EA028407B1 - Сконструированные организмы для фотобиологического продуцирования бутанола из диоксида углерода и воды - Google Patents

Abstract

Данное изобретение обеспечивает технологию биобезопасного фотобиологического продуцирования бутанола на основе сконструированных трансгенных растений, сконструированных водорослей, сконструированных сине-зеленых водорослей (цианобактерий и оксихлоробактерий) или сконструированных растительных клеток. Сконструированные фотосинтетические организмы создаются так, чтобы эндогенный механизм фотобиологической регуляции был управляемым, и восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные в результате фотосинтетического процесса, использовались для синтеза бутанола (CHCHCHCHOH) непосредственно из диоксида углерода (CO) и воды (НО). Способы продуцирования бутанола данного изобретения целиком устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз путем обхода проблемы узких мест технологии биомассы. Технология фотобиологического продуцирования бутанола данного изобретения, как ожидается, обладает более высокой эффективностью энергопревращения солнечной энергии в бутанол, чем современная технология и может также помочь защитить окружающую среду Земли от опасного накопления COв атмосфере.

Description

Данное изобретение, в общем, касается биобезопасной технологии продуцирования биотопливной энергии. А именно, данное изобретение предлагает методологию фотобиологического продуцирования бутанола, основанную на сконструированных трансгенных растениях, таких как трансгенные водоросли, сине-зеленые водоросли (цианобактерии и оксихлоробактерии), или растительных клетках, которые созданы для использования восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ (аденозинтрифосфат)), приобретенных в результате фотосинтетического процесса, для прямого синтеза бутанола (СН₃СН₂СН₂СН₂ОН) непосредственно из диоксида углерода (СО₂) и воды (Н₂О).

Предпосылки изобретения

Бутанол (СН₃СН₂СН₂СН₂ОН), четырёхуглеродный спирт, может использоваться в качестве жидкого топлива для работы двигателей, таких как автомобильные. Бутанол может заменить бензин, и запасы энергии двух топлив примерно одинаковы (110000 Вш (британская тепловая единица) на галлон для бутанола; 115000 Вт на галлон для бензина). Также бутанол имеет много превосходящих свойств по сравнению с этанолом в качестве альтернативного топлива. А именно: 1) бутанол имеет более высокий запас энергии (110000 В1и на галлон бутанола), чем этанол (84000 Вш на галлон этанола); 2) бутанол обладает в шесть раз меньшей испарительной способностью, чем этанол, и в 13,5 раз меньшей испарительной способностью, чем бензин, что делает его более безопасным для применения в качестве оксигената и, таким образом, устраняет необходимость очень нестандартных смесей в течение летних и зимних времён года; 3) бутанол можно транспортировать посредством существующей топливной инфраструктуры, включая бензотрубопроводы, в то время как этанол должен поставляться посредством железной дороги, баржи или грузовика; и 4) бутанол может использоваться как замена галлона бензина на галлон, например 100% или какой-либо другой процентной доли, тогда как этанол можно использовать только в качестве добавки к бензину до около 85% (Е-85) и, к тому же, только после значительной модификации в двигателе (в то время как бутанол может работать как 100%-ая замена топлива без необходимости модификации современного автомобильного двигателя).

Значительный потенциальный рынок бутанола в качестве жидкого топлива уже существует в современной транспортной и энергетической системах. Бутанол также используется как промышленный растворитель. В Соединенных Штатах, в настоящее время, бутанол производится, прежде всего, из нефти. Исторически (1900-1950 гг.) биобутанол производился из кукурузы и мелассы ферментационным процессом, при котором также получается ацетон и этанол, и был известен как АБЭ (ацетон, бутанол, этанол) ферментация обычно с помощью определенных бактерий, продуцирующих бутанол, таких как С1о81ййшт ассЮЬШуПсит и С1о8йтбшт Ъеуегтскл. Хотя США потеряли свои источники поставки дешевого сахара из Кубы около 1954 г., тем не менее, продуцирование бутанола путем ферментации упало, главным образом, из-за того, что цена нефти снизилась больше таковой на сахар. В последнее время, возобновляется научно-исследовательский интерес в продуцировании бутанола и/или этанола из биомассы, такой как кукурузный крахмал, используя ферментационный процесс с помощью С1о8йтФа и/или дрожжей. Однако, аналогично ситуации продуцирования этанола из кукурузного крахмала, способ продуцирования бутанола из кукурузного крахмала также нуждается в ряде энергопотребляющих этапов, включая сельскохозяйственное культивирование кукурузной культуры, уборку кукурузного зерна, обработку крахмала из кукурузного зерна и ферментацию крахмал-сахар-бутанол. На процесс продуцирования бутанола из кукурузного крахмала возможно, также может затрачиваться приблизительно столько же много энергии, сколько составляет энергетическая ценность его продукта бутанола. Это очевидно и не удивительно, так как кукурузный крахмал, который может использовать современная технология, представляет собой только небольшую часть биомассы кукурузной культуры, которая включает кукурузные стебли, листья и корни. Кукурузная солома, как правило, утилизируется в сельскохозяйственных полях, где она медленно разлагается назад до СО2, так как она представляет собой в основном лигноцеллюлозные материалы биомассы, которые современная биоперерабатывающая промышленность не может эффективно использовать для продуцирования этанола или бутанола. Проводятся научноисследовательские работы в попытке получить этанол или бутанол из лигноцеллюлозных растительных материалов биомассы - замысел, называемый целлюлозный этанол или целлюлозный бутанол. Однако растительная биомасса развила эффективные механизмы сопротивления нападениям на ее структурные сахара клеточной стенки из микробного и животного царств. Это свойство лежит в основе естественной неподатливости, создавая преграды для экономичной трансформации лигноцеллюлозной биомассы в ферментируемые сахара. Поэтому, одна из таких проблем, известная как лигноцеллюлозная неподатливость, представляет собой труднопреодолимую техническую преграду экономичной трансформации растительной биомассы в ферментируемые сахара. То есть, из-за проблемы неподатливости лигноцеллюлозные биомассы (такие как кормовая кукуруза, просо и материалы древесных растений) не могут быть полностью превращены в ферментируемые сахара для продуцирования этанола или бутанола без

- 1 028407 определенной предварительной обработки, которую обычно связывают высокими издержками технологического процесса. Вопреки более чем 50-летним научно-исследовательским попыткам по предварительной обработке лигноцеллюлозной биомассы и технологического процесса продуцирования ферментативного бутанола, проблема не поддающихся обработке лигноцеллюлоз по-прежнему остается труднопреодолимым техническим препятствием, которое еще до сих пор не устранено. Кроме того, все этапы культивирования лигноцеллюлозной биомассы, сбора, технологического процесса предварительной обработки и ферментации целлюлоза-сахар-бутанол расходуют энергию. Следовательно, любая новая технология, которая сможет обойти эти проблемы узких мест технологии биомассы, может быть пригодной.

