KR101821702B1 - 희귀 진세노사이드를 고함유하는, 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류 추출물, 인삼류 형성층 유래 식물줄기세포 또는 이의 추출물 제조방법 - Google Patents

희귀 진세노사이드를 고함유하는, 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류 추출물, 인삼류 형성층 유래 식물줄기세포 또는 이의 추출물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인삼류 추출물, 인삼류 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 인삼류 추출물, 인삼류 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 특정 진세노사이드 예를 들어, Rh2와 같은 희귀 진세노사이드의 함량이 증대될 수 있도록 하는 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 인삼류 추출물, 인삼 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료와 혈행 개선용 조성물 또는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

희귀 진세노사이드를 고함유하는, 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류 추출물, 인삼류 형성층 유래 식물줄기세포 또는 이의 추출물 제조방법{Method of Preparing Extract, Plant Stem Cell Derived from Cambium of Panax Ginseng, or Extract Thereof Including Wild Ginseng or Ginseng With High Amount of Rare Ginsenoside}
본 발명은 희귀 진세노사이드의 함량이 증대될 수 있도록 하는 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료와 혈행 개선용 조성물 또는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
인삼은 인삼속 (Panax)에 속하는 식물로, 뿌리를 약용으로 이용하고 있다. 인삼의 효능은 인삼에 존재하는 활성성분인 진세노사이드에 기인한 것으로, 진세노사이드는 진세노사이드 아글리콘 (aglycone)의 구조에 따라서 프로토파낙사다이올계 진세노사이드 (Protopanaxadiol-type ginsenosides), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드 (Protopanaxatriol-type ginsenosides), 그리고 올레아난계 진세노사이드 (Oleanane-type ginsenoside)의 세가지로 분류될 수 있다. 진세노사이드 유도체들은 트리터펜 (triterpene)인 비당부 (protopanaxadiol 또는 protopanaxatriol)의 R1, R2, R3의 알콜성 OH기에 글루코스, 람노스, 자일로스, 아라비노스와 같은 당류가 에스테르 결합된 구조를 갖는 화합물로서, 현재 알려져 있는 인삼의 주요 진세노사이드는 약 13종의 일반 진세노사이드와 이로부터 전환되는 것으로 알려진 희귀 진세노사이드 약 11종이 대표적인 진세노사이드로 알려져 있다.
인삼은 수삼(fresh ginseng)을 그대로 사용하거나, 건조시켜 백삼(white ginseng)의 형태로 제조하여 사용하거나, 또는 증숙시켜 홍삼(red ginseng)의 형태로 제조하여 사용될 수 있다.
인삼 중 수삼에는 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 배당체 진세노사이드가 주를 이루고 있으며, 가공 인삼의 경우 수삼에는 거의 존재하지 않는 희귀 진세노사이드인 Rg3, Rh1, Rh2, Compound K의 함량이 증가할 수 있는 것으로 알려져 있다.
최근에는, 이들 가공된 인삼에만 존재하는 인삼사포닌의 함량을 더욱 높이기 위한 많은 연구가 활발하게 수행되고 있다.
대표적 가공 인삼인 홍삼은 수삼을 증숙하여 제조할 수 있으며, 이 과정에서 화학구조적으로 불안정한 진세노사이드 아글리콘의 C-20위치에 결합되어 있는 배당체의 결합이 가수분해될 수 있다. 이러한 과정을 통해 가공된 홍삼에는 진세노사이드 Rh1, Rh2, Rg2, Rg3 등이 수삼이나 백삼에 비해 많이 함유되어 있다. 다만, 희귀 진세노사이드의 일종인 진세노사이드 Rh2는 홍삼에서도 그 함량이 매우 미량으로 존재하고 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 가공된 인삼에서 암 예방, 암 억제, 혈압강하, 뇌신경세포 보호, 항혈전, 항산화 등에서의 약리 활성 효과가 인삼의 일반 진세노사이드보다 우수하게 나타난다는 결과가 알려지면서, 가공된 인삼에 존재하는 희귀 진세노사이드를 수득하기 위한 여러 방법들이 시도되고 있다. 가장 잘 알려진 방법으로서, 미생물을 이용하거나, 산 및 효소로 인삼을 가수분해하여 특정 진세노사이드의 함량을 증대시키는 방법이 있다.
이러한 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 배양하고, 배양된 형성층 유래 줄기세포를 열처리하는 단계를 포함하는 제조방법을 통해, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 중 목적하는 특정 진세노사이드의 함량을 증대시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 특정 진세노사이드 예를 들어, 별도 처리하지 않은 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물에는 거의 존재하지 않는 희귀 진세노사이드의 함량이 증대될 수 있도록 하거나, 별도 처리하지 않은 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물에 존재하는 일반 진세노사이드를 희귀 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 효과적인 인삼류 추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 또는 이의 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 (Cambial Meristematic Cells, 이하 CMCs) 또는 이의 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함하는, 희귀 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 Protopanaxadiol (이하, PPD) 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 희귀 진세노사이드 함량이 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 인삼 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함하는, 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조되고, 희귀 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 희귀 진세노사이드 함량이 열처리 전과 비교하여 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈행 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈행 개선방법을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 간 기능 개선방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 약리 활성이 높은 Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 희귀 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물 또는 인삼 추출물을 단순화된 공정을 통해 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 열처리 전 정치 과정 진행시 HPLC를 통해 검출된 희귀 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다. (A: 85℃/24hr/추출, B: 85℃/48hr/추출, C: 85℃/72hr/추출)
도 2는 열처리 전 정치 과정 미진행시 HPLC를 통해 검출된 희귀 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다. (A: 85℃/24hr/추출, B: 85℃/48hr/추출, C: 85℃/72hr/추출)
도 3는 열처리 전 정치 기간에 따라 HPLC를 통해 검출된 희귀 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 교반 진행 여부에 따라 HPLC를 통해 검출된 희귀 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 산삼 CMCs, 인삼, 홍삼, 산양삼 또는 산삼 배양근을 시료로 하여 열처리 전 일반 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다. (A: 산삼 CMCs, B: 인삼, C: 홍삼, D: 산양삼, E: 산삼배양근)
도 6은 산삼 CMCs, 인삼, 홍삼, 산양삼 또는 산삼 배양근을 시료로 하여 열풍건조 및 열처리를 통해 검출된 희귀 진세노사이드 분석 결과를 나타낸 것이다. (A: 산삼 CMCs, B: 인삼, C: 홍삼, D: 산양삼, E: 산삼배양근)
도 7는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 산삼 CMCs의 항당뇨 효과를 OGTT (Oral glucose tolerance test)를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 산삼 CMCs의 혈소판 응집 억제능을 평가 (Anti-platelet assay)한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 산삼 CMCs의 간염 관련 간 기능 개선 효과를 평가한 결과를 나타낸 것이다 (ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; GalN,D-galactosamine).
