CN103695486A - 一种(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例提供了一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，属于生物制药领域。其制备方法为：在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中，以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子和葡萄糖作用下，用氰化试剂维持pH值在6～8，室温下反应得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。本发明提供的制备方法以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶的催化下，“一锅法”完成还原反应和氰基取代反应得到产物，过程简单且生产成本低。

Description

一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及阿伐他汀中间体(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。
背景技术
他汀类药物通过抑制胆固醇合成途径的HMG-CoA还原酶，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高脂血症有较好的疗效，是目前临床上应用广泛的血脂调节药物。阿伐他汀（Atorvastatin）由于其具有起效快、降脂作用强、作用时间长等优点，成为全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，是目前最有市场前景的他汀类药物。而(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是阿伐他汀的最为重要的中间体，因而，开展对(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成改进，对阿伐他汀制备方法的研究具有十分重要的作用。
(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是合成阿伐他汀侧链的重要的中间体，其化学结构为：
Figure 757331DEST_PATH_IMAGE001
现有技术中，专利WO2004094243A1公开了一种以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在硼烷及硼氢化钠的作用下，采用低温还原，得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。采用这种方法得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的专利还包括：WO8907598A2，WO2005090301A1，US20090216029，US6433213B1，US6344569B1，US5998633A，US5155251A，US5003080A，EP1659110A1，EP1577297A1。文献包括：Tetrahedron Letter,1992，vol.33,No.17,p2279-2282。申请人发现：该工艺需用到大量有毒的硼烷，且在反应过程中需保护气，在-50℃及更低的超低温下才能进行。因此，此工艺的安全方面不易控制，工业化成本很高，不适合工业化生产。
专利WO2008042876A2公开了以(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在生物酶催化下，室温反应得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。采用这种方法得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的专利还包括：WO9700968A1，WO2006131933A1，CN102643757A，CN102676596A，CN201210466628.1，CN201210554535.4。申请人在实现本发明时发现：该工艺使用的原料为(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，操作步骤繁琐，且成本较高。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明实施例提供了一种以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶的催化下，“一锅法”完成还原反应和氰基取代反应，生成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的新型生物制备方法。其技术方案如下：
本发明实施例提供了一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其制备过程如下：在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中，以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子和葡萄糖作用下，用氰化试剂维持pH值在6～8，室温下反应得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。在起始时的反应体系中，重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.01～0.02: 0.01～0.02:0.0005～0.002:1～2:1（优选为0.0125～0.017: 0.0125～0.017:0.0005～0.001: 1.5～2:1）。本发明的反应式如下：
Figure 599386DEST_PATH_IMAGE002
其中，本发明实施例中的重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶的制备方法为：将携带酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，至OD600值达到0.8～1时，加入诱导剂，于35～40℃下继续培养4～8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液（浓度为0.05M～0.15M）得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10～20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15～-25℃，然后再冷冻干燥24～48小时，即得干粉状重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的复合酶。当然，在本发明实施例中酮还原酶和葡萄糖脱氢酶也可以分开加入到反应体系中，对应地，这两种酶也分开制备，其制备方法参见后续的脱卤酶的制备。但是为了简化制备过程，本发明实施例采用重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶做催化剂。
其中，本发明实施例中的脱卤酶的制备方法为：将携带脱卤酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，至OD600值达到0.8～1时，加入诱导剂，于35～40℃下继续培养4～8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液（浓度为0.05M～0.15M）得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10～20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15～-25℃，然后再冷冻干燥24～48小时，即得干粉状脱卤酶。
其中，本发明实施例中的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
其中，本发明实施例中的(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与盐酸三乙醇胺缓冲溶液的质量体积比为150-300mg/mL。
其中，本发明实施例中的盐酸三乙醇胺缓冲液的浓度为0.05M～0.15M。优选地，盐酸三乙醇胺缓冲液的浓度为0.08M～0.12M。
其中，本发明实施例中的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
其中，本发明实施例中的氰化试剂为氰化钠溶液或氰化钾溶液，其质量浓度为10～30%。优选地，氰化试剂为氰化钠溶液。
具体地，本发明实施例提供的(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其详细制备过程为：在反应容器中加入0.05M～0.15M的盐酸三乙醇胺缓冲溶液，依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶（干粉）、脱卤酶（干粉）、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与盐酸三乙醇胺缓冲溶液的质量体积比为150-300mg/mL，重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.01～0.02: 0.01～0.02:0.0005～0.002:1～2:1。搅拌均匀，用质量浓度为10～30%的氰化钠溶液或氰化钾溶液维持pH值在6～8，室温搅拌反应。反应完成后（8～12小时反应完毕，如可以利用液相监测反应进程，为了保证非对映选择性，转化率≥99%时反应完成）加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，即得(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
本发明所用的重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶和脱卤酶均为自制，其对应的重组大肠杆菌单菌落同样为自制，其自制过程为本领域的技术人员所熟知，故本发明省略详细描述。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
第一、与现有技术相比，本发明提供的制备方法使用原料为(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，而不是(5R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，来源更广，原料价格更低。
第二、该制备方法反应过程中避免了使用有毒试剂硼烷，也无需保护气及超低温等较苛刻的反应条件，反应条件更温和。
第三、反应过程简单，无需中间体的分离，“一锅法”完成了还原反应和氰基取代反应，减少了生产流程，降低了生产成本。
第四、通过生物技术，将重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶复合起来，一次性发酵培养可以得到包含两种酶的复合酶，应用于上述反应中，大大简化了操作步骤和降低了生产成本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的复合酶干粉摇瓶生产工艺
