KR20080028266A

KR20080028266A - 펙티네스 또는 비스코자임을 이용하여 인삼 사포닌으로부터장내 진세노사이드 대사물질인 화합물 케이, 화합물와이, 진세노사이드 에프 1 및 화합물 피지-2를 제조하는방법

Info

Publication number: KR20080028266A
Application number: KR1020070072024A
Authority: KR
Inventors: 안순철; 강주형; 김보혜; 이선이; 조효진; 유선녕; 김광연; 최성욱; 오현철; 이재권; 박천석; 백무열
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2007-07-19
Publication date: 2008-03-31

Abstract

본 발명은 다당류 분해효소를 인삼에 처리하여 유효성분인 화합물 케이와 진세노사이드의 장내 대사물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 미삼, 수삼, 홍삼, 인삼 엑기스에 다당류 분해효소인 펙티네스 (Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)을 처리하여 인삼 성분 중 사포닌의 배당체 성분을 분해하여 생리활성이 우수한 인삼의 주요 장내 대사산물인 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol (진세노사이드 F1, PG-1), PG-2, 20-O-[α-L-arabinopyranosyl-(16)-β-D- glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol (화합물 Y, PG-3) 및 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (화합물 K, PG-4)를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

인삼, 생물전환, 인삼 사포닌(진세노사이드), 펙티네스(Pectinex), 비스코자임(Viscozyme), 다당류 분해효소, 화합물 K, 진세노사이드 F1, 화합물 Y

Description

펙티네스 또는 비스코자임을 이용하여 인삼 사포닌으로부터 장내 진세노사이드 대사물질인 화합물 케이, 화합물 와이, 진세노사이드 에프 1 및 화합물 피지-2를 제조하는 방법 {Method for production of compound K, and compound Y, ginsenoside F1 from Ginseng Using Hydrolytic Enzymes, Pectinex and Viscozyme}

도 1은 인삼 조사포닌을 당가수분해 효소로 처리한 후 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피판, 클로로포름-메탄올-물(4:2:1, 아래층) 등의 전개조건에서 박층 크로마토그래피한 것으로 1: 인삼 조사포닌, 4: 화합물 K 표준물질이고, 2: Pectinex, 3: AMG, 5: Viscozyme 처리 후 분석한 것이다.

도 2는 인삼 조사포닌을 당가수분해 효소로 처리한 후 YMC C18 φ6.0×150 mm, 0-5 min, 30% 아세토나이트릴; 5-40 min, 30-80% 아세토나이트릴; 40-50 min, 80% 아세토나이트릴, 0.5 ml/min. 등의 조건에서 고속액체 크로마토그래피한 것으로 (A) 인삼 조사포닌이고, (B) AMG, (C) Pectinex, (D) Viscozyme 처리 후 분석한 것이다.

도 3은 Pectinex를 처리한 여러 종류의 인삼으로부터 전환되어 생성된 화합물 K의 함량을 설명한 것으로 RLG는 미삼, RG는 수삼, RGP는 홍삼 분말, GE는 인삼엑기스, RGE는 홍삼 엑기스를 나타낸 것이다.

도 4는 미삼을 Pectinex로 처리한 후 YMC C18 φ6.0×150 mm, 0-5 min, 30% 아세토나이트릴; 5-40 min, 30-80% 아세토나이트릴; 40-50 min, 80% 아세토나이트릴, 0.5 ml/min. 등의 조건에서 고속액체 크로마토그래피한 것으로 초록색(연한 것) 크로마토그램은 처리하지 않은 미삼이고 검은색(진한 것) 크로마토그램은 Pectinex 처리한 미삼이다.

도 5는 미삼에 Pectinex를 처리하여 전환되는 화합물 K의 생성량에 대한 pH(산도)의 영향을 나타낸 것이고,

도 6은 미삼에 Pectinex를 처리하여 전환되는 화합물 K의 생성량에 대한 온도의 영향을 나타낸 것이고,

도 7은 미삼에 Pectinex를 처리하여 전환되는 화합물 K의 생성량에 대한 미삼 농도의 영향을 나타낸 것이다.