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함하는, 희귀 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 희귀 진세노사이드 함량이 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 인삼 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함하는, 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 종래 증숙하거나 산, 효소 또는 미생물 처리하는 방법이 아닌, 배양된 인삼류 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에 열처리하는 과정을 통해 희귀 진세노사이드, 그 중에서도 특히 Rh2의 함량을 현저하게 증대시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 인삼류의 형성층 조직으로부터 분리된 선천적으로 미분화된 세포로서, 동질적인 세포이고, 캘러스로의 탈분화과정을 거치치 아니하였으며, 분열조직적 연속성을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 출원의 발명자들은 최초로 식물의 형성층으로부터, 탈분화된 캘러스와 달리, 선천적으로 미분화된 동질적 세포인 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 분리하였다. 한국등록특허 제1064518호에 인삼류의 형성층 유래 줄기세포의 분리방법을 구체적으로 개시하였으며, 이는 본 출원에 참조로서 도입될 수 있다.
선천적으로 미분화된 세포로서, 동질적인 세포이고, 캘러스로의 탈분화과정을 거치치 아니하였으며, 분열조직적 연속성을 가지는 인삼류의 형성층 유래 줄기세포라면, 그 유래는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 본 발명에 따른 형성층 유래 줄기세포는 백삼, 산삼, 산양삼 또는 장뇌삼의 형성층 유래 줄기세포일 수 있다. 이 때, 사용 가능한 인삼류의 원산지는 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 국내산, 미국산, 일본, 히말라야, 베트남, 중국산을 사용할 수 있다. 사용 가능한 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 예를 들어, 줄기세포 생체, 분말, 농축액 또는 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 분말 또는 추출물 (일반 진세노사이드 추출물)을 주로 사용하여 희귀 진세노사이드로 전환시킬 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 시판되는 어떠한 형태라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
줄기세포의 추출물 또는 인삼 추출물은 통상적으로 사용되는 방법을 제한없이 사용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 줄기세포 또는 인삼 건조물의 1중량부당 10-500 중량부의 증류수를 혼합하여 50-100℃의 온도에서 추출할 수 있다.
이와 관련하여, 본 출원의 발명자들은 공지의 인삼, 홍삼, 산양삼 또는 산삼 배양근을 사용하는 경우에는 본 발명의 제조방법을 적용하여도 Rh2와 같은 희귀 진세노사이드의 함량이 목적하는 정도로 증가하는 것을 기대할 수 없으나, 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포에 열처리하는 단순 공정을 통해, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 중 Rh2와 같은 희귀 진세노사이드의 함량을 현저하게 증대시킬 수 있음을 확인하였다.
상기 Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 또는 PPD와 같은 진세노사이드는 희귀 진세노사이드로, 별도 처리하지 않은 미가공의 인삼에 극미량으로 포함되거나, 거의 존재하지 않거나 또는 존재하지 않는 진세노사이드이다. 그러나, 본 발명의 제조방법에 따르면, 별도 처리하지 않은 미가공의 인삼 추출물, 인삼류 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에 주로 포함된 진세노사이드 예를 들어, Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Gypenoside XVII 또는 F2 (이하, 일반 진세노사이드)가 열처리 공정을 통해 희귀 진세노사이드로 전환된다. 그래서, 별도 처리하지 않은 미가공 (열처리하지 않은 미가공)의 인삼 추출물, 인삼류 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물과 비교하였을 때 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 희귀 진세노사이드의 함량이 증대된다.
경우에 따라서, 본 발명에 따르면 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물 중 희귀 진세노사이드로 명명된 Rh2와 Rg3, Rg5 및 PPD 또는 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD 전부의 함량이 증대될 수 있다.
또한, 상기 인삼 추출물 중 Rh2와 Rg3, Rg5, PPD의 진세노사이드 함량이 별도 처리하지 않은 미가공 (열처리하지 않은 미가공)의 인삼 추출물과 비교하여 증대될 수 있다.
희귀 진세노사이드의 함량 증대는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 일반 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드로의 전환을 의미할 수 있으며, 본 발명에 따라 제조된 인삼추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에서 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드가 총 진세노사이드를 기준으로 80 내지 100 중량%, 90 내지 98 중량%로 포함됨을 의미할 수 있다. 이 때, 희귀 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드가 80 내지 100 중량%로 포함되는 경우, 예를 들어 Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Gypenoside XVII 또는 F2와 같은 일반 진세노사이드 함량은 20 내지 0 중량%일 수 있다.
상기 희귀 진세노사이드가 진세노사이드 총 함량을 기준으로 100 중량%로 포함되는 경우, 처리 전 인삼추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에 포함된 일반 진세노사이드가 전부 희귀 진세노사이드로 전환된 것일 수 있다. 이 때, 희귀 진세노사이드는 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 희귀진세노사이드이다.
