CN109182439B - 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，包括：(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；(2)向人参总皂苷提取液中加入β‑葡萄糖苷酶BglPm，a‑L‑阿拉伯呋喃糖酶Abf22‑3，β‑葡萄糖苷酶Bgp1或a‑L‑阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。本发明通过向人参总皂苷提取液中加入β‑葡萄糖苷酶，a‑L‑阿拉伯呋喃糖酶，β‑葡萄糖苷酶或a‑L‑阿拉伯吡喃糖苷酶中的任何一种或多种酶进行生物转化，显著提高了人参稀有皂苷Rg3的转化效率，本发明生物转化方法对于环境友好、转化效率高、适合规模化生产应用。

Description

人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法

技术领域

本发明涉及人参稀有皂苷Rg3的制备方法，尤其涉及人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，属于人参稀有皂苷Rg3的制备领域。

背景技术

Rg3是一种四环三萜皂苷，其分子结构式如图2所示，分子式为C₄₂H₇₂O₁₃，分子量为784.3，其最早是由日本学者北川勋在1980年制备和确定其分子式，并提出人参皂苷Rg3具有选择性抑制肿瘤细胞浸润和转移的作用。在已经发现的180多种皂苷中，人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc等占了皂苷总量的50％以上，而被称为稀有人参皂苷的Rg3只占人参干重的0.015％。

现有的人参稀有皂苷Rg3的制备方法多不同程度的存在转化效率低、耗时长、成本高等缺陷，亟待改进。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种生物转化的方法，将总皂苷中的原人参二醇型皂苷高效转化为人参稀有皂苷Rg3；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，包括：

(1)将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；

(2)向人参总皂苷提取液中加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物。

本发明通过实验发现，步骤(2)中将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达11.39％，显著的高于其它两种酶的组合；另外，在a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物基础上再增加BglPm或Bgp2也能在一定程度上提高Rg3得率。

本发明进一步的发现，将β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达10.64％；将β-葡萄糖苷酶Bgp1和β-葡萄糖苷酶BglPm组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率也达到了4.68％。

其中，由β-葡萄糖苷酶BglPm、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化时，酶的用量配比没有特别的要求，按照任何一种用量进行配比均能达到较好的转化效果；作为一种优选的实施方式，两种酶进行组合时，二者的用量配比优选是1:1；三种酶进行组合时，三者的用量配比优选是1:1:1。

至于人参总皂苷提取液的提取方法是本领域人员所习知，可以采用各种常规的提取方法，例如水提、醇提等各种常规的提取方法，均能适用于本发明。

其中，所述的生物转化的反应温度可以是28-45℃，优选为30-45℃，最优选为40℃；为了实现更好的转化效果，可以将反应体系在震荡的情况下进行生物转化，所述的转化反应时间可以是4-48小时，优选为8-24小时，更优选为12h。

为了达到更好的转化效果，步骤(2)中优选将人参总皂苷提取液进行纯化后再加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化；所述的纯化方法可以本领域的各种常规的纯化方法，例如可以用大孔树脂柱进行纯化，作为一种具体的实施方式，可采用D101大孔树脂柱进行纯化，该纯化方式为本领域技术人员所习知。

本发明中所用到的β-葡萄糖苷酶BglPm可以是任何一种来源的β-葡萄糖苷酶，都可适用于本发明；作为一个具体的实施方式，所用到的β-葡萄糖苷酶BglPm可以是来自芽孢杆菌Paenibacillus mucilaginosus KCTC 3870^T的β-葡萄糖苷酶BglPm，其基因全长序列包含1,260bp(SEQ ID No.1)，编码419个氨基酸(GenBank accession number：AEI42200)(SEQ ID No.3)，分子量大小约48kDa，属于糖苷酶家族1(GH1)，可以特异水解原人参二醇型(protopanaxadiol-type，PPD型)皂苷(如图1所示)的C3位和C20位连接的外侧葡萄糖糖基。

本发明中所用到的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3可以是任何一种来源的a-L-阿拉伯呋喃糖酶，都可适用于本发明；作为一个具体的实施方式，所用到的来自于明串珠菌属Leuconostoc sp.22-3的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，其基因全长序列包含1,527bp(SEQID No.4)，编码508个氨基酸(GenBank accession number：AFD62907)(SEQ ID No.6)，分子量大小约58.5kDa，属于糖苷酶家族51(GH51)，能特异水解PPD型皂苷的C20位的阿拉伯呋喃糖基。

本发明中所用到的β-葡萄糖苷酶Bgp1可以是任何一种来源的β-葡萄糖苷酶Bgp1，都可适用于本发明；作为一个具体的实施方式，所用到的来源于酯香微杆菌Microbacterium esteraromaticum KACC16318的β-葡萄糖苷酶Bgp1，其基因长度2,496bp(SEQ ID No.7)，编码831个氨基酸(GenBank accession number:AEX88466)(SEQ IDNo.9)，分子量大小约88kDa，属于糖苷酶家族3(GH3)，能特异性水解C20位葡萄糖基。

本发明中所用到的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2可以是任何一种来源的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2，都可适用于本发明；作为一个具体的实施方式，所用到的来源于酯香微杆菌Microbacterium esteraromaticum GS514的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2，其基因全长2,430bp(SEQ ID No.10)，编码809个氨基酸(GenBank accession number：AFC90218)(SEQID No.12)，分子量大小约87kDa，属于糖苷酶家族2(GH2)，能特异水解C20位的阿拉伯吡喃糖基。

