CN114891666B - 海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途，属于非水相酶体系催化生物转化制备高效天然抗炎化合物技术领域。本发明提供了来源于海洋的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，在加入底物姜黄素和辅助底物情况下，利用该菌株的全细胞及粗酶液催化不饱和多酚化合物氧化还原脱氢制备稳定产物。本发明确定了该菌株全细胞催化和粗酶液催化姜黄素氧化还原的反应体系和反应条件。本发明在生物催化制备天然药物分子领域具有较好的工业应用前景，对于今后海洋新型生物催化剂的开发和姜黄素衍生物的绿色合成方法的研究具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于非水相酶体系催化生物转化制备高效天然化合物技术领域，具体涉及一种海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途。
背景技术
海洋是复杂、开放、变化的生物有机系统，其复杂的结构特征造就了生物类群的多样性。海洋细菌有着其他生态系统成员不具有的特性，成为新型独特的生物催化剂的重要来源。海洋环境独特性以及细菌产酶多样性，与陆地有着极大差异。独特海洋环境造就了具有耐盐、耐热、适冷、耐压和耐酸、耐碱等特性的极端菌株及其极端酶。近年来，国内外科研工作者在海洋细菌生物酶资源开发方面取得了许多成果。目前研究工作较多集中于脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、转移酶和多糖水解酶等。对海洋氧化还原酶的催化特性研究也逐渐受到重视，不仅可认知生物合成的新途径和新机理，探讨关键代谢过程和生物合成机制，也可实现海洋资源高值化。
姜黄素是一类具有广泛生物活性的天然香料，具有抗炎、抗氧化、抗癌等功能。四氢姜黄素作为姜黄素在生物体内的主要代谢产物，近年来受到国内外学者广泛关注。四氢姜黄素具有降血糖、降血脂、抗转移、抗癌、抗抑郁等药理学作用，同时发现其在抗氧化、降血糖、降血脂等方面的药理活性均优于姜黄素。研究还发现四氢姜黄素对代谢综合征、肥胖型Ⅱ型糖尿病、高血压以及胰岛素抵抗综合征等相关疾病均有较好治疗效果，具有广泛的应用前景。
目前四氢姜黄素中间体化学制备方法主要有：以3-正丁基硼酸酯和脂肪族伯胺为催化剂，使得香草醛和乙酰丙酮硼烷络合物发生发应进而得到姜黄素；利用氢气作为还原剂，在碱存在下合成四氢姜黄素中间体二乙酰四氢姜黄素，进一步脱除乙酰基得到四氢姜黄素等。但是现有的四氢姜黄素的化学合成法和植物提取法存在诸多问题，如难以确保产物的专一性、有机试剂污染和无法大规模生产等。因此，高效生物催化制备四氢姜黄素是解决天然药物制造并减少环境污染等问题的重要途径。生物法制备四氢姜黄素主要通过酶催化还原实现。目前用于制备四氢姜黄素的微生物主要有毕赤酵母、大肠杆菌和真菌等，效率较低。因此，筛选含有催化碳碳双键还原、高活性、高选择性的脱氢酶的菌株是实现四氢姜黄素有效制备的关键。而海洋环境中长期的演化过程使得海洋微生物体内的氧化还原酶具有与陆地来源酶不同的底物特异性和立体选择性。从海洋微生物中获取具有高效催化活性的菌株是解决现有制备方法缺陷的有效途径。
发明内容
本发明提供了海洋菌株及其催化制备四氢姜黄素的用途，从海洋微生物中获得含有依赖NAD(P)H的脱氢酶的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus WSZ2021)，并考察了反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌株全细胞催化或粗酶液催化姜黄素还原烷基团制备四氢姜黄素的反应体系和反应条件。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一如下：
一种海洋菌株，所述海洋菌株为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2022年03月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022292。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二如下：
上述的海洋菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)在催化制备四氢姜黄素中的用途。
进一步地，所述用途为催化姜黄素转化为四氢姜黄素。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三如下：
一种利用上述海洋菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M2022292)催化制备四氢姜黄素的方法，在该催化制备的反应体系中，以姜黄素为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，加入离子液体用于促进底物溶解，利用所述海洋菌株的培养产物催化姜黄素对称氧化还原得到产物四氢姜黄素。
优选地，所述的底物姜黄素在所述反应体系中的浓度为0.001～0.5mol/L。
优选地，所述的离子液体在所述反应体系中的浓度为0.01～0.8mol/L。
优选地，所述离子液体包括1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、或N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴中的至少一种。
优选地，所述的辅助底物在所述反应体系中的浓度为0.001～0.5mol/L。
优选地，所述辅助底物包括葡萄糖、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、苯乙酮、苯乙醛或仲丁醇中的至少一种。
进一步地，所述反应体系中还包括缓冲液，所述缓冲液为pH为7～13的Tris-盐酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、碳酸钠缓冲液、或碳酸钾缓冲液中的至少一种或多种，其中优选pH为9的Tris-盐酸缓冲液。
具体地，所述利用海洋菌株催化制备四氢姜黄素的方法，是利用蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)进行培养，制备全细胞或粗酶液；即所述培养产物包括该海洋菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)的全细胞或粗酶液中的至少一种。
在一个具体的实施例中，所述培养产物包括所述海洋菌株的全细胞，所述方法包括：
1)菌株的培养：将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M2022292)以1～2％(mL/mL)的接种量接种入216L培养基中培养；
