CN102220386B - 一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法。包含以下步骤：发酵培养基的制备；发酵培养基的降粘；丁醇生产微生物种子液的制备；接种和发酵。发酵液中丁醇含量达8.01～9.61g/L，丁醇占总溶剂的比例达63.77％～67.84％。本发明开发了一种新型能源植物浮萍来生产燃料丁醇的方法，发酵终产物浓度和发酵得率与粮食原料玉米相当，丁醇在总溶剂中的比例高于玉米发酵。本发明具有工艺简单，易于工业化的特点。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法。
背景技术
随着世界化石能源的日趋匮乏，石油类产品价格日益攀升，同时化石燃料的大量使用，使得生态环境负荷日益加大，世界各国相继把替代能源的发展作为实现经济可持续发展的重要能源政策。丙酮丁醇发酵曾是仅次于酒精发酵的第二大发酵工业。丁醇是一种极具潜力的生物液体燃料。丁醇与乙醇相比具有以下优势：①丁醇热值和辛烷值与汽油相当，其热值是乙醇的1.3倍，且抗暴性能好；②不腐蚀管道，便于管道运输，丁醇可以使用现有的汽油供应和分销系统，而乙醇的输送需要通过铁路、船舶等专用工具；③与其他生物燃料相比，丁醇的蒸气压低，安全性更高；④丁醇和汽油的混合比更高，不需对现有车辆进行改造。由于具有上述诸多优良特性，丁醇作为新一代生物液体燃料已经引起了各国研究者和企业的兴趣。虽然丁醇作为生物燃料的前景诱人，但发酵法生产燃料丁醇的产业化生产中还存在很多问题，例如：菌种的丁醇耐受性差，发酵液中丁醇终浓度难以超过1.3％；丁醇在总溶剂中的比例相对较低(玉米和糖蜜发酵的都在60％左右)；工业生产中原料成本太高等。这些因素导致了丁醇生产成本过高，从而缺乏市场竞争力。同时，提高丁醇在总溶剂中的比例不仅可以提高目标产物丁醇的获得率，还可降低蒸馏工艺的能耗，提高燃料丁醇发酵生产的净能源产出率。传统丁醇发酵的原料主要是玉米和糖蜜，考虑到我国粮食安全问题，以非粮作物为原料生产丁醇将是未来发展的方向。从目前国内外的研究进展来看以水生植物浮萍为原料发酵生产燃料丁醇的研究还没有报道。
浮萍科(Lemnaceae)植物，通常简称浮萍，全世界共有5个属，38种，我国有4个属.浮萍淀粉含量高，木质素含量很少，是用于燃料乙醇和燃料丁醇发酵生产的极具潜力的原料.以新型水生能源植物浮萍为原料来发酵产丙酮丁醇具有独特的优势：①浮萍可以吸收水体中的氮、磷，在综合治理污水的同时生产了大量的生物质；②浮萍繁殖速度快，约2-7天可繁殖一代，年产量高达55t(干重)hm-2.③浮萍的淀粉含量高，可达75％(干重)，并且丙酮丁醇梭菌能直接利用糊化的淀粉，不需要酵母酒精发酵的液化和糖化工艺，工艺流程更简单；④丙酮丁醇发酵还产生氢气(占总废气的37.93％)，氢气也是一种清洁能源，收集利用又可以提高浮萍燃料丁醇的净能源产出率.ChenY等2008年报道尝试利用浮萍中 的淀粉发酵产出乙醇，产率为25.8％(干重).而以浮萍为原料发酵产丙酮丁醇在国内外还没有报道.
