CN105177078A - 一种羟基四氢嘧啶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羟基四氢嘧啶的制备方法，该制备方法采用含四氢嘧啶的料液为底物，加入具有四氢嘧啶羟化酶活性的大肠杆菌、α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。该方法以发酵法制备的含有四氢嘧啶的料液为底物合成附加值较高的羟基四氢嘧啶，具有原料来源广、生产成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及化合物生物技术生产领域，具体涉及一种羟基四氢嘧啶的制备方法。
背景技术
现有技术中，羟基四氢嘧啶主要通过盐单胞菌发酵来获得。朱道辰等人研究了利用嗜盐菌HalomonasventosaeDL7发酵生产羟基四氢嘧啶的方法。该发酵过程中需要先进行菌体培养，再在短时间内(1h内)将氯化钠浓度从1M提高到3M并将培养温度从30℃提高到42℃以积累羟基四氢嘧啶。最终提取得到的胞内外四氢嘧啶总浓度为13.8g/L，羟基四氢嘧啶总浓度为6.2g/L。
上述发酵法存在以下缺陷：(1)羟基四氢嘧啶作为四氢嘧啶的衍生物其合成受到热刺激的诱导，即需要提高生长温度才能够促进其合成，但是提高生长温度会严重抑制嗜盐菌的生长，导致四氢嘧啶合成量的严重下降，从而影响了羟基四氢嘧啶的产量；(2)嗜盐菌发酵培养基中盐浓度较高，且发酵液中会同时存在四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶，二者性质接近，故较难对羟基四氢嘧啶分离纯化。综上所述，现有发酵法具有生产成本较高，控制工艺复杂，产物回收困难，难于真正实现工业化生产的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、低成本制备羟基四氢嘧啶的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种羟基四氢嘧啶的制备方法，利用含有四氢嘧啶的料液为底物，加入具有四氢嘧啶羟化酶活性的大肠杆菌、α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。
优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，具体步骤如下：
(1)在大肠杆菌BL-21(ACCC11171)(ACCC，中国农业微生物菌种保藏中心)中异源表达四氢嘧啶羟化酶编码基因，构建具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株E.coliHect；
(2)将上述E.coliHect菌株在培养基中培养，产生高酶活性的四氢嘧啶羟化酶；
(3)将步骤(2)中培养获得的具有四氢嘧啶羟化酶活性的细胞(E.coliHect细胞)与含有四氢嘧啶的发酵液或四氢嘧啶水溶液混合，再加入等摩尔量的α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。
优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(1)以pET-his质粒为载体在大肠杆菌BL-21中过表达四氢嘧啶羟化酶编码基因得到具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株，所述四氢嘧啶羟化酶编码基因来源于斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri，CGMCC1.8597)、伸长盐单胞菌(Halomonaselongate，CGMCC1.6329)、嗜盐甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z，DSM19304)或其他含有四氢嘧啶羟化酶编码基因的菌株，其中，
所述编码斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；
所述编码伸长盐单胞菌(Halomonaselongate)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列；
所述编码嗜盐甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。
优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(2)中菌株在培养基中培养的具体步骤如下：
①菌株按照1％接种量接种到150ml培养基中，37℃，200rpm培养；
②待OD长到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG诱导表达蛋白；调整温度为32℃，200rpm继续培养培养；
③继续培养6-8h后，4℃，6000rpm冷冻离心收集菌体；
④搜集的菌体使用PBS缓冲液重悬并洗涤三次，使用移液器吸净残留液体，最后离心保存于-80℃冰箱备用。
优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(2)中培养基为：每10gNaCl，5g酵母粉，10g蛋白胨，用去离子水定容到1L。