Оксифотобактерии (также известные как сине-зеленые водоросли, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) и водоросли (такие как СЫашубошопаз гетйагФи, РЫушопаз зиЪсогбйогшхз, СЫогейа Гизеа, Эипайейа зайиа, ЛпЫзЦойезшиз Ъгаиии и Зсеиебезшиз оЪйцииз), которые могут выполнять фотосинтетическое усвоение СО₂ с выделением О₂ из воды в жидкой культуральной среде с более чем 10% максимальным теоретическим превращением солнечной энергии в биомассу, имеют огромный потенциал, чтобы быть чистым и возобновляемым энергетическим ресурсом. Однако, кислородные фотосинтетические зеленые растения дикого типа, такие как сине-зеленые водоросли и эукариотические водоросли, не обладают способностью продуцировать бутанол непосредственно из СО₂ и Н₂О. Фотосинтез дикого типа использует восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ) фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, через систему тилакоидных мембран водорослей для восстановления СО₂ в углеводороды (СН₂О)_П, такие как крахмал, с помощью ряда ферментов в совокупности называемых цикл Кальвина в стромальной области в хлоропласте водоросли или зеленого растения. Общий результат фотосинтетического процесса дикого типа - это превращение СО₂ и Н₂О в углеводороды (СН₂О)_П и О₂, используя энергию солнечного света, согласно следующей реакции процесса:

пСО₂ + пН₂О (СН₂О)п + ηθ₂ [ 1 ]

Углеводороды (СН₂О)_П, кроме того, затем превращаются во все виды усложненных клеточных (биомассных) материалов, включая белки, липиды и целлюлозу, и другие материалы клеточных стенок в процессе клеточного метаболизма и роста.

У определенной водоросли, такой как СЫашубошоиаз ге1пйагй1и, некоторые из органических запасов, таких как крахмал, могут быть медленно метаболизированы в этанол (но не в бутанол) посредством вторичного ферментативного метаболического пути. Водорослевый ферментативный метаболический путь подобен дрожжевому процессу брожения, при котором крахмал расщепляется на более мелкие сахара, такие как глюкоза, которые, в свою очередь, трансформируются в пируват посредством процесса гликолиза. Пируват можно затем превратить в формиат, ацетат и этанол посредством дополнительных метаболических этапов (С1е11ег апб СЛЪз (1984) РегшеЫайуе ше1аЪоЙ8ш о£ СЫашубошопаз гетйагЫи, Р1ап1 РЬузю1. 75:212-218). Эффективность этого вторичного метаболического процесса довольно ограничена, возможно, из-за того, что он может использовать только малую часть ограниченного органического запаса, такого как крахмал в водорослевой клетке. Кроме того, естественный водорослевый вторичный метаболический процесс вовсе не может продуцировать бутанол. Как указывалось выше, бутанол имеет много превосходных физических свойств, чтобы служить заменой бензину в качестве топлива. Поэтому необходим новый фотобиологический механизм продуцирования бутанола с высокий энергетическим КПД превращения солнечной энергии в бутанол.

Данное изобретение обеспечивает принципиально новые сконструированные фотосинтетические организмы, которые способны непосредственно синтезировать бутанол из СО2 и Н2О, используя солнечный свет.

Фотобиологическая продуцирующая бутанол система, обеспеченная данным изобретением, может обойти все упомянутые выше проблемы узких мест технологии биомассы.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы фотобиологического продуцирования бутанола, основанные на сконструированных трансгенных растениях (таких как водоросли и оксифотобактерии) или растительных клетках. Сконструированные фотосинтетические организмы созданы посредством генной инженерии так, чтобы эндогенные механизмы регуляции фотосинтеза были управляемы, а восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные в результате фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, использовались для синтеза бутанола (СН₃СН₂СН₂СН₂ОН) непосредственно из диоксида углерода (СО₂) и воды (Н2О). Фотобиологические способы продуцирования бутанола по данному изобретению целиком устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз путем того, что обходят проблему узких мест технологии биомасс. Технология фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению, как предполагается, имеет намного более высокую эффективность энергопревращения солнечной энергии в бутанол, чем современная технология.

Основным признаком настоящей методологии фотосинтетического продуцирования бутанола является создание сконструированных растений (таких как водоросли) или растительных клеток, которые содержат трансгены, кодирующие набор ферментов, которые могут воздействовать на промежуточный

- 2 028407 продукт цикла Кальвина и превращать промежуточный продукт непосредственно в бутанол, вместо того, чтобы создавать крахмал и другие сложные материалы биомассы. Соответственно, данное изобретение обеспечивает, среди прочего, способы продуцирования бутанола на основе сконструированного растения или растительных клеток, ДНК-конструкты, кодирующие гены сконструированного пути продуцирования бутанола, а также созданные сконструированные растения и сконструированные растительные клетки.

В одном аспекте данное изобретение обеспечивает способ фотосинтетического продуцирования бутанола, при котором выращивают сконструированное растение (такое как сконструированная водоросль или сконструированная сине-зеленая водоросль) или растительные клетки в жидкой культуральной среде, где растение или растительные клетки создаются посредством генной инженерии для экспрессии набора ферментов, которые воздействуют на промежуточный продукт цикла Кальвина и превращают промежуточный продукт в бутанол.

В соответствии с данным изобретением сконструированное растение, такое как сконструированная водоросль или сконструированная растительная клетка, для использования при фотосинтетическом продуцировании бутанола, могут быть созданы с использованием в принципе любого растения, растительной ткани или растительных клеток в качестве хозяина, поскольку такое растение, растительная ткань и клетки обладают фотосинтетической способностью и могут культивироваться в жидкой среде. В предпочтительном варианте осуществления водное растение (гидрофиты) используется для создания сконструированного растения, которое включает, но не ограничивается, подводные водяные травы (такие как НубгШа усгПсШаЮ. Е1обеа беика, ЛроподсЮп ЪоМшаиик, НудгорЫ1а άίΓΙοπηιηίκ). ряски (такие как δρίгобе1а ро1уггЫ/а, \Уо1ГПа д1оЪока, ЬаибоШа риис!а1а), водный салат (Икйа 51га1ю1ек), лютики (Каиииси1ик), рогульник (Тгара иа1аик и Тгара Ысогшк), кувшинку (такую как ЫутрЬаеа 1о1ик), водяной гиацинт (Еюййогша сга551рек), морские травы (такие как Не1егаи1йега /оЧепГоПа) и водоросли.

В особенно предпочтительном варианте осуществления водоросли применяются в качестве хозяина для создания сконструированных водорослей для фотосинтетического продуцирования бутанола. Водорослями, пригодными для применения в данном изобретении, могут быть или одноклеточные, или многоклеточные водоросли (последние, включающие, но без ограничений, крупные морские водоросли, такие как И1уа 1аЙ551та (ульва), ЛксорйуНит иобокит и Рогрйуга 1еиега) и включают зеленые водоросли (СЬ1огорйу1а), красные водоросли (Кйоборйу1а), бурые водоросли (Рйаеорйу1а), диатомовые водоросли (ВасШагюрйу1а) и сине-зеленые водоросли (ОхурЬо1оЪас1епа, включая Суаиорйу1а (цианобактерии) и представителей РгосЫогорйу1а (оксихлоробактерии)). Как прокариотические сине-зеленые водоросли (оксифотобактерии), так и эукариотические водоросли являются чрезвычайно пригодными для использования в данном изобретении. Особенно предпочтительными видами водорослей для использования в данном изобретении является вид зеленых водорослей СЫатуботоиак ге1ийагб1й, геном которых был недавно секвенирован.

