CN102337304A

CN102337304A - 运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法

Info

Publication number: CN102337304A
Application number: CN2010102377536A
Authority: CN
Inventors: 赵海; 靳艳玲; 方扬
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2012-02-01

Abstract

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法。菌种为运动发酵单胞菌，种子培养基的成分和各成分在培养基中的浓度为葡萄糖100gL^-1，酵母膏5g L^-1，(NH₄)₂SO₄1g L^-1，KH₂PO₄1g L^-1，MgSO₄0.5g L^-1，运动发酵单胞菌种子液培养时间为12h～16h；发酵培养基配制方法为将淀粉质原料打浆或打粉，加水拌料使初始糖浓度为180g kg^-1～280g kg^-1，80℃蒸煮，添加a-淀粉酶液化至碘反应为红棕色，发酵培养基中添加缓冲剂，每升发酵培养基接入100mL～120mL种子液，发酵培养时间为17h～30h，发酵过程中控制溶氧低于6mg L^-1。本发明工艺简单，可操作性强，最终乙醇浓度高，发酵效率高，发酵速度快，乙醇生产周期缩短2倍以上，可以在收获季节大量利用甘薯、芭蕉芋等廉价原料，减少保藏费用，同时提高单位设备的生产能力，降低设备运行费用，从而降低乙醇生产成本，具有良好的经济效益。

Description

运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法。

背景技术

2009年我国石油净进口量21,888.5万吨，原油净进口量19,862.0万吨。原油进口对外依存度达到52.5％，石油进口依存度达到53.6％，双双超过50％的“国际警戒线”。在石油消耗中，车用燃油消耗所占的比例逐年增加。因此，利用可再生的生物质资源发酵生产乙醇等交通运输用液体燃料来代替或部分代替石油成为研究热点。燃料乙醇作为清洁能源，在日益重视环保的今天，更是倍受关注。而目前，由于生产水平不高，燃料乙醇在市场上推广还需要国家财政和政策补贴，为提高其市场竞争力，必须切实地降低燃料乙醇生产成本。

原料成本占乙醇生产成本的一半以上，甘薯、芭蕉芋等非粮作物成本非常低廉，我国占世界产量的绝大部分。但是，这些原料季节性强，含水量大，收获时间比较集中，且主要分布在温带、亚热带地区，不易干燥，保藏很困难。原料腐烂后黏度大、输送困难，还会产生许多抑制发酵的成分，淀粉损耗更是惊人。因此，开发快速乙醇发酵技术，在收获季节及时利用价格低廉的原料，可避免原料资源的不必要浪费，减轻后期原料储存压力，同时可以降低生产原料成本，对于乙醇生产具有相当重要作用。而实现快速乙醇发酵的重要环节之一就是选用快速发酵产乙醇的菌株。

运动发酵单胞菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧菌，具有很强的产乙醇能力，利用葡萄糖生产乙醇的速度比酵母快3～4倍，乙醇产量可以达到理论值的97％，而且生长不需要氧气，能忍耐400gL^-1的葡萄糖溶液，在13％(v/v)乙醇浓度中可以生存，因此运动发酵单胞菌很适合作为乙醇快速发酵的生产菌种。

但是，受现有的乙醇发酵工艺水平限制，生产9％～12％(v/v)的乙醇，发酵时间通常在40～72h之间，发酵效率也不高。若应用于工业生产，则因发酵周期长而不利于降低生产成本，使得乙醇生产缺乏竞争力。运动发酵单胞菌耐酸性较差可能是其乙醇发酵水平不高的主要原因。但是，目前还没有利用缓冲剂调节运动发酵单胞菌乙醇发酵体系pH的报道，因此，开发缓冲剂，缓解乙醇发酵过程中随发酵进行pH降低对运动发酵单胞菌的抑制作用，从而提高菌种代谢活性，缩短发酵时间，提高发酵液乙醇浓度，将可能极大提高乙醇生产效能，增强乙醇生产的竞争力。

发明内容

本发明的目的是针对现有快速乙醇发酵工艺的不足，发明一种运动发酵单胞菌快速发酵生产乙醇的新方法，以降低乙醇生产成本。

本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：

本发明以廉价的甘薯为原料，主要包括如下工艺单元：发酵培养基的配制；种子培养基的制备；运动发酵单胞菌种子液的制备；发酵。具体步骤如下：

1.发酵培养基制备

葡萄糖发酵培养基的配方：每升培养基中含葡萄糖150g～200g，酵母膏5g，(NH₄)₂SO₄1g，KH₂PO₄ 1g，MgSO₄ 0.5g，0.2mol L^-1的Ph5.4醋酸盐缓冲液200mL或碳酸钙粉末5～7.5g，自来水配制后115℃灭菌20min备用。

