CN116889583A - 一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用，属于人参皂苷提取技术领域。本发明公开的一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，是将人参根须或人参茎叶经过提取、酶解及高温高压处理。该制备方法能快速有效提高人参提取物中稀有人参皂苷的比例。经过体外抗氧化实验及体内秀丽隐杆线虫实验证明，该提取物及相关复合物能有效抗氧化，抗氧化应激，并改善与年龄相关的肌肉衰退等功能障碍。经过基因及代谢组学研究，证明其抗衰机制与营养感应、应激相关途径和氧化还原过程相关的基因表达有关，且表现出先天免疫反应和氧化还原过程GO富集，证明了其氧化应激抗性。

Description

一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及人参皂苷提取技术领域，更具体的说是涉及一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用。
背景技术
人参作为我国一种传统的中药已使用了2000多年，被誉为“百草之王”，由于其独特的药理活性而在世界范围内广泛使用。人参皂苷是人参中的主要活性物质，具有独特的生物学活性和药用价值。人参皂苷的生物活性包括抗癌、抗老化、抗炎、抗过敏、抗糖尿病、抗高血脂、抗疲劳和抗氧化活性，并且还可以促进DNA、RNA和蛋白质的合成。
人参皂苷是人参的重要活性成分，属于三萜类糖苷化合物，可分为原人参二醇组皂苷(PPD型皂苷)、原人参三醇组皂苷(PPT型皂苷)和齐墩果烷型。文献研究表明，从人参或三七等中药中分离并鉴定出的人参皂苷有100余种，其中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg1占总人参皂苷的90％以上，通常被认为是主要的人参皂苷。人参皂苷水溶性较差、血药浓度低、口服吸收慢、生物利用度低，在一定程度上限制了人参皂苷的临床应用。
研究表明，通过人参皂苷的酰基化法、硫酸化法、PEG修饰法、氨基酸法、氧化法、氮杂化法、烷基化法、氚化还原法等对人参皂苷进行结构修饰，可以有效提高人参皂苷的水溶性、稳定性、靶向性、从而提高生物利用率，显著提高人参皂苷的药物活性。但通过上述方法对人参皂苷分子的结构进行修饰，会产生有机溶剂残留等问题，不利于后期的临床应用。
研究发现，人参皂苷经过转化后的次级代谢产物具有更强的生物活性，这种次级代谢产物称之为稀有人参皂苷。稀有人参皂苷在人参中的含量极少，人体胃肠道对主要人参皂苷的吸收非常差，而稀有人参皂苷更容易被人体吸收并发挥作用。现已证明稀有人参皂苷具有更好的药理活性，是癌症治疗的潜在候选药物。目前，从人参等中药中提取的稀有人参皂苷产量低，不能满足市场需求，限制了其开发和应用，因此，通过转化主要人参皂苷来制备稀有人参皂苷具有非常重要的意义。物理和化学方法都不适用于工业化大规模生产人参皂苷，如酸水解法虽然能够生产稀有人参皂苷，但反应过程剧烈，且稀有人参皂苷转化率并不高；碱水解法获得稀有人参皂苷对pH、压力和温度等条件要求非常苛刻；微生物转化法获得稀有人参皂苷具有快速、方便、有效和无害化等优点，但是设备要求高，工艺相对复杂。酶解法具有高特异性，被认为是制备稀有人参皂苷的最有效途径之一，但是产率普遍不高，且当前研究集中在针对单体人参皂苷进行生物催化，精制过程有所浪费，而对于普通人参提取物转化稀有人参皂苷的案例较少。中医中药注重整体观念，迫切需要一种高值化利用人参提取物的方法。
因此，提供一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，利用“酶解+热处理”法制备，具体步骤如下：
(1)将人参茎叶提取物干粉或人参根须提取物干粉加水配制成浓度为10～20％(w/v)的底物，调节pH至4.3～5.0；
(2)以所述干粉计，加入2～5U/g(U是酶活单位，/g指的是以干粉为基础核算)β-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度为40～60℃，酶解时间3～5h；酶解后进行热处理，热处理温度为115～132℃，热处理压力为70～200kPa，热处理时间为1～4h；
(3)处理后的溶液进行浓缩，浓缩温度为75～85℃，浓缩压力-0.05～-0.09Mpa，浓缩至比重为1.1-1.2g/L(25℃)，获得浓缩液；
(4)将步骤(3)获得的浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度135-160℃，出风温度80-100℃，离心频率250～280Hz，引风频率50～60Hz，进料泵10～40RPM。
优选的，一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将人参茎叶提取物干粉或人参根须提取物干粉加水配制成浓度为15％的底物，调节pH至4.5；
(2)以所述干粉计，加入3U/gβ葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度为50℃，酶解时间4h；酶解后进行热处理，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h；
(3)处理后的溶液进行浓缩，浓缩温度为77℃，浓缩压力-0.08Mpa，浓缩至比重为1.15g/L(25℃)，获得浓缩液；
(4)将步骤(3)获得的浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
进一步，所述人参茎叶提取物干粉的制备方法如下：采用乙醇提取，乙醇浓度为70％，提取料液比为1：8，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，获得醇提液；对醇提液进行浓缩，浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05g/L(25℃)，获得浓缩液；将浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
进一步，所述人参根须提取物干粉的制备方法如下：采用乙醇提取，乙醇浓度为60％，提取料液比为1：10，提取次数为3次，每次提取时间为3小时，获得醇提液；对醇提液进行浓缩，浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05g/L(25℃)，获得浓缩液；将浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