本发明中所用到的这些酶可以通过商业途径购买得到，也可采用基因工程的方法采用原核表达或真核表达的方法制备得到。

为了提高β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2在大肠杆菌中的表达效率，本发明对β-葡萄糖苷酶BglPm的原始基因(SEQ ID No.1)、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的原始基因(SEQ IDNo.4)、β-葡萄糖苷酶Bgp1的原始基因(SEQ ID No.7)以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的原始基因(SEQ ID No.10)分别进行了优化，优化后的β-葡萄糖苷酶BglPm的基因序列为SEQID No.2所示，优化后的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的基因序列为SEQ ID No.5所示，优化后的β-葡萄糖苷酶Bgp1的基因序列为SEQ ID No.8所示，优化后的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的基因序列为SEQ ID No.11所示；本发明通过实验发现，优化后的基因在大肠杆菌中的表达效率有了显著提升。

为了进一步提升β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2在大肠杆菌中的表达效率，本发明对β-葡萄糖苷酶BglPm基因、a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1以及a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2在大肠杆菌中诱导表达条件进行了优化，根据优化结果来看，BglPm的最优诱导条件是32℃下0.04mM IPTG诱导18h，Abf22-3的最优诱导条件是28℃下0.04mM IPTG诱导24h，Bgp1的最优诱导条件是28℃下0.1mM IPTG诱导9h，Bgp2的最优诱导条件是22℃下0.02mMIPTG诱导24h，在这些诱导条件下，产物的表达效率有了显著提升。

本发明通过向人参总皂苷提取液中加入β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2中的任何一种或多种进行生物转化，极显著的提高了人参稀有皂苷Rg3的转化效率，本发明生物转化方法对于环境友好、转化效率高、适合规模化生产应用。

附图说明

图1是PPD-型皂苷结构。

图2是Rg3的结构式。

图3是双酶结果。

图4是诱导条件的优化结果。

图5是糖苷酶的纯化后检测结果。

图6是BglPm、Abf22-3、Bgp2质谱检测结果。

图7是糖苷酶酶功能验证结果。

图8是不同酶组合转化人参总皂苷HPLC检测结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1β-葡萄糖苷酶BglPm，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3，β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的原核表达和功能验证

1.BglPm、Abf22-3、Bgp1、Bgp2的原核表达载体的构建及诱导表达

1.1表达载体的构建

根据Genbank提供的这4种酶的序列进行碱基序列优化，更利于原核诱导表达，优化后序列分别加上核酸内切酶KpnI/BamHI的酶切位点5’-3’GGTACC/5’-3’GGATCC后进行基因合成，由于Bgp1核苷酸序列含有KpnI/BamHI的酶切位点，所以加上核酸内切酶NdeI/XmaI的酶切位点5’-3’CATATG/5’-3’CCCGGG，优化后基因序列见序列表。

将合成后的基因序列进行37℃双酶切2h，Bgp1使用NdeI/XmaI，其他3个酶基因使用KpnI/BamHI(酶切结果见图3)，表达载体pET14b-MCS进行同样双酶切操作，同时进行琼脂糖凝胶电泳，切胶进行目的条带的回收。回收后的目的条带与表达载体进行T₄连接酶连接，连接后的产物转化感受态细胞E.coli DH5a(DE3)。

阳性克隆鉴定经过菌液PCR鉴定和测序鉴定后，获得pET14b-His-BglPm、pET14b-His-Abf22-3、pET14b-His-Bgp1、pET14b-His-Bgp2重组质粒。

1.2原核诱导表达及纯化后鉴定

重组质粒转化感受态表达菌株E.coli BL21(DE3)，表达菌株在LB培养基(Amp+)中进行预诱导条件筛选。其中BglPm的最佳优诱导条件是32℃下0.04mM IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)诱导18h，Abf22-3的最优诱导条件是28℃下0.04mM IPTG诱导24h，Bgp1的最优诱导条件是28℃下0.1mM IPTG诱导9h，Bgp2的最优诱导条件是22℃下0.02mM IPTG诱导24h，结果如图4所示。

表达菌株扩大培养在OD₆₀₀在0.6时进行最优条件诱导，4℃离心收获菌体，菌体重悬于Binding buffer(20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20mM imidazole,pH 8.0)进行冰上超声破碎。4℃离心取上清，进行Histrap FF(1ml)预装柱亲和纯化，Elution buffer(20mMTris-HCl,0.5M NaCl,300mM imidazole,pH 8.0)进行洗脱，蛋白脱盐后进行SDS-PAGE检测，其纯度达到95％以上，结果如图5所示。质谱检测显示各肽段离子峰经mMass分析拼接后糖苷酶蛋白BglPm、Abf22-3、Bgp2的氨基酸序列与Genbank提供的序列一致，蛋白表达诱导成功且准确，如图6所示。

2、酶功能的验证

2.1试剂配制及程序设定

(1)将人参皂苷标准品20mg(Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、Rh2)稀释成40mg/mL，溶剂为80％乙醇。

(2)取100μL纯化酶，各加入相应的人参皂苷标准品(40mg/mL)2.5μL，最终用磷酸缓冲液补齐至300μL，40℃震荡反应12h，反应结束后加入700μL色谱级甲醇终止反应，HPLC检测。各酶的反应结果见图7。

