CN117535372A - 一种β-葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种β‑葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用。以本发明的β‑葡萄糖苷酶或表达该酶的重组微生物通过全细胞催化可生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1，进而提出本发明的β‑葡萄糖苷酶在制备人参皂苷中的应用，所述β‑葡萄糖苷酶的氨基酸序列在NCBI上的编号为RLF05189.1。本发明提供了一种新的合成人参皂苷Rg3和/或Rh1的方法，优选采用全细胞催化法进行生产还具备周期短、反应专一性强、产率高、污染小、工艺简单的优势。

Description

一种β-葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种β-葡萄糖苷酶及其在制备人参皂苷中的应用。
背景技术
稀有人参皂苷Rg3是一种PPD型三萜皂苷，在人参中含量极低，具有抗肿瘤、抗病毒、提高机体免疫功能(中国药物与临床，2011，11(2)：180-182；中华中医药学刊，2022,40(2)：156-159)，Rg3是某些抗癌辅助药物中的主要成分，Rg3在医药和食品添加剂领域具有潜在的应用前景，但是Rg3纯品价格十分昂贵。稀有人参皂苷Rh1是一种PPT型三萜皂苷，在红参、人参、三七、西洋参等植物中微量存在，具有显著的免疫调节活性，可抑制炎症反应(国际老年医学杂志，2022，43(3)：368-371)。
目前制备稀有人参皂苷的方法主要包括传统的溶剂提取法(煎煮法、浸渍法、回流法、连续提取法、渗滤法等)、酸水解法、微生物转化法、酶催化法。如制备稀有人参皂苷Rg3的方法有：从人参须根中提取法(中国专利申请号202110228324.0)，水解法(中国专利授权公告号CN 110229208 B；中国专利授权公告号CN 102993258 B)，微生物转化法(中国专利申请号202310626928.X),酶催化法(中国专利申请号201610219176.5；中国专利申请号201911117100.1)，但是在实际应用中存在水解产物不易控制、产率低，微生物转化周期长、转化率还有待提高等问题。
因此寻找新的对环境友好、污染小、反应专一性强，产率高、成本低、工艺简单的转化方法仍是工业化生产及应用稀有人参皂苷的关键。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的催化生成稀有人参皂苷的方法。尤其提供一种通过重组菌全细胞催化生成稀有人参皂苷的方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷中的应用，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列在NCBI上的编号为RLF05189.1；所述人参皂苷为稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
本发明经研究发现，嗜热微生物的上述beta-glucosidase可特异性催化底物生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1，进而提出了本发明。
第二方面，本发明提供一种核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、重组微生物或转基因细胞系，所述核酸分子编码β-葡萄糖苷酶，所述β-葡萄糖苷酶如上所述。
本发明的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
第三方面，本发明提供上述核酸分子或含有上述核酸分子的生物材料在制备人参皂苷中的应用；所述人参皂苷为稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
将本发明的核酸分子导入寄主微生物的基因组中后，可使获得的重组微生物表达上述β-葡萄糖苷酶，从而可通过全细胞催化法实现稀有人参皂苷的生产。
第四方面，本发明提供一种生产稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1的方法，其以β-葡萄糖苷酶或重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1；所述β-葡萄糖苷酶如上所述，所述重组微生物包括一种核酸分子，所述核酸分子如上所述。
