CN109456416B - 一种银耳多糖的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种银耳多糖的提取方法，属于银耳深加工技术领域。该方法是将银耳干燥至含水量为4‑8％，将银耳放入粉碎机中进行冷冻粉碎，再在微酸性条件下进行超声提取，提取液脱除蛋白后醇沉得到银耳多糖。本发明方法使银耳多糖的提取率提高至35％以上，并且具有较强的清除自由基和还原能力。

Description

一种银耳多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及一种银耳多糖的提取方法，属于银耳深加工技术领域。
背景技术
银耳，又叫白木耳，雪耳，菊花耳，是一种真菌，多在阴暗处生长。据统计，现有的银耳种类有六十多种，是世界上共同认可的十分珍贵的食用菌类以及中医药药材，在我国的主要产地为福建古田和四川通江。
银耳中所含有多种成分，十分复杂，大量实验及研究证明，无机盐、脂肪、粗纤维、蛋白质、碳水化合物、水分及少量的维生素存在于银耳中。近几年的研究己经充分证明，银耳多糖是银耳的主要生物活性成分。
作为功能性因子，人们对银耳多糖的研究越来越多，其特有的营养功能和生物活性功能被人们越发的青睐。实验表明，银耳多糖不仅可以提高免疫力，还对氢氧根自由基有一定的清除作用，还可以通过提高抗氧化酶的活性显著提高急性衰老模型中小鼠的抗氧化、抗衰老能力。研究表明，银耳多糖能有效地激活淋巴细胞，提高淋巴细胞转化率，增强其对肿瘤细胞的杀伤力。尤其针对白细胞减少的症状，银耳多糖对小鼠外周白细胞减少症状有明显的提升白细胞作用。
由于银耳细胞壁的特殊性，导致细胞内营养成分释放困难，此外大部分银耳多糖在银耳子实体中并不是独立存在的，而是和蛋白结合，以糖蛋白的形式存在，目前的提取方法中不能有效将多糖和蛋白分离，在除去蛋白时多糖也随之除去，造成多糖的大量流失，从而难以实现银耳多糖的高效提取。
发明内容
针对现有银耳多糖提取方法的提取率低的问题，本发明提供了一种银耳多糖的提取方法。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种银耳多糖的提取方法，按照如下步骤进行：
(1)将银耳干燥至含水量为4-8wt％，获得预处理银耳；
(2)将步骤(1)的预处理银耳进行冷冻粉碎，获得银耳粉；
(3)将步骤(2)获得的银耳粉加水，并调pH为6.3～6.8，然后进行超声提取；
(4)提取液经固液分离后取上清液，脱除蛋白后得到银耳多糖。
相对于现有技术，本发明通过将银耳干燥至一定的含水量，在超低温下能够达到合适的硬度和脆性，提高粉碎效率，并且能够使银耳组织和细胞内的多糖最大程度地释放出来，经过特定冷冻粉碎后的银耳粉在微酸性条件下进行超声提取，不仅能够将多糖从组织和细胞内提取出来，并且能够有效使其与蛋白分离，从而避免除蛋白时多糖的大量流失，提高银耳多糖的提取率。
优选地，步骤(2)中所述冷冻粉碎采用液氮冷冻粉碎，具体条件为：液氮充入量为每100g物料通入液氮6～25ml，10000rpm-25000rpm下粉碎1min-3min。优选的液氮充入量和粉碎条件能进一步提高银耳多糖得率。
优选地，步骤(3)中按照料液比为1:(20-60)向银耳粉中加入水，超声提取的条件为：在45℃-75℃、300W-1500W下进行超声提取，提取时间为4-14min。更优选地，超声提取的次数为2次，第一次超声提取结束后固液分离，固体按照相同的方法再提取一次。优选的超声提取条件，能保证将破碎细胞中的银耳多糖充分溶解到水中，并为多糖与蛋白之间糖肽键的断裂提供足够的能量，进一步提高银耳多糖的得率。
优选地，步骤(4)所述固液分离是在4500～5000r/min下离心5～10min。
优选地，步骤(4)中，采用Sevage法脱除蛋白，脱蛋白后的提取液经醇沉得到银耳多糖。
与现有技术相比，本发明采用液氮冷冻粉碎结合微酸性超声提取的方法，使银耳多糖的提取率提高至35％以上，还能够使提取得到的银耳多糖对ABTS自由基、羟基自由基具有较强的清除作用，对ABTS自由基清除率可达到85％，对羟基自由基清除率达到95％，同时得到的银耳多糖具有较强的还原能力。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例提供了一种银耳多糖的提取方法，该方法按照如下步骤进行：
(1)将银耳干燥至含水量为4％，获得预处理银耳；
(2)将步骤(1)的预处理银耳放入粉碎机中进行冷冻粉碎，冷冻粉碎是先向粉碎机中充入液氮，然后再进行粉碎，获得银耳粉；其中液氮充入量为每100g物料20ml，粉碎的条件为10000rpm/min、3min；