2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；将细胞用缓冲液配制成25～5000mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的25～5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系，包括：0.001～0.5mol/L姜黄素，0.001～0.5mol/L辅助底物，0.01～0.8mol/L的离子液体，0.01～0.2mol/L的缓冲液，25～5000mg/L的细胞液，反应体系pH 6～13，在0℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间30～180小时，利用全细胞催化姜黄素还原得到产物四氢姜黄素。
在另一个具体的实施例中，所述培养产物包括所述海洋菌株的粗酶液，所述方法包括：
1’)菌株的培养：将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M2022292)以1～2％(mL/mL)的接种量接种入216L培养基中培养；
2’)粗酶液的制备：将步骤1’)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到含有脱氢酶的粗酶液，用缓冲液调节粗酶液浓度至5～2000mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的5～2000mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系，包括：0.001～0.5mol/L姜黄素，0.001～0.5mol/L辅助底物，0.01～0.8mol/L离子液体，0.01～0.2mol/L的缓冲液，5～500mg/L的粗酶液，反应体系pH 7～13，在5℃～80℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间10～90小时，利用粗酶液催化姜黄素得到产物四氢姜黄素。
进一步地，所述步骤1)或1’)中的培养条件为：起始pH 6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
进一步地，所述步骤1)或1’)中，216L培养基组成为9.0～11.0g/L蛋白胨，4.0～6.0g/L酵母粉，0.4～0.6g/L牛肉膏，0.4～0.6g/L柠檬酸钠，0.1～0.3g/L NH4NO3，0.9～1.1g/L醋酸钠，用人工海水配制。
本发明的关键在于：
(1)微生物催化转化反应的反应体系
采用本发明生产四氢姜黄素时，是利用海洋脱氢酶的高度选择性，催化多功能团姜黄素分子的特定位点还原，获得高纯度四氢姜黄素。由于姜黄素在水相中稳定性差，可溶性低，通过构建一个非水相体系，利用海洋菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)将其转化为四氢姜黄素来发挥其稳定生理功能且易实现辅酶再生。葡萄糖、丙醇、丙酮、苯乙醛等辅助底物加入用于辅酶NAD(P)H的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下(式中Microorganism意为全细胞，crude enzyme意为粗酶液)：
反应体系所涉及的姜黄素的分子结构式如下式所示:
相应地，反应体系中所涉及的四氢姜黄素的分子结构式如下式所示:
(2)催化转化反应的条件
如上步骤1)～3)或1’)～3’)所示，本发明通过全细胞催化或粗酶液催化底物姜黄素还原得到产物四氢姜黄素。反应体系中加入底物姜黄素、辅助底物用于辅酶再生。优化了该菌株全细胞、粗酶液催化姜黄素还原不饱和碳键制备四氢姜黄素的反应体系和反应条件。
本发明采用以下方法分析检测产物四氢姜黄素：
分析检测方法为取上述步骤3)或3’)得到的反应液，加入等体积的乙腈萃取，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为51895-902Agilent TC-18(2)安捷伦C18二代液相柱，检测波长280nm，流动相为体积比为70/29.9/0.1的乙腈/水/乙酸，流速为1mL/min，柱温为35℃。产物纯度用高效液相色谱测定。收率的定义为反应结束后得到产物的摩尔数和反应开始时加入底物的摩尔数的比值。测定得四氢姜黄素保留时间为60.756min，姜黄素的出峰时间为66.122min。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明的有益效果是：
1.本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NAD(P)H的脱氢酶的新菌株蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)，与已报道的菌株相比，该菌株及其脱氢酶对姜黄素不饱和碳键的还原具有高度选择性，对四氢姜黄素制备的选择性好；新菌株的获得及其催化特性的挖掘拓展了海洋菌株在非水相酶体系制备天然药物分子的范围。
2.本发明还考察了反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌株全细胞、粗酶液催化姜黄素还原不饱和碳键制备四氢姜黄素的反应体系和反应条件，为特定种类姜黄素类似物的工业化制备提供了思路和依据。
3.本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备四氢姜黄素和海洋生物资源高值化开发领域具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1为实施例1中涉及的姜黄素在不同菌株转化下的吸光度变化，其中，菌株A006为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021，保藏编号为CCTCC NO:M 2022292，即对应本发明菌株，菌株MA为Citreicella marina sp.，MCCC编号为1A03060。吸光度均呈现下降趋势，初步证明底物被消耗，其中该实施例中的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCCNO:M 2022292)在反应时间90分钟后的转化率更高。
图2为实施例1中涉及的姜黄素在转化之后萃取操作的颜色变化图。由深橘黄色(左)向浅白色(右)过渡。符合姜黄素和四氢姜黄素颜色特征。
图3为本发明中涉及的姜黄素标准样品的高效液相色谱图，其保留时间为65.281min。
图4为本发明中涉及的四氢姜黄素标准样品的高效液相色谱图，其保留时间为61.033min。
图5为实施例2中涉及的产物的高效液相色谱图，显示姜黄素被还原转化为四氢姜黄素，其保留时间为60.756min，同时有部分未转化的姜黄素，其保留时间为66.122min。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1)菌株的培养：蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus WSZ2021(CCTCC NO:M 2022292)以1％(mL/mL)的接种量，将菌种接入50mL 216L培养基中。216L培养基组成为10.0g/L蛋白胨，5.0g/L酵母粉，0.5g/L牛肉膏，0.5g/L柠檬酸钠，0.2g/L NH4NO3，1.0g/L醋酸钠，用人工海水配制。培养条件为：起始pH 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养时间72小时。
