液过膜分离获得的截留液。
更进一步的，所述的膜为40kDa膜。
更进一步的，所述的粗肉苁蓉多糖进行纯化筛选后，将纯化后的肉苁蓉多糖溶于蒸馏水，用DEAE-52层析柱进行柱层析，使用0.5mol氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液再泵入Sephadex G-200层析柱，用水洗脱，洗脱液进行冷冻干燥获得具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖。
所述的洗脱液再泵入Sephadex G-200层析柱前，先进行了透析处理；
所述的透析处理，其中析袋的分子量为1200Da。
本发明从肉苁蓉多糖中筛选发现了具有潜在良好抗疲劳作用的肉苁蓉多糖组分，使得通过该肉苁蓉多糖制成的可食用的制品具有明显的抗疲劳功效。
附图说明
图1：为本发明实施例2中小鼠负重游泳时间的统计图；
图2：为本发明实施例2中肉苁蓉多糖对小鼠血乳酸的统计图；
图3：为本发明实施例2中肉苁蓉多糖对小鼠血清尿素氮的统计图。
具体实施方式
本发明通过提取具有抗疲劳功能的肉苁蓉多糖，使通过该肉苁蓉多糖制成的可食用的制品具有明显的抗疲劳功效。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述
实施例1：肉苁蓉多糖的提取
(1)取肉苁蓉肉质茎鲜样,将肉苁蓉肉质茎鲜样切片后按1:4(v/v)料液比加入蒸馏水煮沸4h,进行四次煮沸提取；
(2)煮沸后过滤,收集四次过滤液,合并后向其内加入75％乙醇静置过夜12h；
(3)将步骤(2)中的醇沉液用离心机5000r/min进行离心25min,收集沉淀,再将沉淀物挥发乙醇后用冷冻干燥机进行干燥,得肉苁蓉多糖DT。
实施例2：肉苁蓉多糖组分的抗疲劳活性
1)实验设计：每个试验进行前先将40只小鼠随机分为4组,每组10只，每天灌胃1次以蒸馏水为对照组，分别以40，80，120mg/kg(肉苁蓉多糖)的剂量为实验组，连续灌胃30d，按要求分别测定每个试验中相应指标。
2)负重游泳试验：末次灌胃30min后，在小鼠尾根部负荷5％体重的铅丝，置30℃游泳箱，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间为其游泳时间。
3)血清乳酸测定试验：末次灌胃30min后，小鼠尾根部负荷2％体重的铅丝，置30℃的游泳箱中游泳60min，游泳后即刻取小鼠内眦静脉血20μL，用酶法在550nm处测定血清乳酸含量。
4)血清尿素氮测定试验：末次灌胃30min后,将小鼠置于水温为30℃的游泳箱中不负重游泳90min，即刻取小鼠内眦静脉血，离心，取血清，采用二乙酰-肟法测定尿素氮含量。
5)实验结果分析：
表1小鼠负重游泳时间记录表
| 剂量(mg/kg) | 游泳时间(min) |
| 0 | 2312±436 |
| 40 | 2932±419 |
| 80 | 3216±465 |
| 120 | 3575±437 |
表2肉苁蓉多糖对小鼠血乳酸、血清尿素氮的影响记录表
| 剂量(mg/kg) | 血乳酸(mmol/L) | 血清尿素氮(mmol/L) |
| 0 | 6192±1023 | 11025±1192 |
| 40 | 4482±1106 | 10291±1119 |
| 80 | 3288±1221 | 9386±1098 |
| 120 | 2106±1176 | 8208±1145 |
由表1-2和图1-3可知，不同剂量的肉苁蓉多糖的实验组均能延长小鼠的负重游泳时间(p＜0.05)，均能够使得血乳酸和血清尿素氮含量减少(p＜0.05)，同时，随着肉苁蓉多糖剂量的增加，小鼠负重游泳时间会更长，血乳酸和血清尿素氮含量减少更明显，实施例1中制备的肉苁蓉多糖具有抗疲劳的效果。
实施例3：肉苁蓉多糖组分的筛选
1)纯化肉苁蓉多糖DL
收集实施例1中含有多糖DT的上清液，然后用分子量为40、20、10、2kDa的膜分离设备截留分离，膜分离过程如下:将上述离心后得到的肉苁蓉多糖上清液通过蠕动泵泵入截留分子量为40kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液DL001；收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为20kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液DL002；收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为10kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液DL003，收集透过液通过蠕动泵泵入截留分子量为2kDa的膜组件，流速为150mL·min-1，膜面积100×100mm。经分离后分为截流液和透过液两部分，最终截留体积35mL时分离完毕，得到截留液DL004，弃去透过液。将DL001、DL002、DL003、DL004放入真空冷冻干燥机中，冷肼温度-60℃，样品温度-55℃，真空度10Pa，冷冻干燥36h，密封保存。
上述4个组分采用苯酚-硫酸法测定总糖的含量，采用DC蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量，用咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量，结果如表3所示。
表3：四个多糖部位总糖、蛋白和糖醛酸含量表
2)肉苁蓉多糖不同部位和组分抗疲劳活性评价
(Ⅰ)一氧化氮合酶活性评价
