CN112315968B - 一种富含稀有人参皂苷的人参叶产品 - Google Patents

一种富含稀有人参皂苷的人参叶产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种富含稀有人参皂苷的产品、制备方法和用途。该产品以人参叶为原料，其中稀有人参皂苷含量高，基本不含常见人参皂苷。制备方法简单、无需使用有机溶剂、无溶剂残留。同时还提供一种具有优异抗肿瘤效果的稀有人参皂苷组合物。

Description

一种富含稀有人参皂苷的人参叶产品
技术领域
本发明涉及一种以人参叶为原料制备的产品，特别是一种富集稀有人参皂苷的人参叶产品。
背景技术
中药人参叶是五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥叶。秋季采收，晾干或烘干。中药人参叶具有补气，益肺，祛暑，生津的功能。常用于气虚咳嗽，暑热烦躁，津伤口渴，头目不清，四肢倦乏等症。人参皂苷是人参叶中最主要的化学成分。
人参皂苷分为常见人参皂苷和稀有人参皂苷两大类。
常见人参皂苷一般是指人参属植物中自然存在且含量相对较高的人参皂苷，主要包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Re等。
稀有人参皂苷一般是指人参属植物中不存在或含量非常低的人参皂苷，主要包括人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3、PPD、PPT等。这些人参皂苷一般都是常见人参皂苷的降解产物。
人参叶中主要含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Re、F1、F2、F3、Fe、F5等常见人参皂苷，其中三醇组人参皂苷Rg1和Re的含量最高，二醇组人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd的含量较高，其中最高的是人参皂苷Rd，人参皂苷Rb3的含量很低。
用一般提取方法如冷浸法、热浸法、超声波提取法和回流法等提取方法提取人参叶所得到的提取物中主要含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Re、F1、F2、F3、Fe、F5等常见人参皂苷，基本不含人参皂苷20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3等稀有人参皂苷，即使能够检测到一些稀有人参皂苷，其含量也非常低。
大量研究表明，相对于高含量的常见人参皂苷，稀有人参皂苷往往具有更好的药理学活性。比如说稀有人参皂苷的抗肿瘤及提高记忆力等活性强于常见人参皂苷，稀有人参皂苷的市场价格也远远高于常见人参皂苷，因此制备稀有人参皂苷具有重要意义。如何开发出20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3等稀有人参皂苷含量较高的人参属植物产品或提取物具有重要的研究价值和广泛的应用前景。
2000年，我国已经批准人参皂苷Rg3为处方药，2006年，我国研发的人参皂苷Rh2药品也已批准上市。但在稀有人参皂苷的产业化方面仍处于起步阶段，国内产业化生产高纯度人参皂苷单体的企业严重不足，具备稀有人参皂苷产业化生产能力的企业更少。主要原因是：由于稀有人参皂苷为人参皂苷的次级代谢产物，在人参属植物的提取物中含量非常低，分离工艺复杂，收率低，只能通过诸如化学反应、生物转化等手段获得这些皂苷。未来抢先具备产业化生产稀有人参皂苷能力的企业必然具有市场话语权。只有积极开展稀有人参皂苷的转化研究才能对大规模产业化制备稀有人参皂苷提供必要的技术支撑。
人参皂苷的转化方法主要包括化学法、微生物转化法和酶法。微生物法和酶法因其环境友好、专一性强、转化效率高等优点被科研人员广泛使用。
化学法：由于人参皂苷连接的糖基链不稳定，在遇酸或碱时糖苷键会发生断裂。在较温和的条件下，人参皂苷的糖苷键依次断裂，得到相应的次生人参皂苷，但若是水解反应的条件过于剧烈，例如使用硫酸或盐酸等强酸作为反应试剂时，人参皂苷的糖链部分会发生完全水解，糖苷键会全部断裂得到人参皂苷元-原人参二醇甚至会得到苷元的结构发生改变了的产物-人参二醇。郭迎迎等将人参皂苷Rd溶解于pH为2.0的甲酸溶液中，60℃水浴加热5h，利用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术对人参皂苷Rd酸水解产物进行分离鉴定，通过水解产物的鉴定推断了人参皂苷Rd的化学转化方式。宋长春等将西洋参茎叶总皂苷利用氢氧化钠进行碱水解，并辅之以乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析以及重结晶等方法，从而转化得到了纯度较高的人参皂苷Rh1和Rh2。化学转化法获得稀有人参皂苷存在反应条件难以控制、产物复杂、污染环境等弊端。
微生物转化法：微生物转化人参皂苷是指利用微生物在适宜的条件下，将底物经过特殊的代谢途径转化为目标产物的过程。近年来，利用微生物转化人参皂苷而提高其药理活性越来越受到人们的关注。利用微生物法对人参皂苷的糖基侧链进行修饰，能够获得多种稀有人参皂苷单体。自1987至今已经对89种天然来源的人参皂苷单体进行了生物转化的研究。蔡小雨等通过药用真菌发酵，显著提高了西洋参总皂苷中稀有人参皂苷的含量，稀有人参皂苷总皂苷含量增加了20-150％，稀有人参皂苷单体F1、C-K和Rg2等皂苷含量也有明显升高。明有山等筛选出一株霉菌，水解人参皂苷Re生成Rg1，经过制备柱分离纯化得到纯度为81.98％的人参皂苷Rg1，产率为71.83％。于珊珊等从土壤中筛选出了一种TH-20菌株，能够同时转化二醇型人参皂苷和三醇型人参皂苷，可分别将Rb1、Re和Rg1转化为Rd、Rg2和PPT。金艳等从橙汁中分离到的菌株CZ2能够转化人参皂苷Rb1生成F2和Gyp-XVII。张丽娜等以西洋参提取物为底物进行微生物转化人参皂苷研究，利用高效液相色谱(HPLC)法对人参皂苷Re及其发酵产物进行分析，结果表明，高效菌株S329可以将人参皂苷Re转化人参皂苷Rh1，转化率为27.65％。Cui Lei等利用内生菌JG09将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1转化为相应稀有人参皂苷F2、C-K和Rh1，人参皂苷F2和C-K的最大转化率分别可达到94.53％和66.34％。微生物转化法具有操作简单，条件温和，人参皂苷的转化效率高，无需提纯粗酶和不会带来二次污染等优点。但也存在选择性差、微生物不易获得且有些微生物不可以应用到食品工业等缺点。
酶转化法：由于酶法具有专一性强、反应条件温和、转化效率高、无污染等优点，在人参皂苷的结构修饰和代谢研究中被认为是最有效的工具。利用糖苷酶对糖链进行结构修饰来改善化合物的生物活性，以满足医药行业的发展，也是目前人参皂苷研究的重点。Shin等发现热解纤维菌中的葡萄糖苷水解酶能够水解皂苷C-20位外侧的L-阿拉伯糖和D-葡萄糖，因此，含有L-阿拉伯糖的人参皂苷Rc可以通过这种酶转化成C-K。童庆宣等利用一种蜗牛酶，转化三七二醇组人参皂苷制备稀有人参皂苷C-K，经硅胶柱分离得到纯度高于98％的人参皂苷C-K。王宇等利用糖苷酶对原人参三醇型人参皂苷进行转化，制备了稀有人参皂苷F1和Rh1。以人参皂苷Rb2、Rb3和Rc为底物，对其C-3位和C-20位进行修饰，能够获得稀有人参皂苷Rg3、Rh2、F2和PPD等产物。这些稀有人参皂苷能够进行大量制备，其药理活性也较为清晰。但是酶法存在对温度敏感，容易失活，对反应条件具有较高要求等缺陷。