Выбор ферментов, подходящих для использования для создания сконструированного пути продуцирования бутанола в хозяине зависит от того, от какого промежуточного продукта цикла Кальвина сконструированный путь ответвляется из цикла Кальвина. В одном варианте осуществления данного изобретения сконструированный путь ответвляется от точки глицеральдегида-3-фосфатов и превращает их в бутанол при помощи, например, набора ферментов, включающего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируватферредоксин-оксидоредуктазу (или пируват-НАДФ⁺-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирилКоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. В этом сконструированном пути для превращения двух молекул глицеральдегид-3-фосфата в бутанол образуются две молекулы НАДН из НАД' на этапе от глицеральдегид-3-фосфата до 1,3дифосфоглицерата, катализируемом глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой; при этом две молекулы НАДН превращаются в НАД': одна на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления ацетоацетил-КоА до 3-гидроксибутирил-КоА, и другая на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления кротонил-КоА до бутирил-КоА. В результате, на этом сконструированном пути количество расходуемых молекул НАДН уравнено с количеством образованных молекул НАДН. Кроме того, как этап, катализируемый бутиральдегиддегидрогеназой при восстановлении бутирил-КоА до бутиральдегида, так и конечный этап, катализируемый бутанолдегидрогеназой при восстановлении бутиральдегида до бутанола, могут использовать НАДФН, которую можно регенерировать фотосинтетическим расщеплением воды и процессом транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Поэтому этот сконструированный путь продуцирования бутанола может функционировать непрерывно.

В другом примере сконструированный путь создают так, что он потребляет промежуточный продукт, 3-фосфоглицерат, и превращает его в бутанол посредством использования, например, набора ферментов, включающего фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируватферредоксиноксидоредуктазу, тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Для того чтобы работал путь продуцирования бутанола, ответвленный от 3-фосфоглицерата, важно использовать 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу и

- 3 028407 бутирил-КоА-дегидрогеназу, которые могут использовать НАДФН, которая может поставляться посредством фотоуправляемого процесса транспорта электронов. Альтернативно, когда используются 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа и бутирил-КоА-дегидрогеназа, которые могут использовать только НАДН, здесь предпочтительно использовать дополнительный вариант осуществления данного изобретения, который может давать механизм превращения НАДФН/НАДН для поставки НАДН путем превращения НАДФН в НАДН, чтобы способствовать фотосинтетическому продуцированию бутанола посредством сконструированного пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата.

В еще одном примере сконструированный путь создают так, что он потребляет фруктоза-1,6дифосфат и превращает его в бутанол посредством использования, например, набора ферментов, включающего альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируват-НАДФ⁺-оксидоредуктазу (или пируватферредоксин-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирилКоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Добавление еще одного дополнительного фермента в сконструированный организм, фосфофруктокиназы позволяет создание другого сконструированного пути, который ответвляется от точки фруктоза-6-фосфата, для продуцирования бутанола. Подобно пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, как путь, ответвленный от фруктоза-1,6-дифосфата, так и путь, ответвленный от фруктоза-6-фосфата, могут сами собой образовывать НАДН для использования в пути на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирилКоА-дегидрогеназой, для восстановления ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и другой на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой, для восстановления кротонил-КоА в бутирил-КоА. В каждом из этих сконструированных путей продуцирования бутанола количества расходуемых молекул НАДН уравнены с количествами образованных молекул НАДН; и как бутиральдегиддегидрогеназа (которая катализирует этап при восстановлении бутирил-КоА в бутиральдегид), так и бутанолдегидрогеназа (которая катализирует конечный этап при восстановлении бутиральдегида в бутанол) все могут использовать НАДФН, которая может быть регенерирована посредством фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Поэтому эти сконструированные пути продуцирования бутанола могут функционировать непрерывно. Можно отметить, что определенные наборы сконструированных ферментов могут разрешать два или более сконструированных пути, т.е., пути, которые ответвляются от двух или более точек цикла Кальвина для продуцирования бутанола.

В соответствии с данным изобретением нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, создаются посредством генной инженерии так, чтобы экспрессирующиеся ферменты были вставлены в хлоропласты хозяина для достижения целевой клеточной локализации. Целевое введение сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола может достигаться посредством использования нуклеотидной последовательности, которая кодирует стромальный сигнальный пептид, расположенный в функциональный связи с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сконструированный фермент. Ряд последовательностей транзитных пептидов пригоден для использования для целевого введения сконструированных ферментов продуцирования бутанола в хлоропласт, включая, но без ограничений, последовательности транзитных пептидов гидрогеназных апобелков (таких как Нуб1), апобелка ферредоксина (Ргх1), апобелка тиоредоксина т (Тгх2), апобелка глютаминсинтазы (С§2), ЬЬсП апобелков, Ρ8ΙΙ-Τ апобелка (РкЪТ), Ρ8ΙΙ-8 апобелка (ΡίΛ8), Ρ8ΙΙ-Ψ апобелка (РьЬШ). апобелка γ-субъединицы СР₀СР₁ (АТРС), апобелка δ-субъединицы СР₀СР₁ (ΑΤΡΌ), апобелка субъединицы-ΙΙ СР₀СР₁ (ΑΤΡΟ), апобелков фотосистемы Ι (Ρ8Ι) (таких как, генов ΡίΛίΩ. ΡίΛίΕ. ΡδαΡ ΡδαΟ. ΡίΛΐΗ. и ΡδαΚ) и апобелков малой субъединицы (88И) РнЪЕсо (рибулеза-1,5-бифосфаткарбоксилаза) (такой как КЪе82). Предпочтительные последовательности транзитных пептидов включают транзитный пептид Нуб1, транзитный пептид Ргх1 и транзитные пептиды 88и РнЪЕсо (такой как КЪс82).

Кроме того, в соответствии с данным изобретением экспрессия сконструированного, продуцирующего бутанол пути контролируется путем использования индуцибельного извне промотора так, что сконструированные трансгены индуцибельно экспрессируются при определенных специфических условиях. В одном варианте осуществления индуцибельный промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов, является промотором, который индуцируется анаэробиозом, включая, например, промоторы гена гидрогеназы (Нуб1), гена Сус6, кодирующего апобелок цитохрома С₆, и гена Срх1, кодирующего копрогеноксидазу. Дополнительные индуцибельные промоторы, пригодные для применения в данном изобретении, включают промотор нитратредуктазы (Νί;·ι1), промотор белка теплового шока Η8Ρ70Α, промотор СаЪП-1, промотор Са1, промотор Са2, промоторы гена нитритредуктазы (шгА), промоторы гена 1юх двухсторонней гидрогеназы, свето- и теплочувствительные дгоЕ промоторы, промоторы гЪсЬ оперона РиЪЕсо, металл (цинк)-индуцибельный 51Ш промотор, железочувствительный ίάίΑ промотор, редокс-чувствительный сгНР промотор, промотор гена теплового шока Ь§р16.6, промотор малого белка теплового шока (Нкр), чувствительные к СО₂ промоторы гена карбоангидразы, чувствительный к зеленому/красному свету срсВ2А2 промотор, чувствительные к УФ-свету (ультрафиолетовый свет) ΙοχΑ, π^Α и гиуВ промоторы, промоторы гена нитратредуктазы (пагВ) и их сочетания.

