CN105695553A - 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法 - Google Patents

一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695553A
CN105695553A CN201610219176.5A CN201610219176A CN105695553A CN 105695553 A CN105695553 A CN 105695553A CN 201610219176 A CN201610219176 A CN 201610219176A CN 105695553 A CN105695553 A CN 105695553A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucosidase
beta
ginsenoside
arabinofuranosidase
seqidno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610219176.5A
Other languages
English (en)
Inventor
赵林果
赵东霞
解静聪
裴建军
李琦
房仙颖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Forestry University
Original Assignee
Nanjing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Forestry University filed Critical Nanjing Forestry University
Priority to CN201610219176.5A priority Critical patent/CN105695553A/zh
Publication of CN105695553A publication Critical patent/CN105695553A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/20—Preparation of steroids containing heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01055—Alpha-N-arabinofuranosidase (3.2.1.55)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，利用来源于Thermotoga petrophila的β-葡萄糖苷酶和Thermotoga thermarum DSM 5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人参皂苷Rb1、Rb2和Rc生产20(S)-Rg3。本发明可以提高资源利用率和降低人参皂苷原料的提取成本，本发明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能在1h内几乎将人参皂苷Rb1、Rb2和Rc完全转化为20(S)-Rg3。

Description

一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及稀有人参皂苷20(S)-Rg3的制备方法，尤其涉及利用重组表达的来源于ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶和Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rc生成20(S)-Rg3。
背景技术
人参Panaxginseng是亚洲传统的名贵中药材，具有生物活性广泛，药理作用独特等特点，但其化学成分复杂。随着分析技术的革新，人参主要的化学成分得到了进一步的明确。研究发现，人参皂苷是人参主要的生物活性物质，到目前为止，已经分离鉴定180余种人参皂苷单体，其中5种主要皂苷(人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re和Rg1)占总皂苷的80％以上，而人参皂苷(Rh1、Rh2、CompoundK、Rg2、F1和Rg3)含量很低，称为稀有皂苷(AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2012，94:673-682)，但其药理活性优于上述高含量的人参皂苷。
稀有人参皂苷20(S)-Rg3具有抑制肿瘤细胞增殖、粘附侵袭和转移，促进肿瘤细胞的凋亡，提高机体免疫机能等生理作用。但稀有皂苷20(S)-Rg3在植物中含量很低，直接提取工艺复杂，成本太高。而人参皂苷Rb1、Rb2和Rc是人参总皂苷中含量最高的几种人参皂苷。它们与稀有人参皂苷20(S)-Rg3具有相似的母核结构，唯一的差别是在20位上的糖基侧链(图1)。如果能专一性的切除Rb1、Rb2和Rc在20位上的糖基侧链，就可以得到稀有人参皂苷20(S)-Rg3。
将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc转化为20(S)-Rg3的方法有化学法和生物法。但化学转化法因其反应剧烈、选择性差、无法得到20(S)-Rg3纯品等缺点而不被采用。生物转化具有反应条件温和，特异性好等特点，而受到青睐。如Cheng等发现新细菌Microbacteriumsp.GS514能转化人参皂苷Rb1生成稀有人参皂苷20(S)-Rg3，但存在转化周期较长，转化率低下等缺点(Phytochemistry，2008，69:218-224)。本课题组在前期的研究中也发现了一种β-葡萄糖苷酶能转化人参皂苷Rb1生成稀有人参皂苷20(S)-Rg3(中国专利201410510836.6)。但目前还没有文献报道能同时转化人参皂苷Rb1、Rb2和Rc生成20(S)-Rg3。同时转化人参皂苷Rb1、Rb2和Rc，能提高资源利用率和降低人参皂苷原料的提取成本，但各种酶对底物的专一性不同，降解的糖苷键类型也各不相同。因此，寻找能高效、特异性降解人参皂苷Rb1、Rb2和Rc生产人参皂苷20(S)-Rg3的糖苷水解酶成为了研究关键，同时选择的酶必须有相似的最适反应pH和温度，能进行协同降解。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，该方法所使用的重组酶分别来源于Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶和ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶。
技术方案：一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，利用来源于Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶和ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人参皂苷Rb1、Rb2和Rc生产20(S)-Rg3。
上述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
上述阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