(3)将步骤(2)获得的银耳粉按照料液比为1:60加入水，用盐酸调pH为6.5，在75℃、300W下进行超声提取，提取时间为10min；
(4)提取结束后，将提取液于4500r/min离心6min，对离心后的沉淀重复上述步骤(3)的超声提取，将两次提取的上清液混合，用Sevage试剂(体积比三氯甲醇：正丁醇＝5:1)脱除蛋白，再用95％的乙醇沉淀多糖，干燥后即得银耳多糖。
实施例2
本实施例提供了一种银耳多糖的提取方法，该方法按照如下步骤进行：
(1)将银耳干燥至含水量为4％，获得预处理银耳；
(2)将步骤(1)的预处理银耳放入粉碎机中进行冷冻粉碎，冷冻粉碎是先向粉碎机中充入液氮，然后再进行粉碎，获得银耳粉；其中液氮充入量为每100g物料6ml，粉碎的条件为25000rpm/min、3min；
(3)将步骤(2)获得的银耳粉按照料液比为1:20加入水，用盐酸调pH为6.8，在45℃、300W下进行超声提取，提取时间为14min，提取结束后，于4500r/min离心6min；
(4)提取结束后，将提取液于4500r/min离心6min，对离心后的沉淀重复上述步骤(3)的超声提取，将两次提取的上清液混合，用Sevage试剂(体积比三氯甲醇：正丁醇＝5:1)脱除蛋白，再用95％的乙醇沉淀多糖，干燥后即得银耳多糖。
实施例3
本实施例提供了一种银耳多糖的提取方法，该方法按照如下步骤进行：
(1)将银耳干燥至含水量为10％，获得预处理银耳；
(2)将步骤(1)的预处理银耳放入粉碎机中进行冷冻粉碎，冷冻粉碎是先向粉碎机中充入液氮，然后再进行粉碎，获得银耳粉；其中液氮充入量为每100g物料25ml，粉碎的条件为25000rpm/min，1min；
(3)将步骤(2)获得的银耳粉按照料液比为1:40加入水，用盐酸调pH为6.3，在55℃、1500W下进行超声提取，提取时间为4min，提取结束后，于4500r/min离心6min；
(4)提取结束后，将提取液于4500r/min离心6min，对离心后的沉淀重复上述步骤(3)的超声提取，将两次提取的上清液混合，用Sevage试剂(体积比三氯甲醇：正丁醇＝5:1)脱除蛋白，再用95％的乙醇沉淀多糖，干燥后即得银耳多糖。
为了更好的说明本发明的技术方案，下面还通过对比例和本发明的实施例做进一步的对比。
对比例1
本对比例步骤(3)中超声提取时不调pH，其余步骤与实施例3均相同。
对比例2
本对比例步骤(3)中用盐酸调pH为5.5，其余与实施例3均相同。
对比例3
本对比例步骤(1)中将银耳干燥至含水量2％，其余与实施例3均相同。
对比例4
本对比例步骤(1)中将银耳干燥至含水量15％，其余与实施例3均相同。
效果例1银耳多糖得率测定
对实施例1～3和对比例1-2获得的银耳多糖采用苯酚-硫酸比色法测定产品中银耳多糖的含量，计算得率，得率的计算方式为：产物中银耳多糖质量/原料干重。结果如表1所示。
表1银耳多糖得率测定结果
序号 得率/％
实施例1 36.5
实施例2 35.9
实施例3 35.4
对比例1 22.6
对比例2 20.3
对比例3 20.5
对比例4 19.3
由上述结果可见，本发明通过调整超声提取时的pH，能够显著地提高银耳多糖的提取率，推测其原因是在该pH和超声条件下，糖蛋白的糖肽键发生了断裂，从而使蛋白和多糖分离，脱除蛋白时减少了多糖的损失。同时，原料的含水量对多糖的得率也有显著影响，过高和过低的含水量都不能达到理想的得率，其原因是冷冻粉碎有可能使高分子物质的分子结构和分子量发生改变，特定条件下冷冻粉碎的物料在微酸性超声提取的条件下才能使糖肽键有效断裂。
效果例2银耳多糖分子量测定
对实施例1-3和对比例1-3获得的银耳多糖通过凝胶渗透色谱分析，色谱条件:Agilent1100型高效液相色谱仪,分析柱为79911GF-083,084型PL aquagel-OH 30,40(8μm),以双蒸水为流动相,流速1ml/min,进样量20μL,柱温30℃,采用示差折光检测器,检测温度35℃,将浓度为0.5％的银耳多糖进样。
结果显示，本发明得到的银耳多糖重均分子量Mw为1.3×104Da-1.6×104Da占整体的85％左右。
效果例3抗氧化活性测试
3.1本发明银耳多糖对ABTS自由基的清除作用
ABTS自由基是检测总自由基的一种方法，同时适用于亲水性和亲脂性的物质。ABTS自由基磷酸盐溶液氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基，将待测物加入到ABTS自由基磷酸盐溶液中，如果存在抗氧化成分，则与ABTS自由基磷酸盐溶液反应，并且溶液褪色。