도 8는 미삼에 Pectinex 또는 Viscozyme을 처리하여 전환되는 대사산물을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 것이다.

도 9는 미삼으로부터 분리한 전환물질 PG-1의 ¹³C NMR spectrum과 구조를 나타낸 것이고,

도 10은 미삼으로부터 분리한 전환물질 PG-3의 ¹³C NMR spectrum과 구조를 나타낸 것이고,

도 11은 미삼으로부터 분리한 전환물질 PG-4의 ¹³C NMR spectrum과 구조를 나타낸 것이다.

도 12는 미삼으로부터 분리한 전환물질 PG-1, PG-2, PG-3, PG-4의 전립선암 세포에 대한 항암활성을 나타낸 것이고,

도 13은 미삼으로부터 분리한 전환물질 PG-1, PG-2, PG-3, PG-4의 유방암 세포에 대한 항암활성을 나타낸 것이다.

본 발명은 다당류 분해효소를 인삼에 처리하여 유효성분인 화합물 케이와 진세노사이드의 장내 대사물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 미삼, 수삼, 홍삼, 인삼 엑기스에 다당류 분해효소인 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)을 처리하여 인삼 성분 중에서 함량이 많은 사포닌의 배당체 성분을 분해하여 생리활성이 우수한 인삼의 주요 장내 대사산물인 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol(진세노 사이드 F1, PG-1), PG-2(진세노사이드), 20-O-[α-L- arabinopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol (화합물 Y, PG-3) 및 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (화합물 K, PG-4)를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

인삼의 화학성분과 약리효능은 현대 과학적인 연구를 통해 사포닌이 주요 유효 성분으로 밝혀졌다(식품산업과 영양 8(2) : 10~23. 2003. Korean J. Food Sci. Technol. 33(2) : 166~172. 2001.). 인삼 특유의 약리활성 사포닌인 진세노사이드 유도체들은 담마란계의 트리터페노이드인 프로토파낙사디올과 프로토파낙사트리올 에 글루코오스, 람노스, 아라비노스 또는 자일로스와 같은 당류가 결합한 화합물로서 지금까지 30종의 사포닌이 인삼으로부터 분리되어 진세노사이드(ginsenoside)로 명명되었다. 인삼 사포닌은 무배당체에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당류의 수 또는 결합 위치에 따라 약리효능이 각각 다른 것으로 알려져 있다. 인삼의 사포닌 성분 중 프로토파낙사디올에 포도당이 하나 붙은 화합물 K, 진세노사이드 Rh2, 프로토파낙사트리올에 포도당이 하나 붙은 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 F1 등은 암세포증식 억제 등의 약리작용이 있는 것으로 알려져 있다.

최근 사포닌의 대사산물에 관한 연구가 진행되면서, 인삼 사포닌의 약효는 사포닌 자체라기보다는 장내세균의 대사산물이 생리활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나 이러한 진세노사이드는 고분자 구성성분과 연결되어 있어서 섭취 후 사람의 장내에 서식하는 특유의 미생물에 의해 분해되지 않고서는 체내 흡수가 되지 않아 약효가 없으므로 반드시 장내에 서식하는 미생물에 의해 저분자의 형태로 분해가 되어야 흡수된다 (Chem. Pharm. Bull. 39(2) : 400~404. 1991.). 사람의 배설물을 표본 추출하여 장내미생물의 진세노사이드 Rb1의 가수분해 능력을 실험한 결과, 표본 중 21%는 분해능력이 없는 것으로 나타났으며, 분해미생물을 보유한 것으로 나타난 70%도 진세노사이드를 분해하는 능력에 있어서 저마다 차이가 있음이 확인되었다(Planta Med. 64, 696-700. 1998). Akao와 Hasegawa 등은 경구 투여한 인삼의 진세노사이드는 장내 미생물에 의해 대사되어 체내에서 유익한 효능을 보이는데 이때 장내 미생물의 일종인 Prevotella oris가 관여하는 것으로 밝혀졌다(Hasegawa, H., Sung,J.H., Matsumiya.S., Uchiyama. M.(1996) Planta Medica 62,453-457). 장 내 미생물에 의한 진세노사이드로의 대사물질 중 생리활성이 가장 높은 물질은 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxadiol (화합물 K, IH901)이다. 인삼의 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, F2 등과 같은 프로토파낙사디올의 사포닌도 prodrugs으로서 장내 미생물에 의해 대사되어 최종산물 화합물 K로 전환된다. 화합물 K는 효능실험을 통하여 면역증강작용, 종양혈관신생억제작용 및 암세포침윤 억제작용 등 여러 가지 유효한 효능이 있는 것으로 밝혀졌으나, 인삼 자체에는 존재하지 않고, 체내 대사산물로만 얻을 수 있고 수율도 매우 낮아 대량으로 얻기가 어렵다.