上述β-葡萄糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：
(1)以提取的Thermotogapetrophila基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
(2)将β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切，连接并转化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；
(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导β-葡萄糖苷酶表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，获得纯化的β-葡萄糖苷酶。
上述阿拉伯呋喃糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：
(1)以提取的ThermotogathermarumDSM5069的基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:7所示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子；
(2)将阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET-28a分别用NcoI和XhoI进行双酶切，连接并转化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重组质粒；
(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导阿拉伯呋喃糖苷表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，离心获阿拉伯呋喃糖苷。
酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，降解条件为：Rb1、Rb2、Rc各1g/L，β-葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH5.0，85℃条件下，降解1h，最终可以将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc转化为人参皂苷20(S)-Rg3，摩尔得率为97.3％。
有益效果：
1.本发明可以同时对人参皂苷Rb1、Rb2和Rc转化生成20(S)-Rg3，可以提高资源利用率和降低人参皂苷原料的提取成本。
2.本发明中的酶对Rb1、Rb2和Rc转化能力强，本发明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能在1h内几乎将人参皂苷Rb1、Rb2和Rc完全转化为20(S)-Rg3。
3.本发明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶专一性强，能特异性降解20位侧链上的糖基，几乎无反应副产物。
4.本发明中所述的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶能协同降解，具有相似的最适反应pH和反应温度。
附图说明
图1是本发明中Rb1、Rb2、Rc和20(S)-Rg3的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的温度对糖苷酶活性的影响；
图3是本发明实施例提供的pH对糖苷酶活性的影响；
图4是本发明实施例提供的β-葡萄糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶对人参皂苷Rb1、Rb2、Rc的转化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。
实施例1：重组质粒pET-20b-bgl的构建
1.1Thermotogapetrophila的培养
Thermotogapetrophila购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为DSM13995。其培养基配方为：10g/L可溶性淀粉，3g/L酵母粉，5g/L胰蛋白胨，5g/L肉浸液，10g/L2-吗啉乙磺酸，10mg/L七水合硫酸铁，1mg/L刃天青，调pH为7.2，煮沸充氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌。用注射器按照0.5wt.％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。
1.2基因组DNA的提取
(1)静置培养Thermotogapetrophila24h，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。
(2)用9.5mLTE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL10wt.％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。
(3)加入1.8mL5mol/LNaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇(体积比24：1)，混匀，6,000g离心10min。
(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀(体积比25：24：1)，6,000g离心10min。
(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70vt.％酒精中清洗。
(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。
(9)室温下风干，加500μLTE缓冲液溶解。
(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
1.3重组质粒pET-20b-bgl的构建
按照已知的Thermotogapetrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因(YP_001244492.1)设计引物(SEQIDNO:5)下划线表示NdeI酶切位点；(SEQIDNO:6)下划线表示XhoI酶切位点,并去除终止密码子；以提取的Thermotogapetrophila的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，2min10s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到Thermotogapetrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因。
得到Thermotogapetrophila极耐热β-葡萄糖苷酶基因和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，转化产物涂布到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)固体培养基上37℃过夜培养，接种几个单菌落到LB(添加氨苄青霉素至终浓度100mg/L)液体培养基中培养8-10小时后，收集菌体提取质粒，酶切验证去除空载质粒，将重组质粒进行核酸序列测定，得到正确的重组表达载体pET20b-bgl。