进一步，利用上述的制备方法制备得到的富含稀有人参皂苷的人参茎叶提取物；所述人参茎叶提取物中稀有人参皂苷的比例≥30％。
进一步，利用上述的制备方法制备得到的富含稀有人参皂苷的人参根须提取物；所述人参根须提取物中稀有人参皂苷的比例≥15％。
进一步，一种制剂，含有所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物；所述制剂包括但不限于散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊、软糖、口服液等可接受的任何剂型。
进一步，所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物在制备抗氧化、抗应激及衰老引起的肌肉衰退产品中的应用。
进一步，一种组合物，包括所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物、茯苓提取物、地黄提取物；与富含稀有人参皂苷的人参提取物组合的物质包括但不限于茯苓、地黄等常见的中药提取物。
进一步，所述的组合物在制备抗氧化、抗应激及衰老引起的肌肉衰退产品中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法及其应用，富含稀有人参皂苷的人参提取物由人参根须或人参茎叶经过提取、酶解及高温高压处理而得。该制备方法能快速有效提高人参提取物中稀有人参皂苷的比例。经过体外抗氧化实验及体内秀丽隐杆线虫实验证明，该提取物及相关复合物能有效抗氧化，抗氧化应激，并改善与年龄相关的肌肉衰退等功能障碍。经过基因及代谢组学研究，证明其抗衰机制与营养感应、应激相关途径和氧化还原过程相关的基因表达有关，且表现出先天免疫反应和氧化还原过程GO富集，证明了其氧化应激抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明17种人参皂苷标准品色谱图；
图2附图为本发明不同人参提取物DPPH自由基清除能力的变化；
图3附图为本发明不同人参提取物ABTS+自由基清除能力的变化；
图4附图为本发明不同人参提取物羟基自由基清除能力的变化；
图5附图为本发明不同人参提取物超氧阴离子自由基清除能力的变化；
图6附图为本发明秀丽隐杆线虫成年时的大小；
其中，虚线标识为空白组(VC组)线虫的平均大小，大小被量化为面积；方框表示平均面积，点是单个动物；误差条表示平均值的标准误差(SEM)；*表示为进一步研究所选择的参考浓度；
图7附图为本发明秀丽隐杆线虫寿命试验；
其中，条形图表示每种情况下的平均寿命，误差条表示标准偏差，平均值的比较采用方差分析，然后进行事后t检验；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；
图8附图为本发明秀丽隐杆线虫寿命周期内的活动状态；
图9附图为本发明暴露于PQT后的秀丽隐杆线虫的运动能力；活动被归一化为平均基线，阴影表示均值的标准误差；
图10附图为本发明暴露于PQT 24小时后秀丽隐杆线虫的运动能力；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；各组比较采用方差分析，然后采用多重比较校正的事后t检验(Bonferroni)；
图11附图为本发明不同年龄段的待试样品组的肌肉图像；
图12附图为本发明各年龄治疗组碎片评分分布；
图13附图为本发明各年龄段治疗组的平均碎片化评分；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001.各组的比较采用方差分析，然后进行事后t检验；
图14附图为本发明各处理组的差异表达基因数量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2，2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]：北京启研生物科技有限公司。硫酸亚铁、30％过氧化氢(均为分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、Vc、邻二氮菲(均为分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。邻苯三酚(分析纯)：天津市福晨化学试剂厂。
实施例1“酶解+热处理”制备富含稀有人参皂苷的人参提取物
1)人参茎叶提取物干粉和人参根须提取物干粉的制备
(1)人参茎叶提取物干粉(自制，批号RSY230201)的制备方法：干燥的人参茎叶经乙醇提取，乙醇浓度为70％，提取料液比为1：8，提取次数为2次，每次提取时间为2小时。醇提液浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05(25℃)。将所得浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
(2)人参根须提取物干粉(自制，批号RSG230201)的制备方法：干燥的人参根须经乙醇提取，乙醇浓度为60％，提取料液比为1：10，提取次数为3次，每次提取时间为3小时。醇提液浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05(25℃)。将所得浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
2)“酶解+热处理”制备工艺
(1)批号XRSY230301：人参茎叶提取物干粉(自制，批号RSY230201)加水配制成15％浓度的底物，调节pH至4.5，加入3U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为50℃，酶解时间4h，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h。
(2)批号XRSG230301：人参根须提取物干粉(自制，批号RSG230201)加水配制成15％浓度的底物，调节pH至4.5，加入3U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为50℃，酶解时间4h，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h。
