KR101597877B1 - 진세노사이드 유효성분의 추출방법 - Google Patents

Abstract

효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효 진세노사이드 함량의 고수율을 달성할 수 있는 진세노사이드의 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품에 관한 것이다. 이에 따라, 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 또한, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효진세노사이드 함량의 고수율을 달성할 수 있다

Description

진세노사이드 유효성분의 추출방법{EXTRACTING METHOD OF EFFECTIVE COMPONENT FROM GINSENOSIDES}

본 발명은 진세노사이드 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품에 관한 것으로, 보다 구체적으로 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효 진세노사이드 함량의 고수율을 달성할 수 있는 진세노사이드 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품에 관한 것이다.

인삼은 식물 분류학상 오가피나무과(Aralaiaceae)의 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있으며, 과거 수천 년 전부터 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 등에서 주로 건강증진을 위한 목적으로 널리 사용하여 왔다. 최근에는 수삼을 증기로 수차례 쪄서 가공하여 인체에 유용한 미량의 진세노사이드를 함유한홍삼의 효능이 뛰어나다고 알려져 있다. 인삼의 대표적인 유효성분인 사포닌(saponine)은 배당체(ginsenoside)라 불리는 화합물의 일종이다. 인삼을 물과 에탄올로 추출한 인삼추출물의 주요 효능을 나타내는 사포닌은 30종류 이상의 진세노사이드로 구성된다. 진세노사이드는 홍삼추출물의 주요성분으로 면역력강화, 항염증작용, 항알러지작용, 항암효과, 혈압강하작용, 항콜레스테롤작용, 항혈전작용, 성인병 및 노화에 대한 예방 및 치료효과가 있음이 보고되어 있다.

진세노사이드들은 다마란(dammarane)계의 트리테르페노이드(triterpenoid)인 프로토파낙사다이올(Protopanaxadiol)과 프로토파낙사트라이올(Protopanaxatriol)에 글루코오스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로오스와 같은 당류가 결합한 화합물들로서 현재까지 인삼에서 30여 종의 유도체들이 밝혀져 있다. 주요 프로토파낙사다이올 유도체들에는 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Rg₃, Rh₂, 컴파운드 K 등이 있다. 주요 프로토파낙사트라이올 유도체에는 Re, Rg₁, Rh₁ 등이 있다.

인삼과 산삼에 80% 이상을 차지하는 진세노사이드 유도체들인 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re 및 Rg₁의 고려인삼 내 대략적 함량은 각각 5, 2, 3, 2, 2 및 2㎎/g이며 총 함량이 약 16mg/g이다. 이들은 한 분자당 2~4 개의 당류를 결합한 유도체들이며 장내에서 흡수가 잘되지 않으며 약리활성이 작은 것으로 밝혀져 있다. 인삼과 산삼에서 검출되지 않거나 미량 검출되는 진세노사이드 Rg₃, Rh₂, Rh₁ 및 컴파운드K 등은 1~2개의 당류가 결합된 유도체들로서 장내에서 혈액으로 흡수되며 생리 활성이 높다.

생리활성이 높은 진세노사이드 Rg₃가 강화된 인삼으로서 홍삼이 대표적이며 국내 인삼 시장의 대부분을 차지하고 있는 인삼 제품이다. 인삼을 증숙하여 제조한 홍삼은 진세노사이드 Rg₃ 함량이 낮아 약리효과가 적고 비경제적이다. 인삼의 가열처리에 입체이성질체인 진세노사이드 Rg₃(R)과 Rg₃(S)가 생성된다.

하기 특허문헌 1에는 진세노사이드 Rg₃ 성분의 함량이 뛰어나도록 인삼을 9회 증숙시키고 10회 건조시켜 제조된 흑삼에 대해 개시되어 있지만, 하기 특허문헌 1은 고열에서 장시간 반복적으로 증식하여 비경제적이다.

