CN106148256B - 产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了产α‑熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明提供了重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris。本发明的实验证明，本发明将来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCC 1.3408的淀粉蔗糖酶基因导入大肠杆菌中，构建基因工程菌，用其来生产α‑熊果苷，转化效率达到99％,生产强度为7.56g/L/h，是目前为止国内外报道的最高水平，同时在生产过程中不用相对较贵的麦芽糖的作为供体，无需纯化酶。这样将大大降低α‑熊果苷的生产成本，因此这一菌株将会在α‑熊果苷的生产中占有重要地位。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到产α-熊果苷的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
熊果苷属氢醌苷类化合物，化学名为4-羟基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，存在于熊果、越橘等植物中是一种高效的美白活性物质。熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，从而阻断多巴及多巴醌的合成，抑制黑色素的合成，达到美白的功效。熊果苷有两种同分异构体，α-熊果苷和β-熊果苷。2003年，Kazuhisa等人已经发现α-熊果苷的增白效果是β-熊果苷的10倍以上。α-熊果苷的IC50为2.1mM,β-熊果苷的IC50为30mM。同时α-熊果苷的生物安全性更好，α-熊果苷不会抑制黑色素细胞的生长，生物副作用小，而β-熊果苷会抑制细胞的生长。因此α-熊果苷在化妆品上的应用更广泛，将会取代β-熊果苷。2000年以来，许多国际知名的化妆品牌，如日本知名品牌DHC、资生堂等都开始使用α-熊果苷作为美白产品的增白剂。但是目前由于生产成本较高，只有高档的化妆品才能使用。因此开发高效、低成本的生产方法将会促进α-熊果苷的大规模应用。
目前合成熊果苷的方法主要有四种，有机合成法、植物提取法、生物转化法和酶合成法。有机合成法和植物提取法主要用于生产β-熊果苷，而α-熊果苷目前获取的主要途径是酶合成法和生物转化法。利用一分子的葡萄糖和一分子的氢醌结合形成单一的α-熊果苷。
酶合成法，目前合成α-熊果苷所用的酶主要包括，蔗糖磷酸酶(Sucrosephospholylase)，葡聚糖蔗糖酶(Dextransucrase)，α-葡萄糖苷酶(a-Glucosidase)，淀粉蔗糖酶(Amylosucrase)以及脂肪酶。利用上述的其中一种酶以蔗糖或者麦芽糖为供体，以氢醌为受体，合成α-熊果苷。目前应用较多的是糖苷酶被运用于合成α-熊果苷。1995年日本的shegetaka okada小组利用糖苷酶合成了α-熊果苷。2011年北京化工大学，邓莉采用脂肪酶在有机相中合成α-熊果苷，最高转化率为95％，转化时间在10个小时以上，并申请了专利，专利号为CN102517361A，但是所采用的转化液的溶剂为有毒的有机溶剂。2011年Dong-Ho Seo等采用来源于耐辐射地热菌(Deinococcus geothermalis)的淀粉蔗糖酶，可以在24h内转化2.3mM对苯二酚，转化率可以达到90％。但是采用酶法合成熊果苷，酶本身需要纯化，而且由于氢醌有一定的毒性，会导致酶的活性大幅度降低，从而导致产率降低。因此酶法合成α-熊果苷也有一定的局限性。
生物转化法主要是利用生物体中的酶对外源化合物进行酶催化反应，这些生物体主要包括植物细胞、微生物细胞。植物细胞，2006年张章利用培养20d的西洋参冠瘿组织培养液，加入60mg/ml的对苯二酚，培养60h后成功得到了熊果苷。2007年严春艳等利用何首乌毛状根器转化合成了熊果苷，当底物浓度为1100mg/L，培养72h后熊果苷的转化率可达81.45％。但是采用植物的组织培养物转化时，植物的组织培养时间很长，导致生产效率很低，成本较高。微生物细胞，主要是利用这些微生物能够表达合成α-熊果苷相应的酶。前人的研究表明多种微生物可以合成α-熊果苷，如巨大芽孢杆菌CNIB-8508、酿酒酵母、丝状真菌。其中芽孢杆菌代谢的蔗糖磷酸化酶催化合成了α-熊果苷。以湿菌体50mg/mL，破碎细胞粗酶液催化合成α-熊果苷,反应时间为24h，经过反应条件的优化后,α-熊果苷含量达到0.35mg/mL、对苯二酚转化率为74％。2012年，朱松洁等对22种微生物物种，包括丝状真菌酵母菌以及细菌等不同微生物发酵生产熊果苷的能力进行筛选，并用高效液相色谱法对发酵生产的熊果苷进行定量比较，结果表明：米根霉、白地霉、酵母910、酵母904以及枯草芽孢杆菌可以利用对苯二酚发酵生产熊果苷，其中以米根霉的产量最高，产量达到441.30mg/L。北京化工大学邓莉等对利用嗜麦芽黄单胞菌BT-112来生产α-熊果苷进行了深入的研究。2007年王秀棒采用生物发酵嗜麦芽黄单胞菌BT-112来生产α-熊果苷，最佳反应条件为：反应温度为35℃，对苯二酚浓度为48mmol·L-1，蔗糖与对苯二酚的摩尔比为2：1，反应时间为48h，反应转速为180r·min-1，最高反应转化率为91.2％。2008年，张鹏等利用添加表面活性剂Tween 80，通过发酵36h，对苯二酚浓度为60mmol·L-1。转化率可以达到96.2％。2014年邓莉等通过流加对苯二酚，可以使α-熊果苷的产量达到61.7g/L，转化率为94.5％,发酵时间为72h，这是目前报道的最高水平。