- 4 028407

В другом аспекте данного изобретения предлагаются сконструированные ДНК-конструкты, которые содержат одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих один или более сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола, каждый из которых расположен в функциональный связи с индуцибельным промотором и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей соответствующий, нацеленный на хлоропласт транзитный пептид. Конструкты могут содержать дополнительные соответствующие последовательности, такие как маркерный ген, для селекции, чтобы способствовать скринингу и идентификации трансформантов. Нуклеиновокислотные конструкты, несущие сконструированные гены, могут доставляться в водоросль-хозяина, растительный организм или растительную ткань или клетки при помощи доступных техник генной трансформации, таких как электропорация, естественная трансформация, конъюгация, ПЭГ-индуцированное поглощение и баллистическая доставка ДНК, и опосредованная АдтоЪаСегшт трансформация.

Сконструированные растения (например, сконструированные водоросли), растительные ткани и растительные клетки, которые были созданы для содержания одного или более сконструированного конструкта, образуют другой вариант осуществления данного изобретения. В дальнейшем аспекте данное изобретение обеспечивает дополнительные способы усиленного фотосинтетического продуцирования бутанола, относящиеся к нему сконструированные конструкты и сконструированные растения, растительные ткани и клетки.

В определенном варианте осуществления данного изобретения фотосинтетическое, продуцирующее бутанол сконструированное растение (например, сконструированная водоросль), растительная ткань или клетка(клетки), описанные выше, дополнительно модифицированы для содержания дополнительных сконструированных трансгенов для индуцибельной экспрессии одного или более ферментов, чтобы способствовать НАДФН/НАДН превращению, таких как НАД+-зависимая глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназа, НАДФН-фосфатаза и НАД-киназа. Альтернативно, 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу сконструированного растения, растительной ткани или клетки(клеток) можно выбрать и модифицировать так, что они также смогут использовать НАДФН.

В другом варианте осуществления данного изобретения фотосинтетические, продуцирующие бутанол сконструированное растение или растительная ткань или клетка(клетки) дополнительно модифицированы для инактивации активности синтеза крахмала. В определенном варианте осуществления данного изобретения такая дополнительная модификация включает ввод сконструированного ДНК-конструкта, который кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, например, крахмалсинтазу, глюкоза1-фосфатаденилилтрансферазу, глюкозофосфатизомеразу и/или фосфоглюкомутазу для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола.

В еще одном другом варианте осуществления сконструированные, продуцирующие бутанол растение или растительные ткань или клетка(клетки) для фотосинтетического продуцирования бутанола дополнительно модифицированы для содержания дополнительного набора сконструированных генов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в строме. Такие дополнительные сконструированные гены включают, например, гены, кодирующие амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу и глюкозофосфатизомеразу.

В другом варианте осуществления фотобиологический путь(пути) продуцирования бутанола распределяется частично как в хлоропласте, так и цитоплазме. Распределение сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола между хлоропластом и цитоплазмой контролируется использованием и/или удалением последовательностей транзитных пептидов в сконструированных ДНК-конструктах.

В еще одном другом варианте осуществления фотобиологический путь(пути) продуцирования бутанола распределяется полностью в цитоплазме, как в случае сконструированных оксифотобактерий (сине-зеленых водорослей), включая сконструированные цианобактерии и сконструированные оксихлоробактерии.

Данное изобретение также обеспечивает биобезопасную технологию фотобиологического продуцирования биотоплива на основе сконструированных, с контролируемым клеточным делением трансгенных растений, водорослей, сине-зеленых водорослей (цианобактерий и оксихлоробактерий) или растительных клеток. Сконструированные фотосинтетические организмы с контролируемым клеточным делением содержат две ключевые функции: сконструированный механизм(ы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива.

Сконструированное свойство(свойства) биологической безопасности придается с помощью ряда механизмов, включающих: (1) индуцибельную вставку сконструированных протонных каналов в цитоплазматическую мембрану для полной блокировки какого-либо клеточного деления и/или способности к скрещиванию, (2) избирательное использование сконструированного регуляторного белка цикла клеточного деления или интерференционной РНК (иРНК) для постоянного ингибирования цикла клеточного деления и, предпочтительно удерживания клетки в С₁ фазе или Со состоянии, и (3) инновационное использование фотосинтетического организма-хозяина, нуждающегося в высоком содержании СО₂, для экспрессии сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива. Технология управления деле- 5 028407 нием сконструированной клетки может помочь обеспечить биологическую безопасность при применении сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования биотоплива.

Данное изобретение, кроме того, обеспечивает способ применения сконструированного фотосинтетического организма (такого как сконструированная цианобактерия или водоросль) в сочетании с фотобиологической реакторной системой и процессом сепарации/сбора бутанола для фотобиологического продуцирования бутанола и О₂ непосредственно из СО₂ и Н₂О с помощью солнечного света. Как промышленные источники СО₂, так и/или атмосферный СО₂ из окружающей среды можно использовать в способе фотобиологического продуцирования бутанола.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 показывает сконструированные пути продуцирования бутанола, ответвленные от цикла Кальвина с применением восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ) из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, для восстановления диоксида углерода (СО₂) в бутанол СН₃СН₂СН₂СН₂ОН посредством серий ферментативных реакций.

Фиг. 2А показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутанола.

Фиг. 2В показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена превращения НАДФН/НАДН для взаимопревращения НАДФН/НАДН.

Фиг. 2С показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена иРНК-ингибитора(ингибиторов) синтеза крахмала/гликогена.

Фиг. 20 показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) гликолитического распада крахмала.

Фиг. 2Е показывает ДНК-конструкт для сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутанола для цитозольной экспрессии.

Фиг. 2Р показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутанола с двумя сайтами рекомбинации для интегративной генетической трансформации у оксифотобактерий.

Фиг. 20 показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) контроля биологической безопасности.

Фиг. 2Н показывает ДНК-конструкт сконструированного гена(генов) протонного канала.

Фиг. ЗА иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением, который содержит две ключевые функции: сконструированный механизм(механизмы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива.

Фиг. ЗВ иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением для фотобиологического продуцирования бутанола (СН3СН2СН2СН2ОН) из диоксида углерода (СО2) и воды (Н₂О) с сконструированным механизмом(механизмами) биологической безопасности.

Фиг. ЗС иллюстрирует сконструированный организм с контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотобиологического продуцирования других биотоплив, таких как этанол (СН₃СН₂ОН), из диоксида углерода (СО2) и воды (Н2О).