2.重组极耐热β-葡萄糖苷酶的表达及纯化
将重组质粒pET-20b-bgl转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Amp(100μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(100μg/mLAmp)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，上清即为重组极耐热β-葡萄糖苷酶的纯酶。
3.重组质粒pET-28a-Arf的构建
3.1ThermotogathermarumDSM5069的培养
ThermotogathermarumDSM5069购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)。编号为：DSM5069。其培养基配方为：5g/L可溶性淀粉，1g/L酵母粉，1.5g/LKH2PO4，4.2g/LNa2HPO4·12H2O，3.4g/LNaCl，1g/LMgSO4x7H2O，0.76g/LEDTA，1mL/L微量元素，0.5g/LNa2S·9H2O，0.5g/LCysteineHCl，1mg/L刃天青，调pH为7.0，煮沸冲氮气，除去氧气后，培养基在无氧条件下装入厌氧瓶灭菌。微量元素(1000×)配方：FeCl32.0g/L；H3BO30.05g/L；ZnCl20.05g/L；CuCl2·2H2O0.03g/L；MnCl2·4H2O0.05g/L；(NH4)2MoO40.05g/L；AlK(SO4)2·12H2O0.05g/L。)用注射器按照0.5wt.％接种量接种，82℃静止培养24h，收集细胞。
3.2基因组DNA的提取
(1)静置培养ThermotogathermarumDSM506924h，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。
(2)用9.5mLTE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL10wt.％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。
(3)加入1.8mL5mol/LNaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。
(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。
(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。
(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。
(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70vt.％酒精中清洗。
(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。
(9)室温下风干，加500μLTE缓冲液溶解。
(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。
3.3重组质粒pET-20b-Arf的构建
按照已知的ThermotogathermarumDSM5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因(WP013932416.1)设计引物：(SEQIDNO:7)下划线表示NcoI酶切位点；(SEQIDNO:8)下划线表示XhoI酶切位点,并去除终止密码子；以提取的ThermotogathermarumDSM5069的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是94℃，3min；30次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min28s)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到ThermotogathermarumDSM5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因。
得到ThermotogathermarumDSM5069极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶基因和pET-28a分别用NcoI和XhoI进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有极耐热糖苷酶基因的重组质粒pET-28a-Arf。
4.重组极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶的表达及纯化
将重组质粒pET-28a-Arf转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌(Novagen)，在含有Kan(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mLKan)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.01mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃诱导培养8h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体，去上清加入无菌水，超声波破碎细胞，随后70℃热处理30min，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，上清即为重组极耐热阿拉伯呋喃糖苷酶的纯酶。
5.重组酶协同转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rc生成20(S)-Rg3的条件
5.1酶活测定
反应体系200μL，10μL20mmol/LpNPG中加入100μL100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)和85μL水，先在90℃孵育2min，再加入5μL酶液(稀释到合适的倍数，使OD405的值在0.2～1.0之间)反应10min。反应结束后立刻加入600μL1M的Na2CO3，用分光光度计在405nm下测定其吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmolPNP所用的酶量为1个酶活力单位。
反应体系200μL，10μL20mmol/LpNPArf中加入100μL100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)和85μL水，先在95℃孵育2min，再加入5μL酶液(稀释到合适的倍数，使OD405的值在0.2～1.0之间)反应10min。反应结束后立刻加入600μL1M的Na2CO3，用分光光度计在405nm下测定其吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmolPNP所用的酶量为1个酶活力单位。