更为重要的是上述三种方法中无论是化学法、微生物法还是酶法，获得的是皂苷元结构未发生改变的次级人参皂苷，主要是20(S)/R-Rg2、20(S)/R-Rh1、20(S)/R-Rh2、20(S)/R-Rg3、PPD、PPT、C-K、C-Y等，并不能获得人参皂苷的皂苷元结构发生改变了的Δ20(21)-和Δ20(22)稀有人参皂苷Rg6、F4、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rk2、Rh3等稀有人参皂苷。
通过文献检索还可以发现，通过长时间加热或高温高压加热人参属植物可以获得同时含有常见人参皂苷和稀有人参皂苷产品，但是转化率低，其中稀有人参皂苷总含量并不高，总含量最高的仍然是常见人参皂苷。
目前把人参叶当做中药材人参叶使用外，其最大的用途就是用来制备人参叶提取物或人参叶总皂苷。最常用的人参叶提取物的制备方法是将人参叶用水煎煮或用乙醇水回流提取，过滤，提取液减压回收溶剂，真空干燥既得；而最常用的人参叶总皂苷的制备方法是将人参叶用水煎煮提取，过滤，提取液过大孔吸附树脂吸附，乙醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂，真空干燥既得。桂明玉等在中国专利(申请号200610093612.5)中提出的利用大孔吸附树脂纯化人参叶提取物的方法，可以获得由人参皂苷F1、Rg2、F2、Fe、Rd、Rb2、Rc、Rb1和Rb3组成的提取物；金永日等在中国专利(申请号200610093607.4)中提出的用氧化铝柱色谱纯化人参叶提取物的方法，可以获得人参皂苷F1、F2、Fe、Rg1、Rg2、Re、Rd、Rc、Rb1、Rb2和Rb3；金永日等在中国专利(申请号200610093603.6)提出了一种从人参叶中提取分离F组人参皂苷的方法，利用大孔吸附树脂柱色谱纯化可以获得含有人参皂苷F1、F2、Fe和Rg2的提取物；桂明玉等在中国专利(申请号200610093615.9)提出了从人参叶中制备人参皂苷单体的方法，利用氧化铝柱、硅胶柱及ODS柱层析法可以获得人参皂苷F1、F2、Fe、Rg2、Rg1、Rd、Rc、Rb3、Rb2和Rb1单体。所述的方法均是利用柱色谱等方法对利用常规方法提取的人参叶提取物进行纯化，获得分组皂苷或单体皂苷，所述提取物中的化合物均为人参皂苷F1、F2、Fe、Rg2、Rg1、Rd、Rc、Rb3、Rb2和Rb1等常见人参皂苷，并不能增加提取物中人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3等稀有人参皂苷的含量。
现有技术中急需一种简便、容易实施、污染小、有机溶剂使用少、溶剂残留少、纯天然的人参叶加工方法，其可以增加产品中稀有人参皂苷的含量，有效利用人参叶。
发明内容
现有技术中的人参叶产品除了中药材人参叶外，就是人参叶提取物或人参叶总皂苷。无论是人参叶提取物还是人参叶总皂苷均离不开用水或乙醇水对人参叶进行提取，过滤，弃去药渣，提取液直接减压回收溶剂获得人参叶提取物，或者水提取液直接过大孔吸附树脂吸附(乙醇提取液减压回收乙醇后过大孔吸附树脂吸附)，乙醇洗脱，洗脱液减压回收乙醇后获得人参叶总皂苷。在这个过程中提取过的人参叶药渣(残渣)则当做废物弃掉。
本课题组长期从事人参叶化学成分的提取、分离、结构鉴定，单体及有效部位的制备及其活性筛选等研究工作。在研究以水为溶剂回流提取人参叶中的人参皂苷的最佳提取工艺时，意外发现，随着加热回流时间的延长，回流初期人参叶(药渣)中的常见人参皂苷含量逐渐降低，与此同步，水提取液中的常见人参皂苷的含量也逐渐升高。但是随着加热回流时间的进一步延长，开始出现水提取液中的常见人参皂苷的含量不升反降的反常现象。进一步的研究更意外地发现随着加热回流时间的延长，水液和药渣中开始出现稀有人参皂苷。再进一步的研究发现，随着加热回流时间的延长，药渣中的稀有人参皂苷含量不断增加，直至达到最大值，然后随着加热回流时间的继续延长其值在最大值附近上下小幅波动，此时药渣中已经基本检测不到常见人参皂苷，水液中不仅基本检测不到常见人参皂苷，也基本检测不到稀有人参皂苷。
比如说将人参叶常压下加热回流至48小时后，水液(水提取液)和药渣中基本不含常见人参皂苷，药渣中的稀有人参皂苷从无到有而且含量很高，可以达到9％，以Rg3、Rh1、Rh2为例，可以达到1％以上。
上述稀有人参皂苷包括20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，常见人参皂苷包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。
本申请提供了一种以人参叶为原料制备的产品，包含比天然人参叶具有更高含量的稀有人参皂苷，基本不含有常见人参皂苷。
所述产品优选的为药渣。
上述产品中包括15种稀有人参皂苷中的一种或多种，具体的可以为20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，上述产品中基本不含有常见人参皂苷，包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。
优选的稀有人参皂苷的总含量高于5％、7％、8％、或9％，优选的为高于7％或9％，最优选的为高于10％或13％。
优选的稀有人参皂苷中Rg3含量高于0.8％，更优选的高于1％，最优选高于1.5％或1.8％。
优选的稀有人参皂苷中Rh1含量高于0.8％，更优选的高于1％，最优选高于1.4％或1.6％或1.8％。
优选的稀有人参皂苷中Rh2含量高于0.5％，更优选的高于0.7％，最优选高于0.8％、0.9％或1.0％。
优选的稀有人参皂苷中Rk1+Rg5总量高于0.8％，更优选的高于1％，最优选高于1.2％或1.3％。
优选的稀有人参皂苷中Rg6+F4总含量高于0.8％，更优选的高于1％，最优选高于1.2％、1.4％或1.5％。
优选的常见人参皂苷总含量低于1％，更优选的低于0.8％或0.6％，最优选的低于0.4％、0.3％、0.2％或0.1％。
优选的常见人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3、Rd各自的含量低于0.5％，更优选的低于0.4％或0.3％，最优选的低于0.2％、0.1％或0.05％。
本申请还涉及一种制备高含量稀有人参皂苷的产品的制备方法，其制备方法为以下的任一一种：
A：将人参叶粉碎，加入适量水，在常压下加热回流36小时以上，优选的为40小时、60小时、72小时、84小时、96小时108小时或120小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；
B：将人参叶粉碎，加入适量水，高温高压下煎煮1小时以上、2小时以上、3小时以上，4小时以上，5小时以上，优选的为6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上、14小时以上、16小时以上、18小时以上、20小时以上、22小时以上、24小时以上、28小时以上、30小时以上、32小时以上、34小时以上、36小时以上、38小时以上、40小时以上、42小时以上、44小时以上、48小时以上或者50小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品。
所述的高温为100℃以上，优选的为不低于110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃或150℃。
在制备方法A中，液料比可以为(30-5):1，优选的为(25-8):1，更优选的为(20-9):1或(15-10):1，优选为10:1。
在制备方法B中，液料比可以为(30-5):1，优选的为(25-6):1，更优选的为(20-7):1或(20-10):1，优选为20:1。
