CN112521519B - 一种中分子量银耳多糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种中分子量银耳多糖的制备方法，由以下步骤获得：(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎后加入10‑15倍银耳粉重量自来水浸泡；(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入10‑12倍水后加入食用乙醇使溶液酒精度达到15‑20％，随后将银耳稀乙醇溶液过胶体磨，再进行高速离心，除去银耳粉渣和沉淀后得中分子量银耳多糖溶液；(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70‑75％，静置后离心，沉淀低温干燥后获得中分子量银耳多糖。中分子量银耳多糖可用于制备保健食品、功能性食品、老年食品、儿童食品和化妆品中。

Description

一种中分子量银耳多糖的制备方法
技术领域
本发明涉及一种银耳多糖的制备方法，尤其涉及一种中等分子量银耳多糖的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
银耳是一种具有悠久食用历史的大型真菌，由于其味美、营养丰富而为人们所喜爱。现代研究发现，银耳多糖是银耳中的重要活性成分，银耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老、降血脂等多种生理活性。传统的银耳多糖提取方法有：(1)热水浸提法，将子实体或匀浆后用热水提取，但提取时间长、收率低，且提取的银耳多糖分子量大(＞100万Da)；(2)酸、碱浸提法，将子实体或匀浆用酸液或碱液加热提取，容易使银耳多糖的糖苷键断裂，使得银耳多糖分子量偏小(几万Da为主)；(3)酶法提取，将银耳匀浆加入果胶酶、纤维素酶、蛋白酶保温提取后加热灭酶，多糖提取得率高，银耳多糖的分子量往往在10万Da左右，属于小分子多糖，且工业化大生产成本高。此外，在前述提取方法基础上，辅助超声、微波等物理方法强化银耳多糖的提取，使得多糖得率提升，这些提取辅助手段的目的都是通过各种物理方式加强银耳细胞的破碎，使得多糖容易溶出。
根据多糖构效关系的研究进展，多糖活性的强弱与单糖组成、分子量大小及高级结构有直接的关系，中等分子量大小的多糖(几万到几十万Da的范围)往往具有较为优异的生物学活性且功能全面。因此，制备中等分子量的银耳多糖具有实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中等分子量银耳多糖的制备方法。一种中等分子量银耳多糖的制备方法，包括如下步骤：
(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎至20目-30目，加入10-15倍银耳粉重量自来水浸泡8-12小时，得银耳粉液；
(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入10-12倍银耳粉重水，然后加入95％食用乙醇，使溶液酒精度达到15-20％，随后将银耳稀乙醇溶液过胶体磨2-3次，再进行高速离心，除去银耳粉渣和沉淀，得中分子量银耳多糖溶液。
(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入95％食用乙醇，使溶液乙醇浓度达到70-75％，溶液静置4小时后离心，收集沉淀低温干燥后得中分子量银耳多糖。
本发明与以往技术相比，其有益效果在于：
本发明提供一种低温提取中分子量银耳多糖得方法，与以往的技术相比，其主要创新点在于：(1)使用稀乙醇溶液进行提取银耳多糖，而非传统的热水、酸或碱液，使得高分子量银耳多糖在提取时即被沉淀分离，而小分子银耳多糖(小于数万Da)则在多糖醇沉时溶解在上清液中，银耳多糖的糖苷键不受破坏；(2)省略了银耳提取液加热浓缩步骤，并且在提取时采用不加热的方式，使溶液中银耳多糖不与溶液中的蛋白质、氨基酸等成分发生反应，从而获得的中分子银耳多糖结构保持良好、外观色泽洁白、免疫活性好。
附图说明
图1实施例1银耳多糖的凝胶色谱图：银耳多糖分子量分布在3万Da到40万Da范围(峰尖分子量Mp显示在图上)。
图2实施例2银耳多糖的凝胶色谱图：银耳多糖分子量分布在几十万Da范围(2为溶剂峰，峰尖分子量Mp显示在图上)。
图3对比例1银耳多糖的凝胶色谱图：银耳多糖分子量分布＞100万Da为主(3为溶剂峰，峰尖分子量Mp显示在图上)。
图4不同样品对RAW264.7细胞分泌NO的影响(*、**分别表示与空白组相比，p＜0.05，p＜0.01)。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对所做的任何修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。在未作说明的情况下，本发明涉及的原料与方法均为本领域的常规原料和方法。