하기 특허문헌 2에는 인삼을 초산균을 이용하여 초산 발효한 후 60 내지 120℃에서 가열하여 추출하여 진세노사이드 Rg₃가 다량 함유된 인삼 추출물을 제조하는 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 3에는 인삼 엑기스를 효소 락타제와 반응시켜 제조하여 20(S)-진세노사이드 Rg₃의 수율을 현저하게 높이는 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 4에는 인삼추출물을 페니실리움속 미생물에서 분리한 효소인 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 효소인 베타-갈락토시다제와 반응시켜 진세노사이드 컴파운드K를 고수율로 얻는 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 5에는 셀룰라제 또는 락타제 조성물 와이-에이오(Y-AO)를 이용하여 인삼 사포닌을 효소 반응시켜 진세노사이드 컴파운드K를 생성하고 이로부터 진세노사이드 컴파운드K를 제조하는 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 6에는 인삼추출물을 다당류분해효소인 펙티넥스 또는 비스코자임을 처리하여 진세노사이드 에프원, 컴파운드 Y 및 컴파운드 K를 대량으로 제조하는 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 7에는 인삼 추출물을 락타제와 반응시키고 반응 생성물에 나린지나제와 베타갈락토시다제 중에서 선택한 효소와 반응시켜 진세노사이드 Rh₂를 대량 생산하기 위한 방법에 대해 개시되어 있다.

하기 특허문헌 8에는 김치 유산균을 접종하여 2~5일 배양한 후 유기산을 첨가하고 40~80도에서 1~72시간 반응시키는 발효 인삼 또는 발효 홍삼의 제조방법에 대해 개시되어 있다. 이 발효 홍삼의 진세노사이드 Rg3(알), 컴파운드K, Rh₂ 및 프로토파낙사디올의 함량이 각각 4.5%, 2.1%, 20.2% 및 6.3%이었다. 인삼의 일반적 진세노사이드 총 함량이 약 1.6% 인데 비해 이 발효 홍삼의 진세노사이드의 총 함량이 33.1%에 이르러 20 배 이상이나 증가하는 것이 예외적이다.

진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리터페노이드를 기본구조로 하는 프로토파낙사다이올과 프로토파낙사트라이올의 어글리콘에 글루코스, 람노스, 아라빈스, 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서 결합된 당들의 종류와 수 그리고 결합위치에 따라 약리작용이 각각 다른것으로 알려져 있다. 이들 유도체들 중 프로토파낙사다이올에 속하는 트리글루코 진세노사이드인 Rd를 농축하여 1차적으로 함량비율을 높이게 되면 여기서부터 2차 효소반응을 통해 다이글루코 진세노사이드인 F2 를 거쳐 모노글루코 진세노사이드 Compound K를 만들게 되는데 각각의 순서에 따라 당 한분자씩이 가수분해로 떨어지게 된다. Rg₃는 가공되지 않은 홍삼에는 존재하지 않거나 극미량만 존재하는 특이 사포닌으로 일반 인삼에서 흔히 볼 수 있는 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, Re 및 Rg₁과 같은 천연 진세노사이드에 비해 항암, 기억력 감퇴 개선, 항알러지효과 등 약리 활성이 탁월한 것으로 알려져 있다.

기존에 진세노사이드 Rg₃, F₂와 CK의 제조를 위해 사용되었던 방법에는 70∼95% 주정을 이용하여 진세노사이드를 추출한 후 효소전환을 통해 F₂와 CK를 제조하고, 유기산 전환을 통해서 Rg₃을 생산하는 이원화 된 작업을 진행하고 있다. 상기의 방법으로 진행할 경우 중간체인 Rd의 의존도가 높아지게 되며 모든 반응은 100% 진행되기 보다는 일정수준 반응이 진행되면 정반응과 역반응의 평형이 생겨 반응이 정지된 것과 같은 효과를 가지게 된다. 따라서 1차 진세노사이드를 반으로 나누어 효소전환과 유기산전환을 진행할 경우 최대 수율을 얻지 못할 수도 있다.

대한민국 등록특허 제0600795호 (2006.07.06 등록) 대한민국 공개특허공보 제2010-0001540호 (2010.01.06 공개) 대한민국 등록특허 제0218553호 (1999.06.10 등록) 대한민국 등록특허 제0377546호 (2003.03.12 등록) 대한민국 등록특허 제0420451호 (2004.02.16 등록) 대한민국 공개특허공보 제2008-0028266호 (2008.03.31 공개) 대한민국 등록특허 제0293968호 (2001.04.10 등록) 대한민국 등록특허 제0789678호 (2007.12.21 등록)

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위한 것으로서,

본 발명의 목적은 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있는 진세노사이드 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효진세노사이드 함량의 고수율을 달성할 수 있는 진세노사이드 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품을 제공함에 있다.