在制备方法A中，优选的为将人参先用水浸泡；更优选的为将人参浸泡6小时以上、8小时以上、10小时以上、12小时以上或24小时以上，然后进行加热回流；同时煎煮结束后趁热过滤，最优选的为煎煮结束后立即趁热过滤。
在制备方法B中，优选的为先将水加热后投料，优选的为先将水加热至60℃以上后投料，更至优选的为先将水加热至90℃后加料；最优选的为先将水加热至100℃后加料。同时煎煮结束后趁热过滤，最优选的为煎煮结束后立即趁热过滤。
所述药渣中20(S)-Rg2的含量范围为0.3％-1.8％；20(S)-Rh1含量范围为0.5％-1.5％；20(R)-Rh1含量范围为0.4％-1％；Rg6含量范围为0.4％-0.8％；F4含量范围为0.6％-1.5％；Rk3含量范围为0.25％-1％；Rh4含量范围为0.3％-1.5％；20(S)-Rg3含量范围为0.5％-1.5％；20(R)-Rg3含量范围为0.3％-1％；Rk1含量范围为0.3％-0.8％；Rg5含量范围为0.1％-1％；20(S)-Rh2含量范围为0.15％-1％；20(R)-Rh2含量范围为0.1％-1％；Rk2含量范围为0.1％-0.5％；Rh3含量范围为0.5％-1％。
任选的对药渣进行进一步制备，可以为粉剂、散剂、饮片、糖浆、口服液、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、缓释剂、速释剂、控释剂、注射液、注射粉针剂、贴剂、栓剂、滴剂。
任选的对药渣进一步地有机溶剂或含水有机溶剂进行提取，得到具有高含量稀有人参皂苷的提取物。优选的提取物中含有15种稀有人参皂苷，具体的可以为20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，稀有人参皂苷的总含量超过15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选的超过50％。优选的，其中Rg3的含量不低于4％、5％、7％或8％；和/或Rh2的含量不低于4％、5％、7％或8％；和/或Rh1含量不低于5％或6％；和/或F4不低于3％或4％；和/或Rh2不低于6％或者7％；和/或Rg3+Rh2的含量和不低于12％、13％或14％；和/或Rk1+Rg5的含量和不低于3％、4％或5％；和/或Rg6+F4的含量和不低于6％或7％。
优选的，提取物中稀有人参皂苷的含量超过7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，常见人参皂苷的含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、或0.1％
更优选的，提取物中基本不含有常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。常见人参皂苷的含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。更优选的，低于0.8％、0.6％、0.5％、或0.1％。
所述有机溶剂可以为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、丙酮。
所述提取物中20(S)-Rg2的含量范围为1％-5％；20(S)-Rh1含量范围为2％-5％；20(R)-Rh1含量范围为1.5％-4％；Rg6含量范围为1.5％-4％；F4含量范围为3％-5％；Rk3含量范围为1％-3％；Rh4含量范围为1.5％-4％；20(S)-Rg3含量范围为2％-6％；20(R)-Rg3含量范围为1.5％-5％；Rk1含量范围为0.5％-3.5％；Rg5含量范围为1％-5％；20(S)-Rh2含量范围为2％-6％；20(R)-Rh2含量范围为2％-6％；Rk2含量范围为0.5％-3％；Rh3含量范围为1％-4％。
本申请还提供了一种组合物，该组合物中包含稀有人参皂苷，优选的，该组合物具有协同抗肿瘤活性。
所述稀有人参皂苷包含Rg3和Rg5的组合物，其重量比为(1-20)：(1-20)，优选的为(1-10)：(1-10)；(5-8.5)：(1.5-4)；或(3-6):(1-2)。
所述稀有人参皂苷包含F4和Rh2的组合物，其重量比为(1-100)：(1-100)，优选的为(1-10)：(10-100)、(10-100)：(1-10)、(1-10)：(10-1)、(1-100)：(1-10)；最优选的为10:1、1:1或1:10；更优选的为(1-1.5)：(1-1.5)或(4.1-4.9)：(5-8)。
所述稀有人参皂苷包含Rh4和Rh2的组合物，其重量比为(1-100)：(1-100)，优选的为(1-90)：(1-90)、(10-100)：(1-10)、(1-10)：(10-1)、(1-20)：(1-20)；最优选的为(2-3)：(5-6.5)或(2-3.5):(5-8)。
所述稀有人参皂苷包含Rk3和Rg3的组合物，其重量比为(1-100)：(1-100)，优选的为(1-90)：(1-90)、(10-100)：(1-10)、(1-10)：(10-1)、(1-100)：(1-10)、(1-10)：(1-5)；最优选的为:(1.5-3)：(5-7)或(1-2)：(4-8)。
组合物中的稀有人参皂苷，任选的还包括20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3中的一种或多种稀有人参皂苷。
优选的，还包括20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和/或Rh3。
组合物中的稀有人参皂苷，任选的还包括20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3中的一种或多种稀有人参皂苷。
优选的，还包括20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2和/或Rh3。
优选的，所述组合物中，基本不包含常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。常见人参皂苷的含量低于10％，优选的低于8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。更优选的，低于0.8％、0.6％、0.5％、或0.1％。
本发明中所述的Rg3、Rh1、或Rh2包括20R构型和/或20S构型，20R构型和20S构型的比例为1:100-100:1，优选的为1:10-10:1，更优选的为1:1。
本发明中所述的Rg3包括20(S)-Rg3和/或20(R)-Rg3；Rh2包括20(S)-Rh2和/或20(R)-Rh2。
本申请还提供了一种包含上述任意一项组合物的人参叶产品，优选的，其是以天然人参叶为原料制备的产品，优选的为药渣或提取物。
优选的，该产品的性能和参数，具备上述任一一项的特征。
上述所述人参叶，包括干燥或新鲜的人参叶。
本申请还提供了上述产品或组合物在治疗和/或预防肿瘤中的用途，所述肿瘤可以为肺癌、结肠癌、神经胶质瘤。
本申请的上述任一产品或组合物，在制备药品、保健食品或者食品中的应用，具体应用于现有技术已知的降血糖、抗疲劳、抗病毒、治疗糖尿病、心血管、中枢神经、生物代谢、生殖功能、免疫功能、肾功能等疾病的食品、保健食品或者药品中；其中可以包含药学或者食品上可接受的载体或者添加剂。
任选的，产品或组合物的给药途径可以为口服、注射或经皮给药。
任选的，产品或组合物的剂型为粉剂、散剂、饮片、糖浆、口服液、混悬剂、乳剂、片剂、胶囊剂、缓释剂、速释剂、控释剂、注射液、注射粉针剂、贴剂、栓剂、滴剂。
附图说明
图1：100℃反应人参叶药渣和水中Rg3含量变化；
图2：100℃反应人参叶药渣和水中Rg3和Rh2总量变化；
图3：100℃反应人参叶药渣和水中Rk1和Rg5总量变化；