实施例2酶组合转化人参总皂苷生成Rg3

1人参总皂苷原液制备

(1)称取15g干燥处处理后的人参不定根，放入研钵中研磨，直至变为粉末状后停止研磨放入50mL离心管中；

(2)取25mL80％甲醇加入50mL离心管，放入超声清洗仪中超声1h，每隔10min震荡一次，结束后取上清；重复上述步骤一次。

(3)将上步中得到的萃取液3000rpm室温离心10min。

(4)滤器过滤取滤液。

(5)将获得的滤液在旋转蒸发仪中蒸干。

(6)加入10mL 80％甲醇复溶。

2人参总皂苷提取液的纯化

(1)50mL D101大孔树脂用95％乙醇浸泡24h，水洗至无乙醇味(恒流泵引流冲洗)；

(2)300mL 5％HCl通过树脂柱，并浸泡2h；

(3)300mL 2％NaOH通过树脂柱，并浸泡2h；

(4)300mL ddH₂O冲洗至中性；

(5)吸入总皂苷原液样品液5mL，然后300mL ddH₂O冲洗，出去原液样品中的糖类等其他水溶性物质；

(6)ddH₂O引流完成后，通过300mL 80％甲醇，引流10min后开始回收甲醇；

(7)回收结束后300mL 95％乙醇冲洗柱子；

(8)回收后的甲醇溶液旋转蒸发仪蒸干，5mL甲醇复溶，得到纯化液。

3总皂苷反应体系及液相检测体系

(1)总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；

(2)建立10组平行试验，其中，各组的反应体系如下：

试验(Ⅰ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Abf22-3各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅱ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Bgp1各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅲ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅳ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：Abf22-3、Bgp1各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅴ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：Abf22-3、Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅵ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：Bgp1、Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅶ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Abf22-3和Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅷ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Bgp1、Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅸ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：BglPm、Abf22-3以及Bgp1各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH 7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

试验(Ⅹ)组：总皂苷原液及反应液各取300μL加入1mL离心管中，50℃烘干；总皂苷反应体系：Abf22-3、Bgp1以及Bgp2各50μg，加入烘干的原液和纯化液到离心管中，再加入pH7.5的20mM磷酸缓冲液使总体系维持在300μL，40℃震荡反应12h；

(3)反应结束后加入800μL色谱级甲醇，混匀。

(4)滤器过滤，HPLC检测程序为表1所示；

各组的转化效率如图8和表2所示。

表1HPLC程序

表2不同酶组合对总皂苷的转化后计算Rg3得率

实验组	酶组合	Rg3得率(％)
			试验(I)组	BglPm+Abf22-3	<0.01％
试验(II)组	Bgp1+BglPm	4.68％
			试验(III)组	Bglpm+Bgp2	<0.01％
试验(IV)组	Bgp1+Abf22-3	11.39％
			试验(V)组	Bgp2+Abf22-3	0.32％
试验(VI)组	Bgp1+Bgp2	10.64％
			试验(VII)组	Bgp2+Abf22-3+BglPm	<0.01％
试验(VIII)组	Bgp1+Bgp2+BglPm	<0.01％
			试验(IX)组	Bgp1+Abf22-3+BglPm	11.45％
试验(X)组	Bgp1+Abf22-3+Bgp2	11.79％

根据转化结果可见，将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达11.39％，显著的高于其它两种酶的组合。另外，在a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物基础上再增加BglPm或Bgp2也能在一定程度上提高Rg3得率。

另外，根据转化结果可见，将β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率高达10.64％。将β-葡萄糖苷酶Bgp1和β-葡萄糖苷酶BglPm组成的酶混合物进行生物转化，Rg3得率也达到了4.68％。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北林业大学

<120> 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法

<130> HLJ-3004-171235C

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 558

<212> DNA

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 1

atgcagccgc cgtttcggga tctcgccatg gcgcaggggg cagccgcggt ggtgctgttc 60

ctcctcgtgc ccgcggcgac cctgcttggg ccgggcatgc accggacggc agggatgctc 120

catgggctgg cggcttcgct gaccgtgctt gtggcaacgt atacatggca tgcgttctac 180

gattatgcga gggggcgggg agccggcagg agcagactgg cgcgcaggct cgggatgacg 240

aacgggctca cactgctgac ccttgtcacg gccaattggc tctatatcgg ataccaggcg 300

ccggaggggg cttcggaatg gttcaagctc cacctcccgg cagggcattg ggttgtgatg 360

gaatacaagg aattcgtgtc gctgatgacg ctgccctgcg gggtcgcggc ccaggtcatc 420

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tatgaacatc gtctgacccc ggttgttgca atgcaccatt ttagcagccc gcagtggctg 360

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<210> 3

<211> 419

<212> PRT

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 3

Met Glu Tyr Ile Phe Pro Gln Gln Phe Met Phe Gly Ser Ala Thr Ala

1 5 10 15

Ala Tyr Gln Val Glu Gly Asn Asn Thr Asn Ser Asp Phe Trp Ala Glu

20 25 30

Glu His Ala Glu Gly Ser Pro Tyr Gln Asp Lys Ser Gly Asp Ala Val

35 40 45

Asp His Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Asp Ile Ala Leu Met Ala Ser Leu

50 55 60

Gly Leu Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile Glu Trp Ala Arg Ile Glu Pro