5.2最适反应温度的测定
在70-90℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0，发现两种极耐热糖苷酶的最适反应温度为85℃(图2)。
5.3最适反应pH的测定
在不同的pH(3.5-7.0，50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)条件下，85℃分别测定酶活，发现两种极耐热糖苷酶的最适反应pH为5.0(图3)。
6.协同转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rc生成人参皂苷20(S)-Rg3
人参皂苷Rb1、Rb2、Rc的浓度均为1g/L，转化条件为85℃，pH5.0，50mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，不同的时间点(0，5，10，20，30，40，50，60min)分别取样，通过HPLC进行检测。结果发现β-葡萄糖苷酶(0.15U)和阿拉伯呋喃糖苷酶(0.6U)协同作用在60min内可以将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc转化为稀有人参皂苷20(S)-Rg3，摩尔得率为97.3％(图4)。
SEQUENCELISTING
<110>南京林业大学
<120>一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法
<130>
<160>8
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>2166
<212>DNA
<213>Thermotogapetrophila
<400>1
atgatgggaaagatcgatgaaatcctttcacagctgactattgaagaaaaagtgaaactt60
gtagtgggggttggtcttccaggactttttggaaatccacattccagagtggcaggtgca120
gctggagaaacgcatcctgttccgaggcttggaattccttctttcgttctggccgacggt180
cccgcgggcctcagaataaatcccacaagagagaacgacgaaaacacctattacacaaca240
gcgtttcctgttgaaatcatgctcgcttccacctggaacaaagatcttctggaagaagta300
ggaaaagctatgggagaagaagtcagggaatacggtgtcgatgtgcttcttgcacctgcg360
atgaacattcacaggaaccctctttgtggaaggaatttcgagtattattcagaagatcct420
gtcctttccggtgaaatggcttcagcctttgtcaagggagttcaatctcaaggggtggga480
gcctgcataaaacactttgtcgcgaacaaccaggaaacgaacaggatggtagtggacacg540
atcgtgtccgagcgagccctcagagaaatatatctgaaaggttttgaaattgccgtcaag600
aaagcaagaccctggaccgtgatgagcgcttacaacaaactgaatggaaaatactgttca660
cagaacgaatggcttttgaagaaggttctcagggaagaatggggatttgacggtttcgtg720
atgagcgactggtacgcgggagacaaccctgtagaacagctcaaggccggaaacgatatg780
atcatgcctggaaaagcgtatcaggtgaacacggaaagaagagatgaaatagaagaaatc840
atggaggcgttgaaggagggaagactcagtgaggaagtcctgaacgaatgtgtgagaaac900
atcctcaaagttcttgtgaacgcgccttcctttaaagggtacaggtactcgaacaaaccg960
gacctcgaatctcacgcgaaagttgcctacgaagcaggtgtggagggtgttgtccttctt1020
gagaacaacggtgttcttccattcgatgaaagtatccatgtcgccgtctttggcaccggt1080
caaatcgaaacaataaagggaggaacgggaagtggagacacccatccgagatacacgatc1140
tctatccttgaaggcataaaagaaagaaacatgaagttcgacgaagaactcacctccatc1200
tatgaggattacatcaaaaagatgagagaaacagaggaatataaacccagaactgactcc1260
tggggaacggttataaaaccgaaacttccagagaactttctctcagaaaaagagataaag1320
aaggctgcgaagaaaaacgatgctgcagttgttgtaatcagtaggatctccggtgaggga1380
tacgacagaaagccggtgaaaggtgacttctacctctccgatgacgagctggagctcata1440
aaaacagtctcaagggaattccacgaacagggtaagaaggttgtggttcttctcaacatc1500
ggaagtcccattgaagttgcaagctggagagatcttgtggatggaatccttctcgtctgg1560
caagcaggacaggagatgggaagaatagtggccgatgttcttgtgggaagggtaaacccc1620
tccggaaaacttccaacgaccttcccgaaggattactcggacgttccatcctggacgttc1680
ccaggagagccaaaggacaatccgcaaagagtggtgtacgaggaagacatctacgtggga1740
tacaggtactacgacacctttggtgtggaacctgcctacgagttcggctacggcctctct1800
tacacaaagtttgaatacaaagatttaaagatcgctatcgacggagatatactcagagtg1860
tcgtacacgatcacaaacaccggggacagagctggaaaggaagtctcacaggtttatgtc1920
aaagctccaaaagggaaaatagacaaacccttccaggagctgaaagcgttccacaaaaca1980
aaacttttgaacccgggtgaatccgaaaagatctttctggaaattcctcttagagatctt2040
gcgagtttcgatgggaaagaatgggttgtcgagtcaggagaatacgaggtcagggtcggt2100
gcatcttcgagggatataaggttgagagatatttttctggttgagggagagaagagattc2160
aaacca2166
<210>2
<211>722
<212>PRT
<213>Thermotogapetrophila
<400>2
MetMetGlyLysIleAspGluIleLeuSerGlnLeuThrIleGluGlu
151015
LysValLysLeuValValGlyValGlyLeuProGlyLeuPheGlyAsn