2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，10000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心操作3次获得细胞，将细胞用pH 9.0的Tris-盐酸缓冲液配制成5000mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.05mol/L姜黄素，加入0.31mol/L 1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐促进底物溶解，0.02mol/L葡萄糖，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，pH 9.0，5000mg/L的细胞液，反应体积1L，反应体系pH 9.0，在反应温度0℃下，100rpm震荡反应36小时，利用全细胞催化得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：取步骤3)中反应结束后的反应液离心除去细胞，加入等体积的乙腈，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为51895-902Agilent TC-18(2)安捷伦C18二代液相柱，检测波长280nm，流动相为体积比为70/29.9/0.1的乙腈/水/乙酸，流速为1mL/min，柱温为35℃。产物纯度用高效液相色谱测定。收率的定义为反应结束后得到产物的摩尔数和反应开始时加入底物的摩尔数的比值。
经检测，实施例1中的产物的高效液相色谱图中，在与四氢姜黄素标准品相应的位置处出现样品峰，表明得到的产物为四氢姜黄素，且具有较高的光学纯度；产物四氢姜黄素光学纯度为e.e 99.0％，收率为89.5％。
实施例2
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH 10的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液配制成2500mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的2500mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.01mol/L姜黄素，0.80mol/L 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐促进底物溶解，0.05mol/L丙醇，0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，pH 10，2500mg/L的细胞，反应体积500mL，反应体系pH 10，在反应温度50℃下，300rpm震荡反应70小时，利用全细胞催化不饱和碳键还原得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物四氢姜黄素收率为60.1％，e.e.值为95.7％。
实施例3
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH 7.5的0.2mol/L的Tris-盐酸缓冲液配制成25mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的25mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.01mol/L姜黄素，0.01mol/L丙酮，0.06mol/L 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐促进底物溶解，0.2mol/L的Tris-盐酸缓冲液，25mg/L的细胞，反应体系pH 7.5，反应体积5L，在反应温度10℃下，300rpm震荡反应，反应时间180小时，利用全细胞催化得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物四氢姜黄素收率为92.1％，e.e.值为96.4％。
实施例4
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH 13的0.01mol/L的乙酸钠缓冲液配制成1500mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的1500mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.02mol/L姜黄素，0.25mol/L N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴，0.2mol/L葡萄糖，0.01mol/L的乙酸钠缓冲液，1500mg/L的细胞，反应体积500mL，反应体系pH 13，在反应温度50℃下，200rpm震荡反应，反应时间30小时，利用全细胞催化得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物四氢姜黄素收率为77.2％，e.e.值为96.7％。
实施例5
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH 9.0的0.2mol/L的碳酸钠缓冲液配制成250mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的250mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.05mol/L姜黄素，0.05mol/L乙醇，0.2mol/L的碳酸钠缓冲液，0.15mol/L溴化1-丙基-3-甲基咪唑，pH 9.0，250mg/L的细胞，反应体积1L，反应体系pH 9.0，在反应温度70℃下，300rpm震荡反应，反应时间30小时，利用全细胞催化不饱和碳键还原得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物四氢姜黄素收率为80.3％，e.e.值为98.7％。
实施例6
1)实验步骤如实施例1的步骤1)；
2)粗酶液制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，10000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心操作3次获得细胞，配制成浓度为150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行破碎处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W，然后4℃、12000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清液即为含有脱氢酶的粗酶液，用pH 11的0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液调节粗酶液浓度为300mg/L；
