KR101802979B1

KR101802979B1 - 생물전환에 의한 진세노사이드 f1의 생산방법

Info

Publication number: KR101802979B1
Application number: KR1020150121941A
Authority: KR
Inventors: 최강덕; 임완택
Original assignee: 셀루스원 주식회사
Priority date: 2015-08-28
Filing date: 2015-08-28
Publication date: 2017-12-01
Also published as: KR20170025468A

Abstract

본 발명은 인삼 유래의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 함유하는 용액에 셀룰라아제를 첨가하고, 교반 반응시켜 진세노사이드 F1을 함유하는 생물전환 반응액을 얻는 단계를 포함하는 생물전환을 이용한 진세노사이드 F1의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 진세노사이드 F1에 관한 것이다.

Description

생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법{Mehod for producing ginsenoside F1 using bioconversion}

본 발명은 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 유래의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물(protopanaxatriol-type ginsenoside mixture; 이하 “PPTGM”으로 약칭함)을 함유하는 용액에 셀룰라아제를 첨가하고, 교반 반응시켜 진세노사이드 F1을 함유하는 생물전환 반응액을 얻는 단계를 포함하는 생물전환을 이용한 진세노사이드 F1의 생산방법 및 상기 방법에 의해 생산된 진세노사이드 F1에 관한 것이다.

인삼은 잘 알려진 약용 식물로서, 동아시아에서 수천년 동안 전통 의학으로 사용되어 왔다. 뿐만 아니라, 지난 수년 동안 서양에서도 유용하게 활용될 수 있음을 인정받았다 (비특허문헌 1 내지 3).

지난 많은 연구들은 인삼의 광범위한 약학적ㆍ치료적 유용성을 보여주고 잇는데, 진세노사이드는 인삼의 주요 성분으로, 항암성ㆍ항종양ㆍ항알레르기ㆍ항염증ㆍ항산과 효과를 반증하는 생물학적 약학적 기능이 밝혀져 있다 (비특허문헌 4 내지 10).

아글리콘(aglycon)과 담마란 골격(dammarane skeleton)의 구조에 기초하여, 진세노사이드는 프로토파낙시디올(PPD, protopanaxadiol), 프로토파낙사트리올(PPT, protopanaxatriol), 및 올레아네인(oleanane) 사포닌으로 구분되어 진다(비특허문헌 1 내지 3).

또한, 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 당 부분과 아글리콘 C-6 및 C-20에 글리코시드결합 (배당 결합, glycosidic bond)한다. 구강으로 인삼을 섭취한 후, 주요 진세노사이드는 가수분해되어 활성화된 작은 진세노사이드가 되며, 이는 인간의 장에서 분해되어 혈액으로 흡수된다.

그러므로, 총 진세노사이드의 80% 이상에 해당하는 대부분의 진세노사이드가 상당히 활성화된 진세노사이드로의 전환은 제약 산업에 상당한 영향을 미친다 (비특허문헌 4 및 5).

또한, 소량의 진세노사이드 F1은 한국 인삼에 저농도로 존재하고 있으며, 진세노사이드 Re와 Rg1은 장내 세균총에 의해 탈당화되어 혈액으로 흡수되고, 이는 에스트로겐 작용에 영향을 미친다 (비특허문헌 12).

상기 진세노사이드 F1은 B16세포 증식을 강하게 억제하는 항암 효과가 있다 (비특허문헌 13). 뿐만 아니라, 진세노사이드 F1은 항노화, 항산화 효과를 보이고, CYP3A4 활성을 경쟁적으로 억제하며, CYP2D6의 활성을 약하게 억제한다 (비특허문헌 14 및 15).

한편, 진세노사이드 F1은 미생물과 효소방법을 통하여 생산될 수 있다. 하나의 예로, 푸자리움 모닐리포르메 (Fusariummoniliforme var.sublutinas)는 베타 글루코시다아제 활성을 가지며, 상기 활성으로 진세노사이드 Rg1을 진세노사이드 F1으로 전환시킬 수 있다 (비특허문헌 16).