从甘油管或转化平板单菌落（携带酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌单菌落）接种到10ml含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于37℃下摇床活化活化12小时（150rpm），将上述培养物以1/100接种量接种到100ml含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于37℃下摇床扩大培养（150rpm），至OD600值达到1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃下继续培养6小时，离心，收集沉淀物，加入10ml盐酸三乙醇胺缓冲液（0.1M，pH=7.0）悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁15分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-20℃，然后再冷冻干燥24小时，即得干粉状重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶。
实施例2：脱卤酶干粉摇瓶生产工艺
从甘油管或转化平板单菌落（携带脱卤酶基因的重组大肠杆菌单菌落）接种到10ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃下摇床活化活化12小时（150rpm），将上述培养物以1/100接种量接种到100ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37℃下摇床扩大培养（150rpm），至OD600值达到1时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃下继续培养6小时，离心，收集沉淀物，加入10ml盐酸三乙醇胺缓冲液（0.1M，pH=7.0）悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁15分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-20℃，然后再冷冻干燥24小时，即得干粉状脱卤酶。
实施例3：
在反应容器中先加入pH为7的0.1M盐酸三乙醇胺缓冲液50ml，依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶(实施例1制备)0.15g，脱卤酶(实施例2制备)0.15g，10mg NAD，15g葡萄糖和10g(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用质量浓度为30%NaCN水溶液维持pH6.8～7.2，室温搅拌反应12小时后反应完毕，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，得8.91g(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，为淡黄色油状液体。
产物结构经1H NMR、13C NMR和ESI-HRMS检测，结果如下：1H NMR(400MHz，CDCl3):δ=4.25(bs，1H)，4.34-4.23(m，1H), 4.21(bt，1H), 3.96(bd，1H), 2.55(dd，J = 5.5, 11.1 Hz, 2H), 2.43(dd，J = 5.3, 11.1 Hz, 2H),1.72(d，J = 6.2 Hz,2H)， 1.47(s，9H)ppm；13C NMR(100MHz，CDCl3):δ = 172.1, 117.4,82.1,68.7,67.9,41.9,40.8,28.1,25.8 ppm；ESI-HRMS：calcd.for C10H19ClO4+Na 252.1212，found 252.1209。产物构型经液相检测，检测条件如下：使用Agilent 1100型高效液相色谱，所用液相柱为Agilent SB C8(50mm ×4.6mm, 5μm)，流动相：等度65%的0.25%乙酸水溶液，35%乙腈，流速：1.0ml/分钟，温度：室温，保留时间：(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯为12.54分钟，(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯为13.49分钟。确认产品为(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，其收率为92%，含量为98.8%，非对映选择性≥99%。
实施例4：
在反应容器中先加入pH为7的0.12M盐酸三乙醇胺缓冲液50ml，依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶(实施例1制备)0.125g，脱卤酶(实施例2制备)0.125g，5mg NAD，18g葡萄糖和10g(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用质量浓度为20%NaCN水溶液维持pH6.5～7.5，室温搅拌反应8小时后反应完毕，，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，得8.52g(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，为淡黄色油状液体。产物结构经1H NMR、13C NMR和ESI-HRMS检测，构型经液相检测，确认产品为(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，其收率为88%，含量为97.5%，非对映选择性≥99%。
实施例5
在反应容器中先加入pH为7的0.1M盐酸三乙醇胺缓冲液50ml，依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶(实施例1制备)0.125g，脱卤酶(实施例2制备)0.15g，8mg NADP，20g葡萄糖和10g(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用质量浓度为30%KCN水溶液维持pH6.5～7.5，室温搅拌反应12小时后反应完毕，加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，得8.62g(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，为淡黄色油状液体。产物结构经1H NMR、13C NMR和ESI-HRMS检测，构型经液相检测，确认产品为(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，其收率为89%，含量为98.3%，非对映选择性≥99%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其特征在于，在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中，以(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯为原料，在重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子和葡萄糖作用下，用氰化试剂维持pH值在6～8，室温下反应得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯；在起始时的反应体系中，所述复合酶、脱卤酶、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.01～0.02: 0.01～0.02:0.0005～0.002:1～2:1。
2.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶的制备方法为：将携带酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素和卡拉霉素双抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，至OD600值达到0.8～1时，加入诱导剂，于35～40℃下继续培养4～8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10～20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15～-25℃，然后再冷冻干燥24～48小时，即得所述重组酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的复合酶。
3.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述脱卤酶的制备方法为：将携带脱卤酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于35～40℃下摇床扩大培养，至OD600值达到0.8～1时，加入诱导剂，于35～40℃下继续培养4～8小时，离心，收集沉淀物，加入盐酸三乙醇胺缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破壁10～20分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-15～-25℃，然后再冷冻干燥24～48小时，即得所述状脱卤酶。
4.根据权利要求2或者3所述的生物制备方法，其特征在于，所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
5.根据权利要求1或2或3所述的生物制备方法，其特征在于，所述盐酸三乙醇胺缓冲液的浓度为0.05M～0.15M。
6.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯与盐酸三乙醇胺缓冲溶液的质量体积比为150-300mg/mL。
7.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。
8.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，所述氰化试剂为氰化钠溶液或氰化钾溶液，其质量浓度为10～30%。
9.根据权利要求1所述的生物制备方法，其特征在于，其制备方法具体为：在盐酸三乙醇胺缓冲溶液中依次加入重组酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的复合酶、脱卤酶、辅因子、葡萄糖和(5R)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用氰化钠溶液或氰化钾溶液维持pH值在6～8，室温搅拌反应，反应完成后加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相并减压蒸去溶剂，即得所述(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
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