KR100377546B1

KR100377546B1 - 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법

Info

Publication number: KR100377546B1
Application number: KR10-2000-0043170A
Authority: KR
Inventors: 고성룡; 최강주; 김영희; 조병구; 이유희; 양재원
Original assignee: 주식회사 케이티앤지
Priority date: 2000-07-26
Filing date: 2000-07-26
Publication date: 2003-03-26
Also published as: KR20020009756A

Abstract

본 발명은 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 성분중에서 함량이 많고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 효소적 방법으로 구조전환시켜 인삼 사포닌성분의 장내대사산물인 화합물 K를 대량 제조하는 방법에 관한 것이다. 화합물 K는 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd, 이들의 혼합물 또는 이들이 함유된 추출물을 완충용액 중에서 페니실리움속 미생물에서 분리한 효소인 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 효소인 베타-갈락토시다제와 반응시키면 간단하게 화합물 K를 고수율로 얻을 수 있다. 컴파운드 K는 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포침윤억제작용이 있는 것으로 알려져 있는 생리활성 물질이다.

Description

효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법{Manufacturing Method for Ginsenoside Compound K by Enzymatic Reaction}

본 발명은 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼사포닌 장내세균 대사산물로서 여러가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 밝혀져 있는 컴파운드 K는 인삼 성분중에서 함량이 많고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 효소적 방법으로 구조전환시켜 인삼 사포닌성분의 장내대사산물인 컴파운드 K를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 효소적 방법에 의하여 다이올형 사포닌으로부터 다음 일반식(Ⅰ)로 표시되는 20(S)-프로토파낙사다이올-20-0-베타-디-글루코피라노사이드 (이하co mpound K라 함〕를 제조하는 방법에 관한 것이다.

(Ⅰ)

상기 일반식(Ⅰ)의 컴파운드 K는 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포침윤 억제작용 등이 있는 성분(대한민국 특허등록 0164266, 하세가와 등, 1998년)으로 알려져 있다.

인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 다마란계의 트리테르페노이드인 프로토파낙사다이올 또는 프로토파낙사트라이올에 글루코스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물들로서 현재까지 고려인삼에서 약 30여종의 유도체들이 밝혀져 있다. 또한 인삼 사포닌은 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합위치에 따라 약리효능이 각각 다르다는 것이 이미 밝혀져 있으며, 인삼 중 함량이 많고 분리하기가 용이한 주요 사포닌의 약리효능에 대해서는 많은 연구가 수행되었으나, 미량 사포닌의 약리효능에 관한 연구는 극히 적은 편이다.

본 발명은 인삼 사포닌성분의 체내 대사산물인 컴파운드 K의 새로운 제조방법에 관한 것으로서 다이올계 인삼사포닌을 경구 투여하게 되면 장내세균, 특히 프리보텔라리스(Prevotellaris)에 의해 대사되어 흡수되며 이들 대사산물이 인삼사포닌의 약효를 나타내는 체내 매개물(The Ginseng Review 10, Kobayashi 등, 1994년)로 밝혀져 있는 데, 화합물 K는 효능실험을 통하여 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포침윤 억제작용 등 여러 가지 유효한 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있으나 인삼 자체에는 함유되어 있지 않고, 체내 대사산물로서 그 수율도 낮아 일시에 다량의 시료를 얻기가 어려운 실정이다. 인삼 사포닌중 다이올계 사포닌은 함량이 높고 진세노사이드 Rd로 구조전환될 수 있는 구조를 갖고 있어 효소적 방법으로 다이올계 사포닌을 구조전환시켜 진세노사이드 Rd를 고수율로 얻을 수 있는 방법을 밝혀 특허출원(대한민국 특허출원 1998년 제16212호)한 바 있다. 한편 컴파운드 K는 프로토파낙사다이올 사포게닌의 C₂₀위치에 포도당 한 분자가 결합된 성분으로 진세노사이드 Rd 성분의 C₂₀위치에 결합된 포도당 한 분자는 그대로 두고 C₃위치에 결합된 포도당 두 분자를 절단할 경우 화합물 K로 전환된다는 점에 착안하여 본 연구를 수행하게 되었다.

종래 홍삼에만 함유되어 있는 미량 사포닌인 진세노사이드 Rh₁이나 Rh₂를 제조하는 방법으로서 산 가수분해법이 개발되어 있다(대한민국 특허등록 제82730호; 대한민국 특허등록 제186757호). 그러나 산 가수분해법은 진세노사이드의 아글리콘 C₂₀위치의 배당체 결합을 분해하기 때문에 산 가수분해법으로 프로토파낙사다이올의 C₂₀위치에 글루코스가 1분자 결합된 형태인 컴파운드 K를 제조하기는 어렵다.또한 종래 컴파운드 K의 제조방법으로서 다이올계 사포닌을 효소인 나린지나제로 가수분해시켜 제조하거나 쥐에 경구투여후 대장에서 분해산물로 생성되는 화합물 K를 분리한 바 있으나 생성 수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러가지 2차 대사산물이 생성되기 때문에 컴파운드 K를 고순도로 정제하는데 어려움이 있다 (Chem. Pharm. Bull. 38, 2859, Karikura 등, 1990년). 예로서 다이올계 사포닌 분획 5g을 장내세균과 반응시킨 후 대사산물로부터 컴파운드 K 320㎎을 분리한바 있다(생약학회지 26, 360, 성종환 등, 1995년).