本发明的方法中，当生产稀有人参皂苷Rg3时，反应底物为人参皂苷Rb1和/或Rd；当生产稀有人参皂苷Rh1时，反应底物为Rg1；优选，在制备稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应底物为三七总皂苷提取物，以利于节约成本，并同时生产上述两种稀有人参皂苷。
本发明的方法中，以所述β-葡萄糖苷酶生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应温度为70-85℃，pH为4-7(优选，反应温度为78-82℃，pH为5.8-6.2，更优选反应温度为80℃，pH为6)；反应溶剂为含0.8-1.2％吐温80的PBS溶液(50mM)或含8-15％(优选，10％)乙醇的PBS溶液(50mM)，或反应溶剂包括低共熔溶剂DES，所述反应溶剂中所述低共熔溶剂的体积分数为15-25％；反应底物与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为10:1-30:1(优选为15:1)。
本发明的方法中，以所述重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应温度为70-85℃，pH为4-7(优选，反应温度为78-82℃，pH为5.8-6.2，更优选反应温度为80℃，pH为6)；反应溶剂为含0.8-1.2％吐温80的PBS溶液(50mM)或含8-15％(优选，10％)乙醇的PBS溶液(50mM)，或反应溶剂包括低共熔溶剂，所述反应溶剂中所述低共熔溶剂的体积分数为15-25％；
反应底物与所述重组微生物的质量比为20:1-50:1(优选为30:1)；所述重组微生物经IPTG诱导表达所述β-葡萄糖苷酶，优选，所述诱导表达的条件为：IPTG终浓度为0.1-0.5mM，37±1℃、180-220rpm下振荡培养，4-6小时，更优选，所述诱导表达的条件为：IPTG终浓度为0.18-0.22mM，37±1℃、180-220rpm下振荡培养，4.5-5.5小时。
本发明的β-葡萄糖苷酶耐热、可工作的pH条件宽泛，利于生产应用。而且在采用全细胞催化生产方法时，高温下进行反应，有利于高温裂解细胞，使酶从细胞中游离出来，与底物更充分接触发生反应。
本发明还研究发现，当在反应溶剂中包含特定低共熔溶剂时，有利于保持本发明的酶在高温下的稳定性，提高底物的转化率和产物的溶解性。
本发明的方法中，所述低共熔溶剂中包括氢键受体和氢键供体；所述氢键受体为氯化胆碱和/或L-脯氨酸，所述氢键供体为乳酸、1，4-丁二醇、D-山梨醇、蔗糖、无水乙醇、甘油中的一种或多种；
优选，所述氢键受体为L-脯氨酸，所述氢键供体为乳酸，所述L-脯氨酸和乳酸的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-2.2)，更优选为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为无水乙醇和1，4-丁二醇，所述氯化胆碱、无水乙醇和1，4-丁二醇的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为D-山梨醇和1，4-丁二醇，所述氯化胆碱、D-山梨醇和1，4-丁二醇的摩尔比为(1.8-2.2)：(0.8-1.2)：(3.8-4.2)；或
所述氢键受体为L-脯氨酸，所述氢键供体为甘油和蔗糖，所述L-脯氨酸、甘油和蔗糖的摩尔比为(3.8-4.2)：(9.8-10.2)：(0.8-1.2)。
更优选，所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为无水乙醇和1，4-丁二醇，所述氯化胆碱、无水乙醇和1，4-丁二醇的摩尔比为(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。
本发明的方法中，以所述重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时包括：
(1)制备重组微生物：以含有核酸分子的重组载体转化寄主微生物感受态细胞，得到重组微生物；所述核酸分子编码β-葡萄糖苷酶，所述β-葡萄糖苷酶如上所述；优选，所述寄主微生物为大肠杆菌；