图4：100℃反应人参叶药渣和水中Rg6和F4总量变化；
图5：100℃反应人参叶药渣和水中15种稀有人参皂苷总量变化；
图6：100℃反应人参叶药渣和水中7种常见人参皂苷总量变化；
图7A和7B分别为115℃、120℃下药渣中15种稀有人参皂苷总量变化；
图8A和8B分别为125℃、130℃下药渣中15种稀有人参皂苷总量变化；
图9A和9B分别为135℃，140℃下药渣中15种稀有人参皂苷总量变化；
图10为145℃下药渣中15种稀有人参皂苷总量变化；
图11：115℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图12：120℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图13：125℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图14：130℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图15：135℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图16：140℃药渣中Rg3+Rh2以及Rg6+F4含量变化；
图17：145℃药渣中Rg3+Rh2，Rg6+F4以及Rg5+Rk1含量变化。
图18A和18B分别为115℃、120℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；
图19A和19B分别为125℃、130℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；
图20A和20B分别为：135℃，140℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；
图21为145℃下药渣中7种常见人参皂苷总量变化；
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明作进一步说明。
高效液相色谱法测定常见人参皂苷含量
色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，柱温为25℃，流速1ml/min，检测波长203nm，进样量20μL。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～35 19.5 80.5
35～35.1 19.5→20 80.5→80
35.1～55 20 80
55～55.1 20→29 80→71
55.1～84 29→36 27→64
84～90 36 64
对照品溶液的制备：
取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3对照品、人参皂苷Rd对照品适量，精密称定，加甲醇制成如下浓度的混标溶液：
人参皂苷Rg1浓度为0.201mg/ml
人参皂苷Re浓度为0.205mg/ml
人参皂苷Rb1浓度为0.121mg/ml
人参皂苷Rc浓度为0.156mg/ml
人参皂苷Rb2浓度为0.174mg/ml
人参皂苷Rb3浓度为0.111mg/ml
人参皂苷Rd浓度为0.201mg/ml
供试品溶液的制备：
1、药渣
取供试品(人参叶药渣)3.0g，精密称定，甲醇回流提取两次，每次2小时，甲醇用量均为250ml，过滤，药渣弃去，滤液减压回收甲醇，残渣用甲醇溶解，定容至100ml容量瓶。
2、水液
取25ml水液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，定容到25ml容量瓶。
高效液相色谱法稀有人参皂苷含量
色谱条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)为填充物(柱长250mm，内径4.6mm，粒度5μm)，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱，柱温25℃，流速0.8ml/min，检测波长203nm，进样量20μL。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～10 29 71
10～25 29→40 71→60
25～50 40→60 60→40
50～60 60→73 40→27
60～75 73 27
对照品溶液的制备：
取人参皂苷20(S)-Rg2、人参皂苷20(S)-Rh1、20(R)人参皂苷R-Rh1、人参皂苷Rg6、人参皂苷F4、人参皂苷Rk3、人参皂苷Rh4、人参皂苷20(S)-Rg3、人参皂苷20(R)-Rg3、人参皂苷Rk1、人参皂苷Rg5、人参皂苷20(S)-Rh2、人参皂苷20(R)-Rh2、人参皂苷Rk2、人参皂苷Rh3对照品适量，精密称定，加甲醇制成含如下浓度的混标溶液：
人参皂苷20(S)-Rg2浓度为0.2268mg/ml
人参皂苷20(S)-Rh1浓度为0.1792mg/ml
人参皂苷20(R)-Rh1浓度为0.1692mg/ml
人参皂苷Rg6浓度为0.1632mg/ml
人参皂苷F4浓度为0.1240mg/ml
人参皂苷Rk3浓度为0.1248mg/ml
人参皂苷Rh4浓度为0.1256mg/ml
人参皂苷20(S)-Rg3浓度为0.1296mg/ml
人参皂苷20(R)-Rg3浓度为0.0596mg/ml
人参皂苷Rk1浓度为0.1580mg/ml
人参皂苷Rg5浓度为0.1560mg/ml
人参皂苷20(S)-Rh2浓度为0.1388mg/ml
人参皂苷20(R)-Rh2浓度为0.1324mg/ml
人参皂苷Rk2浓度为0.1324mg/ml
人参皂苷Rh3浓度为0.0688mg/ml
供试品溶液的制备：
1、药渣
取供试品(人参叶药渣)3.0g，精密称定，甲醇回流提取两次，每次2小时，甲醇用量均为250ml，过滤，药渣弃去，滤液减压回收甲醇，残渣用甲醇溶解，定容至100ml容量瓶。
2、水液
取25ml水液，减压回收溶剂，残渣加甲醇溶解，定容到25ml升容量瓶。
实施例1：常压下煎煮人参叶—水液和药渣中人参皂苷分布
以干燥人参叶为原料，称取1200g人参叶，粉碎，加入10倍量的水浸泡12小时，100℃(常压)加热回流提取，在0小时(浸泡12小时开始加热回流前)、开始加热后30min、60min、A(90min，刚开始沸腾)、沸腾后1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、120小时、132小时、144小时、156小时、168小时、180小时、192小时、204小时、216小时、228小时、240小时、252小时取样，过滤，得水液和药渣，药渣烘干得干燥药渣。以15种稀有人参皂苷和7种常见人参皂苷为标准品，通过HPLC法分析水液和药渣中稀有人参皂苷和常见人参皂苷的含量。300g人参叶加热回流72小时获得干燥药渣164g，得离心水2600ml。
I水液中常见人参皂苷含量变化
表1 100℃常压回流人参叶252小时水液中常见人参皂苷含量(mg/ml，96小时之后均为0)
0min 30min 60min 沸腾 1h 2h 3h 6h 8h 12h 14h 16h 20h 22h 24h 36h 48h
Rg<sub>1</sub> 0.812 0.856 0.825 0.792 0.738 0.694 0.638 0.486 0.336 0.207 0.191 0.136 0.080 0.061 0.048 0.004 0.000
Re 1.905 2.151 2.072 2.037 1.947 1.806 1.665 1.274 0.926 0.537 0.541 0.398 0.236 0.175 0.133 0.027 0.000