65 70 75 80

Ala Pro Gly Gln Phe Ser Leu Ser Ala Ile Ala His Tyr Arg Asp Val

85 90 95

Leu Gln Ala Cys Tyr Glu His Arg Leu Thr Pro Val Val Ala Met His

100 105 110

His Phe Ser Ser Pro Gln Trp Leu Met Arg Phe Gly Gly Trp Gly Ser

115 120 125

Glu Glu Val Pro Glu Arg Phe Ala Lys Tyr Cys Glu Phe Val Phe Gln

130 135 140

Glu Leu Gly Asp Leu Ile Pro Tyr Val Leu Thr Phe Asn Glu Val Asn

145 150 155 160

Leu Pro Val Met Leu Arg Glu Val Phe Ser Ser Ile Gly Ile Ile Pro

165 170 175

Pro Val Gly Ile Asp Gly Ala Ala Trp Thr Ala Pro Gly Trp Arg Ala

180 185 190

Ser Ala Ala Gln Leu Cys Gly Thr Thr Ala Asp Arg Tyr Val Thr Phe

195 200 205

His Met Ile Ser Asp Glu Pro Lys Ile Ala Leu Leu Met Glu Ala His

210 215 220

Arg Arg Ala Arg Gln Thr Ile Lys Arg Leu Gln Pro Asn Ala Lys Val

225 230 235 240

Gly Leu Ser Met Ala Leu Ser Asp Ile Gln Ser Val Pro Gly Gly Glu

245 250 255

Ala Trp Ala Gln Gln Lys Trp Gln Gln Tyr Phe Glu Gln Tyr Leu Pro

260 265 270

Ala Leu Glu Gly Asp Asp Phe Phe Gly Leu Gln Asn Tyr Thr Arg Glu

275 280 285

Val Tyr Gly Pro Glu Gly Arg Val Thr Pro Ala Ala Asp Ala Glu Leu

290 295 300

Thr Gln Met Lys Tyr Glu Tyr Tyr Pro Glu Ala Leu Glu Gln Val Ile

305 310 315 320

Arg Lys Val Ala Lys Ala Leu Thr Leu Pro Ile Phe Val Thr Glu His

325 330 335

Gly Val Ala Thr Asp Asp Asp Glu Arg Arg Ile Glu Phe Ile Arg Arg

340 345 350

Gly Leu Gln Gly Val His Ala Cys Leu Glu Glu Gly Ile Asp Val Arg

355 360 365

Gly Tyr Leu His Trp Thr Thr Phe Asp Asn Phe Glu Trp Asn Ala Gly

370 375 380

Tyr Ser Met Arg Phe Gly Leu Ile Gly Val Asp Arg Thr Thr Gln Glu

385 390 395 400

Arg Thr Val Lys Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Gly Arg Ile Ala Ser Thr

405 410 415

Lys Val Leu

<210> 4

<211> 1527

<212> DNA

<213> Leuconostoc sp.

<400> 4

atgaaagtta aaatagaaaa acgtcaaaat gagactaaaa tcaatccacg tttacatggt 60

caatttatag aatttcttgg taatgcgata aatgatggta tatgggtcgg aaaagaaagt 120

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<211> 1527

<212> DNA

<213> Artifical sequence

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Gly Ile Trp Val Gly Lys Glu Ser Lys Ile Pro Asn Ile Asn Gly Met

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Arg Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Lys Glu Ile Glu Pro Pro Ile Ile

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Val Gly Glu Lys Arg Glu Lys Val Phe Asn Glu Gly Phe Gly Thr Tyr

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Ser Val Glu Thr Asn Glu Phe Gly Thr Asp Glu Phe Leu Glu Phe Ala

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Ser Thr Tyr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Asp Ser Gly His Glu Lys Pro

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Tyr Asp Val Asn Tyr Trp Gly Ile Gly Asn Glu Val Trp Gly Gly Gly

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Lys Val Asp Gly Tyr Asp Leu His Trp Tyr Asn Trp Tyr Leu Gly Asn

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260 265 270

Val Ile Lys Gly Ala Thr Glu Leu Glu Asp Ile Leu Lys Glu Gln Tyr

275 280 285

Asp Leu Ile Gln Asp Gly Leu Asp Gln Leu Pro Glu Pro Glu Gly Glu

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Phe Asp Gln Lys Leu Glu Lys Met Asp Leu Ile Leu Gly Glu Trp Gly

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325 330 335

Asn Thr Met Arg Asp Ala Ile Thr Thr Ala Ile Val Leu Asp Ile Leu

340 345 350

His Ser Asn Ala Asp Lys Val Lys Met Ala Ser Met Ala Gln Thr Ile

355 360 365

Asn Val Leu Asn Ala Leu Ile Leu Thr Asn Gly Glu Gln Phe Val Leu

370 375 380

Thr Pro Val Tyr Asp Ile Phe Lys Met Tyr Lys Val His Arg Asn Asn

385 390 395 400

Asp Val Leu Asp Val Thr Ile Thr Asp Glu Asn Ser Asp His Val Lys

405 410 415

Phe Phe Ala Ser Ile Asn Asp Lys Thr Ile Tyr Leu Asn Val Ile Asn

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<212> DNA

<213> Microbacterium esteraromaticum

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gtatgaggtc tacaggtcag gctccaataa ggttaactag accaaggagg tcaaggaggt 180

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gtgttaatgt tttgttgggt cctggtgtca acattaaaag gcacccattg ggtggtagaa 600