淀粉质原料发酵培养基的配方：原料打浆或打粉，加水拌料使初始糖浓度为180g kg^-1～280g kg^-1，80℃蒸煮，添加α-淀粉酶液化至碘反应为红棕色，添加(NH₄)₂SO₄或尿素，其在发酵培养基中的终浓度分别为1～1.5g kg^-1和0.6～2.0g kg^-1，添加Ph为5.4醋酸盐缓冲液或碳酸钙粉末作为缓冲剂，其在发酵培养基中的终浓度分别为40mmol L^-1和5～7.5gL^-1，装发酵醪于三角瓶或发酵罐中，115℃灭菌20min备用或不灭菌直接接种发酵。

2.种子培养基的配方：每升培养基中含葡萄糖100g，酵母膏5g，(NH₄)₂SO₄ 1g，KH₂PO₄1g，MgSO₄ 0.5g，自来水配制后115℃灭菌20min备用。

3.种子液的制备：从保存种子培养液吸取运动发酵单胞菌，按1∶5～1∶7(体积∶体积)的比例接种到装有新配制的种子培养基的三角瓶中，瓶口封塑料纸，培养温度30℃，100rpm振荡或搅拌培养12h～16h。

4.发酵：种子培养基制备完成之后，立即向每升发酵培养基接入100mL～120mL种子液，瓶口或发酵罐口封塑料纸，培养温度30℃～33℃，100rpm～150rpm振荡或搅拌下发酵，控制溶氧低于6mg L^-1，经17h～30h发酵结束。

所述的甘薯为淀粉含量高、无腐烂、无病虫害的新鲜甘薯。

所述的α-淀粉酶为Liquozyme Supra，购自诺维信公司。标准酶活力为90KNU·g^-1，KNU为诺维信液化酶的专有单位，1KNU是指在37℃，pH 5.6时，每小时水解5.26克淀粉的酶量。

所述的糖化酶为Suhong GAII，购自诺维信公司。标准酶活500AGU·ml^-1。AGU为诺维信液化酶的专有单位，1AGU是指在25℃、pH 4.3、反应时间30分钟条件下，每分钟水解1微克分子麦芽糖所需的酶量。

所述的菌种为运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 10232B，申请人已于2010年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2010151。

本发明发酵工艺简单，发酵17h～30h，乙醇浓度达9.28％～16.19％(v/v)，乙醇生产周期缩短2倍以上，可以在收获季节大量利用甘薯、芭蕉芋等廉价原料，减少保藏费用。同时提高单位设备的生产能力，降低设备运行费用，从而降低乙醇生产成本，具有良好的经济效益。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。

对照例1.不添加缓冲剂

葡萄糖发酵培养基初始糖浓度180gL^-1，不添加缓冲剂。取5mL保存有运动发酵单胞菌的种子液接种到100mL新配制的种子培养基中，瓶口封塑料纸，培养温度30℃，100rpm振荡培养22h后立即取10mL种子液接种到100mL发酵培养基中，瓶口封塑料纸，培养温度31℃，100rpm振荡，控制溶氧低于6mg L^-1，经48h发酵，乙醇浓度达11.09％(v/v)。

对照例2.缓冲剂为Ph5.4磷酸盐缓冲液

葡萄糖发酵培养基初始糖浓度180gL^-1，缓冲剂为0.2mol L^-1的Ph5.4磷酸盐缓冲液，其在培养基中的终浓度为40mmol L^-1。取5mL保存有运动发酵单胞菌的种子培养液接种到100mL新配制的种子培养基中，瓶口封塑料纸，培养温度30℃，100rpm振荡培养15h后立即取10mL种子液接种到100mL发酵培养基中，瓶口封塑料纸，培养温度30℃，120rpm振荡，控制溶氧低于6mg L^-1，经20h发酵，乙醇浓度10.15％(v/v)，发酵效率89.36％。

实施例1：缓冲剂为Ph5.4醋酸盐缓冲液

葡萄糖发酵培养基初始糖浓度180gL^-1，缓冲剂为Ph5.4醋酸盐缓冲液，其在培养基中的终浓度为40mmol L^-1。种子液的制备和接种及发酵培养方式同对照例2，经20h发酵，乙醇浓度11.17％(v/v)，发酵效率92.73％。