202530
ProHisSerArgValAlaGlyAlaAlaGlyGluThrHisProValPro
354045
ArgLeuGlyIleProSerPheValLeuAlaAspGlyProAlaGlyLeu
505560
ArgIleAsnProThrArgGluAsnAspGluAsnThrTyrTyrThrThr
65707580
AlaPheProValGluIleMetLeuAlaSerThrTrpAsnLysAspLeu
859095
LeuGluGluValGlyLysAlaMetGlyGluGluValArgGluTyrGly
100105110
ValAspValLeuLeuAlaProAlaMetAsnIleHisArgAsnProLeu
115120125
CysGlyArgAsnPheGluTyrTyrSerGluAspProValLeuSerGly
130135140
GluMetAlaSerAlaPheValLysGlyValGlnSerGlnGlyValGly
145150155160
AlaCysIleLysHisPheValAlaAsnAsnGlnGluThrAsnArgMet
165170175
ValValAspThrIleValSerGluArgAlaLeuArgGluIleTyrLeu
180185190
LysGlyPheGluIleAlaValLysLysAlaArgProTrpThrValMet
195200205
SerAlaTyrAsnLysLeuAsnGlyLysTyrCysSerGlnAsnGluTrp
210215220
LeuLeuLysLysValLeuArgGluGluTrpGlyPheAspGlyPheVal
225230235240
MetSerAspTrpTyrAlaGlyAspAsnProValGluGlnLeuLysAla
245250255
GlyAsnAspMetIleMetProGlyLysAlaTyrGlnValAsnThrGlu
260265270
ArgArgAspGluIleGluGluIleMetGluAlaLeuLysGluGlyArg
275280285
LeuSerGluGluValLeuAsnGluCysValArgAsnIleLeuLysVal
290295300
LeuValAsnAlaProSerPheLysGlyTyrArgTyrSerAsnLysPro
305310315320
AspLeuGluSerHisAlaLysValAlaTyrGluAlaGlyValGluGly
325330335
ValValLeuLeuGluAsnAsnGlyValLeuProPheAspGluSerIle
340345350
HisValAlaValPheGlyThrGlyGlnIleGluThrIleLysGlyGly
355360365
ThrGlySerGlyAspThrHisProArgTyrThrIleSerIleLeuGlu
370375380
GlyIleLysGluArgAsnMetLysPheAspGluGluLeuThrSerIle
385390395400
TyrGluAspTyrIleLysLysMetArgGluThrGluGluTyrLysPro
405410415
ArgThrAspSerTrpGlyThrValIleLysProLysLeuProGluAsn
420425430
PheLeuSerGluLysGluIleLysLysAlaAlaLysLysAsnAspAla
435440445
AlaValValValIleSerArgIleSerGlyGluGlyTyrAspArgLys
450455460
ProValLysGlyAspPheTyrLeuSerAspAspGluLeuGluLeuIle
465470475480
LysThrValSerArgGluPheHisGluGlnGlyLysLysValValVal
485490495
LeuLeuAsnIleGlySerProIleGluValAlaSerTrpArgAspLeu
500505510
ValAspGlyIleLeuLeuValTrpGlnAlaGlyGlnGluMetGlyArg
515520525
IleValAlaAspValLeuValGlyArgValAsnProSerGlyLysLeu
530535540
ProThrThrPheProLysAspTyrSerAspValProSerTrpThrPhe
545550555560
ProGlyGluProLysAspAsnProGlnArgValValTyrGluGluAsp
565570575
IleTyrValGlyTyrArgTyrTyrAspThrPheGlyValGluProAla
580585590
TyrGluPheGlyTyrGlyLeuSerTyrThrLysPheGluTyrLysAsp
595600605
LeuLysIleAlaIleAspGlyAspIleLeuArgValSerTyrThrIle
610615620
ThrAsnThrGlyAspArgAlaGlyLysGluValSerGlnValTyrVal
625630635640
LysAlaProLysGlyLysIleAspLysProPheGlnGluLeuLysAla
645650655
PheHisLysThrLysLeuLeuAsnProGlyGluSerGluLysIlePhe
660665670
LeuGluIleProLeuArgAspLeuAlaSerPheAspGlyLysGluTrp
675680685
ValValGluSerGlyGluTyrGluValArgValGlyAlaSerSerArg
690695700
AspIleArgLeuArgAspIlePheLeuValGluGlyGluLysArgPhe
705710715720
LysPro
<210>3
<211>1452
<212>DNA
<213>ThermotogathermarumDSM5069
<400>3
atggcttacgaaatcagtgtgaatccgagcaagactgtgaaaccagttagcaagtacatc60
tacgggcatttcactgagcatcttggaagatgtatttacggtgggatttacgaagaaggt120
tcaccgctgtcggatcatcgtgggtttagaaaagacgtgcttgaggcgataaagaagatc180
aaagttccaattctacgatggccaggtggaaactttgtgtcgaattatcattgggaagat240
ggaattggtccaaaggatcaaagacccgtgaggtttgatcttgcttggcaacaagaggaa300
acgaacagatttggtacagatgaattcatcgaatactgtcgtgaaatcaaagcagaacca360
tatatctgtgttaaccttggaactggtaccttggacgaggcacttcattggttggaatac420
tgtaatggaaaaggtaacacatattatgctcaacttaggagaaaatatggtcatccagag480
ccatataacgtcaaattctggggtataggaaatgagatgtatggtgaatggcaagttggg540
catatgacagccgatgaatatgcaagagttgccaaagaatacgcaaaatggatgaaagtt600