Детальное описание изобретения

Данное изобретение направлено на технологию фотобиологического продуцирования бутанола на основе сконструированных фотосинтетических организмов, таких как сконструированные трансгенные растения (например, водоросли и оксифотобактерии) или растительные клетки. Сконструированные растения и растительные клетки создаются с помощью техник генной инженерии так, чтобы контролировался эндогенный механизм регуляции фотосинтеза, а восстановительная способность (НАДФН) и энергия (АТФ), приобретенные из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, могли использоваться для прямого синтеза бутанола (СН₃СН₂СН₂СН₂ОН) непосредственно из диоксида углерода (СО₂) и воды (Н₂О) в соответствии со следующей реакцией процесса:

Способы фотобиологического продуцирования бутанола по данному изобретению полностью устраняют проблему неподатливых лигноцеллюлоз посредством того, что обходят проблему узких мест технологии биомассы. Как показано на фиг. 1, фотосинтетический процесс в сконструированном организме эффективно использует восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ) из фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом, для прямого синтеза бутанола (СН₃СН₂СН₂СН₂ОН) непосредственно из диоксида углерода (СО₂) и воды (Н₂О) без оттягивания в другой путь для синтеза нежелательных лигноцеллюлозных материалов, которые являются очень твердыми и обычно не эффективны для использования в биоперерабатывающей промышленности. Этот подход также отличается от существующего способа продуцирования бутанола из кукурузного крахмала. В соответствии с данным изобретением бутанол может получаться непосредственно из диоксида углерода (СО₂) и воды (Н₂О) без необходимости проходить через многие энергопотребляющие этапы, через которые должен проходить способ продуцирования бутанола из кукурузного

- 6 028407 крахмала, включая культивирование кукурузной культуры, сбор кукурузного зерна, технологический процесс кукурузное зерно-крахмал и ферментацию крахмал-сахар-бутанол. В результате технология фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению, как ожидается, обладает более (более чем в 10 раз) высокой эффективностью энергопревращения солнечной энергии в бутанол, чем современная технология. Предполагая 10%-ную эффективность превращения солнечной энергии для предлагаемого способа фотосинтетического продуцирования бутанола, максимальная теоретическая продуктивность (выход) может быть около 72700 кг бутанола на акр в год, которую могут поддерживать около 70 машин (в год на акр). Поэтому, данное изобретение может дать значительную возможность обществу в том, чтобы помочь обеспечить энергетическую безопасность. Данное изобретение может также помочь защитить окружающую среду Земли от опасного накопления СО₂ в атмосфере, так как данные способы превращают СО₂ непосредственно в чистую энергию бутанола.

Основным признаком данной методологии является использование растения (например, водоросли или оксифотобактерии) или растительных клеток, введение в растение или растительные клетки молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих набор ферментов, которые могут воздействовать на промежуточный продукт цикла Кальвина и превращать промежуточный продукт в бутанол, как иллюстрируется на фиг. 1, вместо того, чтобы создавать крахмал и другие сложные материалы клетки (биомассы) как конечные продукты посредством пути фотосинтеза дикого типа. Соответственно, данное изобретение обеспечивает, среди прочего, способы продуцирования бутанола на основе сконструированного растения (такого как сконструированная водоросль и сконструированная оксифотобактерия), сконструированной растительной ткани или сконструированных растительных клеток, ДНК-конструктов, кодирующих гены сконструированного пути продуцирования бутанола, а также созданные сконструированные водоросли, сконструированные оксифотобактерии (включая сконструированные цианобактерии), сконструированные растения, сконструированные растительные ткани и сконструированные растительные клетки. Различные аспекты данного изобретения дополнительно детально описаны ниже.

Фотосинтетические организмы-хозяева

В соответствии с данным изобретением сконструированный организм или клетка для фотосинтетического продуцирования бутанола по данному изобретению могут быть созданы с использованием в качестве хозяина любого растения (включая водоросль и оксифотобактерию), растительной ткани или растительных клеток, которые обладают фотосинтетической способностью, т.е., активным фотосинтетическим аппаратом и ферментативным путем, который захватывает энергию света посредством фотосинтеза, используя эту энергию для превращения неорганических веществ в органический материал. Предпочтительно организм-хозяин должен обладать достаточной фотосинтетической скоростью фиксации СО2, например, для обеспечения фотосинтетического продуцирования бутанола из СО₂ и Н₂О, по меньшей мере, около 1450 кг бутанола на акр в год, более предпочтительно 7270 кг бутанола на акр в год или даже более предпочтительно 72700 кг бутанола на акр в год.

В предпочтительном варианте осуществления водное растение используется для создания сконструированного растения. Водные растения, также называемые гидрофитные растения, являются растениями, которые живут в или на водной среде, такой как в воде (включая на или под водной поверхностью) или нефти, постоянно насыщенной газом. Как используется в данном документе, водные растения включают, например, водоросли, сине-зеленые водоросли (цианобактерии и оксихлоробактерии), погруженные водные травы (НуйгШа νβπίβίΐΐαΐα, ΕΙοάβα άβηχα, ЕИрригЕ νηΙχαιΈ, Аропо§еЮп Βοίνίηίαηηχ Аропо§еЮп Κΐ§ΐάΐ/οΙΐη8, Αροηοξβίοη Ьогрррктпйозиз, ΟΐάΐρΙΕ 1)ίαηάκα, Уе.Уси1апа 1)иЬуапа,

ЕТу§горкШа АщрлУроИа, МюгаШкетит итЪгозит, Еюккогта Агигеа, 8аигигю>

Сегпиих, СгурЮсогупе ипдиа, Нукготске ΗοίίοηΐΐβοΓα ЕиУгаИз ΞίβΙΙαία,

УаИЕпегш Кикга, Ну§горкИа 8αΙΕί/οΙία, Суре пи Не1/еп, СгурЮсогупе РеЮки,

Уа11Епепа атепсапа, УаИЕпепа Топа, Нукготске ΗοίίοηΐΐβοΓα, Сгаххи1а Некпзи, итпоркИа 8еяяШ$ога, Ροίαηιοξβίοη Рег/оИаВи, ΚοΐαΙα \УаШски,

СгурЮсогупе ВескеЮ, Вкуха АиЪеПи, Ну^горкИа ПрогттЕ), ряски (ΞρΕοάβΙα роЕггкЕа, \Уо101а §1око$а, Еетпа юЕи1са, Еетпа §гкка, Еетпа ттог, ΕαηάοΙΐία рипсЮка), водный салат (ΡΕΐία УгакоЮк), лютики (Ватте и ки), рогульник (Тгара ηαίαηα и Тгара ЫсогпаЕ), кувшинку (Уутркаеа 1оВв, НутрНаеасеае и Ме1итЬопасеае), водяной гиацинт (Еюккогта сгахмреУ), Во1ЪкЕ кеисМокк Сакотка 8р., морские травы (ЕТюегаШкега Ζο.Πβη/'οΙία, РозЫотасеае, 7оз1егасеае, Нуйгосйагйасеае и Сутойосеасеае).

- 7 028407

Бутанол, продуцированный из водного растения, может диффундировать в воду, давая возможность нормальному росту растений и более активному продуцированию бутанола из растений. Жидкие тканевые культуры водных растений (включая, но без ограничений, многоклеточные водоросли) или клетки (включая, но без ограничений, одноклеточные водоросли) также высоко предпочтительны для применения, так как молекулы бутанола, продуцированные из сконструированного пути продуцирования бутанола, могут легко диффундировать из клеток или тканей в жидкую водную среду, которая может служить в качестве большого пула для хранения продукта бутанола, который затем можно собрать посредством техник фильтрации и/или дистилляции/выпаривания.