上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所得反应液中羟基四氢嘧啶的检测方法为：发酵液经13000rpm高速离心2min后取上清，并用去离子水稀释到一定浓度后使用高效液相色谱法测定四氢嘧啶含量；检测条件为：TSK-GELC18色谱柱，流动相为2％乙腈溶液，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl，紫外检测波长230nm，保留时间5min。
本发明所采用的发酵液指通过培养嗜盐菌得到的含有四氢嘧啶的发酵液。嗜盐菌的培养方法采用本技术领域较为通用的培养方法(如201310416404.4所述)即可，技术人员可以参考现有技术作出选择。
本发明的有益效果是：
所述羟基四氢嘧啶的制备方法，是利用上述四氢嘧啶羟化酶制备羟基四氢嘧啶，以四氢嘧啶发酵液和α-酮戊二酸为原料，加入具有四氢嘧啶羟化酶活性的大肠杆菌细胞催化合成羟基四氢嘧啶；与发酵法相比优势如下：
1)利用四氢嘧啶羟化酶催化四氢嘧啶发酵液，原料成本低廉，生产过程中无需使用高浓度的盐，仅一步酶促反应即得产品操作方便，产物单一产物易于分离纯化；2)利用四氢嘧啶羟化酶催化四氢嘧啶发酵液，省去了四氢嘧啶和酶的分离纯化过程，降低了生产成本；3)工艺操作简单，酶制剂可以重复使用。
附图说明
图1羟基四氢嘧啶标准品液相色谱图；
图2发酵液为底物催化合成羟基四氢嘧啶的液相色谱图；
图3四氢嘧啶粗品水溶液为底物催化合成羟基四氢嘧啶液相色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1
(1)四氢嘧啶羟化酶菌株的构建
①采用PCR技术以伸长盐单胞菌(CGMCC1.6329)基因组为模板，根据ectD基因序列设计一对引物，扩增获取ectD基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点NheI和HindIII。
②使用Takara限制性内切酶NheI和HindIII双酶切步骤①中获得目的片段及pET-his载体质粒，获得带有相同粘性末端的ectD和pET-his线性片段。
③使用TakaraT4DNA连接酶连接步骤②中获得的两个目的片段，得到目的载体pET-his-ectD。
④将步骤③中获得的载体转化入E.coliBL-21(ACCC11171)中，获得产四氢嘧啶羟化酶菌株。
(2)具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体制备
①将上述菌株按照1％接种量接种到装液量(培养基：每10gNaCl，5g酵母粉，10g蛋白胨，用去离子水定容到1L)为150ml的500ml圆底三角瓶中，37℃，200rpm培养；
②待OD长到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG诱导表达蛋白；调整温度为32℃，200rpm继续培养培养；
③继续培养6-8h后，4℃，6000rpm冷冻离心收集菌体；
④搜集的菌体使用PBS缓冲液重悬并洗涤三次，使用移液器吸净残留液体，最后离心保存于-80℃冰箱备用。
(3)利用四氢嘧啶发酵液进行羟基四氢嘧啶的催化合成
①将含有5g/L四氢嘧啶的发酵液离心后收集上清，添加44mmol/L的HEPES作为缓冲剂，最后用NaOH调节pH至7.0。
②配制反应体系，向上述发酵液中添加0.035mol/L的α-酮戊二酸，使用NaOH调节pH到7.0后按照30g/L的量添加上述具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体。
③将上述反应体系置于37℃恒温水浴摇床，200rpm反应24h。
④使用UltiMate3000(ThermoScientific)高效液相色谱仪测定羟基四氢嘧啶含量。上述制备样品使用微量进样针，进样量20μl，色谱柱为TSK-GELC18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速1mL/min，紫外检测波长230nm，保留时间5min。经液相色谱检测，反应液中的羟基四氢嘧啶含量约为1.6g/L。
实施例2
(1)产四氢嘧啶羟化酶菌株的构建，参照实施例1。
(2)具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体制备，参照实施例1。
(3)利用四氢嘧啶发酵液进行羟基四氢嘧啶的催化合成
①将含有5g/L四氢嘧啶的发酵液离心后收集上清，添加44mmol/L的HEPES作为缓冲剂，最后用NaOH调节pH至7.0。
②配制反应体系，向上述发酵液中添加0.035mol/L的α-酮戊二酸，使用NaOH调节pH到7.0后按照30g/L的量添加上述具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体。
③将上述反应体系置于40℃恒温水浴摇床，200rpm反应24h。
④液相色谱检测方法请参照实施例1。经液相色谱检测，如图1和图2所示，反应液中的羟基四氢嘧啶含量约为2.3g/L。
实施例3
(1)产四氢嘧啶羟化酶菌株的构建，参照实施例1。
(2)具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体制备，参照实施例1。
(3)利用四氢嘧啶发酵液进行羟基四氢嘧啶的催化合成
①将含有5g/L四氢嘧啶的发酵液离心后收集上清，添加44mmol/L的HEPES作为缓冲剂，最后用NaOH调节pH至7.0。