ttcgatccttcgataaaaacaatagcagttggatgtgatgaccatgaatggaatctaaag660
gttttaaaccaagccggagatgtttttgactacatttcttaccacttttacacgggatct720
gaaaactactacgaaacggtgtccacagtttatttgctagaacaaaggcttataggtctt780
aaaaggctgatagaaacaagcagaacaaagcgaaggaatgaaataaaaatcgcgctcgat840
gaatggaatgtttggtacagagtaatggataacaaacttgaagaaccttacgatctaacc900
gatggtattttcgcctgcggagttttgataatgcttcaaagaatcagcgacattgttcca960
atagcaaatctcgctcagcttgtcaacgcacttggagcaatacacacggagaaaaacgga1020
ataattttgacgcccgtttataaagctttcgagttaatagttaatcacagcggagaaaaa1080
ctcgttgaaacaattgttgaaacagaaacttacgatatagaaggaaaaatgttctacttc1140
aaaacgccgtttaaagtctacgatgcaaagcttttggacgcaactgcaacgatttcagaa1200
gatgggaaaaagttgtatctggcagttgtaaactacaacaaagattcagaaatacgttgt1260
ccaatcaaaatcaaaggttgtggaaagaagcaagcaaaagtttacgtactcaacggtcca1320
gatatcaaagcaagaaatactttggaaaaaccgaatgttgtagatattgttgaaaagaca1380
acaatagttgatgaggaatttgaatttaccttcgaaccacactcttgcactgtgatagaa1440
gtagaaagatca1452
<210>4
<211>484
<212>PRT
<213>ThermotogathermarumDSM5069
<400>4
MetAlaTyrGluIleSerValAsnProSerLysThrValLysProVal
151015
SerLysTyrIleTyrGlyHisPheThrGluHisLeuGlyArgCysIle
202530
TyrGlyGlyIleTyrGluGluGlySerProLeuSerAspHisArgGly
354045
PheArgLysAspValLeuGluAlaIleLysLysIleLysValProIle
505560
LeuArgTrpProGlyGlyAsnPheValSerAsnTyrHisTrpGluAsp
65707580
GlyIleGlyProLysAspGlnArgProValArgPheAspLeuAlaTrp
859095
GlnGlnGluGluThrAsnArgPheGlyThrAspGluPheIleGluTyr
100105110
CysArgGluIleLysAlaGluProTyrIleCysValAsnLeuGlyThr
115120125
GlyThrLeuAspGluAlaLeuHisTrpLeuGluTyrCysAsnGlyLys
130135140
GlyAsnThrTyrTyrAlaGlnLeuArgArgLysTyrGlyHisProGlu
145150155160
ProTyrAsnValLysPheTrpGlyIleGlyAsnGluMetTyrGlyGlu
165170175
TrpGlnValGlyHisMetThrAlaAspGluTyrAlaArgValAlaLys
180185190
GluTyrAlaLysTrpMetLysValPheAspProSerIleLysThrIle
195200205
AlaValGlyCysAspAspHisGluTrpAsnLeuLysValLeuAsnGln
210215220
AlaGlyAspValPheAspTyrIleSerTyrHisPheTyrThrGlySer
225230235240
GluAsnTyrTyrGluThrValSerThrValTyrLeuLeuGluGlnArg
245250255
LeuIleGlyLeuLysArgLeuIleGluThrSerArgThrLysArgArg
260265270
AsnGluIleLysIleAlaLeuAspGluTrpAsnValTrpTyrArgVal
275280285
MetAspAsnLysLeuGluGluProTyrAspLeuThrAspGlyIlePhe
290295300
AlaCysGlyValLeuIleMetLeuGlnArgIleSerAspIleValPro
305310315320
IleAlaAsnLeuAlaGlnLeuValAsnAlaLeuGlyAlaIleHisThr
325330335
GluLysAsnGlyIleIleLeuThrProValTyrLysAlaPheGluLeu
340345350
IleValAsnHisSerGlyGluLysLeuValGluThrIleValGluThr
355360365
GluThrTyrAspIleGluGlyLysMetPheTyrPheLysThrProPhe
370375380
LysValTyrAspAlaLysLeuLeuAspAlaThrAlaThrIleSerGlu
385390395400
AspGlyLysLysLeuTyrLeuAlaValValAsnTyrAsnLysAspSer
405410415
GluIleArgCysProIleLysIleLysGlyCysGlyLysLysGlnAla
420425430
LysValTyrValLeuAsnGlyProAspIleLysAlaArgAsnThrLeu
435440445
GluLysProAsnValValAspIleValGluLysThrThrIleValAsp
450455460
GluGluPheGluPheThrPheGluProHisSerCysThrValIleGlu
465470475480
ValGluArgSer
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ggaattccatatggccagccaaatcttcattgaaa35
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cccaagcttggcaatatcctccggttcaggttca34
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atgccatggcttacgaaatcagtgtgaatc30
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ccgctcgagtgatctttctacttctatcac30

Claims (6)

1.一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于利用来源于Thermotogapetrophila的β-葡萄糖苷酶和ThermotogathermarumDSM5069的阿拉伯呋喃糖苷酶，降解人参皂苷Rb1、Rb2和Rc生产20(S)-Rg3。