生物细胞转化法是高效的α-熊果苷生产方法，但是由于采用野生型的微生物细胞，合成α-熊果苷的酶的表达水平较低。同时野生型菌株的生物量也有限，因此构建基因工程菌来生产α-熊果苷是研究的方向，2006年台湾的Wen-Teng Wu等在大肠杆菌中表达来源于黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的糖苷转移酶(Transglucosidase)利用麦芽糖和对苯二酚，在1小时内可以生产23g/L的熊果苷，转化率为83％。但是所用的供体为麦芽糖，成本较高，同时转化率也只有83％，因此迫切需要构建高效率、安全、低成本的α-熊果苷基因工程菌株，以满足工业化生产α-熊果苷的需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供重组菌。
本发明提供的重组菌，为将淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌；
所述淀粉蔗糖酶来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris。
上述重组菌中，所述野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris为野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCC 1.3408。
上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列表中序列2。
上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
上述重组菌中，所述淀粉蔗糖酶编码基因通过重组载体导入目的菌；
所述重组载体为将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体，本实施例中的重组载体为将序列表中序列1所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-XcAS，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列2。
上述重组菌中，所述目的菌为大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体；
所述淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列表中序列2；
所述淀粉蔗糖酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1。
所述重组载体为将所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体，本实施例中的重组载体为将序列表中序列1所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-XcAS，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列2。
上述的重组菌或上述的重组载体或上述淀粉蔗糖酶或其编码基因在制备α-熊果苷中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的第三个目的是提供一种制备α-熊果苷的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)IPTG诱导培养上述的重组菌，收集培养产物的沉淀；
2)将所述沉淀在含有蔗糖和对苯二酚的反应体系中进行催化反应，即得到α-熊果苷。
上述催化反应的温度为30℃，所述催化反应的时间为6小时。
由上述方法制备的α-熊果苷也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明将来源于野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestrisCGMCC 1.3408的淀粉蔗糖酶基因导入大肠杆菌中，构建基因工程菌，用其来生产α-熊果苷，转化效率达到99％，生产强度为7.56g/L/h，同时在生产过程中不用相对较贵的麦芽糖的作为供体，无需纯化酶。这样将大大降低α-熊果苷的生产成本，因此这一菌株将会在α-熊果苷的生产中占有重要地位。本文还构建了来源Deinococcus radiodurans)的淀粉蔗糖酶的全细胞催化剂，其转化率只有30％，而本发明所获得转化率为99.0％，是目前报道的最高水平。
附图说明
图1为α-熊果苷的合成示意图。
图2为重组载体pET28a-XcAS的示意图。
图3重组载体Pet28a-DrAS的示意图。
图4为转化产物的HPLC图谱。
图5为pET28a-XcAS/BL21和Pet28a-DrAS/BL21转化生成熊果苷能力的比较。
图6为生产α-熊果苷的基因工程菌种淀粉蔗糖酶的蛋白电泳检测结果。
图7为α-熊果苷的核磁图谱。
图8为底物浓度对α-熊果苷转化率的影响。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