본 발명에 따른 진세노사이드 유효성분의 추출방법 및 이를 포함하는 제품은 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출을 수행함과 동시에 Rd을 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂, 컴파운드 K(CK)의 함량을 높임과 동시에 연속적으로 유기산 전환을 진행하는 것을 포함한다. 여기서, 유기산의 전환은 효소전환 반응일 수 있으며, 이러한 효소는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 사이톨라제(cytolase) PCL5 효소처리군 중 적어도 하나일 수 있다.

또 다른 관점의 본 발명에 따른 진세노사이드 유효성분의 추출방법은 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행한다.

본 발명은 위에서 설명한 추출방법으로 만든 제품을 포함하며, 또한, 본 발명은 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하는 진세노사이드를 이용한 제품을 포함한다.

이러한 과정 및 제품은 일반적인 발효홍삼의 제조공정에서는 총 진세노사이드 함량이 보통 130∼200mg/g 으로 효소첨가 추출의 효율성이 높음을 입증하였고, 추출 후 정제한 홍삼을 효소전환과 유기산 전환을 구분하여 생산하는 것보다 효소전환 직후 바로 유기산 전환을 진행하는 방식이 중간 생성물인 Rd의 효율적인 Rg3, F2, CK로의 전환을 촉진하는 것을 판단된다.

항산화효과, 생리활성 증가에 탁월한 Rg3, F₂, CK를 고수율로 생산할 수 있는 효율적인 공정을 최적화하였으며, 이를 활용하여 고부가가치 발효홍삼제품을 생산할 수 있다.

본 발명에 따르면, 효소 추출을 통해 진세노사이드의 추출 수율을 높이고, 1차 전환을 통해 Rd를 농축하고, 2차 효소반응으로 F₂ 및 컴파운드 K(CK)의 함량을 높일 수 있는 효과가 있다.

또한, 진세노사이드를 다단효소전환 반응 후 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효진세노사이드 함량의 고수율을 달성할 수 있다.

도 1은 진세노사이드 19종에 대한 피크 및 분리를 확인한 그래프이다.
도 2는 에탄올 추출용액의 최적화 탐색을 위한 주정농도에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것이다.
도 3은 농도에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것이다.
도 4는 리싸이클에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 대해 자세히 설명하기로 한다.

본 발명은 발효 홍삼을 제조함에 있어서, 효소추출법과 다단 효소전환반응을 이용하고, 추출된 진세노사이드를 이원화하여 효소전환과 유기산 전환을 진행하는 것이 아니라, 다단 효소전환 반응 후에 연속적으로 유기산 전환을 진행하여 공정 단순화 및 유효 진세노사이드 함량의 고수율로 제조할 수 있게 한 것이다.

이하, 실시예를 자세히 설명하면 다음과 같다.

발효 등의 방법으로 전환된 진세노사이드를 분석하기 위해 법적 기준(Rg1, Rb1)에 17개 진세노사이드를 추가하여 동시에 분석할 수 있는 방법을 개발하였다. 시험방법은 건강기능식품공전 중 진세노사이드 분석방법을 기준으로 하였으며 표준물질은 PPT 6종, PPD 13종, Sigma 시약을 포함하여 진세노사이드 19종을 표준물질로 하였다. 분석기기는 UPLC를 이용하였으며 칼럼은 UPLC BEH Shield RP 18(1.7um, 2.1×100mm)을 사용했고, 칼럼온도는 40℃, 투입 부피는 3ul였다. 이동상은 증류수와 아세토나이트릴(Acetonitrile)을 다음과 같은 조건으로 셋팅하였다.

