CN109097417A - 提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法 - Google Patents

提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了通过糖化过程中的pH控制提高木质纤维素全菌糖化效率的方法。所述方法包括以下步骤：(1)在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长中期，得到种子液；(2)在厌氧条件下，将种子液接入具有糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的厌氧发酵装置中，混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液；(3)当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到15‑120g/L后，将糖液分离出去，保留固体残渣；再次添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)。该方法在保证高的糖得率的前提下，大大缩短了全菌糖化的周期，为工业化的进程奠定了基础。

Description

提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种木质纤维素的生物转化方法，具体涉及一种用于提 高木质纤维素的全菌糖化效率的方法。
背景技术
纤维原料的高效综合利用，特别是提高农林废弃生物质原料转化和利用效率是生物产业 发展规划的要求。所以，推动农业废弃生物质综合利用的产业化发展，对我国绿色循环经济 的建立和社会的可持续发展意义重大。木质纤维素类生物质利用的核心瓶颈在于实现木质纤 维素的高效糖化，即将木质纤维素固体底物高效、低成本的转化为可发酵糖。目前，木质纤 维素糖化所用的酶制剂技术被发达国家公司垄断，由此而造成的酶成本高昂，技术上的困难 也阻碍了木质纤维素生物转化技术的发展和应用。因此，开发低成本、高效率的糖化技术， 对发展中国家尤为必要。
与依赖于酶制剂的糖化工艺相比，整合生物加工技术的“一锅法”全菌催化的生物糖化 策略具有简化流程、降低设备要求等优势，是最适合纤维素类生物质生物转化利用的工艺路 线。“一锅法”技术的核心在于采用高效的全菌催化剂，即一种具有木质纤维素底物降解能 力、可以高效将纤维素底物水解转化为可发酵糖的微生物。目前，木质纤维素全菌催化糖化 主要利用产纤维小体的高温厌氧菌作为全菌催化剂，但还未真正大规模应用，相关技术工艺 还处于初级阶段，主要问题在于糖化周期过长，不具效率优势，并且增加生产过程的人工、 能耗成本。
可见，要推动木质纤维素全菌催化糖化的工业化应用和商业化运行，必须通过工艺的改 良，解决周期长、成本高的问题，这将解决生物质资源浪费的同时，解决农林废弃物燃烧带 来的环境污染问题，并且为发酵行业提供低成本碳源，因此具有显著的社会效益、环境效益 和经济效益。
发明内容
针对现有技术中木质纤维素全菌糖化中所存在周期长的问题，本发明提供了通过糖化过 程中的pH控制提高木质纤维素全菌糖化效率的方法，该方法在保证高的糖得率的前提下， 大大缩短了全菌糖化的周期，为工业化的进程奠定了基础。
本发明的技术方案：
用于提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，培养至对数 生长中期，得到种子液；其中，所述产纤维小体菌株的接种量为1-5％(v/v)，并在34-65℃的 温度条件和100-200rpm的转速条件下培养至对数生长中期。
当细胞培养达到对数生长中期的时间超过24小时，重复进行步骤(1)所述的种子液制 备，直至细胞培养达到对数生长中期的时间小于24小时，即二级种子液制备。具体为：在厌 氧条件下，将一级种子液按照接种量1-5％(v/v)接种于种子培养基中，在34-65℃以100-200 rpm的转速，培养至对数生长中期，获得二级种子液。
(2)全菌糖化：在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液接入具有糖化培养基和预处 理后木质纤维素原料的厌氧发酵装置中，混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化， 得到糖液；其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8-7.4；全菌糖化中期，所述糖 化培养基的pH为5.8-6.2；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为6.5-7.5。所述种子液的接 种量为3-20％(v/v)，并在34-65℃和0.5-100rpm的转速条件下与预处理后的木质纤维素原料 的混合均匀；所述糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的重量体积比为1:2-1:25。
其中，所述的糖化初期是指预处理底物中纤维素的糖转化率低于10％，或糖化进行48 小时以内的时期；所述的糖化中期是指预处理底物中纤维素的糖转化率为15％-80％的时期； 所述的糖化后期是指从预处理底物中纤维素的糖转化率为80％-90％开始，延续2-24小时。糖 化各阶段调整pH的目的在于：在糖化初期使全菌催化剂大量繁殖；在糖化中期使全菌催化 剂的菌体进入休眠状态，减少对可发酵糖的消耗，同时提高细胞表面的纤维小体的酶解活力， 提高糖化速率；在糖化后期恢复全菌催化剂细胞的代谢水平，用于启动步骤(3)的新一轮糖 化。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到15-120g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次 添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)所述的全菌糖化，即步骤(2) 的反应条件进行新一轮糖化。这是由于，产纤维小体的微生物可以附着在纤维素底物上，因 此，将糖化完成后附着有产纤维小体微生物的固体残渣作为种子可以进行新一轮的糖化，不 仅节约了种子培养的成本，而且进一步缩短糖化过程的周期。
优选的是，当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到24-120g/L后，通过发酵罐出口装 配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣。