图1为α-熊果苷的合成示意图。
实施例1、产α-熊果苷的基因工程菌的构建
1、构建表达来源于Xanthomonas campestris的淀粉蔗糖酶的重组质粒
为扩增来源于Xanthomonas campestris的淀粉蔗糖酶(Amylosucrase)基因XcAS，设计一对引物，上游引物为：GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGATCGCTTCCTCCCCCATCG和下游引物CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAACGACGCTGCAACCAGCGCAC。
以野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris CGMCC 1.3408基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到大小为1914bp的PCR扩增产物，经过测序，其为淀粉蔗糖酶基因(Amylosucrase)，核苷酸序列为序列表中序列1。
用NheI和XhoI酶切大小为1914bp的PCR扩增产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的pET28a载体(Novagen,货号69864-3)连接，得到重组载体。
测序重组载体，其为将序列表中序列1所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-XcAS(图2)，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列2。
2、构建来源耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)的淀粉蔗糖酶的对照质粒
为扩增淀粉蔗糖酶基因DrAS(Amylosucrase)，设计一对引物,上游引物为：gtgccgcgcggcagccatatggctagcatgctcacgcctgacctcgcc和下游引物cagtggtggtggtggtggtgctcgagttacccccccgccaccagcc。以耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)编号为1.3828基因组DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增，得到大小为1914bp的PCR扩增产物，经过测序，其为淀粉蔗糖酶基因(Amylosucrase)，核苷酸序列为序列表中序列3。
用NheI和XhoI酶切大小为1935bp的PCR扩增产物，得到的酶切产物与经过同样酶切的pET28a载体(Novagen,货号69864-3)连接，得到重组载体。
测序重组载体，其为将序列表中序列3所示的淀粉蔗糖酶基因替换pET28a载体NheI和XhoI酶切位点间的DNA片段得到的重组载体，将该重组载体命名为pET28a-DrAS(图3)，编码淀粉蔗糖酶的氨基酸序列为序列4。
3、构建基因工程菌pET28a-XcAS/BL21
将上述制备的重组载体pET28a-XcAS用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3)，在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆子命名为pET28a-XcAS/BL21。挑取平板上所长的pET28a-XcAS/BL21单克隆，接种到含有80μg/mL的氨苄青霉素的液体2YT培养基中，37℃培养至OD为0.6，然后加0.2mM IPTG诱导，诱导10小时收细胞，用于做细胞转化。
4、构建对照基因工程菌pET28a-DrAS/BL21
将上述2制备的对照重组载体pET28a-DrAS用氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3),在氨苄青霉素平板上筛选阳性克隆子命名为pET28a-DrAS/BL21。挑取平板上所长的pET28a-DrAS/BL21单克隆，接种到含有80μg/mL氨苄青霉素的液体2YT培养基中，37℃培养至OD为0.6，然后加0.2mM IPTG诱导，诱导10小时，收细胞，用于做细胞转化。
5、野油菜黄单胞的淀粉蔗糖酶基因的重组表达和纯化
将上述3制备pET28a-XcAS/BL21接种到含有80μg/mL氨苄青霉素的液体2YT培养基中，37℃培养至OD为0.6，然后加0.2mM IPTG诱导，诱导10小时，离心收菌，超声破碎，离心取上清液。
2YT配方如下：0.5％NaCl、1％yeast extract、1.6％Tryptone和水混匀，得到2YT。
将上述上清液进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示，M:Marker、1:pET28a-XcAS/BL21全细胞、2：pET28a-XcAS/BL21上清液、3：淀粉蔗糖酶(氨基酸序列为序列2)；可以看出，pET28a-XcAS/BL21可以表达淀粉蔗糖酶(70KDa)，说明菌株构建正确。
采用同样的方法重组表达和纯化上述4得到的pET28a-DrAS/BL21，重组蛋白的大小为71.67KD。
实施例2、α-熊果苷的制备