Time(min)	A(%)	B(%)	Flow rate(ml/min)
0	85	15	0.6
0.5	85	15	0.6
12	70	30	0.6
16	60	40	0.6
23	40	60	0.6
25	10	90	0.6
25.5	10	90	0.6
26	85	15	0.6
26.5	85	15	0.6

<ULPC의 이동상 gradient 조건>

도 1은 진세노사이드 19종에 대한 피크 및 분리를 확인한 그래프이다. 총 분석시간은 26.5분으로 셋팅이 완료되었고, 분리능(분해능)을 좋게하기 위해 HPLC 대신 UPLC 기기를 이용한 것이 진세노사이드의 이성질체(isomer) 분석에 매우 유용하다고 판단할 수 있다.

실시예 1 : 백삼 및 홍삼의 사포닌 함량 비교와 효소처리 추출효과 분석

백삼과 홍삼의 사포닌 함량 비교를 위하여 건강기능식품공전 중 진세노사이드 분석법을 기준으로 분석하였으며 백삼, 홍삼 각각 주근:미근=7:3(10-40mesh)로 준비하였고, 추출 조건은 95% 에탄올, 60℃에서 6시간씩 3회 추출하여 농축 후 100mL 볼륨 플라스크(volume flask)에 놓고 표시선까지 정용하였다. 제조된 샘플은 여과하여 분석에 사용하였다. 효소처리 추출의 효용성을 알아보기 위하여 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 사이톨라제(cytolase) PCL5 효소처리군과 미처리군으로 나누어 추출 효율을 분석하였다.

결과는 효소처리군은 고형분 추출율이 31.1%였고, 효소 미처리군은 20.5%로서 효소처리한 군에서 고형분의 추출수율이 높게 나타났다. 고형분의 함량이 진세노사이드 함량과 비례적으로 늘어나는 것은 아니지만 효소처리하여 세포막에 함유된 진세노사이드까지 추출하게 되어 고형분의 함량이 늘어났다고 볼 수 있다.

백삼과 홍삼의 주근과 미근을 7:3으로 하여 효소처리없이 추출을 진행한 결과 백삼은 12.7mg/g, 홍삼은 20.4mg/g의 고형분함량을 나타내어 백삼보다는 홍삼에서 진세노사이드를 효소 및 유기산 전환하는 것이 효율적이다.

실시예 2 : 추출 온도에 따른 추출 수율 비교

추출 온도에 따른 추출 수율 비교는 95% 주정을 넣고 25℃, 60℃ 두 온도에서 추출 수율 비교를 진행하였다. 25℃에서는 12시간씩 3회 추출을 진행하였고, 60℃에서는 6시간식 3회 추출을 진행하였다. 추출결과 25℃에서는 8.98mg/g, 60℃에서는 13.4mg/g으로 60℃에서 추출 효율이 높게 나타났다.

실시예 3 : 에탄올 농도 최적화

홍삼으로부터 진세노사이드 유효성분의 효율적인 추출을 위해 주정 농도를 40%에서 100%의 비율로 높여가며 실험을 진행했으며 결과는 도 2와 같다. 도 2는 에탄올 추출용액의 최적화 탐색을 위한 주정농도에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것으로서, 추출온도는 60℃에서 18시간 추출을 진행하였다.

도 2에서와 같이 70∼100%에서 좋은 효율을 나타냈으며 진세노사이드가 약간 지용성의 특징을 나타내므로 95%의 주정을 사용해 하기의 발명을 진행하였다.

실시예 4 : 홍삼 원료의 농도 최적화

도 3은 농도에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것이다. 이에 도시된 바와 같이, 발효 홍삼의 농도 최적화는 원료의 농도가 낮을수록 진세노이드 추출 함량이 높게 나타났으나 5%의 경우는 농도가 너무 낮아 생산 효율성이 떨어져 진세노사이드 추출율이 약간 낮지만 발효홍삼 원료의 농도는 10%(약 10brix)로 정했다.

실시예 5 : 추출 리싸이클 회수 최적화

추출횟수 실험은 다음과 같이 진행하였다. 추출용매 95% 주정, 추출온도 60℃, 홍삼 원료 농도 10brix, 추출시간은 6시간씩 3회로 진행하였다. 상기의 조건에서 1회 추출시 추출율이 가장 높았으며 2회차 추출부터는 추출 효율이 25%로 매우 적게 나타났다. 이를 도 4에 도시하였는데, 도 4는 리싸이클에 따른 진세노사이드 양을 나타낸 것이다. 상기의 결과를 종합해 볼 때 효소를 처리하고 최소 3회차까지 반복 추출을 하는 것이 생산성에 있어서 우수하다고 판단되었다.