(3)批号XRSY230302：人参茎叶提取物干粉(汉中天然谷生物科技有限公司，批号Crs230310)加水配制成15％浓度的底物，调节pH至4.5，加入3U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为50℃，酶解时间4h，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h。
(4)批号XRSG230302：人参根须提取物干粉(宏久生物科技有限公司，批号S220406)加水配制成15％浓度的底物，调节pH至4.5，加入3U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为50℃，酶解时间4h，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h。
将上述(1)-(4)“酶解+热处理”获得的提取物分别浓缩，浓缩温度为77℃，浓缩压力-0.08Mpa，浓缩至比重为1.15(25℃)。将所得浓缩液用离心式进行喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。即得富含稀有人参皂苷的提取物粉剂。
3)对喷干产物(富含稀有人参皂苷的提取物粉剂)的理化指标进行检测。
其中，收率、粒度、水分、灰分的检测结果见表1。
表1喷干产物理化指标-1
批号 收率 粒度(过80目筛) 水分 灰分
XRSY230301 90.52％ 98.02％ 1.90％ 0.39％
XRSY230302 91.02％ 97.65％ 1.86％ 0.38％
XRSG230301 90.10％ 98.21％ 2.05％ 0.40％
XRSG230302 89.65％ 99.01％ 1.95％ 0.39％
注：收率：“酶解+热处理”后获得的干粉重量/处理前的人参提取物干粉重量*100％；
粒度(过80目筛)：过80目筛的干粉重量/过筛前的干粉总量*100％；
灰分：灰分是指样品经高温灼烧后残留下来的无机物。按照GB 5009.4-2016食品安全国家标准食品中灰分的测定进行。
所得富含稀有人参皂苷的提取物粉剂的指纹图谱检测方法为：采用高效液相色谱法构建图谱，色谱条件为：色谱柱为C18，规格为：4.6×300mm，5μm；柱温为30℃；流速1.3mL/min；检测波长为202nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水，梯度洗脱程序为：
供试品溶液的制备方法为：精密称取样品0.1g于10mL容量瓶中，加入甲醇适量，超声30分钟后，取出放冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤即得。
富含稀有人参皂苷的提取物粉剂的检测结果见表2。
其中17种人参皂苷标准品色谱图见图1。
表2喷干产物理化指标-2
由表2可以看出，在该检测条件下，可检测出17种人参皂苷，总皂苷(液相法)为该17种人参皂苷的和，其中稀有人参皂苷有8种，分别为F2、RK3、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5、Rh2。
在该检测条件下，人参茎叶及人参根须提取物“酶解+热处理”所得提取物中的总皂苷含量前后差别不大，但是稀有人参皂苷的占比明显提升。说明在“酶解+热处理”后，提取物中普通人参皂苷转化为稀有人参皂苷。
实施例2“酶解+热处理”制备富含稀有人参皂苷的人参提取物
1)人参茎叶提取物干粉和人参根须提取物干粉的制备
同实施例1。
2)“酶解+热处理”制备工艺
(1)批号XRSY230303：人参茎叶提取物干粉(自制，批号RSY230201)加水配制成20％浓度的底物，调节pH至5.0，加入5U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为60℃，酶解时间5h，热处理温度为132℃，热处理压力为200kPa，热处理时间为1h。
(2)批号XRSG230303：人参根须提取物干粉(自制，批号RSG230201)加水配制成20％浓度的底物，调节pH至5.0，加入5U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为60℃，酶解时间5h，热处理温度为132℃，热处理压力为200kPa，热处理时间为1h。
(3)批号XRSY230304：人参茎叶提取物干粉(汉中天然谷生物科技有限公司，批号Crs230310)加水配制成20％浓度的底物，调节pH至5.0，加入5U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为60℃，酶解时间5h，热处理温度为132℃，热处理压力为200kPa，热处理时间为1h。
(4)批号XRSG230304：人参根须提取物干粉(宏久生物科技有限公司，批号S220406)加水配制成20％浓度的底物，调节pH至5.0，加入5U/gβ-葡萄糖苷酶，酶解温度为60℃，酶解时间5h，热处理温度为132℃，热处理压力为200kPa，热处理时间为1h。
将上述(1)-(4)“酶解+热处理”获得的提取物分别浓缩，浓缩温度为85℃，浓缩压力-0.05Mpa，浓缩至比重为1.20(25℃)。将所得浓缩液用离心式进行喷雾干燥，参数为：进风温度160℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率60Hz，进料泵40RPM。即得富含稀有人参皂苷的提取物粉剂。
3)对喷干产物(富含稀有人参皂苷的提取物粉剂)的理化指标进行检测。
其中，收率、粒度、水分、灰分的检测结果见表3。
表3喷干产物理化指标-1
批号 收率 粒度(过80目筛) 水分 灰分
XRSY230303 82.56％ 90.02％ 1.95％ 0.30％
XRSY230304 83.02％ 90.05％ 1.86％ 0.39％
XRSG230303 80.02％ 85.24％ 2.21％ 0.35％
XRSG230304 82.27％ 86.15％ 2.25％ 0.35％
注：收率：“酶解+热处理”后获得的干粉重量/处理前的人参提取物干粉重量*100％；
粒度(过80目筛)：过80目筛的干粉重量/过筛前的干粉总量*100％；
灰分：按照GB 5009.4-2016食品安全国家标准食品中灰分的测定进行。