采用实施例1获得的基因工程菌pET28a-XcAS/BL21和对照菌pET28a-DrAS/BL21作为催化剂去生产α-熊果苷，比较这两株菌在全细胞转化中生产α-熊果苷的能力大小，具体如下：
1、制备α-熊果苷
1)将pET28a-XcAS/BL21在含有80μg/mL氨苄青霉素的液体2YT培养基中37℃培养至OD为0.6，然后加0.2mM IPTG诱导，37℃诱导10小时，收集诱导产物，于4℃，8000转/min，离心15min,收集菌体。
将上述菌体(即细胞)、蔗糖、对苯二酚、VC、TritonX-100加入浓度100mM、pH值7.0的Tris-HCl Buffer中混匀，得到混合液；其中，细胞浓度为10g/L(湿重)、蔗糖的浓度为1M、对苯二酚的浓度为50mM、VC的浓度为0.5mM、TritonX-100的浓度为0.1％(体积百分含量)；将混合液在30℃，80rpm/min、催化反应6小时，得到转化液。
2)将上述1)得到的转化液于4℃，12000转/分钟，离心5min，取上清。用0.22μM的滤膜过滤上清，收集滤液进行HPLC检测α-熊果苷的产量。HPLC采用C18柱；流动相：90％含有1/1000甲酸的水，10％甲醇。流速为0.3mL/min。柱温45℃。进样量10μl，检测波长280nm。α-熊果苷的标准品购自Sigma公司。实验设三次重复，结果取平均值。
基因工程菌pET28a-XcAS/BL21结果如图4所示，α-熊果苷的标准品的保留时间为7.324min，转化液上清中的也有保留时间为7.324min的峰值，收集7.324min峰值的转化液上清，即为α-熊果苷。
收集基因工程菌pET28a-XcAS/BL21结7.324min峰值的转化液上清采用大孔树脂H107纯化，水平衡，转化后的样品上柱，水洗杂质(糖类)，30％乙醇洗熊果苷，然后用旋转蒸发仪蒸发样品，然后将熊果苷粗品与硅胶型号为(ZCX)粒度为60-100目拌样，湿法上柱，乙酸乙酯洗杂志，用乙酸乙酯：乙酸：水＝40：1：1的洗脱剂洗熊果苷。旋转蒸发仪蒸干样品。得到纯度为95％以上的样品α-熊果苷。
将上述纯化的α-熊果苷进行核磁检测，核磁的条件为1H NMR(400MHz,D2O,δ,ppm,J/Hz),13C NMR(400MHz,D2O,δ,ppm)，结果如图7，从α-熊果苷的标准品的C谱和H谱所示，可以进一步确认得到α-熊果苷。
采用同样的方法检测对照菌pET28a-DrAS/BL21，结果也得到α-熊果苷。
2、比较对照菌pET28a-DrAS/BL21和基因工程菌pET28a-XcAS/BL21的α-熊果苷转化率
采用上述1同样的方法将pET28a-XcAS/BL21和对照菌pET28a-DrAS/BL21催化50mM对苯二酚，制备α-熊果苷，采用上述HPLC检测α-熊果苷，具体如下:
pET28a-XcAS/BL21催化50mM对苯二酚产生的α-熊果苷摩尔浓度为50mM；
对照菌pET28a-DrAS/BL21催化50mM对苯二酚产生的α-熊果苷摩尔浓度为16.93mM；
计算转化率＝(α-熊果苷摩尔浓度/对苯二酚摩尔浓度)*100％。
基因工程菌pET28a-XcAS/BL21和对照菌pET28a-DrAS/BL21催化50mM对苯二酚的转化率结果如图5所示，可以看出，基因工程菌pET28a-XcAS/BL21(XcAS)催化对苯二酚产生α-熊果苷的转化率达到99％；对照菌pET28a-DrAS/BL21(DrAS)催化对苯二酚产生α-熊果苷的转化率为33.9％；基因工程菌pET28a-XcAS/BL21转化率是对照菌pET28a-DrAS/BL21的2.92倍。
因此，来源于Xanthomonas campestris的淀粉蔗糖酶制备α-熊果苷的效果远大于其余淀粉蔗糖酶。
3、α-熊果苷产量所需底物的摸索
按照上述1的方法用pET28a-XcAS/BL21催化对苯二酚，不同的是采用不同浓度(90mM-240mM)的对苯二酚(HQ)。用HPLC检测α-熊果苷的产量，方法同上述1。
结果如图8，可以看出，当采用180mM的对苯二酚时，α-熊果苷(AT)的产量最高，α-熊果苷的浓度达到45.36g/L(转化液)，底物已检测不到。基因工程菌pET28a-XcAS/BL21生产α-熊果苷的生产强度(生产强度＝α-熊果苷产量(g/L/h))为7.56g/L/h,远远高于邓莉2014年报到的0.86g/L/h。
采用上述1同样的方法将对照菌pET28a-DrAS/BL21催化180mM对苯二酚，制备α-熊果苷，α-熊果苷的产量为3.14g/L(转化液)。
Claims (3)
1.如下1）-4）任一所述在制备α-熊果苷中的应用；
1）淀粉蔗糖酶，其氨基酸序列如序列表中序列2所示；
2）1）所述淀粉蔗糖酶的编码基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；
3）重组载体，为将2）所述淀粉蔗糖酶编码基因插入表达载体得到的重组载体；
4）重组菌，为将2）所述淀粉蔗糖酶编码基因导入目的菌中，得到重组菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述目的菌为大肠杆菌。
3.一种制备α-熊果苷的方法，包括如下步骤：
1）IPTG诱导培养权利要求1或2中所述的重组菌，收集菌体；
2）将所述菌体在含有蔗糖和对苯二酚的反应体系中进行催化反应，即得到α-熊果苷。
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