또 다른 예로, 페니실리움 데쿰벤스(Penicillium decumbens)에서 유래한 나린기나아제(naringinase)는 상업적으로 구매할 수 있으며 (비특허문헌 17), 이는 글루코스를 가수분해하는 능력을 가지고 있으며, C6 위치의 람노스 잔기(rhamnose moiety)가 진세노사이드 Re와 진세노사이드 Rg1로부터 진세노사이드 F1을 생산할 수 있게 된다.

그러나, 기술적인 스케일 업(scale-up)이나 공정 공학의 개발 없이, 단순한 효소 방법만 선행되었을 뿐으로서, 프로토파낙사트리올계 진세노사이드를 가수분해하는 몇몇의 재조합 효소는 구성되어 있지만 (비특허문헌 18 내지 22), 이들의 대부분은 각각의 진세노사이드 Re 또는 Rf1으로부터 Rg2(S)또는 Rh1(S)을 생성하는데 아글리콘의 C20 위치에 존재하는 글루코즈 잔기의 가수분해 능력을 가지고 있다.

이들 중에서, 두가지 효소는 프로토파낙사트리올계 아글리콘의 C6 위치에 존재하는 글루코즈 잔기를 가수분해하여 진세노사이드 F1를 생산할 수 있다고 알려져 있다 (비특허문헌 19 및 21).

진세노사이드 F1이 항노화, 항암성, 항산화 효과를 가지고 있음에도 불구하고, 고순도 진세노사이드 F1을 생산하는 것은 경제적인 유용성에 의해 제한을 받기 마련인데, 상기ㅘ 같은 종래기술들에 의하면, 진세노사이드 F1의 생산 비용이 높고, 대량 생산을 할 수 없는 문제점이 있었다.

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본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 진세노사이드 Re 와 Rg1을 진세노사이드 F1으로 변형시킬수 있도록 높은 활성을 지닌 셀룰라아제를 이용하여 진세노사이드 Re 및 Rg1을 포함하는 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물로부터 고순도의 진세노사이드 F1을 고수율로 생산할 수 있음을 알아 내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 생물전환에 의해 고순도의 진세노사이드 F1을 고수율로 생산할 수 있는 진세노사이드 F1의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 인삼으로부터 얻은 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 함유하는 용액에 Aspergillus niger 유래의 최적 pH가 4.8 내지 5.2이고, 최적 온도가 45℃ 내지 50℃인 셀룰라아제를 첨가하고, 교반 반응시켜 진세노사이드 F1을 함유하는 생물전환 반응액을 얻는 단계, (b) 상기 생물전환 반응액을 원심분리하는 단계, 및 (c) 상기 단계에 의해 형성된 침전물 및 상등액으로부터 진세노사이드 F1을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 생산된 진세노사이드 F1을 제공한다.

본 발명에 의하면, 셀룰라아제를 이용하여 인삼 유래의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 진세노사이드 F1으로 생물전환하기 때문에, 고순도, 고수율로 진세노사이드 F1을 대량 생산할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 셀룰라아제 KN에 의한 진세노사이드 생물전환을 박층크로마토그래피로 시간에 따라 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 상업효소 셀룰라아제 KN에 의해 진세노사이드 Re와 Rg1의 전환 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 진세노사이드 F1의 생산을 위한 PPTGM과 셀룰라아제 KN의 효과적 농도를 나타낸 것이다.
도 4는 셀룰라아제 KN에 의한 PPTGM의 생물전환 고성능액체크로마토그래피 분석결과를 나타낸 것으로서, 도 4의 A는 표준 진세노사이드, B는 진세노사이드 F1의 생산을 위한 기질(PPTGM), C는 셀룰라아제와 4시간 반응 후의 PPTGM, D는 셀룰라아제와 12시간 반응 후의 PPTGM, E는 셀룰라아제와 48시간 반응 후의 PPTGM, F는 실리카로 충진된 컬럼 크로마토그래피 후의 고순도 진세노사이드 F1을 나타낸 것이다.
도 5는 셀룰라아제 KN에 의한 진세노사이드 F1 생산 공정의 일 실시예를 나타낸 것이다.