②配制反应体系，向上述发酵液中添加0.035mol/L的α-酮戊二酸，使用NaOH调节pH到7.0后按照30g/L的量添加上述具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体。
③将上述反应体系置于45℃恒温水浴摇床，200rpm反应24h。
④液相色谱检测方法请参照实施例1。经液相色谱检测，反应液中的羟
基四氢嘧啶含量约为2g/L。
实施例4
(1)产四氢嘧啶羟化酶菌株的构建，参照实施例1。
(2)具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体制备，参照实施例1。
(3)利用四氢嘧啶粗品进行羟基四氢嘧啶的催化合成
①使用去离子水配制44mmol/L的HEPES缓冲液，并用NaOH调节pH至7.5。
②配制反应体系，向上述缓冲液中添加10g/L四氢嘧啶粗品，并添加0.07mol/L的α-酮戊二酸，使用NaOH调节pH到7.5后按照30g/L的量添加上述具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体。
③将上述反应体系置于40℃恒温水浴摇床，200rpm反应24h。
④液相色谱检测方法请参照实施例1。经液相色谱检测，如图1和图3所示，反应液中的羟基四氢嘧啶含量约为4.2g/L。
实施例5
(1)产四氢嘧啶羟化酶菌株的构建，参照实施例1。
(2)具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体制备，参照实施例1。
(3)利用四氢嘧啶粗品进行羟基四氢嘧啶的催化合成
①使用去离子水配制44mmol/L的HEPES缓冲液，并用NaOH调节pH至8.0。
②配制反应体系，向上述缓冲液中添加10g/L四氢嘧啶粗品，并添加0.07mol/L的α-酮戊二酸，使用NaOH调节pH到8.0后按照30g/L的量添加上述具有四氢嘧啶羟化酶活性菌体。
③将上述反应体系置于40℃恒温水浴摇床，200rpm反应24h。
④液相色谱检测方法请参照实施例1。经液相色谱检测，反应液中的羟基四氢嘧啶含量约为3.8g/L。
上述参照具体实施方式对该一种羟基四氢嘧啶的制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种羟基四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：利用含有四氢嘧啶的料液为底物，加入具有四氢嘧啶羟化酶活性的大肠杆菌、α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。
2.根据权利要求1所述的羟基四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)在大肠杆菌BL-21中异源表达四氢嘧啶羟化酶编码基因，构建具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株E.coliHect；
(2)将上述E.coliHect菌株在培养基中培养，产生高酶活性的四氢嘧啶羟化酶；
(3)将步骤(2)中培养获得的具有四氢嘧啶羟化酶活性的E.coliHect细胞与含有四氢嘧啶的发酵液或四氢嘧啶水溶液混合，再加入等摩尔量的α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。
3.根据权利要求2所述的羟基四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)以pET-his质粒为载体在大肠杆菌BL-21中过表达四氢嘧啶羟化酶编码基因得到具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株，所述四氢嘧啶羟化酶编码基因来源于斯氏假单胞菌、伸长盐单胞菌、嗜盐甲烷氧化菌或其他含有四氢嘧啶羟化酶编码基因的菌株，其中，
所述编码斯氏假单胞菌ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；
所述编码伸长盐单胞菌ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列；
所述编码嗜盐甲烷氧化菌ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。
4.根据权利要求2所述的羟基四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中菌株在培养基中培养的具体步骤如下：
①菌株按照1％接种量接种到150ml培养基中，37℃，200rpm培养；
②待OD长到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG诱导表达蛋白；调整温度为32℃，200rpm继续培养培养；
③继续培养6-8h后，4℃，6000rpm冷冻离心收集菌体；
④搜集的菌体使用PBS缓冲液重悬并洗涤三次，使用移液器吸净残留液体，最后离心保存于-80℃冰箱备用。
5.根据权利要求4所述的羟基四氢嘧啶的制备方法，其特征在于：所述培养基为：每10gNaCl，5g酵母粉，10g蛋白胨，用去离子水定容到1L。
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