富含稀有人参皂苷的提取物粉剂的检测方法同实施例1，检测结果见表4。
表4喷干产物理化指标-2
由表4可以看出，在该检测条件下，可检测出17种人参皂苷，总皂苷(液相法)为该17种人参皂苷的和，其中稀有人参皂苷有8种，分别为F2、RK3、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5、Rh2。
在该检测条件下，人参茎叶及人参根须提取物“酶解+热处理”所得提取物中的总皂苷含量前后差别不大，但是稀有人参皂苷的占比明显提升。说明在“酶解+热处理”后，提取物中普通人参皂苷转化为稀有人参皂苷。
实施例3“酶解+热处理”制备富含稀有人参皂苷的人参提取物
1)人参茎叶提取物干粉和人参根须提取物干粉的制备
同实施例1。
2)“酶解+热处理”制备工艺
(1)批号XRSY230305：人参茎叶提取物干粉(自制，批号RSY230201)加水配制成10％浓度的底物，调节pH至4.3，加入2U/gβ葡萄糖苷酶，酶解温度为40℃，酶解时间3h，热处理温度为121℃，热处理压力为110kPa，热处理时间为4h。
(2)批号XRSG230305：人参根须提取物干粉(自制，批号RSG230201)加水配制成10％浓度的底物，调节pH至4.3，加入2U/gβ葡萄糖苷酶，酶解温度为40℃，酶解时间3h，热处理温度为121℃，热处理压力为110kPa，热处理时间为4h。
(3)批号XRSY230306：人参茎叶提取物干粉(汉中天然谷生物科技有限公司，批号Crs230310)加水配制成10％浓度的底物，调节pH至4.3，加入2U/gβ葡萄糖苷酶，酶解温度为40℃，酶解时间3h，热处理温度为121℃，热处理压力为110kPa，热处理时间为4h。
(4)批号XRSG230306：人参根须提取物干粉(宏久生物科技有限公司，批号S220406)加水配制成10％浓度的底物，调节pH至4.3，加入2U/gβ葡萄糖苷酶，酶解温度为40℃，酶解时间3h，热处理温度为121℃，热处理压力为110kPa，热处理时间为4h。
将上述(1)-(4)“酶解+热处理”获得的提取物分别浓缩，浓缩温度为75℃，浓缩压力-0.09Mpa，浓缩至比重为1.10(25℃)。将所得浓缩液用离心式进行喷雾干燥，参数为：进风温度135℃，出风温度80℃，离心频率250Hz，引风频率55Hz，进料泵10RPM。即得富含稀有人参皂苷的提取物粉剂。
3)对喷干产物(富含稀有人参皂苷的提取物粉剂)的理化指标进行检测。
其中，收率、粒度、水分、灰分的检测结果见表5。
表5喷干产物理化指标-1
批号 收率 粒度(过80目筛) 水分 灰分
XRSY230305 92.25％ 93.85％ 2.68％ 0.36％
XRSY230306 91.02％ 91.68％ 3.50％ 0.39％
XRSG230305 90.68％ 94.31％ 3.81％ 0.32％
XRSG230306 90.00％ 90.00％ 3.25％ 0.38％
注：收率：“酶解+热处理”后获得的干粉重量/处理前的人参提取物干粉重量*100％；
粒度(过80目筛)：过80目筛的干粉重量/过筛前的干粉总量*100％；
灰分：按照GB 5009.4-2016食品安全国家标准食品中灰分的测定进行。
富含稀有人参皂苷的提取物粉剂的检测方法同实施例1，检测结果见表6。
表6喷干产物理化指标-2
由表6可以看出，在该检测条件下，可检测出17种人参皂苷，总皂苷(液相法)为该17种人参皂苷的和，其中稀有人参皂苷有8种，分别为F2、RK3、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5、Rh2。
在该检测条件下，人参茎叶及人参根须提取物“酶解+热处理”所得提取物中的总皂苷含量前后差别不大，但是稀有人参皂苷的占比明显提升。说明在“酶解+热处理”后，提取物中的普通人参皂苷转化为稀有人参皂苷。
实施例4体外抗氧化实验
抗氧化能力测定
样品(实施例1的8份人参提取物干粉)制备：
分别精密称取样品1g适量于10mL容量瓶中，加入甲醇约适量，超声30分钟后，取出放冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤即得。分别用甲醇稀释至1、2、3、4、5、6、8、10mg/ml备用。
1)DPPH自由基清除能力的测定
取4g DPPH用无水乙醇定容至100mL容量瓶内，配制浓度为0.04mg/mL的DPPH溶液避光放置备用；分别取0.1mL人参提取物样品(浓度分别为2、4、6、8、10mg/ml)加入到新配制的3.9mL DPPH溶液中，混匀，在37℃水浴条件下反应60min，在517nm处测吸光度，计算公式如下：
DPPH自由基清除率/％＝[1-(A1-A2)/A3]×100％
式中：A1为3.9mL DPPH+0.1mL样品的吸光度；A2为3.9mL乙醇+0.1mL样品的吸光度；A3为3.9mL DPPH+0.1mL乙醇的吸光度。
不同人参提取物对DPPH自由基清除能力的变化见图2。
DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，可表示对羟基、烷基及过氧化自由基抑制作用。如图2所示，不同人参提取物对DPPH自由基的清除能力呈现剂量依赖性，其中富含稀有人参皂苷的人参茎叶提取物(XRSY230301批)对DPPH自由基清除能力最强。
2)ABTS+自由基清除能力的测定
取同等体积的7.4mmol/L ABTS溶液和2.6mmol/L K2S2O8溶液，置于100mL棕色广口瓶中，混合均匀，于室温(20℃)静置12h～16h，再用无水乙醇稀释45倍作ABTS工作液(OD734nm＝0.7±0.02)备用。取0.2mL样品(浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL)，加入到0.8mLABTS工作液中，振荡10s，充分混合后避光静置6min，在734nm处测吸光度为A1，以0.2mL乙醇代替样品为空白组，测得吸光度A0，计算公式如下：
ABTS+自由基清除率/％＝(1-A1/A0)×100％
不同人参提取物对ABTS+自由基清除能力的变化见图3。
ABTS+自由基清除试验是测定化合物抗氧化能力的重要方法。如图3所示，不同人参提取物对ABTS+自由基的清除能力呈现剂量依赖性，富含稀有人参皂苷的人参茎叶提取物(XRSY230301批)对ABTS+自由基清除能力最强。
3)羟基自由基清除能力的测定