Хотя водные растения или клетки являются предпочтительными организмами-хозяевами для применения в способах по данному изобретению, ткань и клетки неводных растений, которые являются фотосинтетическими и могут культивироваться в жидкой культуральной среде, могут также применяться для создания сконструированной ткани или клеток для фотосинтетического продуцирования бутанола. Например, следующие ткань или клетки неводных растений также можно выбрать для применения в качестве организма-хозяина в данном изобретении: фотоавтотрофная культура ткани побега лимона персидского Регоша Ишоша, хлорофильная каллюсная культура растения кукурузы /еа тауз, культуры корней, способные к фотосинтезу, видов Аз1егасеае и 8о1апасеае, тканевая культура паренхимы стебля сахарного тростника, тканевая культура бриофита РНузсотйгеПа ра!епз, суспензионные культуры фотосинтетических клеток растения сои (С1усше тах), фотоавтотрофная и фотомиксотрофная культура зеленых табачных (Мсойапа 1аЬасит Б.) клеток, клеточные суспензионные культуры СнзеИа рНатасео1Йез (С₄растение), фотосинтетические суспензионно культивированные клеточные линии АтагаШНнз ро\уе11н \БаК, СаПи'а 1пиох1а ΜΪ11., Соззуршт ЫгзиШт Б., и гибрид, образованный путем слияния Мсойапа 1аЬасит х Мсойапа §1ийпоза Б.

Под жидкой средой понимается жидкая вода плюс относительно небольшие количества неорганических питательных веществ (например, Ν, Р, К и так далее, как правило в их солевых формах) для фотоавтотрофных культур; и иногда также включающая определенные органические субстраты (например, сахарозу, глюкозу или ацетат) для фотомиксотрофных и/или фотогетеротрофных культур.

В особо предпочтительном варианте осуществления растение, используемое в способе продуцирования бутанола по данному изобретению, является водорослью или сине-зеленой водорослью. Использование водорослей и/или сине-зеленых водорослей имеет несколько преимуществ. Их можно вырастить в открытом пруду в больших количествах и при низких затратах. Сбор и ректификация бутанола из водной фазы также легко достигается посредством дистилляции/испарения или мембранной сепарации.

Водоросли, пригодные для использования в данном изобретении, включают как одноклеточные водоросли, так и многоклеточные формы одноклеточных водорослей. Многоклеточные водоросли, которые можно выбрать для использования в данном изобретении, включают, но без ограничений, крупные морские водоросли, такие как ϋίνα Ιαίύύιηα (ульва), АзсоркуИит ηοά08ит,

СоЛит /гацИе, Бисис Ув81си1о8и8, Бисквита АепксикИит, СгасИапа §гасИБ,

Нукгоскауоп гекси1а!ит, Баттапа уаротса, ϋηάαήα ρίηηΐίβάα, 8асскагта ΐαροηίεα, Рогркуга уе/оетБ и Рогркуга 1епега.

Пригодные водоросли могут быть также выбраны из следующих отделов водорослей: зеленые водоросли (СН1огорНу1а), красные водоросли (КНоборНу1а), бурые водоросли (РНаеорНу1а), диатомовые водоросли (ВасШапорНуЩ) и сине-зеленые водоросли (Охур1го1оЬас1епа, включая Суапор1гу1а и представителей РгосН1огорНу1а). Пригодные порядки зеленых водорослей включают Б1та1ез, Б1о1пс1га1ез, Уо1уоса1ез, СН1оге11а1ез, >с1п/одоМа1ез, Оебодо№а1ез, /удпета1а1ез, С1аборНога1ез, МрНопа1ез и [)азус1ас1а1ез. Пригодными родами К1гос1ор1гу1а являются РогрНуга, СНопбгнз, СуапкйозсНу/оп, РогрНупйнип, СгасИапа, КаррарНусиз, СеЫнпн и Адагс11пе11а. Пригодными родами РНаеорНу1а являются Ратпгапа, БЫапа, Масгосузйз, Загдаззит и [БсКомрНоп. Пригодные роды СуапорНу1а (также известного как СуапоЬаДепа) включают (но без ограничений) РНопбшт, ЗупесНосузйз, ЗупсесНососсиз, ОзсП1а1опа и АпаЬаепа. Пригодные роды представителей РгосН1огорНу1а (также известные как оксихлоробактерии) включают (но без ограничений) РгосЫогоп, РгосЫогоЫлх и РгосЫогососсиз. Пригодными родами ВасП1апор1гу1а являются Сус1о1е11а, СуПЫгоЙгеса, Ы\чси1а, ТЬа1аззюзиа и Р1гаеос1ас1у1ит. Предпочтительные виды водорослей для использования в данном изобретении включают

- 8 028407

СкБатуйотопаз геткагЛИ,

Р1аУутопа8 5аксогЛ/огт15, СЫогеИа β/8οα, СЫогеИа 8огоккНапа, СЫогеИа \'Ыуап8, 'СЫогеИа' βΙΗρ8θίάβα, СЫогеИа 8рр., ОипаПеИа заНпа, 1)шгаПеИа νίπΝ, кЫпаПеИа ЬагИо+И, НаетаЮсоссиз ρΠινίαΙίϊ; РагасЫогеИа кеэЫеп, ВеШркусиз §е1аНпит, СкопИгиз сп8ри8, СуаЫЛо8скугоп тего1ае, СуаЫЛит саЫагшт,

ΟαΙάίβήα зЫркигапа, СеНЛеИа асегоза, СгасНапа с капу Н, Карраркуси8 αΙναΓβζίί,

Рогркуга ητίηίαία, Омгеососсиз ΐαιΐΓΪ, Рогркуга γβζοβη8Ϊ8, РогркугЫклт 8р.,

Ракпапа ραΠηαία, С гас На г ία 8рр., 18оскгу818 уаИэапа, Карр арку с η 8 8рр., Ьаттапа /ароЫса, Иаттапа 8рр., Могишгота 8рр., КаппосЫогор818 осикРа, Рогркуга 8рр., РогркугЫклт 8рр., ϋηάαήα ρίηηαΐίβάα, ϋίνα 1асШса, ϋίνα 8рр., ϋηάαήα 8рр., РкаеоИасТуЫт ТпсогтРит, Νανίαιία 8аргоркПа, СгурБкесоИтшт сокпи, СуНпИгоПгеса βΐ8Ϊ/οπηί8, Сус1о1еИа сгурИса, Еиу1епа §гасШ8, АтрЫскЫит 8р., ВутЫоИтшт тгсгоаИпаксит, Масгосу8118 руп/ега, Апк181гоИе8ти8 ЪгаипН и 8сепеИе8ти8 оЪНдиил.

Предпочтительные виды сине-зеленых водорослей (оксифотобактерии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) для использования в данном изобретении включают

Ткегто8упескососси8 еНтуаШ ВР-1, Ккшос 8р. РСС 7120, 8упескососси8 е1опуаШ8 РСС 6301, 8упсескососси$ 8р. штамм РСС 7942, 8упсескососси8 8р. штамм РСС 7002, 8упсескосу8Н8 8р. штамм РСС 6803, РгосЫогососси8 тагти8 ΜΕΌ4, Ргоск1огососси8 тагти8 ΜΙΤ 9313, РгосЫогососсиз тагтиз ЫАТЫА, РгосЫогососси8 88120, 8ρΐηιΙΐηα р1а1еп818 (Апкго8р1га р1а1еп818), 8ρίηάίηα ραείβεα, ЪупуЪуа тарпсЫе, Апакаепа 8р., 8упескосу8й8 8р., 8упескососсиз е1опуа1е8, 8упескососсиз (МС-А), ТпскоИе8тшт 8р., КЫкеНа Нигасе11и1ап8, 8упескососси8 \УН7803, 8упескососси8 \УН8102,

АкШос рипсН/огте, 8упсескососси8 8р. штамм РСС 7943, дефицитный по фикоцианину мутант ΡΙ21 ЗупескосуЛх РСС 6714, СуапоБкесе штамм 51142, СуапоПгесе 8р. ССУ0110, Ο8θί11αΐοήα Ито8а, ИупуЬуа та/и8си1а, 8утр1оса ти8согит, СИоеоЪасУег νίοΙαεβιΐ8, РгосЫогоп άίάβηιηί, РгосЫогоНтх коИапЛса, 8упескососси8 (МС-А), ТпскоИе8тшт 8р., КЫкеНа т1гасе11и1ап8, РгосЫогососси8 тагти8, РгосЫогососсиз 88120, 8упескососси$ АУН8102, ЬупуЪуа тарл8си1а,

8утр1оса ти8согит, 8упескососси8 ЫугапикРи8, криофильную СНсШаЮпа 8р., РкотИЛит 8р., А/Шос 8р.-I, СаНркпх рапеНпа, термофильный 8упескососси8 ЫугапЫаРсу 8упескососси8 Ιίνίάιω, термофильный Ма8Н§ос1аЛл8 1агЫпо8и8, СЫого§1оеор818 /гП8скП РСС 6912, 8упескососси8 уи1сапи8, 8упескососси8 8р.