본 발명은 (a) 인삼 유래의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 함유하는 용액에 Aspergillus niger 유래의 최적 pH가 4.8 내지 5.2이고, 최적 온도가 45℃ 내지 50℃인 셀룰라아제(cellulase)를 첨가하고, 교반 반응시켜 진세노사이드 F1을 함유하는 생물전환 반응액을 얻는 단계, (b) 상기 생물전환 반응액을 원심분리하는 단계, 및 (c) 상기 단계에 의해 형성된 침전물 및 상등액으로부터 진세노사이드 F1을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물(PPTGM)은 진세노사이드 Re 및 진세노사이드 Rg1을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물은 인삼 뿌리로부터 얻은 것일 수 있으나, 이에 한정되지 아니하고, 인삼 열매나 인삼 줄기로부터오도 얻을 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물의 농도는 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 바람직하게는 7 mg/mL 내지 13 mg/mL, 보다 바람직하게는 9 mg/mL 내지 11 mg/mL, 가장 바람직하게는 10 mg/mL일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 셀룰라아제는 Aspergillus niger 유래의 최적 pH가 4.8 내지 5.2, 바람직하게는 pH 4.9 내지 5.1, 가장 바람직하게는 pH 5.0이고, 최적 온도가 45℃ 내지 50℃일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물 용액 내의 싱기 셀룰라아제의 농도는 80 mg/mL 내지 120 mg/mL, 바람직하게는 90 mg/mL 내지 110 mg/mL, 가장 바람직하게는 110 mg/mL일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 교반 반응의 교반 속도는 100 rpm 내지 300 rpm, 바람직하게는 150 rpm 내지 250 rpm, 가장 바람직하게는 200 rpm일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 교반 반응의 반응 pH는 4.8 내지 5.2, 바람직하게는 4.9 내지 5.1, 가장 바람직하게는 5.0일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 교반 반응의 반응 온도는 48℃ 내지 52℃, 바람직하게는 49℃ 내지 51℃, 가장 바람직하게는 50℃일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 (a) 단계의 교반 반응의 반응 시간은 45시간 내지 50 시간, 바람직하게는 47시간 내지 49 시간, 가장 바람직하게는 48 시간일 수 있다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 침전물로부터 진세노사이드 F1의 분리는 유기 용매, 바람직하게는 탄소수 1-4의 알코올, 가장 바람직하게는 에탄올에 용해시켜 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 상등액으로부터 진세노사이드 F1의 분리는 컬럼 크로마토그래피, 예컨대 옥타데실실란(octadecylsilane)이 충진된 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 정제는 실리카가 충진된 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법에서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물로부터 진세노사이드 F1의 생산 수율은 25 %(w/w) 내지 30 %(w/w), 바람직하게는 25 %(w/w) 내지 27 %(w/w), 보다 바람직하게는 25.5 %(w/w) 내지 26.5 %(w/w)일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 생산된 진세노사이드 F1에 관한 것이다.

본 발명의 상기 진세노사이드 F1은 고순도, 바람직하게는 90% 내지 95%, 보다 바람직하게는 91% 내지 93%일 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

<실시예>

1. 실험 재료 및 실험 방법

1-1. 실험 재료

Rg1, Re, Rh1(S), F1, 프로토파낙사트리올을 포함하는 표준등급 진세노사이드를 Nanjing Zelang Medical Technology Co., Ltd.(난징, 중국)에서 구매하였다.

프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물(PPTGM)은 Panax ginseng C. A. Meyer종 인삼 4kg와 Panax quinquefolius종 인삼 1kg의 뿌리로부터 추출하였다.

인삼 뿌리 분말 5kg는 70% 에탄올 50L로 두 번 추출하였다. 추출물은 여과지로 거르고 난 후, 회전 증발기로 건조시켰다.