Rb<sub>1</sub> 0.039 0.052 0.022 0.026 0.046 0.057 0.047 0.037 0.024 0.059 0.039 0.019 0.030 0.000 0.000 0.036 0.000
Rc 0.129 0.110 0.067 0.174 0.143 0.144 0.134 0.151 0.093 0.117 0.046 0.058 0.049 0.019 0.075 0.000 0.000
Rb<sub>2</sub> 0.094 0.090 0.096 0.099 0.119 0.116 0.102 0.102 0.068 0.204 0.132 0.108 0.071 0.053 0.062 0.023 0.006
Rb<sub>3</sub> 0.004 0.004 0.005 0.005 0.006 0.006 0.004 0.005 0.005 0.042 0.014 0.016 0.009 0.006 0.004 0.002 0.000
Rd 0.420 0.415 0.408 0.408 0.485 0.507 0.493 0.466 0.383 0.618 0.485 0.416 0.282 0.229 0.254 0.102 0.038
总量(mg/ml) 3.403 3.678 3.495 3.541 3.484 3.330 3.083 2.521 1.835 1.784 1.448 1.151 0.757 0.544 0.576 0.194 0.044
Figure BDA0002708350750000111
Figure BDA0002708350750000121
表2 100℃常压回流人参叶252小时药渣中常见人参皂苷含量(％，156小时后均为0)
Figure DA00027083507551224227
通过上表，可以看出，在回流提取过程中，早期随着回流提取时间的延长，水液中常见人参皂苷含量逐渐增加，与此同步，药渣中的常见人参皂苷含量则逐渐降低。但是随着回流提取时间的进一步延长，水液中的常见人参皂苷含量开始逐渐降低。
水液中24小时之后，常见人参皂苷含量明显下降，84小时后仅有一种常见人参皂苷检出，仅为0.05％，96小时无常见人参皂苷检出。与其相应的药渣中常见人参皂苷也逐渐降低，96小时仅有1种常见人参皂苷检出，96小时之后常见人参皂苷含量基本可以忽略不计，144小时之后，常见人参皂苷含量检测为0。
表3 100℃常压回流人参叶252小时水液中15种稀有人参皂苷的含量(mg/ml)
Figure BDA0002708350750000131
Figure BDA0002708350750000132
Figure BDA0002708350750000141
表4 100℃常压回流人参叶252小时药渣中15种稀有人参皂苷的含量(％)
Figure BDA0002708350750000142
Figure BDA0002708350750000151
表3和表4实验结果表明，随着回流提取时间的延长，水中的稀有人参皂苷的含量到12小时为止逐渐升高，超过12小时后含量开始下降。过了144小时其含量已降至0.2％以下。而药渣中的稀有人参皂苷则随着回流提取时间的延长不断增加，84小时到达最高值(9.9％)，之后至252小时为止其含量在8.2％-9.9％之间波动。
稀有人参皂苷Rg3和Rh2，在回流16小时之前，水液中的含量都是增高的，之后逐渐降低，至120小时之后含量很低，可以忽略不计。与之相对应的是，过滤后的药渣中，Rg3和Rh2的含量逐渐升高，药渣中稀有人参皂苷中Rg3含量可以达到1.7％以上；Rg3和Rh2的总量84小时之后，可以达到2.7％以上；稀有人参皂苷中Rk1和Rg5总量可以达到1.3％以上。稀有人参皂苷中Rk6和F4含量和不低于1.0％，可以达到1.5％以上。稀有人参皂苷的Rh1也可以达到1.3％以上。
实施例2：高温高压下煎煮人参叶—水液和药渣中人参皂苷分布
以人参叶为原料，粉碎，加入适量水，高温高压煎煮，在设定时间内取样，过滤，得水样和药渣。药渣烘干，得干燥药渣。通过HPLC分析水液和药渣中稀有人参皂苷和常见人参皂苷的含量。
在单因素试验的基础上，温度设计为130℃、135℃、140℃，液料比设计为15:1、20:1、25:1，时间设计为2.0、2.5、3.0小时，进行正交试验，筛选最佳煎煮工艺。
所在列 1 2 3
因素 温度(℃) 时间(h) 液料比
实验1 130 2 15:1
实验2 130 2.5 20:1
实验3 130 3 25:1
实验4 135 2 15:1
实验5 135 2.5 20:1
实验6 135 3 25:1
实验7 140 2 15:1
实验8 140 2.5 20:1
实验9 140 3 25:1
所在列 1 2 3 4
因素 温度(℃) 时间(h) 液料比 实验结果
实验1 1 1 1 1 1.060
实验2 1 2 2 2 1.201
实验3 1 3 3 3 1.185
实验4 2 1 2 3 1.268
实验5 2 2 3 1 1.124
实验6 2 3 1 2 1.081
实验7 3 1 3 2 1.127
实验8 3 2 1 3 1.144
实验9 3 3 2 1 1.190
均值1 1.149 1.152 1.095 1.125
均值2 1.158 1.156 1.220 1.136
均值3 1.154 1.152 1.145 1.199
极差 0.009 0.004 0.125 0.074
实验结果表明，在135℃或140℃、液料比20:1，煎煮3-5小时效果最佳。另外高温高压煎煮比100℃常压回流制备时间缩短很多，制备得到富含稀有人参皂苷药渣的效率更高。
以下针对115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃和145℃，液料比设计为20:1下的实验数据进行整理和分析。
表5：135℃高温高压煎煮人参叶药渣中7种常见人参皂苷含量变化(％，4小时以后均为0)
0min 10min 15min 20min 25min 30min 1h 1.5h 2h 2.5h 3h 4h 5h
Rg<sub>1</sub> 0.137 0.125 0.107 0.086 0.081 0.055 0.016 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Re 0.376 0.344 0.300 0.234 0.246 0.144 0.048 0.014 0.006 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>1</sub> 0.021 0.025 0.019 0.018 0.016 0.014 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rc 0.066 0.072 0.072 0.053 0.052 0.069 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>2</sub> 0.055 0.057 0.043 0.038 0.043 0.068 0.033 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>3</sub> 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rd 0.387 0.438 0.416 0.398 0.406 0.395 0.223 0.113 0.065 0.029 0.019 0.000 0.000