实施例2.缓冲剂为碳酸钙

种子液的制备同对照例2。葡萄糖发酵培养基初始糖浓度150gL_-1，缓冲剂选用碳酸钙，其在发酵培养基中的终浓度为5.0g L_-1，接种及培养方式同对照例2，经17h发酵，乙醇浓度9.28％(v/v)，发酵效率94.43％。

实施例3.缓冲剂为碳酸钙

种子液的制备同对照例2。葡萄糖发酵培养基初始糖浓度180gL^-1，缓冲剂选用碳酸钙，其在发酵培养基中的终浓度为7.5g L^-1，接种及培养方式同对照例2，经20h发酵，乙醇浓度11.36％(v/v)，发酵效率93.88％。

实施例4.缓冲剂为碳酸钙

种子液的制备同对照例2。葡萄糖发酵培养基初始糖浓度200gL^-1，缓冲剂选用碳酸钙，其在发酵培养基中的终浓度为5.0g L^-1，接种及培养方式同对照例2，经24h发酵，乙醇浓度12.70％(v/v)，发酵效率94.50％。

实施例5.10L发酵罐中的乙醇发酵

葡萄糖发酵培养基初始糖浓度180gL^-1，体积7.8L，缓冲剂选用碳酸钙，添加量为40g。种子液的制备同对照例2。接种0.78L种子液于发酵培养基，培养温度33℃，搅拌浆转速120rpm，控制溶氧低于6mg/L，发酵18h，乙醇的最终浓度达到11.22％(v/v)，发酵效率93.60％。

实施例6.以鲜甘薯为原料的乙醇发酵(灭菌)

鲜甘薯打浆、加水、液化后使甘薯醪初始糖浓度为180g kg^-1，装100g于250mL三角瓶中，同时加入0.13g(NH₄)₂SO₄和0.5g碳酸钙，115℃灭菌20min。种子液的制备和培养方式同对照例1，培养14h后立即接种运动发酵单胞菌种子液10mL于发酵培养基中，同时添加160AGUkg^-1淀粉的糖化酶，32℃、搅拌100rpm，控制溶氧低于6mg L^-1，经21h发酵，乙醇浓度12.06％(v/v)，发酵效率94％。

实施例7.以鲜甘薯为原料的乙醇发酵(不灭菌)

种子液和发酵培养基的制备和培养方式同实施例7，发酵培养基不灭菌。接种和发酵培养方式同实施例6，经21h发酵，乙醇浓度11.76％(v/v)，发酵效率93.76％。

实施例8.以木薯为原料的乙醇发酵

20kg木薯粉加水40kg，装入100L发酵罐中，液化后补水使初始糖浓度为276.20g kg^-1，同时加入0.2g尿素和0.5g碳酸钙，115℃灭菌20min。接种和发酵培养方式同实施例6，发酵30h，乙醇浓度达16.19％，发酵效率90.86％。

Claims

1.运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法，包括种子培养和发酵培养，其特征是：菌种为运动发酵单胞菌，种子培养基的成分和各成分在培养基中的浓度为葡萄糖100g L^-1，酵母膏5g L^-1，(NH₄)₂SO₄1g L^-1，KH₂PO₄1g L^-1，MgSO₄0.5g L^-1，运动发酵单胞菌种子液培养时间为12h～16h；发酵培养基配制方法为将淀粉质原料打浆或打粉，加水拌料使初始糖浓度为180g kg^-1～280g kg^-1，80℃蒸煮，添加α-淀粉酶液化至碘反应为红棕色，发酵培养基中添加缓冲剂，每升发酵培养基接入100mL～120mL种子液，发酵培养时间为17h～30h，发酵过程中控制溶氧低于6mg L^-1。

2.根据权利要求1所述的运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法，其特征是：所述的缓冲剂为：醋酸盐缓冲液或碳酸钙粉末。

3.根据权利要求2所述的运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法，其特征是：添加的醋酸盐缓冲液Ph为5.4，其在发酵培养基中的终浓度为40mmol L^-1；添加的碳酸钙粉末，其在发酵培养基中的终浓度为5～7.5gL^-1。

4.根据权利要求1所述的运动发酵单胞菌快速生产乙醇的方法，其特征是：甘薯或木薯发酵培养基中添加(NH₄)₂SO₄或尿素，其在发酵培养基中的终浓度分别为1～1.5g kg^-1和0.6～2.0g kg^-1。