본 발명자들은 효소적 방법에 의해 인삼 중에 함량이 높은 다이올계 사포닌으로부터 컴파운드 K의 제조방법을 개발할 목적으로 각종 미생물에서 분리한 효소를 사용하여 다각적인 시험을 실시한 결과 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제와 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 진세노사이드 Rb_1,Rb₂, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물과 반응시켰을 때 제조수율 75% 이상의 고수율로 컴파운드 K를 생성한다는데 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 인삼에 다량 함유되어 있는 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 및 이들의 혼합물 또는 다이올계 사포닌 함량이 높은 각종 인삼 추출물을 효소적 방법으로 구조전환시켜 컴파운드 K를 간단하게 대량으로 제조하는 데 있다.

본 발명에서는 인삼의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물을 물, 인산 또는 시트레이트-인산과 같은 완충용액과 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액 중에서 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제와 함께 반응시키면 단기간 내에 아글리콘 C₃위치의 글루코스 두 분자와 C₂₀위치에서 글루코스 1분자를 제외한 나머지 배당체 결합이 용이하게 절단되어 컴파운드 K가 고수율로 생성된다.

본 발명에 사용되는 용매로는 물, 완충용액과 같은 효소의 활성을 저하시키지 않는 수성용매를 사용하는 것이 좋다. 가장 바람직한 수성용매로는 pH 4∼8, 특히 pH 4∼6범위의 완충용액이 바람직하다. 전술한 수성용매는 단독으로 사용할 수도 있으나 다른 수성용매 및 유기용매와 혼합하여 사용할 수도 있는데, 혼합하여 사용할 수 있는 유기용매는 물과 혼화되면서 효소의 활성을 저하시키지 않는 것이어야 한다. 바람직한 유기용매로는 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸 설폭사이드, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등이 있으며, 유기용매의 사용량은 사용한 기질을 기준으로 1∼50% 농도, 특히 2∼30% 농도가 되도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 효소로는 페니실리움속에서 분리한 셀루라제와 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제가 있으며, 이러한 효소의 첨가방법은 효소의 불활성화가 일어나지 않는 방법이라면 특별히 제한을 받지 않는다.

반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도조건이어야 하는데, 수성용매만을 사용하는 경우는 60℃ 이하가 바람직하고, 수성용매와 유기용매의 혼합액을 사용하는 경우는 40℃ 이하가 바람직하다. 본 발명에 사용되는 반응시간 역시 효소의 활성이 유지되는 기간이라면 특별히 제한을 받지 않으나 1∼72시간, 바람직하게는 24∼48시간이 적당하다.

본 발명에 의한 컴파운드 K의 제조방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물 및 이들의 함유비율이 높은 인삼 추출물을 수성용매 또는 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시키고 미생물 페니실리움속에서 유래한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 가하고 20∼60℃에서 1∼72시간 반응시킨 후 비등 수욕조에서 10분간 가열하여 효소를 불활성화시켜 컴파운드 K가 다량 함유된 반응액을 얻는다. 이와 같은 효소적 방법에 의하면 종래에는 고순도의 진세노사이드 표준품을 효소 헤스페리디나제, 나린지나제, 펙티나제와 반응시켜 제조하거나 또는 사포닌의 장내 대사산물로부터 분리 제조하여 얻었으나 본 방법에서는 반응의 기질인 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 등을 고순도의 순품으로 분리해야 하는 어려운 과정을 거치지 않고 사포닌 혼합물을 페니실리움속에서 분리한 효소 셀루라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 효소인 베타-갈락토시다제와 반응시키면 단기간내에 컴파운드 K만이 주로 생성되기 때문에 분리하기가 용이한 장점이 있다. 본 발명에 의해 제조된 생성물은 다음과 같은 물리화학적 성상을 나타내어 이를 컴파운드 K로 동정하였다. 컴파운드 K의 물리화학적 성상은 다음과 같다.