总含量(％) 1.042 1.061 0.957 0.827 0.844 0.745 0.320 0.131 0.071 0.029 0.019 0.000 0.000
表6：135℃高温高压煎煮人参叶水中7种常见人参皂苷含量(mg/ml，10min，25min，3h三个时间点为例，3小时后为0)
10min 25min 3h
Rg<sub>1</sub> 0.254 0.139 0.000
Re 0.685 0.373 0.000
Rb<sub>1</sub> 0.008 0.000 0.000
Rc 0.026 0.013 0.000
Rb<sub>2</sub> 0.035 0.014 0.000
Rb<sub>3</sub> 0.002 0.000 0.000
Rd 0.170 0.088 0.000
总量(mg/ml) 1.180 0.627 0.000
表7：135℃高温高压煎煮人参叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)
Figure BDA0002708350750000171
Figure BDA0002708350750000181
表8：135℃高温高压煎煮水中15种稀有人参皂苷含量(mg/ml，10min，25min，3h三个时间点为例，3小时含量降低至0.2％以下)
10min 25min 3h
S-Rg<sub>2</sub> 0.132 0.137 0.065
S-Rh<sub>1</sub> 0.149 0.142 0.071
R-Rh<sub>1</sub> 0.034 0.033 0.025
Rg<sub>6</sub> 0.033 0.033 0.006
F<sub>4</sub> 0.061 0.062 0.012
Rk<sub>3</sub> 0.016 0.017 0.004
Rh<sub>4</sub> 0.022 0.021 0.005
S-Rg<sub>3</sub> 0.036 0.035 0.002
R-Rg<sub>3</sub> 0.027 0.024 0.001
Rk<sub>1</sub> 0.017 0.014 0.000
Rg<sub>5</sub> 0.022 0.016 0.000
S-Rh<sub>2</sub> 0.029 0.031 0.000
R-Rh<sub>2</sub> 0.024 0.026 0.000
Rk<sub>2</sub> 0.010 0.014 0.000
Rh<sub>3</sub> 0.016 0.017 0.000
Rg<sub>3</sub>总量 0.063 0.059 0.003
Rh<sub>2</sub>总量 0.053 0.057 0.000
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub> 0.116 0.116 0.003
Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub> 0.039 0.030 0.000
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub> 0.094 0.095 0.018
总量(％) 0.628 0.622 0.191
表9：140℃高温高压煎煮人参叶药渣中15种稀有人参皂苷含量(％)
0min 10min 20min 30min 1h 2h 3h 4h 5h 7h 10h
S-Rg<sub>2</sub> 0.344 0.595 0.908 1.065 1.085 0.908 0.726 0.569 0.498 0.331 0.204
S-Rh<sub>1</sub> 0.375 0.625 0.915 1.090 1.204 1.182 1.077 0.985 0.952 0.747 0.556
R-Rh<sub>1</sub> 0.101 0.190 0.298 0.373 0.436 0.514 0.535 0.553 0.607 0.592 0.564
Rg<sub>6</sub> 0.101 0.188 0.321 0.408 0.504 0.518 0.468 0.462 0.448 0.373 0.257
F<sub>4</sub> 0.192 0.357 0.595 0.761 0.988 1.119 1.118 1.168 1.245 1.209 1.154
Rk<sub>3</sub> 0.059 0.110 0.184 0.229 0.308 0.372 0.413 0.455 0.521 0.582 0.701
Rh<sub>4</sub> 0.073 0.132 0.227 0.292 0.399 0.502 0.559 0.647 0.763 0.905 1.170
S-Rg<sub>3</sub> 0.126 0.240 0.417 0.517 0.675 0.717 0.691 0.689 0.692 0.623 0.584
R-Rg<sub>3</sub> 0.088 0.160 0.263 0.334 0.449 0.490 0.491 0.510 0.532 0.517 0.546
Rk<sub>1</sub> 0.048 0.101 0.181 0.234 0.315 0.351 0.357 0.375 0.403 0.416 0.478
Rg<sub>5</sub> 0.072 0.137 0.239 0.315 0.426 0.481 0.478 0.510 0.535 0.575 0.693
S-Rh<sub>2</sub> 0.130 0.235 0.396 0.506 0.705 0.787 0.804 0.807 0.829 0.769 0.777
R-Rh<sub>2</sub> 0.087 0.161 0.277 0.368 0.531 0.580 0.657 0.620 0.649 0.630 0.689
Rk<sub>2</sub> 0.044 0.081 0.147 0.189 0.310 0.351 0.349 0.367 0.388 0.384 0.425
Rh<sub>3</sub> 0.076 0.137 0.240 0.319 0.505 0.579 0.576 0.616 0.649 0.674 0.787
Rg<sub>3</sub>总量 0.214 0.400 0.680 0.851 1.124 1.207 1.182 1.199 1.224 1.140 1.130
Rh<sub>2</sub>总量 0.217 0.396 0.673 0.874 1.236 1.367 1.461 1.427 1.478 1.399 1.466
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub> 0.431 0.796 1.353 1.725 2.360 2.574 2.643 2.626 2.702 2.539 2.596
Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub> 0.120 0.238 0.420 0.549 0.741 0.832 0.835 0.885 0.938 0.991 1.171
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub> 0.293 0.545 0.916 1.169 1.492 1.637 1.586 1.630 1.693 1.582 1.411
总量(％) 1.916 3.449 5.608 7.000 8.840 9.451 9.299 9.333 9.711 9.327 9.585