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agaataaatg gtatacctgc ttctgaatct gcttttttgt tgatcaggtc ttgagggatg 900

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tgttggttat agatggtacg atacaagaga tataacagtt gcttatcctt ttggtcatgg 1860

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Thr Lys Ala Val Arg Asp Ile Pro Ser Val Phe Leu Thr Asp Gly Pro

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Met Ser Tyr Pro Ala Thr Cys Phe Pro Pro Ala Ser Gly Leu Ser Gln

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Ser Trp Asn Thr Asp Leu Ala Arg Arg Val Gly Ile Ala Leu Gly Ile

165 170 175

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Gln Ser Glu His Val Gly Ala Ser Leu Lys His Phe Ala Val Asn Asn

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Gln Glu Thr Asp Arg His Arg Ile Ser Ala Asp Val Asp Ala Arg Thr

245 250 255

Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Arg Ala Phe Gln Ile Ile Val Arg Asp Ala

260 265 270

Asn Pro Trp Thr Val Met Ala Ser Tyr Asn Arg Ile Asn Gly Ile Pro

275 280 285

Ala Ser Glu Ser Ala Phe Leu Leu Thr Gln Val Leu Arg Asp Glu Trp

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Gly Tyr Asp Gly Leu Val Val Ser Asp Trp Gly Ala Val Gly Asp Arg

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Val Ala Ala Ala Arg Ala Gly Leu Asp Leu Gln Met Pro Ala Ala Glu

325 330 335

Gly Thr Asp Glu Gln Leu Leu Asp Ala Val Ile Glu Gly Thr Leu Ser

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Val Glu Ile Leu Asp Arg Ile Ala Glu Arg Val Arg Thr Leu Ala Arg

355 360 365

Arg Ala His Ala Asp Asn Ala Gly Val Gly Thr Thr Phe Asp Val Asp

370 375 380

Ala His His Ala Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ala Gln Ser Ile Val Leu

385 390 395 400

Leu Lys Asn Glu His Asp Leu Leu Pro Leu Asn Ala Gly Thr Ser Val

405 410 415

Ala Val Ile Gly Glu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Phe Gln Gly Gly Gly

420 425 430

Ser Ser Phe Val Asn Thr Thr Arg Val Asp Val Pro Leu Glu Glu Leu

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Arg Arg Leu Gly Gly Asp Ala Val Arg Tyr Ala Ala Gly Tyr Ser Ser

450 455 460

Asp Pro Ala Thr Ala Gly Asp Asp Leu Leu Ala Glu Ala Val Ala Ala

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Ala Arg Glu Ala Asp Val Ala Val Val Phe Ile Ala Ala Pro Leu Glu

485 490 495

Ser Glu Gly Ile Asp Arg Glu Asn Leu Glu Leu Pro Ala Asp Gln Val

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<212> DNA

<213> Microbacterium esteraromaticum

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cccgacggca cacccgtcgg agaaggcatc gcgccgctga cacttctcgc cggcgagtcc 660