将7.4mmol/LABTS和2.6mmol/L过硫酸钾等体积混合，配制成ABTS自由基正离子溶液，在室温、黑暗条件下静置12～16h，而后用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(50mmol/L)将ABTS自由基正离子溶液在734nm处的吸光度调节为0.7～0.8之间。随之取1.9mL该溶液与0.1mL不同处理的待测样品液，60min后，测定其在734nm处的吸光度。
实验设三个组样品组、对照组、本底组。对照组中用蒸馏水代替多糖；本底组中以磷酸盐缓冲液代替ABTS工作液，另取VC做阳性对照组。按下式计算ABTS自由基清除率：
E＝[A0-(A-Aj)]/A0×100％，
式中，E为清除率，A0为对照组OD值，A为样品组的OD值，Aj为本底组的OD值。
结果显示，本发明方法处理得到的多糖对ABTS+·具有很显著的清除作用，清除率达到85％以上，与阳性对照VC组相比，无显著性差异。
3.2本发明银耳多糖对羟基自由基的清除作用
将1mL待测样品液、1mL 9mmol/L的FeSO4、1mL 9mmol/L的水杨酸以及1mL8.8mmol/L的H2O2溶液混合均匀，37℃下反应30min，随后4000rpm离心10min，测定其在510nm处的吸光度。
实验设三个组样品组、对照组、本底组。对照组中用蒸馏水代替多糖；本底组中以蒸馏水代替H2O2，另取VC做阳性对照组。以蒸馏水调零，测值，吸光值越小，清除效果越好。按下式计算·OH清除率：
E＝[A0-(A-Aj)]/A0×100％，
式中，E为清除率，A0为对照组OD值，A为样品组的OD值，Aj为本底组的OD值。
结果显示，本发明方法得到的多糖对羟基自由基试验的清除率达到95％以上。
3.3本发明银耳多糖还原能力测定
取1.0mL待测样品液，与2.5mL50mmol/L、pH值为7.0的磷酸盐缓冲液以及2.5mL1％的铁氰化钾溶液混合，使其在50℃下静置20min。之后加入2.5mL10％三氯乙酸，将混合物在4000×g的条件下离心处理10min。取1mL上清液，与3mL 0.1％的FeCl3溶液混合。在700nm处测定其吸光度。
实验设三个组样品组、对照组、本底组。对照组中用蒸馏水代替多糖；另取VC做阳性对照组。按下式计算还原能力：
E＝[A-A0]/A×100％，
式中，E为清除率，A0为对照组OD值，A为样品组的OD值。
结果可见，本发明方法得到的多糖的还原能力达到92％以上，与阳性对照VC组相比，无显著性差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种银耳多糖的提取方法，其特征在于，所述提取方法按照如下步骤进行：
(1)将银耳干燥至含水量为4-8wt％，获得预处理银耳；
(2)将步骤(1)的预处理银耳进行冷冻粉碎，获得银耳粉；
(3)将步骤(2)获得的银耳粉加水，并调pH为6.3～6.8，然后进行超声提取；
(4)提取液经固液分离后取上清液，脱除蛋白后得到银耳多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述冷冻粉碎采用液氮冷冻粉碎，具体条件为：液氮充入量为每100g物料通入液氮6～25ml，10000rpm-25000rpm下粉碎1min-3min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中按照料液比为1:(20-60)向银耳粉中加入水，超声提取的条件为：在45℃-75℃、300W-1500W下进行超声提取，提取时间为4-14min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声提取的次数为2次，第一次超声提取结束后固液分离，固体按照相同的方法再提取一次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述固液分离是在4500～5000r/min下离心5～10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，采用Sevage法脱除蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，脱除蛋白后的提取液经醇沉得到银耳多糖。
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