因此，开发以浮萍为原料，替代传统的粮食原料并偶联污水治理的生物质能源生产新技术具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是针对现在燃料丁醇发酵生产中原料成本过高的问题，开发出一种以廉价的非粮原料浮萍为底物，以丙丁梭菌为菌种发酵生产丁醇的新方法，以提高丁醇比例、降低生产成本。
本发明以新型水生能源植物浮萍为原料，以丙丁梭菌为菌种发酵生产丁醇。主要包括如下工艺单元：发酵培养基的制备；发酵培养基的降粘；丁醇生产微生物种子液的制备；接种和发酵。具体步骤如下：
1.发酵培养基的制备：浮萍烘干、粉碎后过35目筛，按1∶6～1∶9(质量∶质量)的比例加水后加热，100℃微沸糊化8～12min，补足蒸发水分。
2.培养基降粘：糊化好的培养基用2mol/L的硫酸将pH调为5.5，按100g醪液加入降粘酶0.1～0.4g，50℃150rpm水浴摇床恒温2h，分装到厌氧瓶中，冷却后充氮气除氧，121℃灭菌15～20min备用。
3.种子液的制备：玉米粒晒干，粉碎后过35目筛。将玉米粉与自来水按1∶15～20(质量∶质量)的比例混合均匀，煮至微沸后继续煮1h成糊状，补足水分后分装于厌氧管中，通氮气除氧，盖好内外塞，121℃灭菌1h(自然pH，即不需要通过加酸或加碱调节PH到特定值。玉米粉加水，再按操作进行后的PH就刚好适合菌种生长。)，冷却至室温，从保存有丙酮丁醇梭菌菌种的种子培养基中吸取孢子液，按1∶8～1∶12(体积∶体积)的比例接种到新配制的种子培养基中，沸水浴热击90s，37℃静止培养23h～25h可用做种子液。
4.发酵：按8～12％(体积∶体积)的接种量将种子液接种到发酵培养基中，37℃左右静止发酵72h～108h。
5.发酵醪固液分离：发酵结束后的发酵醪经抽滤使发酵醪固液分离，取滤液进行蒸馏。
6.蒸馏：滤液经Buchi Rotavapor R-210旋转蒸发仪在56℃，78℃，92℃下分别蒸馏得到丙酮、乙醇和丁醇。
所述的浮萍采自四川省成都市邛崃回龙镇，60℃烘干后用打粉机粉碎为小于35目的 粉状颗粒。
所述的玉米粉来自在市区农贸市场采购玉米粒，洗净晒干后粉碎为小于35目的粉状颗粒。
所述的菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum CICC8012)，申请人已于2010年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2010148。保藏中心地址为：中国武汉武汉大学，邮编：430072。
所述的降粘酶为木聚糖酶和果胶酶按4∶1(质量)的混合酶，购自和氏璧生物技术有限公司。木聚糖酶的标准酶活＞1×108U/g(酶活定义：1g酶粉于50℃、pH5.0条件下，1min水解1％木聚糖溶液产生1μg木糖的酶量为一个木聚糖酶活力单位。)；果胶酶的标准酶活＞5×105U/g(酶活定义：1g酶粉于50℃、pH3.5条件下，1min催化果胶水解生成1μg半乳糖醛酸的酶量为一个果胶酶活力单位。)
发酵结束后，测量发酵液中最终的乙醇(E)、丙酮(A)、丁醇(B)的浓度。丁醇浓度为8.01g/L～9.61g/L，总溶剂(ABE)的浓度为12.56g/L～14.80g/L。发酵得率大于0.40。丁醇占总溶剂的比例达63.77％～67.84％。
本发明提供了一种利用浮萍高效生产燃料丁醇的方法，通过对浮萍烘干、打粉糊化后发酵等工艺得到了丁醇，工艺路线简单、可靠，成本低廉。其发酵水平达到了同等条件下以玉米为发酵培养基的发酵水平，并且浮萍发酵的丁醇占总溶剂的比例比以玉米发酵的高出6.61％～13.52％。与以玉米为原料发酵生产丁醇相比，具有明显的比较优势。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。
对照例(玉米培养基进行的丙酮丁醇发酵)
取2.5g玉米粉置于100ml的的厌氧瓶中加入47.5ml的蒸馏水，加热使培养基保持微沸糊化10min，冷却补足蒸发水分后充氮气除氧，121℃灭菌15min备用。冷却至室温后以10％的接种量接入种子培养液。37℃静止培养72h，发酵液中丁醇含量为9.08g/L，ABE含量为15.03g/L，发酵得率为0.363。丁醇占总溶剂的比例为60.41％。发酵结束后的发酵醪经抽滤使发酵醪固液分离，取滤液进行蒸馏。滤液经Buchi Rotavapor R-210旋转蒸发仪在56℃，78℃，92℃下分别蒸馏得到丙酮、乙醇和丁醇。