测定了4种肉苁蓉多糖部位DL001、DL002、DL003和DL004的一氧化氮合酶。取DL001、DL002、DL003和DL004溶液(0.5，1.0，5.0，10.0和20.0mg/mL)各45μL，加入15μL一氧化氮合酶(0.02mg/mL)后在37℃水浴下保温10min，然后加入60μL血乳酸溶液(0.08％)，于37℃水浴反应15min后得到反应液。同时用15μL的PBS缓冲液替代一氧化氮合酶解液作为空白。最后在酶标仪550nm下测吸光度。DL001-T1、DL001-T2和DL001-T3采用相同的方法进行测定。抑制率计算公式如下所示。
其中，Ab表示阴性空白吸光度，Ac表示阴性对照吸光度，Asb表示样品空白吸光度，Asc表示样品对照吸光度。
4个肉苁蓉多糖部位抑制一氧化氮合酶活活性评价结果，DL001对一氧化氮合酶的抑制活性最高，在浓度为1-50mg/mL时，DL001的抑制率高达66.45±0.21％，DL002的抑制率最低，为24.25±0.31％。实验结果表明DL001组分是最有潜力的降血糖成分；并进行进一步分离纯化。
(Ⅱ)DL001的进一步分离纯化
将5克DL001溶于100mL蒸馏水中，用氯仿:正丁醇4:1脱除蛋白，重复6次直至溶液中间没有絮状物质，以表示蛋白除去完全。然后加入氨水，将溶液调至pH＝8，在热水浴下边搅拌边加入20mL 30％的过氧化氢对其进行脱色，脱色结束后，再用分子量1200Da的透析袋透析3天，截留液冷冻干燥得纯化后的DL001多糖。
将纯化后的肉苁蓉多糖DL001溶于蒸馏水，用蠕动泵泵入事先处理好的DEAE-52层析柱，分别用蒸馏水，0.2和0.5mol氯化钠溶液分步洗脱，流速为1mL/min，每管收集8mL。将水洗脱的组分、0.2mol、0.5mol氯化钠洗脱得到的组分合并收集，用1200Da透析袋透析2天，冷冻干燥，依次得到肉苁蓉多糖DL001-T1，DL001-T2和DL001-T3组分。将上述各组分用10mL蒸馏水溶解，分别用蠕动泵泵入Sephadex G-200层析柱，用水洗脱。流速为1mL/min，每管收集8mL。收集得到的相应组分合并，用旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥得到的3个组分，也相应的命名为肉苁蓉多糖DL001-T1，DL001-T2和DL001-T3。
一氧化氮合酶评价结果显示，DL001-T1，DL001-T2和DL001-T3均表现出抑制活性。其对一氧化氮合酶的抑制率随样品浓度的增加而逐渐上升，在0.5-20mg/mL浓度下对一氧化氮合酶具有剂量依赖性作用。其中DL001-T3对一氧化氮合酶的抑制作用强于DL001-T1和DL001-T2。当浓度在0.5-20.0mg/mL时，DL001-T3的抑制率分别为15.43％、18.65％、72.34％、85.67％和97.23％，该实验数据说明DL001-T3具有较强的抗疲劳活性潜力。
3)纯化肉苁蓉多糖的抗疲劳研究
将小鼠随机分为空白组、第一实验组和第二实验组；每组各10只，每天灌胃1次蒸馏水为空白组，两周结束时游泳，造成运动疲劳。第一实验组和第二实验组每天按照给体积0.2mL/10g灌胃相应多糖溶液。其中第一实验组灌胃DL001，第二实验组灌胃DL001-T3，连续灌胃给药两周。两周结束后，和空白组同时游泳，造成运动疲劳，末次灌胃30min后，将小鼠置于恒温游泳箱中，水深大于30cm，水温25.0℃±1℃，游泳60min，捞出擦干采血，离心取血清测定血糖、乳酸(LD)及肝糖原水平。
表4对小鼠生化指标的影响表(n＝10,
)
由表4可见，第一实验组和第二实验组的血糖水平、血清乳酸水平以及肝糖原水平均显著降低，与空白组比较差异具有统计学意义。第二实验组DL001-T3的效果明显好于第一实验组DL001。
本发明通过游泳来获得小鼠疲劳模型，为筛选作用更加确切的缓解体力疲劳制品提供了研究基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖，其特征在于，是从肉苁蓉肉质茎鲜样中提取粗肉苁蓉多糖，再对粗肉苁蓉多糖进行纯化筛选所制备的。
2.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的粗肉苁蓉多糖，是将肉苁蓉肉质茎鲜样切片后，经蒸馏水煮沸提取后，再过滤合并滤液，用75％乙醇静置过夜后离心所制备的。
3.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的煮沸，是按1:4的料液比加入蒸馏，再进行煮沸。
4.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的煮沸，煮沸时间为4h。
5.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的离心，是用离心机5000r/min进行离心25min。
6.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的提纯，是将离心上清液经过膜分离获得截留液。
7.根据权利要求1所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的膜为40kDa膜。
8.根据权利要求7所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的粗肉苁蓉多糖进行纯化筛选后，将纯化后的肉苁蓉多糖溶于蒸馏水，用DEAE-52层析柱进行层析，使用0.5mol氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液再泵入Sephadex G-200层析柱，用水洗脱，洗脱液进行冷冻干燥获得具有抗疲劳效果的肉苁蓉多糖。
9.如权利要求8所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的洗脱液再泵入Sephadex G-200层析柱前，先进行了透析处理。
10.如权利要求8所述的肉苁蓉多糖，其特征在于，所述的透析处理，其中透析袋的分子量为1200Da。
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