상기 건조하여 얻은 분말은 물에 용해시켜 다이아 이온 HP-20 수지(Diaion HP-20 resin, Tokyo, Mitsubishi Chemical)로 가득찬 유리 칼럼(400 mm L × 100 mm D)에 넣었다.

상기 다이아 이온 HP-20 수지로부터 유리당 분자와 원치 않는 친수성 화합물은 컬럼의 8배가 되는 물로 씻어주었다. 마지막으로 컬럼의 8배가 되는 에탄올(36%)로 녹여서 분리하였다.

에탄올 추출물을 진공내에서 증발시켜 건조되고 남은 잔여물은 진세노사이드 F1을 생산하기 위한 기질로 사용하였다.

고성능액체크로마토그래피(HPLC) 분석에 따르면, PPTGM은 대부분은 Re (245 mg/g), Rg1 (203 mg/g), Rb1 (32 mg/g), Rb2, (25 mg/g), Rb3 (53 mg/g), Rd (80 mg/g) 및 소량의 다른 진세노사이드로 구성되어 있고, 이는 50 mM 아세테이트 완충액(acetate buffer)에 녹여져 있으며, PPTGM은 최대 100 mg/mL까지 용해될 수 있다.

고성능액체크로마토그래피 등급의 메탄올과 아세토나이트릴은 SK Chemical Co., Ltd. (Seoul, Korea)로 부터 얻은 것이며, 이 연구에서 사용된 다른 화학물질은 분석등급이거나 그 이상이다.

1-2. 프로토파낙사트리올계 진세노사이드를 전환하는 효소의 스크리닝

PPTGM은 1% (w/v)에 해당하는 아세테이트 완충액(pH5.0) 500㎕에 희석될 수 있으며, 같은 부피의 효소를 혼합한 뒤 계속해서 실험을 진행하였다.

상기 효소는 Novozym 960 (Bagsvaerd, Novozyme), Viscozyme (Novozyme), Pectinex AFPL-4 (Novozyme), Pectinex Ultra SP-L (Novozyme), Fungamyl 800L (Novozyme) 및 Cellulase KN (0.2 g/mL, Kagawa, Kyowa Chemical)의 상업 효소이었다.

상기 PPTGM 용액과 효소의 혼합물은 50℃의 호기성 환경에서 150rpm으로 48시간 동안 흔들어 주었다.

그 결과물은 분석을 위한 전처리 후에 박층 크로마토그래피(TLC) 또는 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 일정한 간격으로 분석하였다.

1-3. 셀룰라아제 KN을 이용한 프로토파낙사트리올계 진세노사이드의 생물전환 활성

셀룰라아제 KN의 활성은 진세노사이드 Re와 Rg1이 전환시킬 수 있는 특이성과 선택성을 밝혀냄으로써 측정될 수 있으며, 이는 C6 위치에 부착하여 람노스나 글루코스 잔기를 분해할 수 있는 특이성과 선택성을 의미한다.

100mM 아세테이트 완충액 내의 효소 용액의 농도는 100mg/mL이며, 이는 같은 부피의 Re 및 Rg1 (100mM 아세테이트 완충액내의 농도 1mg/mL, pH 5.0) 용액과 50℃에서 반응한다.

그 결과물은 분석을 위한 전처리 후에 박층 크로마토그래피 또는 고성능 액체크로마토그래피를 통하여, 일정한 간격으로 분석하였다.

1-4. 효소와 기질의 농도를 기초로 생물전환 최적화

셀룰라아제 KN을 이용하여 PPTGM을 생물전환을 할 수 있는 최적의 조건을 알아내기 위하여, PPTGM의 기질 농도를 최대한 적합하게 조제하였다.

최종 효소 농도를 50 ~ 100 mg/mL로 고정하였고, PPTGM은 최종 기질 농도를 5, 10, 15 mg/mL로 맞추기 위하여, 아세테이트 완충액(pH 5.0)에 용해시켜 반응시켰다.