이 때, Rh2는 희귀 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 및 PPD 총 중량을 기준으로 10 내지 35 중량%, 11 내지 33 중량%로 포함될 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 인삼추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물과 달리, 인삼, 산양삼, 산삼 배양근의 경우 본 발명에 따른 제조방법을 적용하더라도, Rh2는 인삼추출물, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에 포함된 희귀 진세노사이드의 3-8%에 불과함을 확인하였다.
상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 본 출원인의 한국등록특허 제1064518호에 따라 분리될 수 있고, 분리된 줄기세포를 배양하는데 예를 들어, 증식을 위한 배양 (증식배양) 및 생산을 위한 배양 (생산배양) 단계를 거쳐 배양될 수 있다.
상기 증식배양에 사용된 배지는 수크로즈가 3% 첨가된 MS 배지로(Murashige and Skoog's, 1962) 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 접종한 다음, 배양에 적합한 에어 유량 조건에서 약 13일간 배양될 수 있다.
상기 생산배양에 사용된 배지는 3% 갈색 설탕이 첨가된 modified MS 배지로 증식배양이 완료된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 접종한 다음, 추가로 엘리시터를 처리하여 배양에 적합한 에어 유량 조건에서 약 11일간 배양될 수 있다.
상기 엘리시터의 예로는 메틸 자스모네이트 (methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모 (yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난 (glucomanan), 글루칸 (glucan), 페닐알라닌 (phenylalanine), 벤조산 (benzoic acid), 살리실산 (salicylic acid), 아라키돈산 (arachidonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰 (ethephon), 히푸익산 (hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트 (amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트 (vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산 (p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드 (brassinosteroids), 소디움알지네이트 (sodium alginate), 아세트산나트륨 (sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질이며, 바람직하게는 메틸 자스모네이트를 사용할 수 있다. 이 때, 엘리시터로 첨가되는 메틸 자스모네이트는 50~200μM의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 증식배양 및 생산배양을 통해 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포에서는 일반 진세노사이드 예를 들어, Rg1, Re, Rb1, Rb2, Rc, Rd, Gypenoside XVII 또는 F2가 확보될 수 있으며, 희귀 진세노사이드 예를 들어, Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 또는 PPD는 검출되지 않을 수 있다.
이후, 본 발명은 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함함으로써, 일반 진세노사이드로부터 희귀 진세노사이드로의 전환을 통해 희귀 진세노사이드의 함량이 증대된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 제조할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은 열처리 단계 전에 이전에 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 증류수에 분산시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
경우에 따라서 증류수에 분산시키기 전 동결건조를 추가로 수행할 수 있다. 동결건조를 통해, 편리하게 관리 및 보관할 수 있으며, 세포 내 수분 및 수분 중 존재하는 미생물 등을 일부 제거할 수 있을 뿐 아니라, 수분으로 인해 생길 수 있는 미생물의 번식을 억제할 수 있다.
인삼류의 형성층 유래 줄기세포 분산에 사용되는 증류수는 건조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 1 중량부 당 1 내지 200 중량부, 건조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 1 중량부 당 30 내지 200 중량부일 수 있다. 건조되지 않은 줄기세포를 사용하는 경우, 증류수는 건조되지 않은 줄기세포 1 중량부 당 2 내지 15 중량부, 건조되지 않은 줄기세포 1 중량부 당 2.5 내지 10 중량부일 수 있다.
전술한 범위 내에서 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 기준으로 증류수의 비율이 증가할수록 일반 진세노사이드 함량이 낮아지면서, 희귀 진세노사이드의 함량이 증가할 수 있다.
이후, 증류수에 분산된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 정치시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 정치는 증류수와 혼합된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 예를 들어, 1 내지 35℃의 온도, 10 내지 24℃의 온도에서 1 내지 15일 동안, 2 내지 10일 동안 정치함으로써 수행될 수 있다.
이러한 단계를 포함하여 제조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 일반 진세노사이드 함량이 거의 존재하지 않거나, 존재하지 않으며, 희귀 진세노사이드 함량이 매우 높게 증가함을 확인하였다. 특히, 전술한 범위에서 정치시간이 증가함에 따라, 희귀 진세노사이드 중 Rh2의 함량이 크게 증가함을 확인하였다.
또 하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 제조방법은 열처리 단계 전에 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 열풍건조하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계를 포함하여 제조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포에는 일반 진세노사이드가 거의 존재하지 않거나, 존재하지 않으며, 희귀 진세노사이드 함량이 매우 높게 증가함을 확인하였다. 특히, 희귀 진세노사이드 중 Rh2의 함량이 크게 증가함을 확인하였다.
상기 열풍건조는 예를 들어, 45 내지 75℃의 온도, 50 내지 70℃의 온도로 조정된 열풍건조기 중에서 수행될 수 있으며, 이 때 열풍건조는 예를 들어 24 내지 72 시간, 30 내지 60 시간 동안 지속될 수 있다. 전술한 범위 내에서 열풍건조하여 제조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포에서는 희귀 진세노사이드 함량이 매우 높게 증가함을 확인하였다. 특히, 희귀 진세노사이드 중 Rh2의 함량이 크게 증가함을 확인하였다.
이후, 본 발명에 따른 제조방법은 상기 정치되거나 열풍건조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 열처리 하는 단계를 포함한다. 상기 열처리는 85 내지 160℃의 온도에서 증류수를 이용한 열수 추출을 의미할 수 있다.
정치된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 정치 이전에 증류수 중 분산되어 있는 상태이므로 85 내지 160℃의 열을 가하여 즉시 열처리될 수 있고, 열풍건조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 추가로 증류수에 분산되어 열처리될 수 있다. 이 때, 증류수는 건조된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 1 중량부 당 1 내지 200 중량부, 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 1 중량부 당 30 내지 200 중량부로 혼합할 수 있다.