取样品2mL(浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL)，加入1mL 0.75mmol/L邻二氮菲溶液、2mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)(pH7.4)，混匀再加入1mL 0.75mmol/L硫酸亚铁溶液、1mL 0.01％过氧化氢溶液，混匀后在37℃水浴1h，在536nm处测吸光度，对照组用蒸馏水代替过氧化氢溶液，空白组用蒸馏水代替样品，计算公式如下：
羟基自由基清除率/％＝(As-Ac)/(Ab-Ac)
式中：As为试验样品的吸光度；Ac为对照组的吸光度；Ab为空白组的吸光度。
羟基自由基是活性氧中最活泼的氧自由基，也是毒性最大的自由基，是造成生物体损伤的主要因素。不同人参提取物对羟基自由基清除能力的变化见图4。由图4可以看出，不同人参提取物对羟基自由基的清除能力呈现剂量依赖性，富含稀有人参皂苷的人参根须提取物(XRSG230301批)对羟基自由基的清除能力最强。结合人参皂苷(液相法)含量指标及文献，说明除人参皂苷外，羟基自由的清除能力与人参提取物中多糖及糖苷类具有相关性。
4)超氧阴离子自由基清除能力的测定
取2mL样品(浓度分别为1、2、3、4、5mg/mL)、4mL 0.05mol/L Tris-HCl溶液(pH8.2)，在25℃水浴加热20min；取出后加入60μL 25mmol/L邻苯三酚溶液，充分混匀在25℃水浴加热5min；取出后加入200μL 10mmol/L盐酸溶液，终止反应，在325nm处测吸光度。
超氧阴离子自由基清除率/％＝[1-(A1-A2)/A3]×100％
式中：A1为60μL邻苯三酚+2mL样品的吸光度；A2为60μL蒸馏水+2mL样品的吸光度；A3为60μL邻苯三酚+2mL蒸馏水的吸光度。
超氧阴离子自由基是机体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，产生活性更强的自由基。不同人参提取物对超氧阴离子自由基清除能力的变化见图5。由图5可以看出，不同人参提取物对超氧阴离子自由基的清除能力呈现剂量依赖性，富含稀有人参皂苷的人参根须提取物(XRSG230301批)对超氧阴离子自由基的清除能力最强，且人参根须相关提取物对于超氧阴离子自由基的清除能力优于人参茎叶相关提取物。结合人参皂苷(液相法)含量指标及文献，说明除人参皂苷外，人参提取物对于超氧阴离子自由基的清除能力与人参提取物中的多糖及糖苷类物质具有相关性。
如上所述，结合文献内容，富含稀有人参皂苷的人参根须提取物(XRSG230301批)对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力最强，对于DPPH及ABTS+自由基清除能力稍弱。综合来看，富含稀有人参皂苷的人参根须提取物体外抗氧化能力较优。
实施例5秀丽隐杆线虫抗衰实验
衰老发生不仅加速了身体功能衰退，还导致了诸多退行性疾病的发病率增加，例如阿尔兹海默症、帕金森病、心血管疾病和肿瘤等，为了揭示衰老的发生机制，通常会建立相应衰老模型进行研究，其中，利用秀丽隐杆线虫研究衰老过程具有实验期短、易于检测和丰富明确的遗传背景等优点，使秀丽隐杆线虫发展成为一个主要的衰老模型模式生物。
本实验利用秀丽隐杆线虫(来源于InVivo Biosystems)作为动物模型，通过一系列标准化的分析方法，测试了相关产品及其成分对活力(寿命和健康寿命)、抗氧化能力和线粒体健康的影响。
1)供试品：
富含稀有人参皂苷的人参根须提取物，批号XRSG230301，实施例1制备。收率：90.10％，折合到药材收率为32.57％。
茯苓提取物：茯苓块粉碎过筛80目，加6-8倍饮用水煮3小时，浓缩后喷雾干燥。收率：82.42％。
地黄提取物：50％乙醇回流提取3次，加液量分别为6、6、5倍量，每次提取2小时，浓缩后喷雾干燥。收率43.24％。
JadeAging：将上述富含稀有人参皂苷的人参提取物：茯苓提取物：地黄提取物按照15％、46％、39％复配即得。
2)试验过程
(1)实验分组情况见表7。
表7
分组 药物
空白组 VC(vehiclecontrol，无药物处理对照)
样品1 JadeAging(Ginseng+Poria+Rehmannia)
样品2 Ginseng(XRSG，富含稀有人参皂苷的人参根须提取物)
样品3 Poria(茯苓提取物)
样品4 Rehmannia(地黄提取物)
(2)制备储备液
上述样品溶解在10％DMSO中，通过超声波分散，然后通过0.2μm过滤器灭菌，制成100mg/mL的储备液。使用时将原液用0.1％DMSO稀释到每次试验所需的浓度。
(3)浓度筛选
高分辨率成像和自动检测被用于精确测量动物从孵化到成年期第一天的生长速率。秀丽隐杆线虫的生长和发育试验对化学或营养扰动高度敏感，并广泛应用于毒理学研究。在一系列剂量范围内进行这项测试有助于确定一组具有生理影响的剂量，并排除可能毒性而在其寿命中对动物有益的剂量范围。
根据文献，选择7种浓度进行生产和发育结果测试，以确定它们对生长的影响，并与空白组(VC组)进行对比。
通过高分辨率成像和自动检测和跟踪软件(WormLab)获得了成年期(孵化后4天)线虫的平均大小，结果见图6。虚线标识为空白组线虫的平均大小，大小被量化为面积。
与空白组(VC组)相比(虚线)，Rehmannia(地黄提取物)促进了线虫的生长；然而，在较高的剂量测试下，线虫大小的差异明显增加，这表明Rehmannia(地黄提取物)对线虫寿命影响的最佳剂量将低于667μg/mL。Poria(茯苓提取物)没有引起浓度依赖性的大小变化。Ginseng(富含稀有人参皂苷的人参提取物)在浓度超过148μg/mL出现了生长抑制，表明较低的浓度是测试Ginseng对线虫影响的最佳选择。
结论：基于生长发育试验，选择在生长和发育试验中生长最好的每种化合物的浓度。将Rehmannia(地黄提取物)定为220μg/mL、Poria(茯苓提取物)定为37μg/mL、Ginseng(富含稀有人参皂苷的人参提取物)定为50μg/mL，同时将JadeAging定为100μg/mL。
(4)活力实验
为了确定JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia是否影响健康和寿命，对线虫进行了每种化合物的选定浓度测定，并评估了种群的寿命和整个寿命过程中的活动水平。
目的：比较4个治疗组(Ginseng、Poria、Rehmannia、JadeAging)及空白组(VC)对秀丽隐杆线虫的寿命和健康的影响，监测成年秀丽隐杆线虫的生存和运动状态。