(2)以IPTG诱导所述β-葡萄糖苷酶在所述重组微生物中的表达后，收集、重悬获得所述重组微生物的全细胞溶液；
(3)将所述重组微生物的全细胞溶液、底物和反应溶剂混合、反应生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
本发明优选利用含上述嗜热微生物beta-glucosidase基因的重组菌全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
作为一个具体实施方式，本发明生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1的方法包括：
全基因合成来自嗜热微生物Thermoprotei archaeonr的beta-glucosidase基因(GenBank Accession No.:RLF05189.1)，命名为Thabgl，通过高保真PCR并连接到PET28a载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
将含有Thabgl的重组菌在37℃，200rpm振荡培养至OD值0.6时，加入IPTG(终浓度为0.2mM)，继续培养5小时后，5000rpm离心5分钟收集细胞，加入pH6的50mM PBS溶液重悬细胞洗涤，再以5000rpm离心5分钟收集洗涤后细胞，此时加入pH6的50mM PBS配制成100克/升的全细胞溶液。
以0.5％全细胞溶液加入到含15克/升三七皂苷的20％低共熔溶剂溶液中，80℃恒温，反应2h，可将三七提取物中的Rb1底物基本转化为Rg3，Rg1底物基本转化为Rh1。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种新的合成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1的方法，优选采用全细胞催化法进行产物的生产，相对于经典的酶催化反应，无需酶的分离纯化，更加节约成本；相对水解法和生物转化法，在高温下进行全细胞催化对底物的专一性更高，产率高，副产物少，转化周期短。更优选，采用低共熔溶剂为反应体系，可提升产率，且对环境友好，污染小。
附图说明
图1为Thabgl基因的扩增电泳图。
图2为Thabgl基因与PET28a连接产物转化BL21(DE3)后挑取6个菌落进行PCR鉴定。泳道1-6分别为6个菌落电泳结果。
图3为Thabgl基因的诱导表达及耐热性实验结果。泳道1表示BL21(DE3)细胞总蛋白电泳图；泳道2表示BL21-Thabgl重组菌细胞未加IPTG总蛋白电泳图；泳道3表示BL21-Thabgl重组菌细胞加IPTG诱导后总蛋白电泳图；泳道4表示BL21-Thabgl重组菌细胞加IPTG诱导后上清蛋白电泳图；泳道5表示BL21-Thabgl重组菌细胞加IPTG诱导后上清蛋白经85℃热处理10min后电泳图。
图4为在不同反应液中PH对酶活性的影响结果。
图5为在不同反应液中温度对酶活性的影响结果。
图6为THABGL蛋白酶溶液转化人参皂苷Rb1、Rd高效液相检测结果，图中A为Rd纯品(反应前)检测结果；B为Rd纯品转化结果；C为Rb1纯品(反应前)检测结果；D为Rb1纯品转化结果；E为Rg3标准品检测结果。横坐标为时间(min)。
图7为THABGL蛋白酶溶液转化人参皂苷Rg1高效液相检测结果，图中A为Rg1纯品(反应前)检测结果；B为Rg1纯品转化结果；C为Rh1标准品检测结果；D为15克/升三七提取物(20％DES2溶液)检测结果；E为15克/升三七提取物转化产物结果。
图8为含Thabgl基因的全细胞液催化三七提取物转化生成稀有人参皂苷Rg3和Rh1的液相色谱检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
实施例1
实验试剂与材料：
大肠杆菌BL21(DE3)和PET28a载体购自生工生物工程(上海)股份有限公司，限制性内切酶及连接酶、高保真酶购自Takara公司。高效液相色谱级乙腈购自安徽天地高纯试剂有限公司，各种化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，去离子水为娃哈哈纯净水。
本发明所用三七提取物(含总皂苷80％)购自陕西锦泰臻品生物工程有限公司，人参皂苷Rb1、Rd、Rg1和稀有人参皂苷Rg3、Rh1购自成都曼思特生物科技有限公司。