3)粗酶液催化：以步骤2)得到的300mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.04mol/L姜黄素，40mmol/L的N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴，0.001～0.2mol/L甲醇，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，300mg/L的粗酶液，反应体系pH 11，在反应温度10℃下，100～300rpm震荡反应，反应时间90小时，利用粗酶液催化得到产物四氢姜黄素。
4)分离与检测：取步骤3)中反应结束后的反应液，加入等体积的乙腈，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为51895-902Agilent TC-18(2)安捷伦C18二代液相柱，检测波长280nm，流动相为体积比为70/29.9/0.1的乙腈/水/乙酸，流速为1mL/min，柱温为35℃。产物纯度用高效液相色谱测定，产物四氢姜黄素收率为82.6.％，e.e.值为93.2％。
实施例7
1)～2)实验步骤如实施例6的步骤1)～2)，且步骤2)中用pH 12的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液调节粗酶液浓度为1500mg/L；
3)粗酶液催化：以步骤2)得到的1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.05mol/L姜黄素，0.80mol/L 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐促进底物溶解，0.1mol/L苯乙酮，0.05mol/L的乙酸钠缓冲液，1500mg/L的粗酶液，反应体系pH 12，在反应温度70℃下，200rpm震荡反应，反应时间45小时，利用粗酶液催化不饱和碳键还原得到产物四氢姜黄素。
4)按照实施例6中的步骤4)进行分离检测，结果显示，高效液相色谱图中，在与四氢姜黄素标准品相应的位置处出现样品峰，表明得到的产物为四氢姜黄素，且具有较高的光学纯度。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种海洋菌株，其特征在于：所述海洋菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）WSZ2021，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2022年03月18日，保藏编号为CCTCC NO: M 2022292。
2.权利要求1所述的海洋菌株在催化姜黄素制备四氢姜黄素中的用途。
3.一种利用权利要求1所述的海洋菌株催化制备四氢姜黄素的方法，其特征在于：反应体系中，以姜黄素为底物，加入辅助底物和离子液体，利用所述海洋菌株的培养产物催化姜黄素还原得到四氢姜黄素，所述培养产物为所述海洋菌株全细胞或粗酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的离子液体在所述反应体系中的浓度为0.01～0.8 mol/L，所述离子液体为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、或N,N'-(亚甲基)双(1-(3-乙烯基咪唑))溴中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的辅助底物在所述反应体系中的浓度为0.001～0.5 mol/L；所述辅助底物为葡萄糖、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇、苯乙酮、苯乙醛或仲丁醇中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述反应体系中还包括缓冲液，所述缓冲液为pH为7～13的Tris-盐酸缓冲液、乙酸钠缓冲液、碳酸钠缓冲液、或磷酸钾缓冲液中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养产物为所述海洋菌株的全细胞，所述方法包括：
1）菌株的培养：将所述海洋菌株以1～2%的接种量接种入216L培养基中培养；
2）全细胞的制备：将步骤1）培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；将细胞用缓冲液配制成25～5000 mg/L的细胞液；
3）全细胞催化：以步骤2）得到的25～5000 mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系，包括：0.001～0.5 mol/L姜黄素，0.001～0.5 mol/L辅助底物，0.01～0.8 mol/L离子液体，0.01～0.2 mol/L的缓冲液，25～5000 mg/L的细胞液，反应体系pH 6～13，在0℃～70℃反应温度下，100～300 rpm震荡反应，反应时间30～180小时，利用全细胞催化姜黄素还原得到四氢姜黄素。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养产物为所述海洋菌株的粗酶液，所述方法包括：
1’）菌株的培养：将所述海洋菌株以1～2%的接种量接种入216L培养基中培养；
2’）粗酶液的制备：将步骤1’）培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到粗酶液，用缓冲液调节粗酶液浓度至5～2000 mg/L；
3’）粗酶液催化：以步骤2’）得到的5～2000 mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系，包括：0.001～0.5 mol/L姜黄素，0.001～0.5 mol/L辅助底物，0.01～0.8 mol/L离子液体，0.01～0.2 mol/L的缓冲液，5～500 mg/L的粗酶液，反应体系pH 7～13，在5℃～80℃反应温度下，100～300 rpm震荡反应，反应时间10～100小时，利用粗酶液催化姜黄素还原得到四氢姜黄素。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述步骤1）或步骤1’）中，培养条件为：起始pH 6.0～8.0，装液量体积分数为5%～30%，培养温度25～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
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