상기 열처리는 형성층 유래 줄기세포에 85 내지 160℃의 온도, 85 내지 115℃의 온도, 95 내지 115℃의 온도로 열을 가하여 수행될 수 있다. 일반 진세노사이드가 희귀 진세노사이드로 전환되는데 적합한 온도 범위를 확인하였고, 전술한 온도 범위 내에서 희귀 진세노사이드의 함량 증가가 확인되었으며, 범위 내에서 온도가 높아질수록 일반 진세노사이드의 함량은 낮아지면서 희귀 진세노사이드 함량이 증대 또는 일반 진세노사이드가 모두 희귀 진세노사이드로 전환될 수 있다.
상기 열처리는 예를 들어, 10분 내지 72시간, 24 시간 내지 72 시간, 48 시간 내지 72 시간 동안 수행될 수 있다. 일반 진세노사이드가 희귀 진세로사이드로 전환되는데 적합한 열처리 시간 범위를 확인하였고, 전술한 시간 범위 내로 열처리한 인삼류의 형성층 유래 줄기세포에서 희귀 진세노사이드가 검출되었으며, 전술한 시간 범위 내에서 시간이 증가할수록 일반 진세노사이드의 함량은 낮아지면서 희귀 진세노사이드 함량이 증대되거나, 또는 일반 진세노사이드가 모두 희귀 진세노사이드로 전환될 수 있다.
상기 열처리는 대기압 하에서 수행될 수 있으나, 온도가 높아지면서 압력 역시 상승할 수 있으며, 전술한 온도 범위의 열이 가하여지는 경우 예를 들어 상압 (0.57 내지 6.1의 기압 범위)에서 수행될 수 있다.
상기 열처리 중 교반하는 과정을 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 교반 조건은 예를 들어, 10 내지 200 rpm, 30 내지 180 rpm으로 교반할 수 있다. 전술한 조건의 교반 과정을 포함하는 경우 미교반 하는 경우에 비해 희귀 진세노사이드 함량이 더욱 증대될 수 있으며, 교반 조건에서 목적하는 희귀 진세노사이드의 함량이 증대되거나, 또는 희귀 진세노사이드로 전환되는데 소요되는 시간이 단축될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 제조방법에 의해 제조된, 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 증가된 것을 특징으로 하는 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 진세노사이드 Rh2와 Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 증가된 인삼 추출물에 관한 것이다.
앞서 언급한 희귀 진세노사이드 또는 이의 함량과 관련된 구성은 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물 및 인삼 추출물과 관련된 발명에도 동일하게 적용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다. 희귀 진세노사이드 함량이 증대된 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물 또는 인삼 추출물은 유의한 내당능을 나타내어 항당뇨 효과를 보임을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈행 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 혈행 개선방법에 관한 것이다. 희귀 진세노사이드 함량이 증대된 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물, 또는 인삼 추출물이 우수한 혈소판 응집 억제능을 보여, 혈행 개선에 유의한 효과가 있음을 확인하였다.
상기 혈행은 혈구수(hematocrit), 점성(viscosity), 혈액에 의한 전단 응력(shear stress) 등과 같은 물리적인 요소뿐만 아니라 혈중 지질 조성의 변화, 혈구세포(혈소판) 등에 의해 조절될 수 있는데, 정상 상태에서는 항상성을 잘 유지하지만, 당뇨 등과 같은 질병 상태, 약물, 흡연 등에 의해 혈행 조절 기능이 교란되면 혈장, 혈소판, 적혈구 등이 과도하게 응집되고 비정상적인 지혈(abnormal haemostasis)이 발생하여 혈액의 흐름이 저해되게 된다. 또한 활성화 혈소판 응집이 촉진되면, 혈류의 항상성을 파괴하여 혈행장애가 동맥경화, 뇌졸증, 심혈관질환, 심근경색, 심허혈질환 및 뇌혈관질환의 발명을 유발시키는 원인이 되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 혈행 개선용 조성물은 혈전 생성을 저해하여 혈행 개선에 도움을 주므로 세포와 각 기관의 노화를 방지하고, 세포의 성장과 재생을 촉진할 수 있는데, 혈행 개선을 통해 예를 들어 동맥경화증, 뇌출혈, 뇌졸증 및/또는 뇌경색 등의 혈액 순환 장애 및/또는 말초혈관 혈행 장애, 수족 냉증, 두피 혈액 순환 장애로 인한 탈모 증상 등을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물, 또는 인삼 추출물, 또는 이를 포함한 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 간 기능 개선방법에 관한 것이다.
본 발명에서 간 기능 개선은 예를 들어 지방간 질환의 예방 또는 치료를 포함할 수 있고, 상기 지방간 질환은 알콜성 지방간 질환, 비알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환 또는 지방간염일 수 있다. 또한, 간 기능 개선은 간질환 예를 들어, 간경화증, 알콜성 간경변, 지방간, 중독성 간질환, 급·만성 간염의 예방 또는 치료를 포함할 수 있다.
희귀 진세노사이드 함량이 증대된 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물, 또는 인삼 추출물이 유의한 간염 개선, 비알콜성 지방간 유도 개선 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명에 따른 조성물은 인삼류의 형성층 유래 줄기세포, 이의 추출물 또는 인삼 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 대략 2,000g/kg/일 범위이다.
"약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포는 예를 들어, 기능성 식품의 형태로 제공될 수 있다. 상기 "기능성 식품"은 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하여 질병의 예방 또는 치료 효과를 보이는 기능을 나타내는 식품을 의미한다.