ggggtcgcac gcacccgcat ctgggtcact gatcccgacc gttggagtgt ggagaacccc 720

gccctgtacc gtgccgacgt ttcagtcgct gggaacggca ctgaggacag cgactctgtc 780

acgttcggca tccgcaccct gcagttggat gtgcagcatg ggctgcggat caacggcgtc 840

accgtgaagc tgcgtggcgc ctgcatccac cacgacaacg gcatcctcgg tgcgcgcgcc 900

atcggccgtg ccgaggaacg ccgcatcgaa atcctcaaag aggccgggtt caacgccatc 960

cgcagctccc acaacccact cacaccagag atgctcgacg cgtgcgaccg cctcgggatg 1020

ctggtgatgg acgaagcgtt cgacatgtgg gcagaagcaa aatccccgtt cgactactcg 1080

ctgtccttcc ccgaatggtg ggaacgagac atcgagtccc tcgtcgccaa agacttcaac 1140

cacccctcgg tgatcttcta ctccatcggc aacgagatcc ccgaaaccgg ccgaccgcac 1200

ggatcccggc agggccgtct catcgccgac aaagtccaca ccctcgaccc gacgagatac 1260

accacgaaca gcatcaaccc cctcgtctcc gtcgtcaaag acctgcccgc gatcggcggc 1320

ggatcggccg agccacagga cgtgaacgcc gcgatggccg acatgggcgc aatgatggcc 1380

gccctggtca cctcggacct cgtcactcac cgcaccgagg agagcttcgc cgccgtcgac 1440

gccgccggcc tcaactacgg cgatagccgg tacgcatccg acgccacccg cttccccaac 1500

cgtgtcatca tcggcaccga gaccttcgcc acccgcctgc acgacgcgtg gccgaccatc 1560

ctggagaaca accacgtcat cggtgagttc acctggaccg gatgggacta cctcggcgaa 1620

gccggcatcg gccgcgtcga atacaccgaa cggggcggcg cgctggtcgg cacatccggc 1680

ccgttcccgt ggcagctcgc ctggtgcgga gacatcgaca tcactggtca ccgccgcccc 1740

gcgtcctact tccgggagat cgtctacggc ctccgcggca ccccgtacat cgccgtccac 1800

aagcctcgga cagatgggct gctgccggcc acaggcccct ggtcctggac ggacagcgtg 1860

gcctcatggt cctggtcggt accgaccggc acgtccgtga ccgtcgacgt gtacagcgcc 1920

gcggacaccg tcgaactgtt cttgaacggc acctcactcg gcacctcccc cgccggccag 1980

gaggccggct actgcgccac cttccacgtg ccctttgacc agggggaact ggtcgctgtg 2040

gcgttcacga acggcgtcga gaccgggcgt gacgtgctcc gatccgggag cggcgacgtc 2100

tcgctccgag cagtcgccga gcggaccagc atcagcgaca gcctcgatga cctcgcctac 2160

gttcagatct ctctcaccga cgctgagggc atcgtctggc cggacgtcga ccgcgagatc 2220

gaagtcacgg tcgagggtcc ggcagagctg atcggcctcg gcaacgcgga cccgcagacc 2280

accgcgtctt acctcaccac gcgtcaccac accttcgacg gtcgggcgca agcgatcctg 2340

cgcccgacag gcatcggcga aatcgccgtc acggtgaccg ccgacggtga tgccccgcag 2400

cgcgttcagg tgacggtgag cccctcatga 2430

<210> 11

<211> 2430

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<400> 11

atgcgtagtc tgcctctgct gaccgattgg accgttggtc ctaaacgcgg tctgttcgat 60

ggcatgaatc cgatgatcgc agcacctgca ccggtgaccc tgccgcatga tgccatgctg 120

ggcatgcagc gtagtgccga tgtgccgagc gccgaacata gcggttattt ccctggtggt 180

gccgtggaat atacccgcac actggatgtt aacgcaagcg atgccgagag cgttcactta 240

ctggttctgg atggcgttta ccgcgacgcc atggtgttcg tgaacgacga atttgcagcc 300

cagcgtccta atggctacgc acgtttcgcc gttcgcttag atccttttct gcgctttgat 360

gcaccgaacg tgatccgtgt ggaagcacgt gcccatcacg atagtcgctg gtatagtggc 420

ctgggcattc atcgcaaggt tagtctggtt accggcccgc tggtgcacat tgccctggat 480

ggtgtgcgcg tgaccacccc tgaggtggat gaacagggtg ccctggttca ggtggagacc 540

accgtgacca atgacagcct gcatacccgt accgtggcag ccacagttac catcaccgca 600

cctgatggta caccggttgg cgaaggtatt gccccgctga cactgctggc aggcgaaagt 660

ggtgttgcac gcacccgtat ttgggtgaca gacccggatc gctggagcgt ggaaaatccg 720

gccttatatc gcgcagacgt gagtgtggca ggcaatggta cagaagacag cgacagcgtt 780

acctttggca ttcgcaccct gcagttagac gtgcaacatg gcctgcgtat caatggtgtg 840

accgtgaaac tgcgcggtgc ctgtatccac cacgataacg gtattctggg cgcacgtgca 900

atcggtcgcg cagaggagcg tcgcatcgaa attctgaaag aagctggctt caacgcaatc 960

cgcagcagcc acaatccgct gaccccggaa atgctggacg catgcgatcg cttaggtatg 1020

ctggtgatgg atgaggcatt tgacatgtgg gccgaagcca agagcccgtt cgactatagc 1080

ctgagcttcc ctgaatggtg ggagcgcgat atcgagagcc tggttgcaaa ggactttaac 1140

cacccgagtg tgatttttta cagcatcggc aacgaaatcc cggagaccgg tcgcccgcat 1200