штамм МА4, 8упескососси8 8р. штамм МА19 и Ткегто8упескососси8 е1оп§аЛ8.

Также существенным является подходящий выбор фотосинтетических организмов-хозяев по их генетическим фонам и определенным отдельным признакам. Например, фотосинтетическая продуцирующая бутанол сконструированная водоросль, созданная из криофильных водорослей (психрофилы), которые могут расти в снегу и льде, и/или из хладотолерантных штаммов хозяина, таких как холодовой штамм ССМО1619 СЫатуботопаз, который был охарактеризован, как способный выполнять фотосинтетическое расщепление воды с температурой до 4°С (Ьее, В1апкшзЫр апС ОгеепЬаит (1995), Тетрега1иге еП'ес! оп ргобисйоп о£ Еубгодеп апС охудеп Ьу СЫатуботопаз со1С з!гат ССМР1619 апС ^ίΐά 1уре 137с, АррНеС. ВюсЕет1з1гу апС Вю1есЬпо1оду 51/52:379-386), дает возможность фотобиологического продуцирования бутанола даже в холодные времена года и в холодных регионах, таких как Канада. При

- 9 028407 этом сконструированная водоросль, созданная из термофильного/теплотолерантного фотосинтетического организма, такого как термофильные водоросли Суатбшт са1бапит и СаИюпа ыбрПигапа и/или термофильные цианобактерии (сине-зеленые водоросли), такие как ТЬегтокуиесЬососсик е1опда1п5 ВР-1 и §уиесЬососси8 Ыдгапи1а1и8, может позволить хорошо расширить осуществление на практике данного изобретения в теплые времена года или в зонах, таких как Мексика и Юго-Западный регион Соединенных Штатов, включая Неваду, Калифорнию, Аризону, Нью-Мехико и Техас, где погода часто может быть жаркой. Кроме того, сконструированная водоросль для фотосинтетического продуцирования бутанола, созданная из морской водоросли, такой как Р1а1утопа5 щЬсогбйогтП. позволит осуществлять на практике данное изобретение, используя морскую воду, в то время как сконструированная водоросль, созданная из пресноводной водоросли, такой как С.’П1атуботопа5 гешПагбОк может использовать пресную воду. Дополнительные факультативные признаки фотосинтетической продуцирующей бутанол сконструированной водоросли включают преимущества уменьшенного размера хлорофильной антенны, которая, как было показано, обеспечивает более высокую фотосинтетическую продуктивность (Ьее, МеК апб СтееиЬаит (2002). 1тргоуетеп1 оГ рПоЮ куиШейс еГПаепсу а1 Ыдй Пд1и шкенкбу (ПгопдП гебисОоп оГ сШогорНуН аШеппа й/е, АррПеб ВюсПетМгу и В1о1есЬио1оду, 98-100: 37-48) и толерантность к бутанолу, что позволяет более повышенное и эффективное фотосинтетическое продуцирование бутанола из СО₂ и Н₂О. С помощью дефицитного по фикоцианину мутанта ЗупесПосуЧй РСС 6714 было экспериментально продемонстрировано, что фотоингибирование может быть также уменьшено с помощью уменьшения содержания светособирающих пигментов (ШПарта, Тки/икк апб Иеба (1999) Кебисеб рПо1о1пШЫНоп оГ а рПусосуашп-беПает тШап1 оГ ЗупесПосуЧй РСС 6714, 1оигпа1 оГ АррПеб Ркусо1оду 10: 447-452). Эти факультативные признаки могут включаться в сконструированную водоросль, например, с помощью мутанта, толерантного к бутанолу, и/или с дефицитом по хлорофильной антенне (например, СЫатуботоиаδ гетПагбШ штамм Ό8521) в качестве организма-хозяина, для генной трансформации сконструированными генами пути продуцирования бутанола. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления водоросль-хозяина выбирают из группы, включающей зеленые водоросли, красные водоросли, бурые водоросли, сине-зеленые водоросли (оксифотобактерии, включая цианобактерии и прохлорофиты), диатомовые водоросли, морские водоросли, пресноводные водоросли, одноклеточные водоросли, многоклеточные водоросли, крупные морские водоросли, хладотолерантные водорослевые штаммы, теплотолерантные водорослевые штаммы, мутантов с дефицитом по светособирающему антенному пигменту, толерантные к бутанолу водорослевые штаммы и их сочетания.

Создание сконструированного пути продуцирования бутанола у хозяина. Выбор подходящих сконструированных ферментов.

Одним из ключевых признаков в данном изобретении является создание сконструированного пути продуцирования бутанола для того, чтобы управлять и работать с естественными фотосинтетическими механизмами для достижения необходимого синтеза бутанола непосредственно из СО₂ и Н₂О. Естественные фотосинтетические механизмы включают (1) процесс фотосинтетического расщепления воды и транспорт электронов, сопряженный с протонным градиентом, через тилакоидную мембрану, который дает восстановительную способность (НАДФН) и энергию (АТФ), и (2) цикл Кальвина, который восстанавливает СО₂ посредством потребления восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ).

В соответствии с данным изобретением используется ряд ферментов для создания сконструированного продуцирующего бутанол пути, который потребляет промежуточный продукт цикла Кальвина и превращает промежуточный продукт в бутанол как иллюстрируется на фиг. 1. Сконструированный фермент пути продуцирования бутанола в данном документе определяется как фермент, который служит в качестве катализатора, по меньшей мере, для одного из этапов в сконструированном пути продуцирования бутанола. В соответствии с данным изобретением ряд промежуточных продуктов цикла Кальвина может использоваться для создания сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола; а ферменты, необходимые для сконструированного пути продуцирования бутанола, выбирают в зависимости от какого промежуточного продукта цикла Кальвина ответвляется сконструированный путь продуцирования бутанола цикла Кальвина.