实施例1
(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎至20目，加入10倍银耳粉重量自来水浸泡12小时，得银耳粉液；
(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入10倍水，然后加入食用乙醇，使溶液酒精度达到15％，随后将银耳粉稀乙醇溶液过胶体磨3次，采用高速离心机1000g离心力高速离心，离去银耳粉渣和沉淀，得中分子量银耳多糖溶液。
(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70％，溶液静置5小时，然后高速离心取沉淀，把沉淀用烘箱45℃干燥得中分子量银耳多糖粉。
实施例2
(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎至30目，加入15倍银耳粉重量自来水浸泡8小时，得银耳粉液；
(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入12倍水，然后加入食用乙醇，使溶液酒精度达到20％，随后将银耳粉稀乙醇溶液过胶体磨2次，采用高速离心机1000g离心力离心，离去银耳粉渣和沉淀，得中分子量银耳多糖溶液。
(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到75％，溶液静置7小时，然后高速离心取沉淀，把沉淀用微波干燥得中分子量银耳多糖粉。
对比例1(热水提取法)
(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎至20目，加入13倍银耳粉重量用水浸泡12小时，得银耳粉液；
(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入15倍水，随后将溶液加热至90℃并保持2小时，随后采用高速离心机1000g离心力离心，离去银耳粉渣，得热水提取银耳多糖溶液。
(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到75％，溶液静置过夜(＞8小时)，然后高速离心取沉淀，把沉淀用烘箱45℃干燥得银耳多糖粉。
各实施例和对比例样品分子量的测定
采用凝胶渗透色谱仪(Water Breeze GPC)，色谱柱TOSOH公司TSK-GEL G-5000PWXLcolumn(7.8mm×300mm)与TSK-GEL G-3000PWXL column(7.8mm×300mm)串联；流动相0.02moL/L KH2PO4溶液，PH6.0；流速0.6mL/min；柱温35℃。检测器为2414型示差折光检测器。将葡聚糖标准品系列分别用流动相配成浓度为1.0mg/ml的标准溶液，进样量为20μL，采集GPC色谱图。以标准葡聚糖分子量的对数logMW为纵坐标，洗脱体积V为横坐标，绘制“logMW-V”曲线，用Breeze GPC系统软件对曲线进行回归拟合，选出与曲线相关度较好的葡聚糖分子量GPC校正曲线方程。样品处理：银耳多糖用流动相配成浓度为1mg/mL的样液，过0.45μm水相微孔滤膜后按照2.4.4.1所述色谱条件，进样量为20μL，采集GPC色谱图。根据葡聚糖GPC校正曲线方程，利用Breeze GPC系统软件分析香菇多糖的GPC谱图，计算出银耳多糖的分子量。
各样品银耳多糖分子量的测定结果见说明书附图(1-3)，从图可知，本发明方法制备的银耳多糖分子量分布在中等范围(几万到几十万Da)。
各实施例和对比例样品的活性测定(NO的分泌量)
将小鼠腹腔巨噬细胞(RAW264.7)以1×105个/孔的浓度接种在96孔板中，每孔0.1mL，培养24h，更换培养液，其中设置对照组、实施例1、实施例2、对比例1。培养48h后用NO试剂盒测定培养孔上清液中NO分泌量。
结果见图4，由图可知，中等分子量的银耳多糖刺激巨噬细胞分泌NO的活性优于大分子银耳多糖(p＜0.05)。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种中分子量银耳多糖的制备方法，其特征在，包括以下步骤：
(1)银耳的前处理：将银耳子实体粉碎至20目-30目，加入10-15倍银耳粉重量用水浸泡8-12小时，得银耳粉液；
(2)银耳多糖的提取：在银耳粉液中加入10-12倍银耳粉重水，然后加入95％食用乙醇，使溶液酒精度达到15-20％，随后将银耳稀乙醇溶液过胶体磨2-3次，再进行高速离心，除去银耳粉渣和沉淀，得中分子量银耳多糖溶液；
(3)银耳多糖沉淀分离：往银耳多糖溶液中缓慢加入95％食用乙醇，使溶液乙醇浓度达到70-75％，溶液静置4小时后离心，收集沉淀后低温干燥得中分子量银耳多糖。
2.权利要求1所述的中分子量银耳多糖在制备保健食品、功能性食品、老年食品、儿童食品和化妆品中的应用。
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