ggtagccgtc agggccgtct gatcgccgat aaagttcata ccttagaccc gacccgctat 1260

accaccaata gcatcaaccc gctggtgagc gttgttaaag atctgccggc aatcggcggt 1320

ggtagcgcag aaccgcagga tgttaatgcc gcaatggccg atatgggtgc aatgatggca 1380

gcactggtga ccagcgatct ggtgacacac cgcacagaag agagtttcgc cgcagtggac 1440

gccgccggtt taaactacgg cgacagccgc tatgcaagtg acgccacccg ttttccgaac 1500

cgtgtgatca ttggcacaga aaccttcgcc acccgtctgc acgatgcatg gccgacaatt 1560

ctggagaata atcatgtgat cggtgagttc acctggaccg gctgggatta tctgggcgaa 1620

gccggcatcg gtcgtgtgga gtacaccgaa cgtggcggtg cactggttgg caccagcggt 1680

ccttttcctt ggcagctggc ctggtgtggc gacattgata ttaccggtca tcgccgtcct 1740

gccagttact tccgcgaaat tgtttacggc ctgcgtggca ccccgtatat cgcagttcat 1800

aaacctcgca ccgatggttt attaccggca accggcccgt ggagttggac cgatagcgtg 1860

gccagctgga gttggagtgt tccgaccggc actagtgtta ccgtggatgt ttacagcgcc 1920

gcagataccg tggaactgtt cctgaatggc accagcctgg gcactagccc tgccggtcaa 1980

gaagcaggtt actgcgcaac cttccatgtt ccgtttgatc agggtgagct ggtggcagtt 2040

gcatttacca acggcgtgga aaccggccgt gacgtgttac gtagcggtag cggcgacgtt 2100

agtttacgtg ccgttgcaga gcgtaccagc atcagcgata gcctggacga cctggcctat 2160

gtgcagatta gcctgaccga cgccgaaggt attgtgtggc ctgacgttga tcgcgaaatc 2220

gaagtgaccg tggaaggccc ggcagagtta attggcctgg gtaacgcaga tccgcaaacc 2280

accgccagtt atctgacaac ccgccatcat acattcgatg gccgcgcaca ggccattctg 2340

cgcccgaccg gtatcggcga gattgccgtt accgtgacag cagatggcga tgcaccgcaa 2400

cgtgtgcagg tgaccgttag cccgagctga 2430

<210> 12

<211> 809

<212> PRT

<213> Microbacterium esteraromaticum

<400> 12

Met Arg Ser Leu Pro Leu Leu Thr Asp Trp Thr Val Gly Pro Lys Arg

1 5 10 15

Gly Leu Phe Asp Gly Met Asn Pro Met Ile Ala Ala Pro Ala Pro Val

20 25 30

Thr Leu Pro His Asp Ala Met Leu Gly Met Gln Arg Ser Ala Asp Val

35 40 45

Pro Ser Ala Glu His Ser Gly Tyr Phe Pro Gly Gly Ala Val Glu Tyr

50 55 60

Thr Arg Thr Leu Asp Val Asn Ala Ser Asp Ala Glu Ser Val His Leu

65 70 75 80

Leu Val Leu Asp Gly Val Tyr Arg Asp Ala Met Val Phe Val Asn Asp

85 90 95

Glu Phe Ala Ala Gln Arg Pro Asn Gly Tyr Ala Arg Phe Ala Val Arg

100 105 110

Leu Asp Pro Phe Leu Arg Phe Asp Ala Pro Asn Val Ile Arg Val Glu

115 120 125

Ala Arg Ala His His Asp Ser Arg Trp Tyr Ser Gly Leu Gly Ile His

130 135 140

Arg Lys Val Ser Leu Val Thr Gly Pro Leu Val His Ile Ala Leu Asp

145 150 155 160

Gly Val Arg Val Thr Thr Pro Glu Val Asp Glu Gln Gly Ala Leu Val

165 170 175

Gln Val Glu Thr Thr Val Thr Asn Asp Ser Leu His Thr Arg Thr Val

180 185 190

Ala Ala Thr Val Thr Ile Thr Ala Pro Asp Gly Thr Pro Val Gly Glu

195 200 205

Gly Ile Ala Pro Leu Thr Leu Leu Ala Gly Glu Ser Gly Val Ala Arg

210 215 220

Thr Arg Ile Trp Val Thr Asp Pro Asp Arg Trp Ser Val Glu Asn Pro

225 230 235 240

Ala Leu Tyr Arg Ala Asp Val Ser Val Ala Gly Asn Gly Thr Glu Asp

245 250 255

Ser Asp Ser Val Thr Phe Gly Ile Arg Thr Leu Gln Leu Asp Val Gln

260 265 270

His Gly Leu Arg Ile Asn Gly Val Thr Val Lys Leu Arg Gly Ala Cys

275 280 285

Ile His His Asp Asn Gly Ile Leu Gly Ala Arg Ala Ile Gly Arg Ala

290 295 300

Glu Glu Arg Arg Ile Glu Ile Leu Lys Glu Ala Gly Phe Asn Ala Ile

305 310 315 320

Arg Ser Ser His Asn Pro Leu Thr Pro Glu Met Leu Asp Ala Cys Asp

325 330 335

Arg Leu Gly Met Leu Val Met Asp Glu Ala Phe Asp Met Trp Ala Glu

340 345 350

Ala Lys Ser Pro Phe Asp Tyr Ser Leu Ser Phe Pro Glu Trp Trp Glu

355 360 365

Arg Asp Ile Glu Ser Leu Val Ala Lys Asp Phe Asn His Pro Ser Val

370 375 380

Ile Phe Tyr Ser Ile Gly Asn Glu Ile Pro Glu Thr Gly Arg Pro His

385 390 395 400

Gly Ser Arg Gln Gly Arg Leu Ile Ala Asp Lys Val His Thr Leu Asp

405 410 415

Pro Thr Arg Tyr Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Leu Val Ser Val Val