유용한 인삼의 대사산물의 하나인 화합물 K의 제조방법으로서, Bifidobacterium K-103은 진세노사이드 Rc를 진세노사이드 Rd를 거쳐 화합물 K로 전환되고 Bifidobacterium K-506은 진세노사이드 Mb를 거쳐 화합물 K로 전환된다. 또한 Aspergillus niger, 쥐의 장내세균 및 사람 분변유래 장내세균을 이용한 방법이 보고되었다(한국특허 제178863호). 원광대학교 약학대학 김재백 교수팀에 의해서도 국내에서 처음으로 4년 근 인삼을 적정온도, pH, 수분에서 1개월 발효시킨 약리성분이 대폭 향상된 효삼을 개발하였다. 뿐만 아니라 일화 중앙연구소와 경희대학교 약학대학 김동현 교수팀에 의해 세계 최초로 유산균 발효 인삼이 개발되어 진세노사이드의 대사물질인 IH-901(화합물 K)의 암 전이 억제 능력과 건강 증진 작용을 확인하였다.

화합물 K를 제조하기 위한 종래의 방법으로, 토양균이나 사람 분변유래의 장내세균을 이용할 경우 상당 시간의 배양기간을 필요로 할 뿐 만 아니라 화합물 K외에도 다른 중간체들이 제조되며, 베타갈락토시다제, 나린지나제 및 락타아제 등의 효소를 반응시키는 경우에는 화합물 K와 진세노사이드 F1이 소량 생성되고 진세노사이드 Rh1과 Rh2가 주로 생성되는 문제점이 있다. 화합물 K의 제조방법으로서 다이올계 사포닌을 쥐에 경구투여한 후 대장에서 화합물 K를 분리한 경우가 있으나 수율이 매우 낮고 여러 가지 2차 대사산물이 생성되어 화합물 K를 고순도로 정제하는 데 어려움이 있다(Chem. Pharm. Bull. 38, 2859, Karikura 등, 1990년).

본 발명에서는 다당류 분해 효소를 이용하여 인삼의 배당체 형태를 무배당체 형태로 전환함으로써 장내 효과 개선 및 소화 흡수율 증대 뿐 만아니라 장내 미생물의 유무나 가수분해 능력의 차이로 인한 흡수와 효능의 차이를 제거할 수 있으며 생리활성이 증가되거나 새롭게 생합성된 대사산물 및 인삼의 진세노사이드 중 가장 강력한 성분으로 알려진 화합물 K와 같은 특정 성분이나 화합물 Y, 진세노사이드 F1, PG-2 등과 같은 성분으로 전환하여 수율을 향상할 수 있는 방법을 발명하였다. 인삼 사포닌을 효소적 방법으로 생물전환하여 인삼 사포닌 성분의 장내대사산물인 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxatriol(이하 “진세노사이드 F1”이라 한다), 20-O-[α-L- arabinopyranosy-(16)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol (이하 “화합물 Y”라 한다) 및 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxadiol (이하 “화합물 K”라 한다)를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 반응시간이 길고 수율이 낮은 장내세균이 아닌 당분해효소인 Pectinex 또는 Viscozyme을 인삼 분쇄액과 반응시키는 간단한 공정에 의해 고수율의 화합물 K, 화합물 Y, 진세노사이드 F1, PG-2를 제조할 수 있으며 조사포닌 혹은 정제 진세노사이드 혹은 인삼 추출물을 제조하지 않고 미삼, 수삼 자체를 분쇄한 현탁액 자체로부터 고수율로 제조할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 다당류 분해효소를 인삼에 처리하여 유효성분인 화합물 K와 진세노사이드의 장내 대사물질을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 미삼, 수삼, 홍삼, 인삼 엑기스에 다당류 분해효소인 Pectinex 또는 Viscozyme을 처리하여 인삼 성분 중에서 함량이 많은 사포닌의 배당체 성분을 분해하여 생리활성이 우수한 인삼의 주요 장내 대사산물인 진세노사이드 F1 (PG-1), PG-2 (진세노사이드), 화합물 Y (PG-3) 및 화합물 K (PG-4)를 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