其中，步骤(1)中，所述产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解 纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。所述种子培养 基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、 硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L以及作为碳源的0.1-10g/L 预处理后的木质纤维素原料。
步骤(2)中，所述糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、 氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸 三钠2g/L。所述的预处理为碱法、酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多 种的组合。所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸 中的一种或多种的组合。所述的厌氧发酵装置为带有搅拌桨的厌氧发酵设备或者厌氧旋转混 匀器；所述带有搅拌桨的厌氧发酵设备通过搅拌实现混合均匀，而厌氧旋转混匀器则通过容 器的整体滚动翻转实现混合均匀。所述pH的控制通过流加氢氧化钠或盐酸的方式实现。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过控制糖化过程中的pH，实现了木质纤维素全菌糖化效率的极大提高； 因此，本发明在保证高糖得率的前提下，缩短了全菌糖化的周期，为产业化奠定了基础。
(2)本发明通过研究发现，低pH条件下纤维小体微生物生长缓慢而纤维小体活力提高、 高pH条件下产纤维小体微生物生长快速；因此提出了通过调整糖化过程中反应体系的pH值 控制糖化过程的方法。该方法不但降低了微生物对糖的消耗，提高了酶解活力，而且在保证 高的糖转化率的前提下，显著缩短了糖化周期；与现有技术相比，糖化周期可以缩短到3天。
(3)本发明还充分利用产纤维小体微生物可以附着在纤维素底物上的特性，利用糖化完 成后附着有产纤维小体微生物的固体残渣作为种子进行新一轮的糖化，从而节约了种子培养 的成本，并进一步缩短糖化过程的周期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：
用于木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌DSM1313按照接种量5％(v/v)接种于种 子培养基中；所述种子培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯 化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L以及作为碳源的5g/L磺化法预处理后的玉米秸秆。然后在55℃的温度条件和100rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。
(2)全菌糖化：采用磺化法预处理玉米秸秆。按照重量体积比1:6.5，将1kg预处理后 的玉米秸秆和6.5L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的 种子液按照接种量10％(v/v)接种至上述厌氧发酵装置中，并在60℃和50rpm的转速条件 下与预处理后的玉米秸秆的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其 中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.0；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为7.5。
其中，所述的糖化初期是指预处理底物中纤维素的糖转化率低于10％，或糖化进行48 小时以内的时期；所述的糖化中期是指预处理底物中纤维素的糖转化率为15％-80％的时期； 所述的糖化后期是指从预处理底物中纤维素的糖转化率为80％-90％开始，延续24小时。
所述糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、 氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L。
所述的厌氧发酵装置为带有搅拌桨的厌氧发酵设备，所述带有搅拌桨的厌氧发酵设备通 过搅拌实现混合均匀。所述pH的控制通过流加氢氧化钠的方式实现。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到74g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)所述的全菌糖化，即步骤(2)的反应条件进行新一轮糖化。
对照实施例1：
与实施例1不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例2：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌DSM1313::Cels-BglA按照接种量1％(v/v) 接种于种子培养基中；所述种子培养基中作为碳源的碱法预处理后的灌木枝条的量为1g/L。 然后在60℃的温度条件和150rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。
(2)全菌糖化：采用碱法预处理灌木枝条。按照重量体积比为1:3，将0.2kg预处理后 的灌木枝条和0.6L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的 种子液按照接种量5％(v/v)厌氧发酵装置中，并在60℃和10rpm的转速条件下与预处理后 的灌木枝条的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.2；全菌糖化 后期，所述糖化培养基的pH为7.0。所述的糖化后期延续时间为5小时。
所述的厌氧发酵装置厌氧旋转混匀器；所述厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转 实现混合均匀。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到120g/L后，通过发酵 罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的灌木枝条，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例2：