상기 기능성 식품은 예를 들어 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태일 수 있고, 기타 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 필요에 따라 포함할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 희귀 진세노사이드로 전환된 인삼 추출물
1. 희귀 진세노사이드로 전환된 인삼 추출물의 제조
증류수에 Panax ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer)뿌리 추출물 분말 (Xian LVSEN사)을 30:1(0.033%)의 농도로 넣어 녹이고, 120℃, 상압 조건에서 48시간 동안 열처리하였다. 추출물을 식힌 후, 침전물만 회수하였다. 수거된 침전물을 동결건조 하였다.
2. HPLC 분석
희귀 진세노사이드 분석에 Agilent HPLC 1260 DAD system을 사용하였으며 Agilent사의 Zorbax Eclipse plus C18 (4.6 x 100mm, 3.5㎛) column을 사용하였다. DAD 검출기의 검출파장은 UV 203nm, column 온도는 30℃에서 분석하였고 이동상(mobile phase)은 0.05% 트리플로로 초산(trifluoroacetic acid)이 이 함유된 물과 아세토니트릴을 사용하여 flow rate 1mL/min으로 분석하였다. 일반 진세노사이드와 희귀 진세노사이드 분석은 이동상(mobile phase)의 비율을 조절하여 분석을 진행하였다. 분석에 사용한 진세노사이드 표준품은 Chromadex(USA), Sigma-Aldrich(USA) 및 Ambo Institute(Korea)에서 구매하여 사용하였다. 희귀 진세노사이드 Rk2, Rh3는 표준품이 없어 정량분석을 진행하지 못하였고, 분리동정과 LC/MS로 정성적 확인만 진행하였다. 분석에 사용한 용매는 Acetonitrile(Merck, Germany), Methanol(J.T Baker, USA), Trifluoroacetic acid (Daejung, Korea)사에서 구입하였다. 각각의 시료는 대상에 따라 메탄올과 물 비율을 조절하여 진세노사이드 추출을 진행하였고 0.2 ㎛ filter로 여과한 후 분석을 진행하였다. 희귀 진세노사이드로 전환 여부를 확인하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[표 1] 인삼 추출물 중 전환된 희귀 진세노사이드
Figure 112015081942970-pat00001
* 각 수치는 인삼추출분말 1g에 함유된 ginsenoside 함량(mg)을 나타냄
[실시예 2] 희귀 진세노사이드로 전환된 산삼 CMCs (Cambial meristematic cells) 분말의 제조
1. 산삼 CMCs의 배양
Panax Ginseng (wild ginseng, 강원도, 한국)의 형성층에서 산삼 CMCs를 수득하였다. 산삼 CMCs (Wild ginseng CMCs)는 250mL 플라스크, 3L 생물반응기, 20L 생물반응기, 250L 생물반응기 단계로 점진적 스케일-업이 진행되었다.
일반적으로 식물세포 배양에서 세포 분열을 유도하기 위한 식물 생장조절제인 2,4-다이클로로페녹시아세틱 에시드 (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)나 나프탈렌아세틱 에시드(naphthaleneacetic acid)가 사용되는데, 산삼 CMCs 는 생장조절제가 첨가되지 않고 산삼 CMCs가 증식되는 조건을 확립하여 유지되고 있다. 산삼 CMCs의 생체중을 확보하기 위한 증식 배양조건은 MS 배지에 3% 수크로즈가 첨가된 배지를 사용하였고 (Murashige and Skoog's, 1962), MS 배지의 pH는 5.8로 조정되었으며, 13일간 배양되었다.
증식 배양이 완료된 후 생산 배양은 modified MS 배지에 3% 갈색 설탕이 첨가된 생산 배지에 100㎛ 메틸 자스모네이트를 처리하여, 11일간 진행되었다. 증식 배양 및 생산 배양은 동일한 배양실에서 진행되었으며, 배양실 온도는 21ㅁ1℃, 암배양 조건으로 배양되었다.
2. 희귀 진세노사이드로 전환된 CMCs의 제조
증식 배양 및 생산 배양을 통해 바이오메스와 일반 진세노사이드 (Rb1, Rb2, Rc, Rd)를 확보한 후 5일간 에어-오프(air-off) 시킨 후 배양실에서 정치하였다. Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, PPD 등 희귀 진세노사이드를 획득하기 위하여, 추출기에서 열처리 하였다. 열처리 공정을 통해 일반 진세노사이드에서 희귀 진세노사이드인 Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 및 PPD로 전환시킨 후 바이오메스를 수거 후 건조(동결건조 또는 열풍건조) 하였다.
3. HPLC 분석
산삼 CMCs의 희귀 진세노사이드 분석은 실시예 1에서와 동일하게 진행하였다.
시험예 1: 물 추출 비율에 따른 희귀 진세노사이드 전환율 비교
실시예 2에서 항목 2를 진행함에 있어 항목 1 진행 후 건조된 산삼 CMCs 1 중량부당 30 내지 200 중량부의 증류수 혼합물을 추출기를 통해 85℃에서 24시간 열처리하여 일반 진세노사이드를 희귀 진세노사이드로 전환시키는데 적합한 비율을 확인하였다.
[표 2]
Figure 112015081942970-pat00002
* 각 수치는 건조된 산삼 CMCs 1g에 함유된 ginsenoside 함량 (mg)을 나타냄
표 2를 참조하면, 열처리 온도 85℃ 및 열처리 시간 24h 조건에서의 산삼 CMCs는 증류수의 비율이 증가할수록 대부분의 일반 진세노사이드 함량이 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
시험예 2: 열처리 온도 조건에 따른 희귀 진세노사이드 전환율 비교
실시예 2에서 항목 2를 진행함에 있어 항목 1 진행 후 건조된 산삼 CMCs 1 중량부당 100 중량부의 증류수 혼합물을 추출기를 이용하여 85℃ 내지 115℃에서 24시간 열처리하여 일반 진세노사이드를 희귀 진세노사이드로 전환시키는데 적합한 온도를 확인하였다.