상기와 같은 6가지의 최적화된 반응은 200 rpm의 속도, 50℃의 온도, 1ml의 부피로 에펜도르프 튜브(2mL Eppendorf tube)에서 48시간 동안 이루어졌다.

그 결과물은 분석을 위한 전처리 후에 박층 크로마토그래피 또는 고성능 액체크로마토그래피를 통하여 일정한 간격으로 분석하였다.

1-5. 셀룰라아제 KN을 이용하여, PPTGM 스케일 업 생물전환

스케일 업 생물전환은 탱크형 반응기(10L, Biotron GX, Hanil Science Co., Seoul, Korea)에서 5L의 부피로, 200rpm 속도로, 48시간 동안 수행되었다. 상기 반응은 pH 5.0, 50℃의 조건에서 수행하였다.

상기 반응은 기질인 PPTGM(총 50g)의 마지막 농도가 10mg/mL가 되도록 될 때 시작하였고, 셀룰라아제 KN 500g을 추가하였다.

샘플은 주기적으로 모아, PPTGM으로부터 진세노사이드 F1가 생산했는지를 고성능 액체크로마토그래피를 통하여 분석하였다.

1-6. 진세노사이드 F1의 정제

PPTGM 5L와 셀룰라아제 KN 반응 혼합물을 4,000rpm 속도로, 20분간, 4℃로 원심 분리하였다 (Component R, Hanil Science Co Ltd., Korea).

상등액과 침전물에 있는 생물전환된 진세노사이드 F1은 효소, 염, 유리당을 제거하기 위한 각각의 과정을 수행하였다.

상등액에 있는 진세노사이드 F1은 octadecylsilane(ODS; ZEOprep 60 C₁₈, 40-63μm) 340g으로 가득차 있는 Biotage SNAP flash chromatography cartridge (180 × 70 φ mm; Biotage, Uppsala, Sweden)를 이용하여 분리하였다.

또한, 침전물은 95% 에탄올 용액 3L에 용해시켜 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)로 걸러내고, 진공에서 증발시켰다.

상등액과 침전물로부터 얻은 진세노사이드 분말은 미가공의 진세노사이드 F1을 의미하며, 이는 실리카 수지(230-400 mesh) 340g으로 가득찬 Biotage SNAP flash chromatography cartridge (180 ×70 φ mm; Biotage)로 정제하였다.

카트리지(cartridge)는 클로로포름으로 균형을 유지하게 하고, 미가공 진세노사이드 F1 분말 13.5g을 카트리지에 두 번 넣어 여과하였다.

용리는 클로로포름의 3 충진 부피(bed volumes, BVs)와 클로로 포름-메탄올(85:15, v/v)의 5 충진 부피로 수행하였고, 그 결과를 박층 크로마토그래피로 분석하였다.

용리제는 진공에서 증발시켰다. 그 결과로 얻은 분말을 100% 메탄올로 용해시켜 고성능액체크로마토그래피로 분석하였다.

1-7. 분석방법

1-7-1. 박층 크로마토그래피(TLC) 분석

박층크로마토그래피는 실리카 젤 플레이트(60F₂₅₄silica gel plates, Merck, Darmstadt, Germany)와 용매로 CHCl₃-CH₃OH-H₂O(65:35:10,lower phase)를 사용하여 수행하였다.

박층 크로마토그래피 플레이트 상의 스팟(spot)은 10% 황산(vol/vol,H₂SO₄)을 분무하고, 110℃에서 5분간 가열하여 시각화시킨 후, 표준 진세노사이드와 비교하여 동정할 수 있다.

1-7-2. 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 분석

진세노사이드(Rb1, Rd, F1, Rh1(S), F2, Rg1, Re, C-K, F1, 및 프로토파낙사트리올계)의 고성능 액체크로마토그래피 분석은 펌프(quaternary pump), 자동분사기, 단파장 유브이 검출기로 이루어진 고성능 액체크로마토그래피 시스템 및 피크 식별과 피크 면적(integration)을 위한 Younglin’s AutoChro 3000 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.