화합물 K는 면역증강작용, 종양혈관신생 억제작용 및 세포침윤 억제작용이 있는 것으로 알려져 있는 장내 대사산물의 최종 생리활성물질이다. 사람 분변에서 유래한 장내세균을 이용할 경우, 상당한 시간의 배양기간을 필요로 하고 전환효소를 사용할 경우, 화합물 K와 진세노사이드 F1이 소량 생성되거나 화합물 K 외에 진세노사이드 Rh1과 Rh2와 같은 다른 중간체들이 제조되는 문제점이 있다. 또한 사포닌을 쥐에 경구투여한 후 대장에서 화합물 K를 분리한 경우, 수율이 매우 낮고 여러 가지 대사산물이 생성되어 화합물 K를 고순도로 정제하는 어려움이 있다. 따라서 본 발명에서는 인삼으로부터 여러 공정을 통해 조사포닌 혹은 정제 진세노사이드를 제 조하지 않고 미삼, 수삼 자체를 분쇄한 현탁액에 다당류 분해효소인 Pectinex 또는 Viscozyme을 반응시킴으로써 간단하게 고수율로 진세노사이드 F1(PG-1), PG-2 (진세노사이드), 화합물 Y (PG-3) 및 화합물 K (PG-4)를 얻을 수 있다.

본 발명은 인삼의 주요 장내대사산물인 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1을 제조하는 방법에 관한 것으로, 인삼을 분쇄한 현탁액에 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)을 반응시킴으로써 단기간 내에 아글리콘 C3 위치의 글루코스와 C20 위치의 글루코스를 용이하게 절단하여 고수율의 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1, PG-2를 생성한다.

본 발명에 의한 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1의 제조방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

[참고 예] 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1, PG-2의 제조방법

먼저 수삼, 미삼, 홍삼, 인삼 엑기스, 홍삼 엑기스 0.1∼20 중량%를 물에 첨가하여 분쇄하고 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)을 1∼10 중량% 첨가한 후, 20∼60℃에서 1∼72시간을 반응시킨 후, 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1, PG-2 등이 다량 함유된 반응액을 얻는다.

또한 반응온도는 효소의 불활성화가 일어나지 않는 온도 즉, 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)의 경우에는 20∼60℃, 바람직하게는 50∼55℃에서 24∼72시간, 바람직하게는 36∼72시간 교반하면서 반응한다.

반응액을 열수 추출 또는 메탄올로 추출하고 부탄올을 1:1로 넣고 3회 추출한 후 농축한 다음 실리카겔 칼럼크로마토그래피(에틸아세테이트, 클로로포름:메탄올:물=4:2:1)과 역상 RP-18 칼럼크로마토그래피(메탄올 : 물 = 6:4 ~ 8:2)에 의해 화합물 K, 화합물 Y, 진세노사이드 F1 및 PG-2 등을 얻는다.

또한, 본 발명은 분리한 화합물 K, 화합물 Y 및 진세노사이드 F1, PG-2 등의 전립선암 세포와 유방암 세포에 대한 항암활성에 관한 것을 포함한다.