2.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
3.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉伯呋喃糖苷酶的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
4.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：
(1)以提取的Thermotogapetrophila基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:5所示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:6所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到β-葡萄糖苷酶的DNA分子；
(2)将β-葡萄糖苷酶的DNA分子和pET-20b分别用NdeI和XhoI进行双酶切，连接并转化得到含有β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒；
(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导β-葡萄糖苷酶表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，获得纯化的β-葡萄糖苷酶。
5.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于所述阿拉伯呋喃糖苷酶是通过重组表达制备的，步骤为：
(1)以提取的ThermotogathermarumDSM5069的基因组DNA为模板，用具有SEQIDNO:7所示的核苷酸序列为上游引物和具有SEQIDNO:8所示的核苷酸序列为下游引物，PCR扩增得到阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子；
(2)将阿拉伯呋喃糖苷酶的DNA分子和pET-28a分别用NcoI和XhoI进行双酶切，连接并转化得到含有阿拉伯呋喃糖苷的DNA分子的重组质粒；
(3)将上述获得的重组质粒转化表达宿主E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导阿拉伯呋喃糖苷表达，收集菌体，破碎细胞，70℃热处理30分钟，离心获阿拉伯呋喃糖苷。
6.根据权利要求1所述一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法，其特征在于降解条件为：Rb1、Rb2、Rc各1g/L，β-葡萄糖苷酶0.15U，阿拉伯呋喃糖苷酶0.6U，pH5.0，85℃条件下，降解1h，最终可以将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc转化为人参皂苷20(S)-Rg3，摩尔得率为97.3％。
CN201610219176.5A 2016-04-08 2016-04-08 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法 Pending CN105695553A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610219176.5A CN105695553A (zh) 2016-04-08 2016-04-08 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610219176.5A CN105695553A (zh) 2016-04-08 2016-04-08 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105695553A true CN105695553A (zh) 2016-06-22

Family

ID=56219543

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610219176.5A Pending CN105695553A (zh) 2016-04-08 2016-04-08 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695553A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107384896A (zh) * 2017-08-11 2017-11-24 南京林业大学 一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用
CN109182439A (zh) * 2018-09-15 2019-01-11 东北林业大学 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法
CN110325648A (zh) * 2016-09-28 2019-10-11 株式会社爱茉莉太平洋 包含高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的用于生产人参皂苷化合物K的组合物及制备人参皂苷化合物K的方法
CN117535372A (zh) * 2023-10-23 2024-02-09 镇江市德尔生物制品研究所有限公司 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4621137A (en) * 1982-12-24 1986-11-04 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Alpha-glycosyl ginsenosides
KR20030009873A (ko) * 2001-07-24 2003-02-05 주식회사 일화 20-Ｏ-β-Ｄ-글루코피라노실-20(Ｓ)-프로토파낙사디올의제조방법
CN103409393A (zh) * 2013-07-09 2013-11-27 复旦大学 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，编码基因及其制备方法与应用
CN103865867A (zh) * 2014-03-31 2014-06-18 上海交通大学 基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其实现方法
CN104328098A (zh) * 2014-09-28 2015-02-04 江苏康缘药业股份有限公司 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104611313A (zh) * 2015-01-19 2015-05-13 南京林业大学 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104651336A (zh) * 2015-02-02 2015-05-27 南京林业大学 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4621137A (en) * 1982-12-24 1986-11-04 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Alpha-glycosyl ginsenosides