성상: 백색 무정형 분말(에탄올),녹는점: 176-178^oC, [alpha]_D ²²:＋9.3°( c=0.90, CHCℓ₃),Rf값: 키젤겔 60 F₂₅₄박층크로마토그래피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물(=65:35:10, 아래층)로 전개하였을 때 0.65,

고속원자 충격 질량 스펙트럼(negative): m/z 621.6〔C₃₆H₆₂O₈-H〕^-, 459.4〔C₃₆H₆₂O₈-Glc-H〕^-

수소 핵자기공명 스펙트럼(δ): 3.42(1H, dd, J=10.5, 5.1 Hz, H-3), 0.82(1H, d, J=11.1, Hz, H-5), 4.19(1H, dd, H-12), 5.25(1H, t, J=6.8, 1 Hz, H-24), 0.90(3H, s, Me-18), 0.90(3H, s, Me-19), 1.57(3H, s, Me-21), 1.60(3H, s, Me-26), 1.60(3H, s, Me-27), 1.23(3H, s, Me-28), 1.02(3H, s, Me-29), 0.95(3H, s, Me-30), 5.19(1H, d, J=7.2, H-1'-20-Glc)

탄소 핵자기공명 스펙트럼(δ): 15.99, 16.29, 16.32, 17.36, 17.72, 18.73, 22.29, 23.14, 25.72, 26.60, 28.22, 28.65, 30.74, 30.91, 35.13, 36.13, 37.32, 39.37, 39.51, 40.03, 49.47, 50.27, 51.38, 51.56, 56.33, 62.86, 70.11, 71.62, 75.06, 78.01, 78.19, 79.25, 83.24, 98.20, 125.92, 130.85

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음의 실시예와 같다. 다만 이들 실시예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1>

진세노사이드 Rb₁1g을 0.1M 초산완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 3g을 첨가하여 37℃ 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 당류와 효소는 증류수로 세척하여 제거하고 반응생성물은 메탄올로 용출한후 농축시켜 컴파운드 K가 85% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다.

<실시예 2>

진세노사이드 Rb₂1g을 초산완충용액(pH 4.8)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 45℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 컴파운드 K가 85% 이상 함유된 반응생성물을 얻었다.

<실시예 3>

진세노사이드 Rc 1g을 인산완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 4g을 첨가하여 37℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출, 농축하여 분말상의 반응생성물 750㎎을 얻었다. 농축액은 실리카겔 컬럼크로마토그래피(클로로포름-메탄올-물=70:30:5)와 역상 RP-8 컬럼 크로마토그래피(85% 메탄올)로 컴파운드 K 425㎎을 얻었다.

<실시예 4>

진세노사이드 Rd 1g을 시트레이트 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제 5g을 첨가하여 50℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 증류수로 세척하고 메탄올로 용출시켜 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=87:13) 에 의해 컴파운드 K 478mg을 얻었다.

<실시예 5>

진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd의 동량 혼합물 1g을 시트레이트- 인산완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 4g을 첨가하여 50℃ 수욕조상에서 교반하면서 72시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출, 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=9:1)에 의해 컴파운드 K 455 mg을 얻었다.

<실시예 6>

다이올계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획 1g을 초산 완충용액(pH 5.0)에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 37℃의 수욕조상에서 교반하면서 48시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음 수포화 부탄올로 추출후, 감압 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=9:1)에 의해 컴파운드 K 326mg을 얻었다.

<실시예 7>

인삼 추출엑스 1g을 물에 용해시켜 전체를 50㎖로 정용한 다음 여기에 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제 3g을 첨가하여 37℃에서 48시간 반응시킨다. 반응액은 열수중에서 가열하여 효소를 불활성화시킨 다음 다이아이온 HP-20 수지를 충진한 컬럼에 흡착시킨 후 증류수로 세척하여 당류와 효소류를 제거하고 반응생성물은 메탄올로 용출시켜 농축한다. 농축액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=87:13)로 분리하여 컴파운드 K가 60% 이상 함유된 분말상 반응생성물을 얻었다.

본 발명은 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 인삼에 다량 함유되어 있는 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb_1,Rb₂, Rc, Rd 또는 이들의 혼합물과 효소적 방법으로 반응시켜 제조수율 75% 이상의 고수율로 컴파운드 K를 간단하게 대량으로 제조하는 데 있다.

Claims

인삼의 다이올계 사포닌을 수성용매 중에서 효소적으로 반응시켜 일반식(Ⅰ)로 표시되는 컴파운드 K의 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법

(Ⅰ)
제 1항에 있어서, 다이올계 사포닌은 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 또는 다이올계 사포닌 혼합물중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제1항에서, 다이올형 사포닌이 고려인삼, 삼칠인삼, 미국인삼, 죽절인삼, 히말라야인삼 또는 베트남인삼의 뿌리 또는 지상부로부터 추출 분리하여 얻은 인삼사포닌 혼합물 및 추출물의 하나에 함유된 것임을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제 1항에 있어서, 효소는 미생물 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제인 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제 1항 또는 제 4항에 있어서, 효소반응은 10∼50℃ 범위에서 진행됨을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제 1항에 있어서, 유기용매는 아세톤, 아세토니트릴, 디옥산, 디메틸설폭사이드 또는 저급 알콜 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제 1항에 있어서, 수성용매는 물 또는 시트레이트-인산의 완충용액중에서 선택된 어느 하나를 유기용매와 혼합시켜 pH 4∼8의 범위로 사용하는 것을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.
제 1항 또는 제 7항에 있어서, 유기용매는 수성용매의 중량을 기준으로 40% 이하로 사용됨을 특징으로 하는 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 K의 제조방법.