이와 같은 효소적 방법에 의하면 종래에는 순수 분리한 진세노사이드나 조사포닌을 헤스페리디나제, 나린지나제, 펙티나제 등의 효소와 반응시켜 제조하였으나 본 방법에서는 반응 기질인 진세노사이드 등을 고순도로 분리해야 하는 어려운 과정을 거치지 않고 인삼 분쇄액 자체에 시판되는 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)와 반응시키면 단기간내에 화합물 K, 화합물 Y, 진세노사이드 F1 및 PG-2 등이 대량 생성되기 때문에 분리하기가 용이한 장점이 있다.

이와 같은 본 발명을 다음의 실시 예에 의거 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더욱 상세히 설명하겠지만, 본 발명이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시 예 1] 진세노사이드의 분석 조건

당분해 효소를 처리한 사포닌과 인삼의 메탄올 추출물을 박층크로마토그래피와 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 진세노사이드를 분석하였다. 박층크로마토그래피 조건은 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피판(Merck, Germany)를 사용하였으며 클로로포름-메탄올-물의 비율을 4:2:1로 하여 아래 유기용매층을 전개용매로 사용하였다. 전개 후, anisaldehyde sulfuric acid로 분무하고 110℃에서 약 10 분 간 가온하여 발색시켰다. 고속액체 크로마토그래피 조건은 시료의 농도를 1 mg/ml로 맞추어 5 ㎕씩 주입하였으며, 이동상으로 물과 아세토나이트릴을 부피비 30%로 하여 5분간 흘려주고, 40분까지는 80% 아세토나이트릴, 40분에서 50분까지는 80% 아세토나이트릴로 농도구배를 주며 유속은 0.5 ml/min로 하였으며 고정상으로는 YMC-Pack C18 column (6.0×150 mm, YMC Co., Japan)을 사용하였다.

[실시 예 2] 다당류 분해효소에 의한 인삼 사포닌의 전환

인삼의 조사포닌의 전환에 이용된 당분해효소인 AMG 300L, Pectinex 100L, Viscozyme은 Novo Nordisk 사의 제품을 이용하였다. 인삼 사포닌으로부터 효소반응을 진행시킨 후 효소 반응 전과 효소반응 후의 변화를 고속액체 크로마토그래피와 박층크로마토그래피를 이용하여 조사하였다. 부피비 5% 사포닌 용액에 AMG, Pectinex, Viscozyme을 각각 부피비 10%가 되게 첨가하여 50℃에서 150 rpm으로 3일간 진탕 배양한 결과, Pectinex를 처리한 사포닌에서 인삼 진세노사이드의 강력한 성분으로 알려진 화합물 K가 생성되는 것을 박층 크로마토그래피를 통해 확인할 수 있었고(도 1), 고속액체 크로마토그래피를 통하여 분석한 결과, 29분, 34분, 40분, 43분대에, 순차적으로 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2가 만들어진다 즉, 29분에 진세노사이드 F1(PG-1), 36분에 화합물 Y(PG-3), 40분에 화합물 K(PG-4), 43분에 PG-2의 새로운 전환물질이 생성됨을 확인할 수 있었다(도 2C). 한편, AMG를 처리한 사포닌에서는 새로운 전환물질 및 화합물 K는 생성되지 않았고(도 2B), Viscozyme을 처리한 사포닌에서는 화합물 K가 미량 생성 됨을 확인할 수 있었다(도 2D).