KR20030009873A (ko) * 2001-07-24 2003-02-05 주식회사 일화 20-Ｏ-β-Ｄ-글루코피라노실-20(Ｓ)-프로토파낙사디올의제조방법
CN103409393A (zh) * 2013-07-09 2013-11-27 复旦大学 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，编码基因及其制备方法与应用
CN103865867A (zh) * 2014-03-31 2014-06-18 上海交通大学 基于胞外α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的工程菌及其实现方法
CN104328098A (zh) * 2014-09-28 2015-02-04 江苏康缘药业股份有限公司 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104611313A (zh) * 2015-01-19 2015-05-13 南京林业大学 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104651336A (zh) * 2015-02-02 2015-05-27 南京林业大学 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶及其在制备人参皂苷Rd中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG-SHAN AN 等: "Characterization of a novel ginsenoside-hydrolyzing α-L-arabinofuranosidase, AbfA, from Rhodanobacter ginsenosidimutans Gsoil 3054T", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
张春枝: "人参皂苷糖基水解酶的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
高娟: "糖苷酶转化人参皂苷的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110325648A (zh) * 2016-09-28 2019-10-11 株式会社爱茉莉太平洋 包含高温α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的用于生产人参皂苷化合物K的组合物及制备人参皂苷化合物K的方法
CN107384896A (zh) * 2017-08-11 2017-11-24 南京林业大学 一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用
CN107384896B (zh) * 2017-08-11 2020-07-31 南京林业大学 一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用
CN109182439A (zh) * 2018-09-15 2019-01-11 东北林业大学 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法
CN109182439B (zh) * 2018-09-15 2021-11-09 东北林业大学 人参稀有皂苷Rg3的生物转化方法
CN117535372A (zh) * 2023-10-23 2024-02-09 镇江市德尔生物制品研究所有限公司 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695553A (zh) 一种酶法制备稀有人参皂苷20(S)-Rg3的方法
CN106995829B (zh) 一种酶法转化淫羊藿总黄酮制备淫羊藿苷元的方法
CN104611313B (zh) 一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN104762281B (zh) 一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
CN107384896B (zh) 一种制备稀有人参皂苷的酶组合物及其应用
CN107384895B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法和应用
CN104312996B (zh) α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用
KR20180005716A (ko) 한 그룹의 글리코실전이효소 및 그 응용
CN102492757A (zh) 一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法
CN104328098A (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用
CN105348337A (zh) 一种甜菊苷生物转化制备的甜菊糖衍生物、制备方法及其应用
CN105695552A (zh) 一种酶法制备稀有人参皂苷Rh1的方法
CN108467858A (zh) 一种α-L-鼠李糖苷酶及其应用
CN104404065A (zh) 罗汉果糖基转移酶基因ugt74ac1及其应用
CN109852597A (zh) 一种β-半乳糖苷酶galRBM20_1及其制备方法和应用
KR20100107865A (ko) 고온성 베타-글리코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드의제조방법
CN108384769A (zh) 一种耐高温复合酶及其应用
CN107267478A (zh) 一种淀粉蔗糖酶及其用于转化生产α‑熊果苷的方法
CN109294950A (zh) 高活性结冷胶寡糖产生菌及其应用
CN105255805B (zh) 一种枯草芽孢杆菌基因工程菌株及其构建方法与在生产乳果糖中的应用
CN109837261B (zh) 一种葡萄糖苷酶突变体及其应用
Zeng et al. Specific and efficient hydrolysis of all outer glucosyls in protopanaxadiol type and protopanaxatriol type ginsenosides by a β-glucosidase from Thermoclostridium stercorarium
CN107189992B (zh) 一种肝素前体合酶及其应用
CN106754989B (zh) 布渣叶黄烷酮-2-羟基化酶及其编码基因与应用
CN103160483B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其表达基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160622

RJ01 Rejection of invention patent application after publication