与实施例2不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例3：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将热纤梭菌DSM1313::Cels-BglA按照接种量3％(v/v) 接种于种子培养基中；然后在60℃的温度条件和200rpm的转速条件下培养至对数生长中期， 得到种子液。
(2)全菌糖化：采用水热法预处理废纸。按照重量体积比为1:10，将0.2kg预处理后的 废纸和2L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液按 照接种量8％(v/v)厌氧发酵装置中，并在60℃和5rpm的转速条件下与预处理后的废纸的 混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8；全菌糖化后期，所述糖 化培养基的pH为6.5。所述的糖化后期延续时间为2小时。
所述的厌氧发酵装置厌氧旋转混匀器；所述厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转 实现混合均匀。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到54g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的废纸，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例3：
与实施例3不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例4：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将黄色溶纤梭菌按照接种量3％(v/v)接种于种子培养 基中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的木片的量为10g/L。然后在65℃的温度条件 和170rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。
(2)全菌糖化：采用碱法+水热法预处理木片。按照重量体积比为1:15，将0.2kg预处 理后的木片和3L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种 子液按照接种量3％(v/v)厌氧发酵装置中，并在65℃和20rpm的转速条件下与预处理后的 木片的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.0；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.2；全菌糖化后期， 所述糖化培养基的pH为7.0。所述的糖化后期延续时间为12小时。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到34g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的木片，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例4：
与实施例4不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为7.0。
实施例5：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将嗜纤维梭菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培养基 中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的麦秸的量为5g/L。然后在37℃的温度条件和170 rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备，获得二 级种子液。
(2)全菌糖化：采用磺化法预处理麦秸。按照重量体积比为1:20，将0.2kg预处理后的 麦秸和4L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液按 照接种量15％(v/v)厌氧发酵装置中，并在37℃和20rpm的转速条件下与预处理后的麦秸 的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8；全菌糖化后期，所述 糖化培养基的pH为7.0。所述的糖化后期延续时间为12小时。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到26g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的麦秸，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例5：
与实施例5不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例6：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将解纤维梭菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培养基 中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的麦秸的量为5g/L。然后在34℃的温度条件和170 rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备，获得二 级种子液。
(2)全菌糖化：采用水热法+磺化法预处理麦秸。按照重量体积比为1:20，将0.1kg预 处理后的麦秸和2L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的 种子液按照接种量15％(v/v)厌氧发酵装置中，并在34℃和75rpm的转速条件下与预处理 后的麦秸的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.2；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为6.5。所述的糖化后期延续时间为12小时。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到28g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的麦秸，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例6：