方法：寿命测定法改编自新隐杆线虫干预试验计划(CITP)使用和发表的标准方案。
寿命结果：用选定浓度的每种化合物处理线虫，并与空白组(VC)进行比较。寿命数据以线虫随着时间的推移存活的比例表示，称为Kaplan-Meier生存函数估计，结果如图7所示。总体来说，相对于空白组(VC)没有检测到待试样品对于寿命增加的积极影响。
健康跨度：秀丽隐杆线虫的运动在整个一生中可被量化。运动可以表明能量水平和健康状况，年长的秀丽隐杆线虫通常表现出活动减少。每个治疗组在这些运动状态下的寿命百分比如图8所示。结果表明，治疗组均增加了秀丽隐杆线虫在其生命中的剧烈运动比例，但改善效果不大，且用220μg/mL Rehmannia(地黄提取物)处理的秀丽隐杆线虫在其生命中更大比例地表现出剧烈的运动。
如上所述，在测试条件及浓度下，JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia并没有显著改善秀丽隐杆线虫的健康寿命。
(5)抗氧化试验
活性氧(ROS)是由正常的细胞代谢和暴露于污染物和辐射等环境因子所产生的分子。过量的ROS会损害人体的DNA、RNA和蛋白质，导致严重的应激反应，并导致细胞死亡，而抗氧化剂可以减轻ROS损伤。百草枯是一种有机化合物，通常用作除草剂，已知会导致ROS的释放。测试JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia是否能够减轻暴露于杀虫剂百草枯所造成的氧化损害。
目的：测定治疗组(JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia)的抗氧化能力。
方法：记录暴露于10mM百草枯(PQT)后，用待试样品(2mg/mL Rehmannia、100μg/mLPoria、500μg/mL Ginseng、1mg/mL JadeAging)处理秀丽隐杆线虫后的种群运动情况。观察在10mM百草枯暴露后24小时内的种群运动活动；ROS应激24小时后秀丽隐杆线虫群的平均运动活动水平。
秀丽隐杆线虫在空白组(Control，no PQT)或其中一种待测样品中预孵育过夜，记录每组秀丽隐杆线虫在暴露于10mM PQT(虚线)前2小时的基线活动，如图9所示。
治疗组暴露于PQT 24小时后，将其运动能力与未暴露于PQT或仅暴露于PQT的秀丽隐杆线虫进行比较，结果表明，4种待试样品处理后的秀丽隐杆线虫对PQT的影响都有显著的保护作用，如图9-10所示。在PQT处理前，在任一种待试样品中预孵育的秀丽隐杆线虫表现出与从未暴露过PQT的秀丽隐杆线虫相同的活性水平；在PQT暴露24小时后，在待试样品中预孵育的秀丽隐杆线虫的活性水平显著高于仅暴露于PQT的秀丽隐杆线虫的活动水平，与未暴露于PQT的秀丽隐杆线虫活动水平相似。
结论：JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia处理的秀丽隐杆线虫，在氧化应激下比PQT组具有更大的活性，即JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia对氧化应激均具有保护作用，且复配的JadeAging保护作用更强。
(6)线粒体健康测试
骨骼肌减少症是指与年龄相关的肌肉和力量的丧失。在骨骼肌减少症开始时观察到肌肉线粒体功能障碍，随后骨骼肌节结构发生改变，最终导致运动下降。近年来，临床研究表明尿石素A可改善线粒体健康，缓解衰老导致的肌肉衰退。本次用荧光标记肌细胞核和线粒体的秀丽隐杆线虫来评估JadeAging能否改善年龄相关的功能障碍。
目的：评估衰老保护肌肉衰退和延迟肌减少症发作的能力。
方法：用JadeAging治疗SD1347 C.秀丽隐杆线虫，荧光标记其肌肉细胞核和线粒体，使用共聚焦显微镜评估秀丽隐杆线虫成年期第2、9和12天肌肉和线粒体的健康状况。将JadeAging处理的秀丽隐杆线虫与空白组(VC组)、阳性对照(尿石素A，UrolithinA)处理的秀丽隐杆线虫进行比较。
荧光标记的SD1347 C.秀丽隐杆线虫(来源于InVivo Biosystems)，被放置在含有100μg/mL JadeAging、11.4μg/mL尿石素A及空白组(VC组)的培养皿中。在秀丽隐杆线虫成年期的第2、9和12天，用旋转圆盘共聚焦显微镜拍摄其肌肉图像，如图11所示。
图11中为秀丽隐杆线虫成年期第2、9和12天动物的最大强度投影共聚焦图像，所有图像都来自“头部”区域。健康肌肉即空白组(VC组)第2天图像中以箭头标记，呈均匀条纹；空白组(VC组)第12天图像中以箭头标记，表现为不均匀荧光。
所有图像均由6名观众进行盲法评估，他们对每张图像进行评分：0＝完全完整，1＝轻度碎片，2＝中度碎片，3＝严重碎片。比较各组图像的得分分布(图12)以及各组动物的平均得分(图13)。
正如预期的那样，随着线虫年龄的增长，分数的分布会向右移动(图12)。然而，使用JadeAging、尿石素A治疗的秀丽隐杆线虫的得分变化不如空白组(VC组)的线虫显著，即JadeAging及尿石素A组线粒体健康优于空白组(VC组)。
图13显示，JadeAging和尿石素A对相关骨骼肌减少症有显著的保护作用。在秀丽隐杆线虫成年期的第2天，所有试验组中的大多数秀丽隐杆线虫肌肉图像的得分为0或1，这表明线粒体和肌肉都很健康。到第9天，用JadeAging处理的秀丽隐杆线虫肌肉图像的碎片化分数明显低于空白组(VC组)(图12)。在第12天，线虫们老化严重，表现出严重的碎片化。然而，与空白组(VC组)的秀丽隐杆线虫肌肉图像相比，JadeAging处理的秀丽隐杆线虫肌肉图像表现出明显更少的碎片化，与尿石素A处理的秀丽隐杆线虫肌肉图像相当(图11)。
上述结果表明，JadeAging可以防止与衰老相关的肌肉和力量的损失。
如上所述，在活力测试中，JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia对秀丽隐杆线虫未表现出显著的积极作用，但均表现出优异的抗氧化特性，可保护线虫免受百草枯的有害影响。此外，JadeAging对年龄相关的肌肉衰退(骨骼肌减少症)的保护程度与临床验证的尿石素A相当(Liu et al.2022)。综上所述，这些研究结果支持了JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia对抗衰抗氧化方面的积极影响。
实施例6秀丽隐杆线虫抗衰机制研究