분리는 Prodigy octadecylsilane(2) C₁₈column(5μm, 150× 4.6-mm i.d.; Phenomenex, Torrance, CA, USA)과 guard column (5μm, 12.5× 4.6-mm i.d.; Eclipse X DB C₁₈)로 수행하였다. 또한, 이동상은 아세토나이트릴(A)과 물(B)을 사용하였다.

경사 용리법은 17% 용매 A와 83% 용매 B로 시작하고, 이어 다음과 같은 순서로 진행하였다.

용매 A 17~25%, 12~20분; 용매 A 25~32%, 20~30분; 용매 A 32~55%, 30~35분; 용매 A 55~60%, 35~40분; 용매 A 60~80%, 40~45분; 용매 A 80~100%, 45-50분; 용매 A 100%, 50~54분; 용매 A 100~17%, 54.0~54.1분; 용매 A 17%, 54.1~65분.

또한, 유량은 1.0 mL/min 이었으며, 25㎕㎕의 주입 용량을 흡광도 203nm로 모니터링하여 측정하였다.

2. 실험 결과

2-1. 진세노사이드 F1 생산에 가장 효과적인 효소의 선택

몇개의 효소를 2일 동안 이용하여 PPTGM으로부터 진세노사이드 F1의 생산을 조사하였다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 효소 처리 반응에서 생성된 진세노사이드 F1의 내용물은 고성능 액체크로마토그래피 분석을 사용하여 측정 가능한 전체의 진세노사이드 피크 면적 중 진세노사이드 F1의 비율에 의해 결정하였다.

상업 효소 Novozym 960, Viscozyme, Pectinex AFPL-4, Pectinex Ultra SP-L 및 Fungamyl 800 L (Novozyme)은 진세노사이드 Re 와 Rg1을 진세노사이드 F1으로 전환시키지 못하였다. 그러나, 셀룰라아제 KN은 진세노사이드 Re 와 Rg1을 진세노사이드 F1을 효과적으로 전환시켰다.

PPTGM은 피크 면적에 기초하여, 진세노사이드 Re는 27.3%, Rg1은 37.0% 함유하고 있었으며, 셀룰라아제 KN을 처리한 진세노사이드 F1은 피크 면적에 기초하여 57.9%에 달하였다.

이외에도, 전환되지 않은 진세노사이드 Re와 프로토파낙시디올계 진세노사이드 F2, 진세노사이드 Rb1, Rb3 및 Rd에서 유래한 컴파운드 K가 소량 검출되었다.

6가지 효소를 검사한 결과, 셀룰라아제 KN이 진세노사이드 F1을 가장 효과적으로 생산할 수 있음을 알 수 있었다.

2-2. 셀룰라아제 KN을 이용한 프로토파낙사트리올계 진세노사이드의 생물전환

두 가지의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 Re와 Rg1의 생물전환이 셀룰라아제 KN에 의해 일어나는지 확인하기 위하여, 박층 크로마토그래피를 통하여 일정한 간격으로 분석하였다.

기질로 Re(1.0 mg/mL)와 Rg1 (1.0 mg/mL)을 사용하였을 때, 48시간 내에 셀룰라아제 KN(100 mg/mL)에 의해 진세노사이드 F1으로 생물전환아 일어나는지를 박층크로마토그래피의 R_f값으로 나타내었다 (도 1 참조).

셀룰라아제 KN에 의한 진세노사이드 Re의 생물전환율은 진세노사이드 Rg1보다 낮았다.

셀룰라아제 KN에 의해 진세노사이드 Re로부터 진세노사이드 Rg1이 생성되었을 때, 반응 혼합물이 거의 남지 않게 진세노사이드 F1으로 신속하게 전환되엌T다.

따라서, 셀룰라아제 KN은 진세노사이드 Re의 C6 위치에서 람노스와 글루코스 잔기를 효과적으로 가수분해하여 진세노사이드 F1으로 생물전환시켰다는 결론을 내릴 수 있다 (도 2 참조).