与实施例6不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例7：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将解纤维醋弧菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培养 基中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的废纸的量为5g/L。然后在37℃的温度条件和 170rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备，获得 二级种子液。
(2)全菌糖化：采用汽爆法预处理玉米芯。按照重量体积比为1:20，将0.1kg预处理后 的玉米芯和2L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子 液按照接种量15％(v/v)厌氧发酵装置中，并在37℃和100rpm的转速条件下与预处理后的 玉米芯的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期， 所述糖化培养基的pH为6.8；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.2；全菌糖化后期， 所述糖化培养基的pH为7.0。所述的糖化后期延续时间为12小时。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到25g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的玉米芯，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例7：
与实施例7不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例8：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将溶纤维假拟杆菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培 养基中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的废纸的量为5g/L。然后在42℃的温度条件 和170rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备， 获得二级种子液。
(2)全菌糖化：采用汽爆法预处理废纸。按照重量体积比为1:25，将0.2kg预处理后的 废纸和5L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液按 照接种量20％(v/v)厌氧发酵装置中，并在42℃和1.6rpm的转速条件下与预处理后的废纸 的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.2；全菌糖化后期，所述 糖化培养基的pH为6.5。所述的糖化后期延续时间为12小时。
所述的厌氧发酵装置厌氧旋转混匀器；所述厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转 实现混合均匀。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到27g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的废纸，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例8：
与实施例8不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.5。
实施例9：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将白色瘤胃球菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培养 基中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的稻草的量为0.5g/L。然后在37℃的温度条件 和170rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备， 获得二级种子液。
(2)全菌糖化：采用碱法+汽爆法预处理稻草。按照重量体积比为1:10，将0.2kg预处 理后的稻草和2L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种 子液按照接种量20％(v/v)厌氧发酵装置中，并在37℃和0.5-100rpm的转速条件下与预处 理后的稻草的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8-7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8-6.2；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为6.5-7.5。所述的糖化后期延续时间为12小时。
所述的厌氧发酵装置厌氧旋转混匀器；所述厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转 实现混合均匀。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到32g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的稻草，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例9：
与实施例9不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.2。
实施例10：
与实施例1不同的是，
用于木质纤维素的全菌糖化方法，包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将黄化瘤胃球菌按照接种量5％(v/v)接种于种子培养 基中；所述种子培养基中作为碳源的预处理后的玉米芯的量为5g/L。然后在40℃的温度条件 和170rpm的转速条件下培养至对数生长中期，得到种子液。重复进行所述的种子液制备， 获得二级种子液。
(2)全菌糖化：采用酸法预处理玉米芯。按照重量体积比为1:5，将0.4kg预处理后的 玉米芯和2L糖化培养基转移至厌氧发酵装置中。在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液 按照接种量20％(v/v)厌氧发酵装置中，并在40℃和10rpm的转速条件下与预处理后的玉 米芯的混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液。其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为6.2；全菌糖化后期， 所述糖化培养基的pH为6.8。所述的糖化后期延续时间为12小时。