表10 140℃高温高压煎煮人参叶药渣中7种常见人参皂苷含量(％，3小时后均为0)
0min 10min 20min 30min 1h 2h 3h 4h 5h 7h 10h
Rg<sub>1</sub> 0.112 0.074 0.047 0.029 0.005 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Re 0.324 0.222 0.133 0.081 0.010 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>1</sub> 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rc 0.062 0.051 0.039 0.026 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>2</sub> 0.079 0.054 0.034 0.020 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rb<sub>3</sub> 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
Rd 0.431 0.435 0.367 0.268 0.091 0.046 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
总含量(％) 1.008 0.836 0.620 0.424 0.106 0.046 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
通过表5-10可以看出，在药渣中不包含常见人参皂苷，其含量为0；在药渣中富集了稀有人参皂苷，其含量逐渐上升。
从图7至图10可以看出，在135℃、140℃条件下，药渣中稀有人参皂苷的总量达到最大值，可以达到8％以上、9％以上、9.9％以上，其最佳煎煮时间分别为5小时或以上；2小时或以上或5小时以上。
从图11至图17中可以看出：
对于稀有人参皂苷Rg3和Rh2总量来说，最适宜温度为125℃或145℃，其药渣中的含量可以达到2.79％和2.70％；最佳煎煮时间分别为12小时或以上及3小时或以上。
对于稀有人参皂苷Rk1和Rg5总量来说，最适宜温度为140℃和145℃，含量可以分别达到1.17％和1.4％，最佳煎煮时间为10小时或以上及8小时或以上。
对于稀有人参皂苷Rg6和F4总量来说，最适宜温度为135℃和140℃，含量可以分别达到1.82％和1.69％，最佳煎煮时间为5小时或以上；6小时或以上。
从图18A至图21中可以看出：
药渣中的常见人参皂苷含量逐渐降低并最终消失，煎煮温度越高常见人参皂苷含量降低到0的时间越短。
实施例3：降低水中Rg3含量的实验条件筛选
在135℃、液料比为20:1、提取时间为2.5小时的情况下，研究了立即离心VS次日离心、常温加料VS升温加料以及事先浸泡与否对水中Rg3含量的影响。
实验结果表明，当日立即离心的水液中Rg3含量更低，即当日立即离心优于次日离心；
升温后加料优于常温加料，也可以降低水液中Rg3含量。常压100℃煎煮的情况下提取浸泡药材，可提高水液中的Rg3含量。
实施例4：从药渣中制备提取物
温度分别设定为115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃和145℃，液料比设定为20:1，按表11时间分别进行煎煮。煎煮后离心过滤，得水液和药渣，药渣干燥得到干燥人参叶药渣；取干燥药渣200g，乙醇回流提取，减压回收乙醇，烘干，获得提取物。利用HPLC法测定提取物中15种稀有人参皂苷的含量。
药渣产率＝药渣重量/西洋参叶重量×100％
提取物产率＝提取物重量/药渣重量×100％
表11：煎煮获得药渣和提取物质量
Figure BDA0002708350750000201
Figure BDA0002708350750000211
表12：提取物中15种稀有人参皂苷的含量：
145℃ 140℃ 135℃ 130℃ 125℃ 120℃ 115℃
S-Rg<sub>2</sub> 1.392 2.184 3.737 2.712 3.903 3.039 3.097
S-Rh<sub>1</sub> 3.246 4.122 4.840 4.175 4.456 4.333 4.638
R-Rh<sub>1</sub> 2.154 1.770 2.400 2.278 1.989 2.227 2.302
Rg<sub>6</sub> 2.142 2.326 1.994 1.973 1.893 1.938 1.895
F<sub>4</sub> 4.946 4.710 4.613 4.723 4.198 4.121 4.189
Rk<sub>3</sub> 2.210 1.718 1.536 1.922 1.462 1.465 1.312
Rh<sub>4</sub> 3.238 2.331 2.049 2.694 2.006 2.132 2.042
S-Rg<sub>3</sub> 2.408 4.768 3.266 2.703 3.333 3.660 2.658
R-Rg<sub>3</sub> 2.145 3.670 2.317 2.118 2.238 2.652 1.838
Rk<sub>1</sub> 1.709 2.559 1.525 1.582 1.508 1.600 0.988
Rg<sub>5</sub> 2.197 3.194 2.015 1.911 1.910 1.906 1.537
S-Rh<sub>2</sub> 4.133 2.640 4.162 4.352 3.467 4.280 4.368
R-Rh<sub>2</sub> 4.006 2.327 3.273 3.689 2.836 3.477 4.060
Rk<sub>2</sub> 1.666 0.921 1.426 1.568 1.285 1.358 1.293
Rh<sub>3</sub> 2.525 1.206 2.384 2.448 2.139 1.979 1.929
Rg<sub>3</sub>总量 4.553 8.438 5.583 4.821 5.571 6.311 4.495
Rh<sub>2</sub>总量 8.139 4.967 7.435 8.041 6.303 7.758 8.429
Rg<sub>3</sub>+Rh<sub>2</sub> 12.692 13.405 13.018 12.862 11.874 14.069 12.924
Rk<sub>1</sub>+Rg<sub>5</sub> 3.906 5.753 3.539 3.493 3.417 3.506 2.525
Rg<sub>6</sub>+F<sub>4</sub> 7.088 7.036 6.608 6.696 6.091 6.059 6.084
总量(％) 40.116 40.446 41.538 40.848 37.811 40.168 38.146
由此可见在高温高压煎煮下，乙醇回流药渣获得的提取物中的稀有人参皂苷的含量均可以达到35％以上，这是令人惊讶的。且在130℃至145℃时，其含量可以达到40％以上，Rg3的总量可以达到4％以上，甚至8％以上；Rh2的总量可以达到4％以上，甚至8％以上；Rk1+Rg5的总量达到3％以上，甚至达到5％以上；Rg6+F4的总量达到6％以上，甚至达到7％以上。
实施例5：鲜人参叶常压和高温高压煎煮实验
以鲜人参叶为原料，进行100℃加热回流或高温高压煎煮实验，获得的实验结果其趋势与干燥人参叶实验结果基本一致。水液和药渣中的常见人参皂苷含量逐渐降低，相反药渣中稀有人参皂苷含量逐渐升高，到达最高值之后继续煎煮其含量在其附近小幅波动。只是鲜人参叶煎煮获得的药渣中的稀有人参皂苷含量比干燥人参叶低很多。