셀룰라아제 KN은 셀룰라아제와 나린기나아제(naringinase)의 기능성을 제공한다. 이것은 일반적으로 셀룰라아제에는 셀로비오히드로라아제(cellobiohydrolase), 엔도글루카나아제(endoglucanase) 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase)의 세가지 셀룰로스 분해효소 그룹이 있음을 의미한다 (Trends in Biotechnology 1987;9:255261 참조).

베타 글루코시다아제는 프로토파낙사트리올계 진세노사이드의 C6 위치에서 베타-글루코시딕 연결(β-glucosidic linkage)를 가수분해시키는데 가장 적합한 효소로 여겨진다. 이는 진세노사이드 Rg1은 베타 글루코시다아제 작용에 의해 진세노사이드 F1으로 전환될 수 있음을 추정하게 한다.

게다가, 나린기나아제는 진세노사이드 Re의 아글리콘의 C6 수산기에 부착하여 -O-β-D-글루코스 (2←1)-α-L-람노스 연결에 대해 알파 람노시다아제(α-L-rhamnosidase) 활성을 가지는 것으로 여겨지며, 진세노사이드 Rg1의 C6에서 글루코시딕 연결에 대하여 베타 글루코시다아제 활성이 더 높은 것으로 판단된다.

상기의 결과들은 셀룰라아제 KN이 진세노사이드 Re와 Rg1을 가장 효과적으로 진세노사이드 F1으로 전환시킨다는 것을 의미한다.

2-3. PPTGM과 효소 농도의 최적화

생산 비용을 줄이기 위하여, 반응 용적과 효소농도를 감소시키는 적절한 기질 농도을 설정하고자, 마지막 농도로서 세가지의 기질농도 (5mg/mL, 10mg/mL, 15mg/mL)와 두가지의 조효소 농도 (50mg/mL, 100mg/mL)를 테스트에 사용하였다.

6가지 시험 환경에서, PPTGM과 생성물 F1을 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 시간별로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.

중간 기질 농도(5mg/mL)와 높은 조효소 농도(100mg/mL)의 시험 환경에서는, PPTGM이 24시간 이내에 완전히 진세노사이드 F1으로 전환되었다. 이 반응 속도는 PPTGM 5mg/mL과 조효소(crude enzyme) 50mg/mL일 때 보다 1.3배 빨랐고, PPTGM 10mg/mL과 조효소 100mg/mL일 때 보다 1.6배 빨랐다.

다른 3가지 반응 조건에서는 48시간 이내에 전환이 완전히 일어나지 않았다. 따라서, 상기 3가지 반응을 제외하고 다음 단계의 실험을 진행하였다.

적은 양의 효소와 완전한 Re의 전환의 장점을 제공하는 조건은 10mg/mL 기질 농도와 100mg/mL 조효소(crude enzyme) 농도일 때이며, 다음의 스케일 업 생물전환 실험에서도 상기 조건을 이용하였다.

2-4. 진세노사이드 F1 스케일 업 생산과 정제

효소 반응은 10mg/mL 농도로 갖는 PPTGM 기질에 대하여, 셀룰라아제 KN에 의해 발생하며, 셀룰라아제 KN은 진세노사이드 F1을 생산하기 위해서 5L의 최종농도 100mg/mL가 되게 조정하였다.

PPTGM의 진세노사이드 Re와 Rg1은 시간에 비례하여 점차적으로 변하며, 48시간 내에는 진세노사이드 Rg1의 98%와 진세노사이드 Re의 92%가 진세노사이드 F1으로 전환되었다.

진세노사이드의 생물전환은 도 4A, 도 4B, 도 4C, 도 4D 및 도 4E에 나타나는 바와 같이, 고성능 액체크로마토그래피 분석으로 잘 도식화되었다. 이는 이론적으로, PPTGM 50g의 진세노사이드 Re 12.3g중에 11.3g이, 그리고 진세노사이드 Rg1 10.2g중에 9.9g 전환되어, 진세노사이드 F1 17.9g 중에 17.1g을 생산할 수 있음을 의미한다.