[실시 예 3] 펙티네스(Pectinex)를 이용한 인삼 진세노사이드의 전환

인삼내 진세노사이드를 화합물 K로 전환하기 위하여 5% 인삼엑기스, 5% 홍삼 엑기스, 5% 홍삼 분말, 10% 수삼, 5% 미삼에 5% Pectinex를 처리하여 50℃에서 150 rpm으로 3 일간 효소를 반응시킨 후, 75% 메탄올로 추출하고 부탄올로 추출하여 화합물 K로의 전환량을 고속액체 크로마토그래피로 비교 분석하였다(도 3). 0일, 1 일, 2 일, 3 일의 시료를 회수하여 분석한 결과, 0 일째 모든 시료에서의 화합물 K는 측정되지 않았으나, 인삼 시료 모두에서 1일부터 화합물 K가 최대로 생성되어 3일까지 유지되었다. 다른 인삼에 비해 5% 인삼 엑기스에의 화합물 K로의 전환율이 가장 높았으며, 5% 미삼, 5% 홍삼엑기스에서도 비슷한 전환율을 보였다. 그러나 10% 미삼, 5% 홍삼분말의 경우, 화합물 K로의 전환율이 낮았다(도 3). 따라서 Pectinex를 처리한 미삼에서의 새로운 전환물질이나 화합물 K를 분석하기 위하여 고속액체 크로마토그래피를 한 결과, 사포닌을 처리한 결과(도 2C)와 유사하게 26, 36, 40, 43 분에서 새로운 전환물질에 해당하는 peak를 확인하였다 (도 4).

[실시 예 4] 화합물 K로의 전환을 위한 펙티네스(Pectinex)의 최적 반응 조건 선정

미삼에 대한 Pectinex 처리 산도에 대한 영향을 조사하기 위하여, 5% 미삼에 5% Pectinex를 처리하고 산도 3, 5, 7, 9의 조건에서 50℃에서 150 rpm으로 각각 3 일간 배양하고 화합물 K로의 전환율을 알아보았다 (도 5). 산도 3과 산도 5에서는 1일째부터 화합물 K가 최대로 생성되기 시작하여 3일째까지 비슷하게 유지되었으며, 산도 7과 9에는 1일째 생성되기 시작하여 3일 째에 최대로 전환되었다. 또한 반응온도에 대한 영향을 조사하기 위하여 5% 미삼에 5% Pectinex를 처리하고 산도 5의 조건에서 25, 37, 50, 55℃에서 150 rpm으로 각각 3 일간 배양하고 화합물 K로의 전환율을 알아보았다 (도 6). 그 결과, 배양온도 50-55℃에서 최대로 전환되었다. 그러나 25, 37℃에서는 전환율이 낮았다. 따라서 미삼에 Pectinex를 처리하여 화합물 K로의 전환을 위해서는 50℃ 이상으로 열을 가하는 과정이 필요하다. 한편 효소 처리시 미삼의 함량에 대한 영향을 조사하기 위하여 0.2, 1.0, 5.0, 10.0, 15.0% 미삼에 5% Pectinex를 처리하고 산도 5, 50℃에서 150 rpm으로 각각 3 일간 배양하고 화합물 K로의 전환율을 알아보았다 (도 7). 그 결과, 1일째에는 5.0-15.0%에서 비슷한 전환율을 보였으나 2-3일째는 10.0-15.0%에서 최대로 화합물 K로 전환 되었다. 따라서 미삼으로부터 화합물 K로 최대 전환하기 위해서는 10.0-15.0% 미삼, 5% Pectinex, 산도 5, 50-55℃에서 150 rpm으로 각각 2-3 일간 반응 시키는 것이 최적이었다.

[실시 예 5] 펙티네스(Pectinex) 처리한 미삼으로부터 화합물 K의 분리

위의 결과를 토대로 다량의 화합물 K의 양을 분리하기 위하여 Pectinex로 2일간 처리한 미삼 300 g을 회수하였다. 상등액과 침전물로 나누고 침전물에 상등액과 동량의 메탄올을 처리하여 초음파 분쇄기로 1 시간동안 침전물을 분쇄하여 상등액만을 농축한 후, 부탄올 추출을 하여 30 g의 추출물을 얻었다. 실리카겔 컬럼크 로마토그래피를 위하여 추출물을 실리카겔에 흡착을 시킨 후, 클로로포름으로 충진된 실리카겔에 클로로포름 (200 ml)과 에틸아세테이트 (500 ml)를 용출시키고 클로로포름-메탄올-물의 비율을 부피비 4:2:1으로 하여 아래층만을 전개용매로 사용하였다. 박층 크로마토그래피한 결과, 클로로포름-메탄올-물 (4:2:1, 아래층)의 용매에서 Pectinex에 의해 전환된 화합물 K가 포함된 분획 18 g을 얻을 수 있었다. 이를 60% 메탄올로 충진된 역상 RP-18 컬럼크로마토그래피를 통하여 진세노사이드 F1 (PG-1)을 1.4 g, 70% 메탄올에서는 PG-2(미동정 진세노사이드)를 310 mg 분리하고 70-80% 메탄올에서는 화합물 Y (PG-3)와 화합물 K (PG-4)를 얻었다. PG-3와 PG-4 혼합물은 2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 통해 전개용매 클로로포름-메탄올(20:1-10:1, 부피비)의 조건에서 백색분말의 화합물 Y (PG-3, 250 mg)과 화합물 K (PG-4, 4.2 g)을 얻었다 (도 8).