本发明中所用的分子生物学方法及各试剂配方来自《分子克隆实验指南(第四版)》。
一、全基因合成来自嗜热微生物Thermoprotei archaeonr的β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)基因
基于Thermoprotei archaeonr的β-葡萄糖苷酶基因命名为Thabgl，所编码的蛋白命名为THABGL蛋白(GenBank Accession No.:RLF05189.1)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并连接到载体PUC57载体BamHⅠ位点上，命名为PUC57-Thabgl。合成的全基因序列如SEQ ID No.1所示。
二、扩增Thabgl基因并与PET28a载体连接
1、Thabgl基因的扩增
设计引物P1与P2。P1中引入了BamHⅠ位点(下划线表示)，P2中引入了Hind III位点(下划线表示)，引物由上海生工基因有限公司合成。
上游引物P1(SEQ ID No.2)：5′-GT GGATCC ATG AAG CCC GCT ATA GTT-3′；
下游引物P2(SEQ ID No.3)：5′-CG AAGCTT TTA CGG GGG GTA TCT AAT CT-3′；
以PUC57-Thabgl质粒为模板进行扩增，反应体系如下表1所示。
表1
组分 用量
10×PCR buffer 2.5μl
PCR高保真酶 0.2μl
P1引物 0.4μl
P2引物 0.4μl
PUC57-Thabgl 1μl
ddH2O 20.5μl
总量 25μl
扩增反应条件：94℃预变性2min；94℃30s变性，57℃15s退火，72℃1min 45s延伸；35个循环；最后72℃总延伸10min，PCR反应产物电泳结果如图1所示。
2、将获得的PCR产物与双酶切线性化处理的PET28a载体(PET28a载体双酶切位点为BamHⅠ位点与XohⅠ位点)进行连接，连接反应体系如表2所示。
表2
组分 体积
PET28a载体 0.5μl
SolutionⅠ 5μl
高保真PCR产物 4.5μl
ddH2O 补至总体系终体积10μl
混匀反应体系在16℃反应30min，置于4℃下过夜以提高其连接效率。
三、Thabgl基因与PET28a连接产物转化BL21(DE3)感受态细胞
从-70℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，在冰上融化；取5μL连接反应液加入感受态细胞BL21(DE3)中，轻轻混匀，冰浴30min后，置于42℃中热激60s，再迅速冰浴2min；加入700μL液体LB培养基，37℃180rpm振荡培养1h；4000rpm离心5分钟，去上清保留150微升，轻轻重悬菌体，将菌液涂布至含卡那霉素(50微克/毫升)的LB平板上；平板于37℃中培养12～16h，随机挑取6个菌落接种3mL含卡那霉素(50微克/毫升)的5毫升LB培养基中，以200rpm在37℃振荡培养过夜，以上述P1和P2引物进行PCR鉴定，鉴定结果如图2所示。将阳性重组子送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，无突变的正确重组菌株命名为BL21-Thabgl。
四、Thabgl基因的诱导表达与热稳定性实验
将重组菌BL21-Thabgl接种3mL含卡那霉素(50微克/毫升)的LB培养基中，以200rpm在37℃振荡培养过夜；再以1:10培养液转接到50mL含卡那霉素(50微克/毫升)的新鲜LB培养基中，以200rpm在37℃振荡培养至OD值为0.6；加入IPTG(IPTG终浓度为0.2mM)，在200rpm在37℃振荡培养诱导表达5小时。以4000rpm离心5min收集细胞，用PBS重悬洗涤，然后用PBS重悬菌体，用于进行SDS-PAGE蛋白电泳。各蛋白电泳结果如图3所示。对BL21(DE3)细胞总蛋白进行电泳检测(泳道1)；未加IPTG诱导培养的BL21-Thabgl重组菌细胞总蛋白进行电泳检测(泳道2)。BL21-Thabgl重组菌细胞加IPTG诱导后总蛋白电泳图见泳道3。将上述重组菌BL21-Thabgl加IPTG诱导后收集的菌体配制成100克/升的细胞溶液，将细胞溶液进行超声破碎(超声功率150W，超声1秒，间隔2秒，共15分钟)，破碎后的细胞液以8000rpm离心10min获得上清蛋白，上清蛋白电泳图见泳道4，在80kDa左右有明显的可溶性THABGL蛋白产生。