为了确定JadeAging发挥抗衰作用的潜在机制，进行mRNA测序(RNA-Seq)和代谢组学研究，以揭示JadeAging喂养秀丽隐杆线虫诱导的整体基因表达和代谢物变化。本实验中，我们分别用Rehmannia(地黄提取物)220μg/mL、Poria(茯苓提取物)37μg/mL、Ginseng(富含稀有人参皂苷的人参提取物)50μg/mL，JadeAging100μg/mL处理秀丽隐杆线虫后，收集幼龄(第2天)和成年(第9天)秀丽隐杆线虫，将基因表达数据映射到已知的活力相关通路来进行分析，以确定被治疗的衰老激活或抑制的相关通路。
1)基因表达通路研究
使用mRNA测序(RNA-seq)来检测基因表达，并确定哪些生物途径受到暴露于JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia的影响，以解释JadeAging对健康的有益影响，包括线粒体健康和对活性氧(ROS)的保护。
目的：确定暴露于JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia影响的秀丽隐杆线虫的遗传和细胞途径。
方法：RNA-seq用于识别暴露于衰老后差异表达的RNA转录本。
结果表明，JadeAging处理显著影响了几个在抗衰通路中具有确定作用的基因表达，包括参与抗应激和自噬的基因。在通路分析中，使用P<0.1的截断值和±1.25的倍变化来鉴定差异表达的基因。在已知的与抗衰相关的93个基因中，发现6个在暴露于JadeAging的幼龄(第2天)秀丽隐杆线虫中差异表达，5个在暴露于JadeAging的成年(第9天)秀丽隐杆线虫中差异表达，如表8所示。
表8 JadeAging组与空白组(VC组)衰老相关基因差异情况
由表8可以看出，典型抗衰通路的关键基因在经JadeAging处理的秀丽隐杆线虫中有差异表达，如下所示：
(1)胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号通路(IIS)是涉及寿命和衰老的遗传调控的途径。胰岛素受体DAF-2功能的丧失可能使线虫的寿命延长一倍以上，这是一个里程碑式的发现，有助于衰老领域的研究(Kenyon et al.1993)。在接受JadeAging治疗的秀丽隐杆线虫(第9天)中，DAF-2表达下调(表8)。
(2)雷帕霉素靶蛋白(TOR)途径是通过感应营养水平参与调节寿命的重要途径。TOR是动物生长和能量代谢的关键营养介导传感器和主调节器(Blackwell et al.2019)。通过TOR的信号转导涉及两种不同的蛋白复合物，mTORC1和mTORC2，它们调节不同的生理过程。mTORC1主要通过核糖体蛋白S6激酶(S6K)发挥作用，抑制由RSKS-1编码的S6K蛋白，显著延长寿命(Hansen等，2007)(Hansen等，2007)。试验组秀丽隐杆线虫第9天的RSKS-1略有下降(表8)。有趣的是，IIS和TOR通路还可相互作用，在DAF-2和RSKS-1中功能均下降的动物中表现出协同延长寿命(Chen et al.2013)。
(3)导致寿命延长的另一个主要机制是通过促进自噬。编码组织蛋白酶B的线虫同源基因CPR-1在经过JadeAging处理的秀丽隐杆线虫第2天显著上调(表8)，CPR-1基因可组织蛋白酶控制溶酶体内的蛋白降解，这对自噬至关重要。
促进长寿与压力相关的通路中基因也有差异表达，如下所示：
(1)中等水平的压力会引发促进长寿的保护性反应(岸本、Uno和西田2018)。转录因子SKN-1是人类核呼吸因子(Nrf)的同源物，它与DAF-16共同作用，激活对异生物和氧化应激的转录反应(Tullet et al.2008)。DAF-16/SKN-1是胰岛素信号转导的关键效应物，但也与其他长寿基因交互促进。虽然SKN-1和DAF-16的表达没有变化，但下游的应激反应效应因子谷胱甘肽转移酶(GSTs)受到了影响。JadeAging处理后第2天和第9天的秀丽隐杆线虫中GST-4均下调(表8)。相比之下，GST-5在第2天和第9天的秀丽隐杆线虫中表达上调(表8)，而GST-20在第2天的成虫中表达适度上调(表8)。
(2)DAF-16的另一个靶点是应激反应蛋白SIP-1。SIP-1表达的减少已被证明会导致寿命的减少(Morley和森本，2004年)。在缺乏RSKS-1基因的动物中，SIP-1的表达略有升高(Seo et al.2013)。第9天接受JadeAging处理的秀丽隐杆线虫中SIP-1表达上调(表8)。
(3)RNAsek(PHI-62)影响DAF-16依赖的转录，敲除它会降低寿命(McCormick etal.2012)。PHI-62在第2天接受JadeAging处理的秀丽隐杆线虫中表达下调，但在第9天未受影响(表8)。
(4)寿命延长，不仅依赖于DAF-16，还依赖于核激素受体DAF-12(Hsin和Kenyon1999)。DAF-12水平的增加会导致寿命的延长(Gerisch et al.2007)。在接受JadeAging处理的秀丽隐杆线虫第2天时，DAF12表达上调(表8)。
我们还研究了用Rehmannia(地黄提取物)、Poria(茯苓提取物)和Ginseng(含稀有人参皂苷的人参提取物)三种成分处理的秀丽隐杆线虫与长寿相关的差异表达基因。一些在JadeAging过程中表达上调的基因，如CRP-1、GST-5、GST-20，在用Ginseng处理的秀丽隐杆线虫中也表达上调。同样，GST-4在JadeAging中下调，在Poria和Rehmannia处理的秀丽隐杆线虫中也下调。另一方面，一些在JadeAging处理的秀丽隐杆线虫中差异表达的基因，如RSKS-1、SIP-1、PHI-62、DAF-12和DAF-2，在其他成分处理的秀丽隐杆线虫中没有发现显著的差异表达。
2)GO富集
在转录组学分析中，研究根据其功能分组的基因的协调调控，可以揭示在单个基因水平上不明显的生物过程的变化。GO富集分析是一种常见的方法，它根据其注释的分子功能对差异调控的基因进行分组。在此分析中，我们使用了更传统的P<0.05的显著性截断值和±1.5的倍变化截断值。结果表明，用JadeAging、Ginseng和Rehmannia处理的秀丽隐杆线虫在第2天时GO条目显著富集，汇总如表9-11。而JadeAging处理的秀丽隐杆线虫在第9天GO条目没有显著富集，Poria处理的秀丽隐杆线虫在第2天和第9天均无GO条目的富集。
表9JadeAging处理的秀丽隐杆线虫第2天GO富集
表10Ginseng处理的秀丽隐杆线虫第2天GO富集