[실시 예 6] 펙티네스(Pectinex) 처리를 통해 전환된 화합물 K의 동정

[실시 예 5]의 여러 가지 정제과정을 통해 얻은 분리물질 PGF-1, PG-2, PG-3, PG-4를 박층 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 핵자기공명법 등으로 기기분석하여 구조를 동정하였다.

분리 물질 PG-1(진세노사이드 F1)의 물리화학적 성상은 백색의 무정형 분말로서 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물(4:2:1, 아래층)로 전개하였을 때 Rf값이 0.65이고 RP-18 박층크로마토그래피를 이용하여 메탄올-물(8:2)로 전개하였을 때 Rf값이 0.60이다. 또한 탄소 핵자기공명 스펙트럼(δ) 은 16.5, 17.4, 17.5, 17.6, 17.8, 22.3, 23.2, 25.8, 26.7, 28.2, 30.8, 31.0, 32.0, 36.2, 39.4, 39.4, 40.4, 41.2, 47.5, 49.2, 49.9, 51.4, 51.6, 61.8, 63.0, 67.6, 70.2, 71.7, 75.1, 78.3, 78.5, 79.2, 83.3, 98.3, 126, 131 ppm에서 signal을 보여 PG-1은 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxatriol (진세노사이드 F1)으로 동정되었다(도 9).

분리 물질 PG-3(화합물 Y)의 물리화학적 성상은 백색의 무정형 분말로서 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물(4:2:1, 아래층)로 전개하였을 때 Rf값이 0.50이고 RP-18 박층크로마토그래피를 이용하여 메탄올-물(8:2)로 전개하였을 때 Rf값이 0.35이다. 또한 탄소 핵자기공명 스펙트럼(δ)은 16.1, 16.3, 16.3, 17.4, 17.9, 18.8, 22.3, 23.2, 25.8, 26.6, 28.3, 28.7, 30.7, 30.8, 35.1, 36.2, 37.4, 39.4, 39.6, 40.1, 49.5, 50.3, 51.4, 51.7, 56.4, 65.6, 68.6, 69.2, 70.2, 71.8, 72.1, 74.1, 74.9, 76.7, 78.1, 79.3, 83.5, 98.1, 104.78, 126.0, 131.1 ppm에서 signal을 보여 PG-3는 20-O-[α-L-arabinopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranosyl]-20(S)-protopanaxadiol (화합물 Y)으로 동정되었다(도 10).

분리 물질 PG-4(화합물 K)의 물리화학적 성상은 백색의 무정형 분말로서 키젤겔 60 F254 박층크로마토그래피를 이용하여 클로로포름-메탄올-물(4:2:1, 아래층)로 전개하였을 때 Rf값이 0.70이고 RP-18 박층크로마토그래피를 이용하여 메탄올-물(8:2)로 전개하였을 때 Rf값이 0.30이다. 또한 탄소 핵자기공명 스펙트럼(δ)은 115.9, 16.2, 16.3, 17.3, 17.6, 18.7, 22.2, 23.1, 25.6, 26.5, 28.2, 28.6, 30.7, 30.9, 35.1, 36.1, 37.2, 39.3, 39.5, 40.0, 49.4, 50.2, 51.3, 51.5, 56.2, 62.8, 70.0, 71.6, 75.1, 77.9, 78.2, 79.2, 83.1, 98.1, 125.9, 130.8 ppm에서 signal을 보여 PG-4는 20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol (화합물 K)으로 동정되었다(도 11).