进一步将细胞破碎液在85℃保持10min，以8000rpm离心10min取上清溶液，进行蛋白电泳检测，结果见图3中泳道5，其显示在80kDa左右有明显的蛋白条带，初步表明THABGL蛋白是耐高温蛋白，并且通过高温处量(85℃保持10min)，可以将其从细胞中进行纯化分离出来。
五、反应体系PH值对THABGL蛋白酶活力的影响
采用p-NPG法检测THABGL蛋白酶活力：
(1)对硝基苯酚标准曲线的绘制
准确称取对硝基苯酚标准品0.0139g，用纯水定容至500mL配制成0.2μmol/mL的对硝基苯酚溶液，用0.1mol/L的Na2CO3溶液定容，配制成浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06μmol/mL的对硝基苯酚溶液。纯水作空白，测定λmax＝395nm处的吸光度，绘制对硝基苯酚的标准曲线为y＝0.00527x-0.00013，R2＝0.999。
(2)BGL的酶活定义为：70℃反应1min水解生成1μmol对硝基苯酚的酶量为1个酶活单位U。
BGL的酶活测定方法：将步骤四中经过热处理(85℃保持10min)纯化分离的THABGL蛋白溶液以50mM的PBS溶液稀释10倍(v/v)，取0.1mL稀释的酶液与0.9mL、30mmol/L的对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)溶液混合后，在不同PH值条件下(反应溶液分别为含1％吐温的50mM PBS溶液、含10％乙醇的50mM PBS溶液、含20％低共熔溶剂(氯化胆碱:D-山梨醇:1，4-丁二醇摩尔比例为2:1:4)的溶液)，70℃下保温10min进行反应，立即加入1mol/L的Na2CO3溶液2mL终止反应，再加入蒸馏水定容至5mL，摇匀。以纯水作为空白，在λmax＝395nm处测定样品的吸光度，代入对硝基苯酚标准曲线，求得反应生成对硝基苯酚的量，进而计算得到BGL的酶活，按公式(1-1)计算游离酶的酶活，结果如图4所示，表明在不同的反应液中，当PH为6时，酶活达到最高。
式中：
A：λmax＝395nm处样品的吸光度；
N：稀释倍数；
0.0527：对硝基苯酚标准曲线的斜率；
10：反应时间(min)；
0.1：加入酶液的体积(mL)。
六、反应温度对THABGL蛋白酶活力的影响
参照步骤五中的检测酶活的方法，在PH6的反应溶液(反应溶液分别为含1％吐温的50mM PBS溶液、含10％乙醇的50mM PBS溶液、含20％低共熔溶剂(氯化胆碱:D-山梨醇:1，4-丁二醇摩尔比例为2:1:4)的溶液)中进行不同高温条件下THABGL蛋白酶活力的检测，结果如图5所示，在不同反应溶液中当温度为80℃时，酶活达到最高。
七、THABGL蛋白酶对人参皂苷Rb1、Rd、Rg1的催化反应按步骤四中方法将重组菌BL21-Thabgl加IPTG诱导后收集菌体，配制成100克/升的细胞溶液，对细胞溶液进行超声破碎，将细胞破碎液在85℃保持10min，以8000rpm离心10min取上清溶液，获得耐高温的THABGL蛋白酶溶液，将牛血清白蛋白(BSA)进行梯度稀释制备标准曲线，用Bradford法测定蛋白质浓度，配制浓度为0.25mg/ml的耐高温THABGL蛋白酶溶液。
分别配制含1克/升的人参皂苷Rb1、Rd、Rg1的反应液(反应液的溶剂为PH6的含20％的DES2的溶液，DES2的组分见表3)。
反应液的溶剂制备方法如下：采用加热法制备一系列低共熔溶剂DESs，DESs的组分和摩尔比例如表3所示。根据表3中所示，按一定摩尔比例准确称取氢键受体(氯化胆碱、L-脯氨酸)和氢键供体(乳酸、1，4-丁二醇、D-山梨醇、蔗糖、无水乙醇、甘油)，混合于圆底烧瓶中，在80℃恒温水浴振荡器中以150rpm水浴加热，直至获得澄清透明液体，将制备的不同低共熔溶剂DESs按照体积分数20％溶解于pH6的50mM PBS缓冲液中，制备成含20％的DESs的溶液。
表3制备不同DES中的组分及各成份摩尔比例
将THABGL蛋白酶溶液(THABGL蛋白酶浓度0.25mg/ml)分别以1％(V/V)加入上述配制的含1克/升人参皂苷Rb1、Rd、Rg1的反应液(含DES2)中，在80℃下反应2小时后进行高效液相色谱检测，检测结果如图6和图7所示。Rb1与Rd几乎能完全转化成Rg3(图6)，摩尔转化率分别为98.3％和97.8％；Rg1也几乎能完全转化成Rh1(图7中A、B、C)，摩尔转化率为98.1％。