실시예 6 : 효소전환과 유기산 전환 공정 단일화 효과 검증

상기의 방법으로 추출 후 추출액의 50%는 효소전환을 실시하였고, 50%는 유기산 전환을 하는 방법과 본발명의 핵심인 효소전환 후 유기산 전환을 하는 방법에 대한 수율 비교를 실시하였다.

　실험결과는 표 2와 같다.

<발효홍삼 제조공정 변경에 따른 진세노사이드 함량 분석>

상기의 표에서와 같이 대조군처럼 홍삼추출액을 정제 후 50:50으로 나누어 효소전환과 유기산 전환한 샘플은 총 진세노사이드 함량이 179.78mg/g이었으며, Rb1+Rg1의 함량은 19.6mg, Rg3는 14.9mg, Rg2+Rh1은 12mg, F2+CK의 함량은 16.3mg이었다. 효소처리 추출 및 1차 Rd 농축에 의한 2차 효소반응, 유기산전환을 했을 경우에도 생리활성이 우수한 진세노사이드의 함량이 매우 높게 나타났다. 그러나 기존의 공정방식을 통합하여 효소전환과 유기산전환 공정을 연이어 할 경우 예상대로 Rd가 효율적으로 감소하면서 Rg3, F2, CK의 성분이 평균 1.5배 이상 함량이 증가하였다.

　현재 일반적인 발효홍삼의 제조공정에서는 총 진세노사이드 함량이 보통 130∼200mg/g 으로 효소첨가 추출의 효율성이 높음을 입증하였고, 추출 후 정제한 홍삼을 효소전환과 유기산 전환을 구분하여 생산하는 것보다 효소전환 직후 바로 유기산 전환을 진행하는 방식이 중간 생성물인 Rd의 효율적인 Rg3, F2, CK로의 전환을 촉진하는 것을 판단된다.

항산화효과, 생리활성 증가에 탁월한 Rg3, F2, CK를 고수율로 생산할 수 있는 효율적인 공정을 최적화하였으며, 이를 활용하여 고부가가치 발효홍삼제품을 생산할 수 있다.

이상과 같이 본 발명에서는 구체적인 구성 요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것이다. 또한, 본 발명이 상술한 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 그러므로, 본 발명의 사상은 상술한 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 70% 내지 100%의 주정 농도를 갖는 추출 용매를 사용하고 효소 추출을 통하여 백삼 또는 홍삼으로부터 진세노사이드를 추출하는 단계;
   상기 추출된 진세노사이드를 효소 전환하는 단계; 및
   상기 효소 전환하는 단계 직후 유기산 전환을 연이어 실시하는 단계를 포함하고,
   상기 효소 전환하는 단계는,
   상기 진세노사이드에 포함된 Rd를 농축하여 함량비율을 높이는 단계; 및
   상기 Rd를 효소 반응을 통하여 F₂ 및 컴파운드 K(CK)로 전환하는 단계를 포함하고,
   상기 효소 추출 또는 상기 효소 전환에 사용되는 효소는, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 사이톨라제(cytolase) PCL 5의 구성 효소 중 적어도 하나를 포함하는 진세노사이드 유효성분의 추출 방법.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 70% 내지 100%의 주정 농도를 갖는 추출 용매를 사용하고 효소 추출을 통하여 백삼 또는 홍삼으로부터 진세노사이드를 추출하고, 동시에 상기 진세노사이드에 포함된 Rd를 농축하는 단계;
   상기 Rd를 효소 반응을 통하여 F₂ 및 컴파운드 K(CK)로 전환하는 단계; 및
   상기 전환하는 단계 직후 유기산 전환을 연이어 실시하는 단계를 포함하고,
   상기 효소 추출 또는 상기 효소 전환에 사용되는 효소는, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속의 사이톨라제(cytolase) PCL 5의 구성 효소 중 적어도 하나를 포함하는 진세노사이드 유효성분의 추출 방법.
   
6. 삭제
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