420 425 430

Lys Asp Leu Pro Ala Ile Gly Gly Gly Ser Ala Glu Pro Gln Asp Val

435 440 445

Asn Ala Ala Met Ala Asp Met Gly Ala Met Met Ala Ala Leu Val Thr

450 455 460

Ser Asp Leu Val Thr His Arg Thr Glu Glu Ser Phe Ala Ala Val Asp

465 470 475 480

Ala Ala Gly Leu Asn Tyr Gly Asp Ser Arg Tyr Ala Ser Asp Ala Thr

485 490 495

Arg Phe Pro Asn Arg Val Ile Ile Gly Thr Glu Thr Phe Ala Thr Arg

500 505 510

Leu His Asp Ala Trp Pro Thr Ile Leu Glu Asn Asn His Val Ile Gly

515 520 525

Glu Phe Thr Trp Thr Gly Trp Asp Tyr Leu Gly Glu Ala Gly Ile Gly

530 535 540

Arg Val Glu Tyr Thr Glu Arg Gly Gly Ala Leu Val Gly Thr Ser Gly

545 550 555 560

Pro Phe Pro Trp Gln Leu Ala Trp Cys Gly Asp Ile Asp Ile Thr Gly

565 570 575

His Arg Arg Pro Ala Ser Tyr Phe Arg Glu Ile Val Tyr Gly Leu Arg

580 585 590

Gly Thr Pro Tyr Ile Ala Val His Lys Pro Arg Thr Asp Gly Leu Leu

595 600 605

Pro Ala Thr Gly Pro Trp Ser Trp Thr Asp Ser Val Ala Ser Trp Ser

610 615 620

Trp Ser Val Pro Thr Gly Thr Ser Val Thr Val Asp Val Tyr Ser Ala

625 630 635 640

Ala Asp Thr Val Glu Leu Phe Leu Asn Gly Thr Ser Leu Gly Thr Ser

645 650 655

Pro Ala Gly Gln Glu Ala Gly Tyr Cys Ala Thr Phe His Val Pro Phe

660 665 670

Asp Gln Gly Glu Leu Val Ala Val Ala Phe Thr Asn Gly Val Glu Thr

675 680 685

Gly Arg Asp Val Leu Arg Ser Gly Ser Gly Asp Val Ser Leu Arg Ala

690 695 700

Val Ala Glu Arg Thr Ser Ile Ser Asp Ser Leu Asp Asp Leu Ala Tyr

705 710 715 720

Val Gln Ile Ser Leu Thr Asp Ala Glu Gly Ile Val Trp Pro Asp Val

725 730 735

Asp Arg Glu Ile Glu Val Thr Val Glu Gly Pro Ala Glu Leu Ile Gly

740 745 750

Leu Gly Asn Ala Asp Pro Gln Thr Thr Ala Ser Tyr Leu Thr Thr Arg

755 760 765

His His Thr Phe Asp Gly Arg Ala Gln Ala Ile Leu Arg Pro Thr Gly

770 775 780

Ile Gly Glu Ile Ala Val Thr Val Thr Ala Asp Gly Asp Ala Pro Gln

785 790 795 800

Arg Val Gln Val Thr Val Ser Pro Ser

805

Claims (12)

1.一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，其特征在于，包括：

（1）将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；

（2）向人参总皂苷提取液中加入由a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3和β-葡萄糖苷酶Bgp1组成的酶混合物进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物；优化后的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的基因序列为SEQ ID No.5所示，优化后的β-葡萄糖苷酶Bgp1的基因序列为SEQ ID No.8所示。

2.一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，其特征在于，包括：

（1）将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；

（2）向人参总皂苷提取液中加入由a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1和β-葡萄糖苷酶BglPm组成的酶混合物进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物；优化后的β-葡萄糖苷酶BglPm的基因序列为SEQ ID No.2所示，优化后的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的基因序列为SEQ ID No.5所示，优化后的β-葡萄糖苷酶Bgp1的基因序列为SEQ ID No.8所示。

3.一种人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法，其特征在于，包括：

（1）将人参进行提取得到人参总皂苷提取液；

（2）向人参总皂苷提取液中加入由a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1和a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2组成的酶混合物进行生物转化，得到含有人参稀有皂苷Rg3的转化产物；优化后的a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3的基因序列为SEQ ID No.5所示，优化后的β-葡萄糖苷酶Bgp1的基因序列为SEQ ID No.8所示，优化后的a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2的基因序列为SEQ ID No.11所示。

4.按照权利要求1-3任何一项所述的生物转化方法，其特征在于，所述的生物转化的反应温度是28-45℃，所述的转化反应时间是4-48小时；所述的生物转化是在震荡的条件下进行转化反应。

5.按照权利要求4所述的生物转化方法，其特征在于，所述的生物转化的反应温度为30-45℃；所述的转化反应时间是8-24小时。

6.按照权利要求5所述的生物转化方法，其特征在于，所述的生物转化的反应温度为40℃；所述的转化反应时间是12小时。

7.按照权利要求1所述的生物转化方法，其特征在于，所述a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3或β-葡萄糖苷酶Bgp1通过原核表达制备得到，包括：将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因或β-葡萄糖苷酶Bgp1基因分别与原核表达载体可操作性连接构建得到原核表达载体；将所构建的原核表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。

8.按照权利要求2所述的生物转化方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶BglPm， a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3或β-葡萄糖苷酶Bgp1通过原核表达制备得到，包括：将β-葡萄糖苷酶BglPm基因，a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因或β-葡萄糖苷酶Bgp1基因分别与原核表达载体可操作性连接构建得到原核表达载体；将所构建的原核表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。

9.按照权利要求3所述的生物转化方法，其特征在于，所述a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3、β-葡萄糖苷酶Bgp1或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2通过原核表达制备得到，包括：将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因、β-葡萄糖苷酶Bgp1基因或a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2基因分别与原核表达载体可操作性连接构建得到原核表达载体；将所构建的原核表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。

10.按照权利要求7所述的生物转化方法，其特征在于，将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.04mM IPTG诱导24h；将β-葡萄糖苷酶Bgp1基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.1mM IPTG诱导9h。

11.按照权利要求8所述的生物转化方法，其特征在于，将β-葡萄糖苷酶BglPm基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是32℃下0.04mM IPTG诱导18h；将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.04mM IPTG诱导24h；将β-葡萄糖苷酶Bgp1基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.1mM IPTG诱导9h。

12.按照权利要求9所述的生物转化方法，其特征在于，将a-L-阿拉伯呋喃糖酶Abf22-3基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.04mM IPTG诱导24h；将β-葡萄糖苷酶Bgp1基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是28℃下0.1mM IPTG诱导9h；将a-L-阿拉伯吡喃糖苷酶Bgp2基因在大肠杆菌中进行诱导表达时的条件是22℃下0.02mM IPTG诱导24h。

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