本实施例进一步在含有15克/升三七提取物(含总皂苷80％，其中Rb1的含量为43％、Rg1的含量为21％)的20％DES2的溶液中加入1％(V/V)THABGL蛋白酶溶液，在80℃下反应2小时后进行高效液相色谱检测，结果显示三七提取物中的Rg1可转化成Rh1，摩尔转化率为97.6％，Rh1含量为2.45克/升(如图7中D和E)。三七提取物中的Rb1可转化成Rg3，摩尔转化率为97.2％。
八、全细胞催化反应
1、将BL21-Thabgl重组菌以1％接种到500ml新鲜LB培养基(卡那霉素终浓度50微克/毫升)中，37度，200rpm震荡培养至OD值达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mM，37度200rpm震荡培养5小时，以5000rpm离心5分钟收集培养液中细胞。
2、以PH6的PBS溶液(50mM)重悬细胞进行洗涤，再以5000rpm离心5分钟收集洗涤后的细胞并称量重量。
3、以PH6的PBS溶液(50mM)重悬洗涤后的细胞，配制成100克/升菌悬液，获得BL21-Thabgl重组菌全细胞溶液。
4、根据上述酶活检测，本发明发现，在低共熔溶剂存在下，THABGL蛋白酶活更佳，故进一步在催化反应中研究了不同低共熔溶剂对反应的影响。具体将全细胞溶液(100克/升)以0.5％(v/v)分别加入步骤七制备的各20％低共熔溶剂DESs中(见表3)，以三七提取物为底物，在低共熔溶剂中进行全细胞催化制备稀有人参皂苷Rg3和Rh1。
详细而言，分别将步骤七制备的各20％低共熔溶剂DESs的溶液配制成含15g/L三七提取物(含总皂苷80％，其中Rb1的含量为43％、Rg1的含量为21％)的反应液，加入上述含Thabgl基因表达产物的全细胞溶液0.5％(v/v)进行催化反应，反应温度80℃，反应时间2h，分别检测不同反应液中Rg3和Rh1的含量，结果如下表4所示，全细胞催化反应含15克/升三七提取物的20％DES溶液反应后高效液相检测结果如图8所示。图中空白对照是含15克/升三七提取物的20％DES2溶液高效液相检测图(不加入全细胞溶液进行催化反应)。
其中以含15g/L三七提取物(含总皂苷80％)的20％DES2(氯化胆碱:无水乙醇:1，4-丁二醇摩尔比为1:1:1)进行全细胞催化生产的Rg3含量达到4.47克/升，摩尔转化率为97.9％，Rh1含量达到2.45克/升，摩尔转化率为97.7％。
表4不同种类的DES中生成的Rg3含量及摩尔转化率
本发明中人参皂苷(稀有人参皂苷)的检测及标准曲线制作如下：
标准曲线制备如下：取人参皂苷(稀有人参皂苷)溶解于50％甲醇溶液中，配制成0.5克/毫升的溶液，按比例稀释后每个样品进行高效液相检测三次制作标准曲线。检测条件如下所述。
取反应液加甲醇稀释一定倍数，过0.22μm微孔滤膜后进行HPLC分析，结合标准曲线，计算产物含量。
测定人参皂苷(稀有人参皂苷)的HPLC条件如下：流动相为乙腈(A)和0.02％(v/v)磷酸水溶液(B)，二元梯度洗脱。洗脱流速为1.0mL/min，进样量为20μL，梯度洗脱条件：0～10min乙腈(A)78％，流动相B为22％，10～25min乙腈(A)76％，流动相B为24％，25～45min乙腈(A)60％，流动相B为40％，45～90min乙腈(A)45％，流动相B为55％，柱温为30℃，检测波长为203nm。
摩尔转化率计算方法为：产物摩尔数/底物摩尔数×100％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷中的应用，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列在NCBI上的编号为RLF05189.1；所述人参皂苷为稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
2.一种核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、重组微生物或转基因细胞系，其特征在于，所述核酸分子编码β-葡萄糖苷酶，所述β-葡萄糖苷酶如权利要求1所述。
3.根据权利要求2所述的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.权利要求2或3所述的核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料在制备人参皂苷中的应用；所述人参皂苷为稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