[표 3]
Figure 112015081942970-pat00003
* 각 수치는 건조된 산삼 CMCs 1g에 함유된 ginsenoside 함량 (mg)을 나타냄
표 3을 참조하면, 물 추출 비율 1:100 및 열처리 시간 24hr 조건에서의 산삼 CMCs는 열처리 온도가 증가할수록 대부분의 일반 진세노사이드 함량이 낮아지는 것을 확인할 수 있다.
시험예 3: 열처리 시간 조건에 따른 희귀 진세노사이드 전환율 비교
실시예 2에서 항목 2를 진행함에 있어 항목 1 진행 후 건조된 산삼 CMCs 1 중량부당 100 중량부의 증류수 혼합물을 추출기 85℃에서 24시간 내지 72시간 열처리하여 일반 진세노사이드를 희귀 진세노사이드로 전환시키는데 적합한 시간을 확인하였다.
[표 4]
Figure 112015081942970-pat00004
* 각 수치는 건조된 산삼 CMCs 1g에 함유된 ginsenoside 함량 (mg)을 나타냄
표 4를 참조하면, 물 추출 비율 1:100 및 열처리 온도 85℃ 조건에서의 산삼 CMCs는 열처리 시간이 증가할수록 대부분의 일반 진세노사이드 함량이 거의 존재하지 않는 것을 확인할 수 있다.
시험예 4: 정치 진행 여부에 따른 희귀 진세노사이드 생산성 비교
실시예 2의 항목 2와 동일하게 산삼 CMCs를 제조하되, 열처리 전 정치 과정을 진행하지 않은 산삼 CMCs를 추가로 제조하였다. 열처리 전 정치 과정 (5일)을 진행한 결과를 미진행한 경우와 비교하여, 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1 및 도 2를 참조하면, 정치 과정을 진행하지 않은 도 2와 달리, 정치 과정을 진행한 경우 도 1에 도시된 바와 같이 희귀 진세노사이드 중 Rh2 및 PPD의 함량 증가가 나타남을 확인할 수 있다.
시험예 5: 정치 과정 진행 기간에 따른 희귀 진세노사이드 생산성 비교
실시예 2의 항목 2와 동일하게 산삼 CMCs를 제조하였으며(95℃/48hr), 열처리 전 정치 과정 진행 기간에 따른 희귀 진세노사이드 함량을 도 3 및 표 5에 나타내었다. 도 3 및 표 5를 참조하면, 정치 과정 기간이 늘어남에 따라 희귀 진세노사이드 중 Rh2의 함량 증가가 나타남을 확인할 수 있다.
[표 5]
Figure 112015081942970-pat00005

시험예 6: 교반 진행 여부에 따른 희귀 진세노사이드 생산성 비교
실시예 2에서 산삼 CMCs 생체중 1 중량부당 2.5 내지 10 중량부의 증류수 (건체중 1 중량부당 50 내지 200 중량부의 증류수) 혼합물을 95℃/48hr 열처리 중 30 내지 180 rpm의 조건으로 교반을 진행하였는지 여부에 따라 희귀 진세노사이드에 함량 변화가 있는지 여부를 확인하였다. 도 4 및 표 6를 참조하면, 교반을 진행한 경우 미교반한 경우에 비하여 희귀 진세노사이드 Rg3, Rh2, Rg5 및 PPD 함량이 높은 것을 확인할 수 있다.
[표 6]
Figure 112015081942970-pat00006

[실시예 3] 열풍건조 및 열처리 진행
실시예 2의 항목 1과 동일하게 산삼 CMCs를 제조하고, 60℃/48hr 동안 열풍건조 (HK-06H, ㈜한국기술이엔지) 후 분말화 (120 mesh)한 다음, 분말 1 중량부 당 100 중량부의 증류수를 첨가하여 95℃, 48hr 동안 열수추출 하였다. 또한 인삼, 홍삼, 산양삼, 산삼배양근도 동일한 조건에서 열처리하였다.그 결과를 도 5, 도 6, 표 7 및 8에 나타내었다.
[표 7]
Figure 112015081942970-pat00007
[표 8]
Figure 112015081942970-pat00008

도 5 및 표 7을 참조하면, 열풍건조된 산삼 CMCs는 다른 인삼류에 비하여 일반 진세노사이드 Gypenoside XVII 과 F2 함량이 높은 것을 확인할 수 있고, 열처리 진행시 다른 인삼류에 비하여 희귀 진세노사이드 Rh2 함량이 독보적으로 높은 것을 확인할 수 있다. 홍삼을 제외한 인삼, 산양삼, 산삼 배양근의 경우 건조하지 않은 생체 (fresh) 상태로 구매하여 동일한 조건으로 열풍건조를 진행하였으나, 희귀 진세노사이드 Rh2 생산성에 영향을 미치는 일반 진세노사이드 Gypenoside XVII 과 F2 함량이 높아지는 것을 확인할 수 없었고, 열처리 진행 시 희귀 진세노사이드 Rh2 함량이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 현상의 원인은 Gypenoside XVII 및 F2와 같이 C-3 탄소 위치에 글루코스 분자 1개가 붙어있는 구조가 Rh2를 수득하기에 유리한 것이기 때문인 것으로 판단된다. Gypenoside XVII 및 F2의 경우, C-20 탄소 위치에 각각 당분자가 2개, 1개가 붙어 있고, C-3 탄소 위치에 1개의 당이 붙어 있는데, 열에 의해 C-20 탄소 위치에 붙어 있는 당들의 경우 쉽게 탈리되고, C-3 탄소 위치에 당이 1개만 붙어 있을 경우에 Rh2가 획득되기 때문에, 이러한 결과가 수득되는 것으로 판단된다.