实施例6：不同比例稀有人参皂苷类成分对于癌细胞的抑制作用
在96孔板中接种A549人肺癌细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO2)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取物DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。样本对A549肿瘤细胞IC50值如下表所示。
在96孔板中接种DLD1人结肠癌细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO2)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取物用DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。样本对DLD1肿瘤细胞IC50值如下表所示。
在96孔板中接种U251人胶质瘤细胞悬液100μL，接种密度为8000个/孔。将96孔细胞培养板置于细胞培养箱中(培养条件37℃，5％CO2)培养24h。不同比例人参皂苷类组分和提取物用DMSO配制成高浓度储备液。在细胞处于对数生长情况下，用储备液配制适当浓度梯度样本，将不同浓度的24组待测样本与细胞共培养24h。检测细胞活性时，弃去96孔板各组细胞上清液，配制含10％CCK-8检测试剂的培养基，向每反应孔加入100μL，并将培养板放于培养箱孵育1h左右。用酶标仪测定450nm处吸光度。24组样本对U251肿瘤细胞IC50值如下表所示(表中Rg3和Rh2均为20S构型)。
表13：不同比例稀有人参皂苷类成分对于癌细胞的抑制作用
Figure BDA0002708350750000221
Figure BDA0002708350750000231
通过筛选试验，筛选出了如表中所示对癌细胞抑制活性较好的不同的稀有人参皂苷组合，其对于三种癌细胞均显示出协同的抗肿瘤活性。
以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代，虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims (12)

1.一种制备高含量稀有人参皂苷产品的方法，其特征在于，其制备方法为A或B：
A：将人参叶粉碎，加入适量水，在常压下加热回流36小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；液料比为(30-5):1；
B：将人参叶粉碎，加入适量水，高温高压下煎煮1小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；所述高温为100℃以上；液料比为(30-5):1。
2.如权利要求1中的制备方法，其特征在于：
方法A中加热回流时间为40小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时以上；
方法B中煎煮时间为2小时以上、3小时以上，4小时以上，5小时以上，6小时以上，8小时以上，10小时以上，12小时以上，14小时以上，16小时以上，18小时以上，20小时以上，22小时以上，24小时以上，28小时以上，30小时以上，32小时以上，34小时以上，36小时以上，38小时以上，40小时以上，42小时以上，44小时以上，48小时以上或者50小时以上；
方法B中高温为不低于110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃或150℃。
3.如权利要求1中的制备方法，其特征在于：
在制备方法A中，液料比为(25-8):1，(20-9):1，(15-10):1，或10:1；
在制备方法B中，液料比为(25-6):1，(20-7):1，(20-10):1，或20:1。
4.如权利要求1-3任一项中的制备方法，其特征在于：任选的对药渣进一步地用有机溶剂或含水有机溶剂提取，得到具有高含量稀有人参皂苷的提取物。
5.如权利要求1-3任一项中的制备方法，其特征在于：
药渣中含有15种稀有人参皂苷中的一种或多种，具体的为20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，基本不含常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd；
药渣中稀有人参皂苷的总含量高于5％、7％、8％、或9％，常见人参皂苷总含量低于1％、0.8％、0.5％、0.2％、或0.1％。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
提取物中含有15种稀有人参皂苷中的一种或多种，具体的为20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，基本不含常见人参皂苷，常见人参皂苷包括Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd；
提取物中稀有人参皂苷的总含量超过7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，常见人参皂苷的总含量低于10％，8％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.3％、0.2％、或0.1％。
7.一种以人参叶为原料制备的产品，包含高含量的稀有人参皂苷，基本不含有常见人参皂苷；其中稀有人参皂苷包括：20(S)-Rg2、20(S)-Rh1、20(R)-Rh1、Rg6、F4、Rk3、Rh4、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5、20(S)-Rh2、20(R)-Rh2、Rk2、Rh3，常见人参皂苷包括：Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd中的一种或多种；
其制备方法为A或B：
A：将人参叶粉碎，加入适量水，在常压下加热回流36小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；液料比为(30-5):1；
B：将人参叶粉碎，加入适量水，高温高压下煎煮1小时以上，过滤，将药渣干燥，得到所需产品；所述高温为100℃以上；液料比为(30-5):1；
常见人参皂苷总含量低于1％、0.8％、0.5％、0.2％、或0.1％。
8.如权利要求7所述的以人参叶为原料制备的产品，稀有人参皂苷的总含量高于5％、7％、8％、或9％，常见人参皂苷总含量低于1％、0.8％、0.5％、0.2％、或0.1％。
9.权利要求7或8中任一项所述的产品在制备抗肿瘤产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其肿瘤为肺癌、结肠癌或者神经胶质瘤。
11.一种抗肿瘤组合物，该组合物中包括稀有人参皂苷，其包含以下任一项所述的组合物：
由Rg3和Rg5组成的组合物，其重量比为(5-8.5)：(1.5-4)；或(3-6)：(1-2)；
由F4和Rh2组成的组合物，其重量比为(1-10)：(1-10)；
由Rh4和Rh2组成的组合物，其重量比为(1-20)：(1-20)；
由Rk3和Rg3组成的组合物，其重量比为(1-10)：(1-10)。
12.如权利要求11所述的应用，其肿瘤为肺癌、结肠癌或者神经胶质瘤。
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