5.一种生产稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1的方法，其特征在于，以β-葡萄糖苷酶或重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1；所述β-葡萄糖苷酶如权利要求1所述，所述重组微生物包括一种核酸分子，所述核酸分子如权利要求2或3所述。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，当生产稀有人参皂苷Rg3时，反应底物为人参皂苷Rb1和/或Rd；当生产稀有人参皂苷Rh1时，反应底物为Rg1；优选，在制备稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应底物为三七总皂苷提取物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，以所述β-葡萄糖苷酶生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应温度为70-85℃，pH为4-7；反应溶剂为含0.8-1.2％吐温80 的PBS溶液或含8-15％乙醇的PBS溶液，或反应溶剂包括低共熔溶剂，所述反应溶剂中所述低共熔溶剂的体积分数为15-25％；反应底物与所述β-葡萄糖苷酶的质量比为(10-30):1。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，以所述重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时，反应温度为70-85℃，pH为4-7；反应溶剂为含0.8-1.2％吐温80的PBS溶液或含8-15％乙醇的PBS溶液，或反应溶剂包括低共熔溶剂，所述反应溶剂中所述低共熔溶剂的体积分数为15-25％；反应底物与所述重组微生物的质量比为(20-50):1；所述重组微生物经IPTG诱导表达所述β-葡萄糖苷酶，优选，所述诱导表达的条件为：IPTG终浓度为0.1-0.5mM，37±1℃、180-220rpm下振荡培养，4-6小时。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述低共熔溶剂中包括氢键受体和氢键供体；所述氢键受体为氯化胆碱和/或L-脯氨酸，所述氢键供体为乳酸、1，4-丁二醇、D-山梨醇、蔗糖、无水乙醇、甘油中的一种或多种；
优选，所述氢键受体为L-脯氨酸，所述氢键供体为乳酸，所述L-脯氨酸和乳酸的摩尔比为(0.8-1.2):(0.8-2.2)，更优选为(0.8-1.2):(0.8-1.2)；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为无水乙醇和1，4-丁二醇，所述氯化胆碱、无水乙醇和1，4-丁二醇的摩尔比为(0.8-1.2):(0.8-1.2):(0.8-1.2)；或
所述氢键受体为氯化胆碱，所述氢键供体为D-山梨醇和1，4-丁二醇，所述氯化胆碱、D-山梨醇和1，4-丁二醇的摩尔比为(1.8-2.2):(0.8-1.2):(3.8-4.2)；或
所述氢键受体为L-脯氨酸，所述氢键供体为甘油和蔗糖，所述L-脯氨酸、甘油和蔗糖的摩尔比为(3.8-4.2):(9.8-10.2):(0.8-1.2)。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，以所述重组微生物通过全细胞催化生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1时包括：
(1)制备重组微生物：以含有核酸分子的重组载体转化寄主微生物感受态细胞，得到重组微生物；所述核酸分子编码β-葡萄糖苷酶，所述β-葡萄糖苷酶如权利要求1所述；优选，所述寄主微生物为大肠杆菌；
(2)以IPTG诱导所述β-葡萄糖苷酶在所述重组微生物中的表达后，收集、重悬获得所述重组微生物的全细胞溶液；
(3)将所述重组微生物的全细胞溶液、底物和反应溶剂混合、反应生成稀有人参皂苷Rg3和/或Rh1。
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