表11Rehmannia处理的秀丽隐杆线虫第2天GO富集
JadeAging、Ginseng和Rehmannia处理过的秀丽隐杆线虫样本显示出与防御革兰氏阴性菌和先天免疫反应相关的GO富集，其中先天免疫反应的激活与寿命的增加有关(Kumar等人，2019年)。JadeAging和Ginseng处理过的秀丽隐杆线虫样本也显示出解毒和代谢、外源药物分解代谢过程和异生物代谢过程有关的GO富集。此外，待试样品处理后的秀丽隐杆线虫样本，均在氧化还原过程显示出GO富集，支持了其氧化应激抗性。
3)差异基因表达
我们在所有试验组的第2天和第9天的样本中都鉴定出了差异基因表达(图14)。其中Ginseng处理的秀丽隐杆线虫在第2天(326个)和第9天(812个)的数量最多。
结论：
利用秀丽隐杆线虫作为动物模型，利用mRNA测序来探索JadeAging产品抗衰老的作用机制。对秀丽隐杆线虫进行JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia处理，然后用RNA-Seq在秀丽隐杆线虫生命早期和后期进行分析。结果表明，JadeAging对与营养感应、应激相关途径和氧化还原过程相关的基因表达有显著影响。
GO富集分析表明，JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia处理秀丽隐杆线虫，体内氧化还原过程均显示出GO富集。此外，JadeAging、Ginseng和Rehmannia处理的样本，显示出与防御革兰氏阴性菌和先天免疫反应相关的GO富集，此前已被认为与寿命延长有关。
对JadeAging、Ginseng、Poria、Rehmannia试验组的差异表达基因(DEGs)总数进行了表征，其中Ginseng处理后样本中差异表达基因(DEGs)最高，且JadeAging组和Ginseng组之间的差异基因表达具相似性，表明它们的作用机制可能存在重叠。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，其特征在于，利用“酶解+热处理”法制备，具体步骤如下：
(1)将人参茎叶提取物干粉或人参根须提取物干粉加水配制成浓度为10～20％(w/v)的底物，调节pH至4.3～5.0；
(2)以所述干粉计，加入2～5U/gβ-葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度为40～60℃，酶解时间3～5h；酶解后进行热处理，热处理温度为115～132℃，热处理压力为70～200kPa，热处理时间为1～4h；
(3)处理后的溶液进行浓缩，浓缩温度为75～85℃，浓缩压力
-0.05～-0.09Mpa，浓缩至比重为1.1-1.2g/L，获得浓缩液；比重测定时浓缩液温度为25℃；
(4)将步骤(3)获得的浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度135-160℃，出风温度80-100℃，离心频率250～280Hz，引风频率50～60Hz，进料泵10～40RPM。
2.根据权利要求1所述的一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将人参茎叶提取物干粉或人参根须提取物干粉加水配制成浓度为15％的底物，调节pH至4.5；
(2)以所述干粉计，加入3U/gβ葡萄糖苷酶进行酶解，酶解温度为50℃，酶解时间4h；酶解后进行热处理，热处理温度为115℃，热处理压力为70kPa，热处理时间为2h；
(3)处理后的溶液进行浓缩，浓缩温度为77℃，浓缩压力-0.08Mpa，浓缩至比重为1.15g/L，获得浓缩液；比重测定时浓缩液温度为25℃；
(4)将步骤(3)获得的浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
3.根据权利要求1或2所述的一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，其特征在于，所述人参茎叶提取物干粉的制备方法如下：采用乙醇提取，乙醇浓度为70％，提取料液比为1：8，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，获得醇提液；对醇提液进行浓缩，浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05g/L，获得浓缩液；比重测定时浓缩液温度为25℃；将浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
4.根据权利要求1或2所述的一种富含稀有人参皂苷的人参提取物的制备方法，其特征在于，所述人参根须提取物干粉的制备方法如下：采用乙醇提取，乙醇浓度为60％，提取料液比为1：10，提取次数为3次，每次提取时间为3小时，获得醇提液；对醇提液进行浓缩，浓缩温度为65℃，浓缩压力-0.06Mpa，浓缩至比重为1.05g/L，获得浓缩液；比重测定时浓缩液温度为25℃；将浓缩液进行离心喷雾干燥，参数为：进风温度140℃，出风温度100℃，离心频率280Hz，引风频率50Hz，进料泵20RPM。
5.利用权利要求3所述的制备方法制备得到的富含稀有人参皂苷的人参提取物，其特征在于，得到富含稀有人参皂苷的人参茎叶提取物；所述人参茎叶提取物中稀有人参皂苷的比例≥30％。
6.利用权利要求4所述的制备方法制备得到的富含稀有人参皂苷的人参提取物，其特征在于，得到富含稀有人参皂苷的人参根须提取物；所述人参根须提取物中稀有人参皂苷的比例≥15％。
7.一种制剂，其特征在于，含有权利要求5或6所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物；所述制剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊、软糖或口服液。
8.权利要求5或6所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物在制备抗氧化、抗应激及衰老引起的肌肉衰退产品中的应用。
9.一种组合物，其特征在于，包括权利要求5或6所述的富含稀有人参皂苷的人参提取物、茯苓提取物、地黄提取物。
10.权利要求9所述的组合物在制备抗氧化、抗应激及衰老引起的肌肉衰退产品中的应用。
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