또한, 본 발명에 따른 열처리 방법은 도 6 및 표 8에서와 같이 일반 진세노사이드의 대부분을 희귀 진세노사이드로 전환시킬 수 있는데, 건조하지 않은 생채 상태의 산삼 CMCs는 세포 수준에서, 동결건조 및 열풍건조된 산삼 CMCs는 분말화된 상태에서 열을 전달 받기 때문에 열 전달 효율이 높아 희귀 진세노사이드 전환율에 우위성을 가진다. 예를 들어, 홍삼 제조시 인삼의 고유 형태를 유지한 상태로 증숙과정을 진행하는데, 대부분 희귀 진세노사이드 함량이 낮고 일반 진세노사이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있는데, 인삼을 분말화 하여 본 발명에 따른 열처리 방법을 처리할 경우 대부분 희귀 진세노사이드로 전환되는 것을 확인할 수 있고, 희귀 진세노사이드 Rg3 함량도 높은 것을 확인할 수 있다.
이와 같이, 공지의 홍삼, 인삼, 산양삼, 산삼 배양근과 달리 본 발명에 따른 제조방법을 적용한 산삼 CMCs에서 Rh2를 포함한 희귀 진세노사이드의 현저한 함량 증가를 보이는 것은 산삼 CMCs가 세포 단위에서 열처리 되거나, 최종 건조 후 분쇄 및 분체 산물이 열처리 되었을 때의 입자 크기가 수백 nm ~ 수십 ㎛이어서 열전달 효율이 높기 때문에, PPD라는 아글리콘(aglycone)에서 C-20번 탄소(carbon) 위치에 붙은 당들이 쉽게 탈리 되기 때문인 것으로 판단된다.
희귀 진세노사이드의 함량을 증가시키기 위한 여러 시도가 있었으나, 홍삼, 인삼, 산양삼, 산삼 배양근을 이용하는 경우 다양한 처리(열, 효소, 산, 염기처리 등)를 하더라도 조직(tissue) 수준에서 진행된 것이므로, C-20 위치에서 당 제거 효율이 낮아 희귀 진세노사이드 함량 증가 정도가 매우 낮은 것으로 판단된다.
[실시예 4] 희귀 진세노사이드로 전환된 산삼 CMCs 추출물
1. 희귀 진세노사이드로 전환된 산삼 CMCs 추출물의 제조
건조된 산삼 CMCs 건체중 1 중량부당 50 내지 200 중량부의 증류수를 혼합하여 75도에서 18시간 추출하였다. 산삼 CMCs와 추출물을 분리하고, 0.2㎛ 필터를 통해 여과하여 산삼 CMCs 추출물을 제조하였다. 제조된 산삼 CMCs 추출물을 고온고압기 (포스엔텍, MSR-3L-150/250-MD-S6-SYS)에 넣고 140℃, 150℃, 160℃, 상압 조건에서 60분 동안 열처리하였다. 산삼 CMCs 추출물을 식힌 후 침전물만 회수하고, 수거된 침전물을 동결건조 하였다.
2. HPLC 분석
산삼 CMCs 추출물의 희귀 진세노사이드 분석은 실시예 1에서와 동일하게 진행하였다. 희귀 진세노사이드로 전환 여부를 확인하고, 그 결과를 표 9에 나타내었다.
[표 9] 산삼 CMCs 추출물 중 전환된 희귀 진세노사이드
Figure 112015081942970-pat00009

시험예 7: 산삼 CMCs의 항당뇨 효과
OGTT (Oral glucose tolerance test)를 통해 실시예 2에서 제조된 산삼 CMCs의 항당뇨 효과를 확인하였다. 열처리는 95℃에서 48hr 진행하였으며 70% 에탄올로 추출한 추출물을 경구투여 하였다. C57BL/6J mice (8주령, 수컷)을 하룻밤 동안 절식시켰다. C57BL/6J mice의 무게와 혈당을 측정한 후 2 g/kg의 D-glucose를 경구로 투여시켰다. 이 때, 음수는 제공하나 사료는 제공하지 않았다. 30분 시간 간격을 두고 2시간 동안 혈당의 변화를 측정하였다.
그 결과를 도 7 및 표 10에 나타내었다. D-glucose를 경구 투여하였을 때 정상군(Normal)에 비해 당뇨군(DM)에서는 당 내성이 거의 없었으며, 대조군으로 항당뇨 분야의 건기식으로 인정된 난소화성 말토덱스트린 (RMD) 및 홍삼추출물 (RG-200)과 산삼 CMCs 추출물을 비교하였다. 그 결과, 산삼 CMCs (산삼CMCs-200)는 건기식으로 인정된 시료들에서 나타난 내당능을 나타내는 항당뇨 효과를 보였다.
[표 10] 혈중 글루코스 농도 (mg/dL)
Figure 112015081942970-pat00010
DM : untreated diabetic group, RMD : Resistant maltodextrin (2 g/kg)-treated diabetic group, RG-200 : Red Ginseng extract (200 mg/kg)-treated diabetic group, 산삼CMCs-200 : 산삼CMCs extract (200 mg/kg)-treated diabetic group.
시험예 8: 산삼 CMCs의 혈행 개선 효과
실시예 2에서 제조된 산삼 CMCs의 혈소판 응집 억제능을 평가 (Anti-platelet assay)하였다. 95℃에서 48hr 열처리한 산삼 CMCs를 70% 에탄올로 추출한 산삼 CMCs 추출물을 경구투여 하였다.