진세노사이드 F1을 높은 순도로 얻기 위해서, 셀룰라아제 KN을 포함한 PPTGM의 5L 반응의 반응물에서부터 효소, 염, 유리당을 제거하였다.

진세노사이드 F1의 약 절반은 고체로 침전되고, 반면에 나머지 절반은 상등액에 용해되어 있었다. 95% 에탄올 용액 3L를 두번 사용하여서, 침전된 진세노사이드 F1을 두 번 완전히 용해시켰다.

상등액에 있는 진세노사이드 F1는 옥타데실실란(95% 메탄올 용리제 4L 가량)가 가득찬 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.

침전물과 상등액 분획의 용리제는 진공에서 증발시켰으며, 미가공 진세노사이드 F1의 26.9g 수율을 얻었다. 이때, 크로마토그래피 순도는 60.8± 1.1%이며, 이는 고성능액체크로마토그래피로 측정하였다.

실리카 컬럼을 이용하여 정제한 다음, 최종적으로 PPTGM 50g으로부터 고순도의 진세노사이드 F1(91.5± 1.1%) 13.0g을 최종적으로 얻었다(도 4F 참조).

PPTGM에는 주로 진세노사이드 Re와 Rg1으로 구성되어있으며, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rb3, Rd 및 Rg3(S)가 포함되어 있었다.

이러한 진세노사이드 중에, 진세노사이드 Re와 Rg1의 전체 몰량은 셀룰라아제 KN을 이용해 진세노사이드 F1으로 생물전환될 수 있으며, 이는 50g의 22.5g에 해당하는 24.3mmol이었다.

잔여물(27.5g)은 다른 계열의 진세노사이드와 알려지지 않은 불순물로 구성되어 있었고, 제조된 고순도의 진세노사이드 F1(13.0g)의 몰량은 18.6 mmol이었다.

이는 PPTGM의 진세노사이드 Re와 Rg1가 진세노사이드 F1으로 생물전환하는 전체 과정 동안의 회수율은 72.7%이었다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의하면, 셀룰라아제를 이용하여 인삼 유래의 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 진세노사이드 F1으로 생물전환하기 때문에, 고순도, 고수율로 진세노사이드 F1을 대량 생산할 수 있기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims

(a). 인삼 뿌리로부터 얻은 것으로 진세노사이드 Re 및 진세노사이드 Rg1을 포함하는 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물을 5 mg/mL 내지 15 mg/mL의 농도로 함유하는 용액에 Aspergillus niger 유래의 최적 pH가 4.8 내지 5.2이고, 최적 온도가 45℃ 내지 50℃인 셀룰라아제를 80 mg/mL 내지 120 mg/mL의 농도로 첨가하고, 100 rpm 내지 300 rpm의 교반속도, 반응 pH 4.8 내지 5.2, 반응 온도 48℃ 내지 52℃ 및 반응 시간 45시간 내지 50 시간의 조건으로 교반 반응시켜 진세노사이드 F1을 함유하는 생물전환 반응액을 얻는 단계;
(b). 상기 생물전환 반응액을 원심분리하는 단계; 및
(c). 상기 단계에 의해 형성된 침전물 및 상등액으로부터 진세노사이드 F1을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법.
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제1항에 있어서, 상기 셀룰라아제의 최적 pH가 5.0이고, 최적 온도가 45℃ 내지 50℃인 것을 특징으로 하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법.
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제1항에 있어서, 상기 침전물로부터 진세노사이드 F1의 분리는 유기 용매에 용해시켜 수행하고, 상기 상등액으로부터 진세노사이드 F1의 분리는 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 정제는 실리카가 충진된 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 프로토파낙사트리올계 진세노사이드 혼합물로부터 진세노사이드 F1의 생산 수율은 25 %(w/w) 내지 30 %(w/w)인 것을 특징으로 하는 생물전환에 의한 진세노사이드 F1의 생산방법.
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