[실시 예 7] 전환물질의 생리활성 분석

인삼의 대사산물은 항암활성을 포함한 여러 가지 생리활성이 보고되었으며 주요 생리활성 성분으로는 사포닌이 알려져 있다. Pectinex에 의해 전환된 미삼, 분리 정제한 전환물질 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2의 전립선 암세포인 PC-3 세포(도 12)와 유방암 세포인 MCF-7 세포(도 13)에서의 항암 활성을 분석한 결과, 전환된 미삼 추출물, 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2 등이 PC-3 세포와 MCF-7 세포에 대하여 세포독성을 보였다. 따라서 전환된 미삼에서 항암활성을 나타내는 인삼 성분으로 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2인 것으로 밝혀졌으며 그 중, 화합물 K로 동정된 PG-4의 경우 농도 의존적으로 가장 높은 항암활성을 보였다.

다양한 종류의 다당류 분해 효소를 이용하여 인삼의 배당체 형태를 무배당체 형태로 전환함으로써 장내 효과 개선 및 소화 흡수율 증대 뿐 만아니라 장내 미생물의 유무나 가수분해 능력의 차이로 인한 흡수와 효능의 차이를 제거할 수 있으며 생리활성이 증가되거나 새롭게 생합성된 대사산물 및 인삼의 진세노사이드 중 가장 강력한 성분으로 알려진 화합물 K와 같은 특정 성분이나 화합물 Y, 진세노사이드 F1, PG-2 등과 같은 성분으로 전환하여 수율을 향상할 수 있는 방법을 발명하였다.

Claims

수삼, 미삼, 인삼, 홍삼 중에서 선택된 어느 하나를 물에 첨가하여, 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)과 반응시킴으로써, YMC-Pack C18 컬럼(6.0×150 mm, YMC Co., Japan)을 사용하여, 5 분 동안, 30% 아세토나이트릴;, 5~40 분 동안, 30-80% 아세토나이트릴;, 40~50 분 동안, 80% 아세토나이트릴로 농도구배를 주며, 유속은 0.5 ml/min의 조건에서 고속액체 크로마토그래피하여 29분, 36분, 40분, 43분에 순차적으로 나타나는 진세노사이드 F1(PG-1), 화합물 Y(PG-3), 화합물 K(PG-4), PG-2를 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 원료인 수삼, 미삼, 인삼, 홍삼 중에서 선택된 어느 하나를 0.1∼20 중량%로 물에 첨가하여 분쇄하는 분쇄과정(1)과, 상기 분쇄된 분쇄액에 펙티네스(Pectinex) 또는 비스코자임(Viscozyme)을 1∼10 중량% 첨가한 후, 50∼55℃에서 150 rpm으로 36∼72시간 교반하면서 반응시키는 효소 반응과정(2)과, 효소 반응과정(2)후의 반응액을 열수 추출 또는 메탄올로 추출하는 추출과정(3)과, 상기 추출(3)된 반응액에 대하여, 부탄올을 1:1로 넣고, 3회 추출한 후, 농축하는 농축과정(4)과, 농축(4)된 농축액을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(에틸아세테이트, 클로로포름:메탄올:물=4:2:1)에 의해 화합물 K 과, 60%~80% 메탄올로 충진된 역상 RP-18 칼럼크로마토그래피(메탄올 : 물 = 6:4 ~ 8:2)에 의해 진세노사이드 F1 및 PG-2, 화합물 Y를 제조하는 방법.
제 2항의 방법에 의하여 진세노사이드 F1, 화합물 Y, 화합물 K, PG-2가 제조되어지는 것을 특징으로 하는 화합물
제 3항에 있어서, 진세노사이드 F1, 화합물 Y, 화합물 K, PG-2의 화합물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 항암활성의 효능을 가진 것을 특징으로 하는 항암제.