实施例1：取5.21g浮萍粉置于100ml的厌氧瓶中加入44.79ml的蒸馏水，加热使培 养基保持微沸糊化10min，冷却补足蒸发水分后充氮气除氧，121℃灭菌15min备用。冷却至室温后加入5ml左右的种子液接种，37℃左右静止发酵60h。发酵液中丁醇含量达到9.15g/L，ABE含量为13.56g/L，发酵得率为0.42。丁醇占总溶剂的比例达67.48％。发酵结束后的发酵醪经抽滤使发酵醪固液分离，取滤液进行蒸馏。滤液经Buchi RotavaporR-210旋转蒸发仪在56℃，78℃，92℃下分别蒸馏得到丙酮、乙醇和丁醇。
实施例2：取6.25g浮萍粉置于100ml的厌氧瓶中加入43.75ml的蒸馏水，加热使培养基保持微沸糊化10min，冷却后补足蒸发水分，用2mol/L的硫酸调pH＝5.5，加入0.25g降粘酶，50℃150rpm水浴摇床恒温2h，用少量的氢氧化钙调pH＝7.0，充氮气除氧，121℃灭菌15min备用。冷却至室温后加入5ml左右的种子液接种，37℃左右静止发酵108h。发酵液中丁醇含量为9.61g/L，ABE含量为14.80g/L，发酵得率为0.42。丁醇占总溶剂的比例达64.93％。发酵结束后的发酵醪经抽滤使发酵醪固液分离，取滤液进行蒸馏。滤液经Buchi Rotavapor R-210旋转蒸发仪在56℃，78℃，92℃下分别蒸馏得到丙酮、乙醇和丁醇。
实施例3：取6.25g浮萍粉置于100ml的厌氧瓶中加入43.75ml的蒸馏水，加热使培养基保持微沸糊化10min，冷却后补足蒸发水分，加入0.20g降粘酶，50℃150rpm水浴摇床恒温2h，充氮气除氧，121℃灭菌20min备用。冷却至室温后加入5ml左右的种子液接种，37℃左右静止发酵72h。发酵液中丁醇含量为9.59g/L，ABE含量为14.46g/L，发酵得率为0.41。丁醇占总溶剂的比例达66.32％。发酵结束后的发酵醪经抽滤使发酵醪固液分离，取滤液进行蒸馏。滤液经Buchi Rotavapor R-210旋转蒸发仪在56℃，78℃，92℃下分别蒸馏得到丙酮、乙醇和丁醇。
Claims (4)
1.一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征是包含以下步骤：发酵培养基的制备；发酵培养基的降粘；丁醇生产微生物种子液的制备；接种和发酵;具体生产步骤为：
（1）发酵培养基的制备：浮萍烘干、粉碎后过35目筛，按质量∶质量=1∶6～1：9的比例加水后加热，100℃微沸糊化8～12min，补足蒸发水分；
（2）培养基降粘：糊化好的培养基加入降粘酶分装到厌氧瓶中，冷却后充氮气除氧，121℃灭菌15～20min备用；所述的降粘酶为木聚糖酶和果胶酶按质量比为4∶1的混合酶；
（3）丁醇生产微生物种子液的制备：玉米粒晒干，粉碎后过35目筛，将玉米粉与自来水按质量∶质量=1∶15～20的比例混合均匀，煮至微沸后继续煮1h成糊状，补足水分后分装于厌氧管中，通氮气除氧，盖好内外塞，121℃灭菌1h，冷却至室温即得新配制的种子培养基，从保存有丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）CCTCC M2010148的种子培养基中吸取孢子液，按体积：体积=1：8～1：12的比例接种到新配制的种子培养基中，沸水浴热击90s，37℃静止培养23h～25h后用做种子液；
（4）接种和发酵∶按体积∶体积=8～12%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，37℃静止发酵72h～108h。
2.根据权利要求1所述的一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征是：步骤（2）中培养基降粘的方法为：按100g醪液加入降粘酶0.1～0.4g，50℃150rpm水浴摇床恒温2h，分装到厌氧瓶中，冷却后充氮气除氧，121℃灭菌15～20min备用。
3.根据权利要求1所述的一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征是：步骤（2）中培养基降粘的方法为：糊化好的培养基用2mol/L的硫酸调节pH为5.5，按100g醪液加入降粘酶0.1～0.4g，50℃150rpm水浴摇床恒温2h，分装到厌氧瓶中，冷却后充氮气除氧，121℃灭菌15～20min备用。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法，其特征是：所述的原料为浮萍全原料。
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