3.2% Trisodium citrate를 준비하여 혈액과 1:9 (v/v)가 되도록 Rat의 복대동맥에서 채혈하였다. 10분간 roll mixer에서 잘 섞이도록 방치한 후 1000 rpm, 상온에서 10분간 원심분리하고 상층액을 분리하였다 (Platelet rich plasma; PRP). PPP를 이용하여 PRP의 혈소판 개수를 counting하여 250~400 X 103개/mL이 되도록 희석한 후 roll mixer에서 5분간 방치하였다. Aggregometer (Chrono-log, USA)에서 PRP 또는 시료를 첨가한 PRP를 37℃로 예열한 다음, PRP에 혈소판 응집을 유도하는 agonist (ADP, collagen 등)를 점적한 후 PPP를 대조로 하여 탁도의 변화를 측정하여 응집률 (%)(수치가 100에 가까울수록 응집이 많이 일어나며 0에 가까울수록 응집이 적은 것임)로 나타내었다. 억제율은 아래의 식에 따라 나타낼 수 있다:
억제율 (%) = (PRP만 있을 때의 응집률(%) - 시료와 혼합한 PRP의 응집률(%)) / PRP만 있을 때의 응집률(%) X 100
그 결과를 도 8 및 표 11에 나타내었다. 혈행개선 분야의 건기식으로 인정된 은행잎엑스(GB-40)와 홍삼추출물(RG-50)을 대조군으로 비교한 결과, 산삼 CMCs 추출물(산삼CMCs-20, 산삼CMCs-50)은 건기식으로 인정된 시료들에 비해 혈행개선 효과가 더 탁월한 것으로 나타났다.
[표 11] 혈소판 응집 억제율
Figure 112015081942970-pat00011
GB-40 : Gingko leaf extract (40 mg/kg)-treated group, RG-50 : Red Ginseng extract (50 mg/kg)-treated group, 산삼CMCs-20 : 산삼CMCs extract (20 mg/kg)-treated group, 산삼CMCs-50 : 산삼CMCs extract (50 mg/kg)-treated group.
시험예 9: 산삼 CMCs의 간기능 개선 효과
1. GalN 유도 간염의 간기능 개선 효과
동결건조 된 산삼 CMCs는 조제 용매인 멸균 생리식염수에 용해시켜 사용하였으며, 경구투여 바늘(sonde)을 이용하여 경구로 투여하였다. 18시간 절식시킨 7주령 Male Sprague-Dawley rats에 GalN (700 mg/kg PBS)을 복강 내 투여하고 24시간 경과 후 혈액 및 간조직을 채쥐한 후 혈정 내 ALT 및 AST 활성을 측정하였다. 실험물질은 GalN 투여 14일 전부터 1일 1회 동일한 시각에 경구 투여하였으며, GalN 투여 당일에는 GalN 투여 전 2시간 및 투여 후 6시간째에 경구 투여하였다,
도 9를 참조하면, 75, 150 및 300 mg/kg으로 2주 처치시 모두에서 GalN 유도 모델에서 ALT, AST를 양성대조군 실리마린에 비해 현저히 억제함을 확인하였다.
2. 비알콜성지방간 유도 개선 효과
산삼CMCs를 증류수에 현탁시킨 후 경구투여 바늘(sonde)을 이용하여 경구로 10주간 투여하였다. 22 g에서 24 g 사이의 57BL/6계 생쥐에 10주간 고지방 식이를 투여해 지방간을 유도하였다. 각 그룹별로 정상실험동물용 고형사료, 고지방 식이 사료(Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ, USA) 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.
표 12를 참조하면, 산삼 CMCs의 투여는 체중, 혈청 및 간조직의 지질 함량, 혈청 ALT 활성을 크게 경감시켰음을 확인할 수 있다.
[표 12] 고지방식이 마우스에 대한 산삼CMCs의 체중, 지질대사 지표, 혈청 ALT 활성에 대한 효과
Figure 112015081942970-pat00012
8 to 10 mice per group. ALT, alanine aminotransferase; HFD, high fat diet; NFD, normal fat diet; TC, total cholesterol; TG, triglyceride; HFD 75, HFD + wild ginseng CMCs 75 mg/kg; HFD 150, HFD + wild ginseng CMCs 150 mg/kg; HFD 300, HFD + wild ginseng CMCs 300 mg/kg; HFD sily, HFD + silymarin 100 mg/kg.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. (a) 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 증류수에 분산시킨 후 정치시키는 단계; 및
    (b) 상기 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 85 내지 160℃의 온도에서 열처리하는 단계를 포함하며,
    진세노사이드 Rh2, Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rh2, Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드는 총 진세노사이드 함량을 기준으로 80 내지 100 중량%의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 진세노사이드 Rh2는 진세노사이드 Rg3, Rk1, Rg5, Rh2, Rk2, Rh3 및 PPD 총 중량을 기준으로 10 내지 35 중량%의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포 추출물 중 진세노사이드 Rh2, Rg3 및 Rg5의 함량이 열처리 전과 비교하여 증가된 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 증류수의 첨가량은 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 1 중량부 당 1 내지 200 중량부인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서,
    상기 정치는 1 내지 35℃의 온도에서 1 내지 15일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 정치 전 동결건조를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 열처리하는 단계 전에 배양된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포를 열풍건조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 열풍건조는 45 내지 75℃의 온도에서 24 내지 72 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 열처리는 10 분 내지 72 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 열처리 단계 중 10 내지 200 rpm에서 교반하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 인삼은 백삼, 산삼, 산양삼 또는 장뇌삼인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제1항의 방법에 의해 제조되고, 진세노사이드 Rh2, Rg3, Rk1, Rg5, Rk2, Rh3 및 PPD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 진세노사이드 함량이 열처리 전과 비교하여 증가된 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물.
  19. 삭제
  20. 제18항에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물.
  21. 제18항에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈행 개선용 조성물.
  22. 제18항에 따른 인삼류의 형성층 유래 줄기세포 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 조성물.
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