所述的厌氧发酵装置厌氧旋转混匀器；所述厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转 实现混合均匀。
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到72g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加 糖化培养基和预处理后的玉米芯，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
对照实施例10：
与实施例10不同的是，步骤(2)全菌糖化的pH始终为6.2。
表1.实施例1-10及其对照实施例的糖化效果数据
由表1可知，本发明实施例1-10第一轮全菌糖化中，葡萄糖浓度为24-120g/L，糖化周 期为3-18.5天，葡萄糖转化率为80.1-90.8％。对照实施例1-10第一轮全菌糖化中，葡萄糖浓 度为14-73g/L，糖化周期为10-26.5天，葡萄糖转化率为59.7-73％。与对照实施例相比，本 发明实施例1-10在葡萄糖浓度和葡萄糖转化率保持一致的前提下，糖化周期缩短了3-10天， 缩短了18-40％。其中，实施例8缩短了3天；实施例9缩短了10天。此外，实施例3中，糖化周期可以缩短到3天。这说明，本发明通过控制糖化过程中的pH，实现了木质纤维素全菌糖化效率的极大提高；因此，本发明在保证高糖得率的前提下，缩短了全菌糖化的周期，为产业化奠定了基础。
本发明实施例1-10第二轮全菌糖化中，葡萄糖浓度为26-120g/L，糖化周期为3.5-15天， 葡萄糖转化率为81.0-88.0％；与第一轮相比，糖化效果相差无几。这说明利用产纤维小体微 生物可以附着在纤维素底物上的特性，利用糖化完成后附着有产纤维小体微生物的固体残渣 作为种子进行新一轮的糖化，从而节约了种子培养的成本，并进一步缩短糖化过程的周期。

Claims (10)

1.提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)种子液制备：在厌氧条件下，将产纤维小体菌株接种于种子培养基中，培养至对数生长中期，得到种子液；
(2)全菌糖化：在厌氧条件下，将步骤(1)得到的种子液接入具有糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的厌氧发酵装置中，混合均匀，并在特定的pH条件下进行全菌糖化，得到糖液；其中，全菌糖化初期，所述糖化培养基的pH为6.8-7.4；全菌糖化中期，所述糖化培养基的pH为5.8-6.2；全菌糖化后期，所述糖化培养基的pH为6.5-7.5；
(3)新一轮全菌糖化：当步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到15-120g/L后，通过发酵罐出口装配的过滤组件将糖液分离出去，保留固体残渣；并向所述的厌氧发酵装置再次添加糖化培养基和预处理后的木质纤维素原料，重复步骤(2)所述的全菌糖化。
2.根据权利要求1所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(1)所述的产纤维小体菌株为热纤梭菌、黄色溶纤梭菌、嗜纤维梭菌、解纤维梭菌、解纤维醋弧菌、溶纤维假拟杆菌、白色瘤胃球菌或黄化瘤胃球菌。
3.根据权利要求2所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(2)中所述的糖化初期是指预处理底物中纤维素的糖转化率低于10％，或糖化进行48小时以内的时期；所述的糖化中期是指预处理底物中纤维素的糖转化率为15％-80％的时期；所述的糖化后期是指从预处理底物中纤维素的糖转化率为80％-90％开始，延续2-24小时。
4.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(2)中所述种子液的接种量为3-20％(v/v)，并在34-65℃和0.5-100rpm的转速条件下与预处理后的木质纤维素原料的混合均匀；所述糖化培养基和预处理后木质纤维素原料的重量体积比为1:3-1:25。
5.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(1)所述的种子液制备中，所述产纤维小体菌株的接种量为1-5％(v/v)，并在34-65℃的温度条件和100-200rpm的转速条件下培养至对数生长中期。
6.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(1)所述的种子培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L以及作为碳源的0.1-10g/L预处理后的木质纤维素原料；步骤(2)所述的糖化培养基为：磷酸氢二钾2.9g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、尿素0.8g/L、氯化钙0.1g/L、氯化镁1.8g/L、硫酸亚铁0.0005g/L、硫化钠2g/L、玉米浆4g/L、柠檬酸三钠2g/L。
7.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：所述的预处理为碱法、酸法、水热法、汽爆法和磺化法预处理技术中的一种或多种的组合；所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秸、灌木条枝、木片、玉米芯、稻草和废纸中的一种或多种的组合。
8.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：当细胞培养达到对数生长中期的时间超过24小时，重复进行步骤(1)所述的种子液制备，直至细胞培养达到对数生长中期的时间小于24小时。
9.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(2)所述的厌氧发酵装置为带有搅拌桨的厌氧发酵设备或者厌氧旋转混匀器；所述带有搅拌桨的厌氧发酵设备通过搅拌实现混合均匀，而厌氧旋转混匀器则通过容器的整体滚动翻转实现混合均匀。
10.根据权利要求3所述的提高木质纤维素糖化效率的全菌糖化方法，其特征在于：步骤(2)所述pH的控制通过流加氢氧化钠或盐酸的方式实现；所述步骤(3)得到的糖液中葡萄糖浓度达到24-120g/L后，分离糖液。
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