В одном примере сконструированный путь создается так, чтобы он потреблял глицеральдегид-3фосфаты и превращал их в бутанол с помощью, например, набора ферментов, который включает, как показано с помощью числовых подписей 01-12 на фиг. 1, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу 01, фосфоглицераткиназу 02, фосфоглицератмутазу 03, энолазу 04, пируваткиназу 05, пируват-ферредоксиноксидоредуктазу 06, тиолазу 07, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 08, кротоназу 09, бутирил-КоАдегидрогеназу 10, бутиральдегиддегидрогеназу 11 и бутанолдегидрогеназу 12. В этом сконструированном пути, ответвленном от глицеральдегидов-3-фосфата, для превращения двух молекул глицеральдегид-3-фосфата в бутанол из НАД' образуются две молекулы НАДН на этапе от глицеральдегид-3-фосфат до 1,3-дифосфоглицерата, который катализируется глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой 01; при этом две молекулы НАДН превращаются в НАД': одна на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназой 08, при восстановлении ацетоацетил-КоА в 3- гидроксибутирил-КоА, а другая на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой 10, при восстановлении кротонил-КоА в бутирил-КоА. В результате, в этом сконструированном пути, ответвленном от глицеральдегидов-3-фосфата (01-12), коли- 10 028407 чество потребляемых молекул НАДН уравнены с количеством образованных молекул НАДН. Кроме того, как этап пути, катализируемый бутиральдегидлегидрогеназой 11 (при восстановлении бутирил-КоА до бутиральдегида), так и конечный этап, катализируемый бутанолдегидрогеназой 12 (при восстановлении бутиральдегида до бутанола), могут использовать НАДФН, который может быть образован фотосинтетическим расщеплением воды и процессом транспорта электронов, сопряженным с протонным градиентом. Следовательно, этот сконструированный путь продуцирования бутанола, ответвленный от глицеральдегидов-3-фосфата, может функционировать непрерывно.

В другом примере сконструированный путь создают так, чтобы он потреблял промежуточный продукт, 3-фосфоглицерат, и превращал его в бутанол с помощью, например, набора ферментов, который включает (как показано с помощью числовых подписей 03-12 на фиг. 1) фосфоглицератмутазу 03, энолазу 04, пируваткиназу 05, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу 06, тиолазу 07, 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназу 08, кротоназу 09, бутирил-КоА-дегидрогеназу 10, бутиральдегиддегидрогеназу 11 и бутанолдегидрогеназу 12. Следует отметить, что последние десять ферментов (03-12) сконструированного пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфатов, (01-12) являются идентичными с теми, которые используются в сконструированном пути, ответвленном от 3-фосфоглицерата (03-12). Другими словами, сконструированные ферменты (01-12) пути, ответвленного от глицеральдегид3-фосфатов, позволяют получать бутанол как из точки 3-фосфоглицерата, так и из точки глицеральдегид3-фосфатов в цикле Кальвина. Эти два пути, однако имеют разные характеристики. В отличие от пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, путь, ответвленный от 3фосфоглицерата, который состоит из активностей только десяти ферментов (03-12), не может самостоятельно образовывать сколько-либо НАДН, который необходим для использования в двух местах: один на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой 08, при восстановлении ацетоацетилКоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и другой на этапе, катализируемом бутирил-КоА-дегидрогеназой 10, при восстановлении кротонил-КоА в бутирил-КоА. То есть, если (или когда) используется 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа и/или бутирил-КоА-дегидрогеназа, которая может использовать строго только НАДН, но не НАДФН, для функционирования пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата, (03-12) будет необходима поставка НАДН. Следовательно, для того, чтобы функционировал путь продуцирования бутанола, ответвленный от 3-фосфоглицерата, важно использовать 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназу 08 и бутирил-КоА-дегидрогеназу 10, которые могут использовать НАДФН, которая может поставляться посредством фотоуправляемого процесса транспорта электронов.

Поэтому предпочтительной практикой является использование 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназы и бутирил-КоА-дегидрогеназы, которые могут использовать НАДФН или и НАДФН, и НАДН (т.е., НАД(Ф)Н) для этого сконструированного пути продуцирования бутанола, ответвленного от 3-фосфоглицерата (03-12 на фиг. 1). Альтернативно, когда используются 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназа и бутирил-КоА-дегидрогеназа, которые могут использовать только НАДН, здесь предпочтительно использовать дополнительный вариант осуществления изобретения, который может предоставить механизм превращения НАДФН/НАДН (для поставки НАДН посредством превращения НАДФН в НАДН, более детально смотри далее в тексте) в сконструированном организме, чтобы способствовать фотосинтетическому продуцированию бутанола посредством сконструированного пути, ответвленного от 3-фосфоглицерата.

В еще одном другом примере сконструированный путь создают так, чтобы он потреблял фруктоза1,6-дифосфат и превращал его в бутанол с помощью, как показано с помощью числовых подписей 20-33 на фиг. 1, набора ферментов, который включает альдолазу 20, триозофосфатизомеразу 21, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу 22, фосфоглицераткиназу 23, фосфоглицератмутазу 24, энолазу 25, пируваткиназу 26, пируват-НАДФ⁺-оксидоредуктазу (или пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу) 27, тиолазу 28, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу 29, кротоназу 30, бутирил-КоА-дегидрогеназу 31, бутиральдегиддегидрогеназу 32 и бутанолдегидрогеназу 33, при этом альдолаза 20 и триозофосфатизомераза 21 являются единственными двумя дополнительными ферментами, относящимися к сконструированному пути, ответвленному от глицеральдегид-3-фосфатов. Использование пируват-НАДФ⁺-оксидоредуктазы 27 (вместо пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы) при катализе превращения молекулы пирувата в ацетилКоА делает возможным продуцирование НАДФН, который может использоваться в некоторых других этапах пути продуцирования бутанола. Добавление еще одного фермента в сконструированный организм, фосфофруктокиназы 19, позволяет создать другой сконструированный путь, который ответвляется от точки фруктоза-6-фосфата цикла Кальвина, для продуцирования бутанола. Наподобие пути продуцирования бутанола, ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата, как путь, ответвленный от фруктоза-1,6дифосфата (20-33), так и путь, ответвленный от фруктоза-6-фосфата, (19-33) могут сами образовывать НАДН для использования в пути на этапе, катализируемом 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназой 29, для восстановления ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА, и на этапе, катализируемом бутирилКоА-дегидрогеназой 31, для восстановления кротонил-КоА в бутирил-КоА. В каждом из этих сконструированных путей продуцирования бутанола количества расходуемых молекул НАДН уравновешены с количествами образованных молекул НАДН; и как бутиральдегиддегидрогеназа 32 (катализирующая этап при восстановлении бутирил-КоА в бутиральдегид), так и бутанолдегидрогеназа 33 (катализирую- 11 028407 щая конечный этап при восстановлении бутиральдегида в бутанол) все могут использовать НАДФН, который может регенерироваться посредством фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом. Следовательно, эти сконструированные пути продуцирования бутанола могут функционировать непрерывно.

Табл. 1 перечисляет примеры ферментов, включающие те, которые указаны выше, для построения сконструированных путей продуцирования бутанола. В этом описании, когда речь идет о ферменте, таком как, например, любой из ферментов, перечисленных в табл. 1, он включает их изозимы, функциональные аналоги и сконструированные модифицированные ферменты, и их сочетания. Эти ферменты можно выбрать для использования при построении сконструированных путей продуцирования бутанола (таких как проиллюстрированные на фиг. 1). Изозимы или функциональные аналоги относятся к определенным ферментам, которые имеют тождественную каталитическую функцию, но могут обладать или не обладать совершенно тождественными белковыми структурами. Наиболее важным признаком фермента является его активный центр, который катализирует ферментативную реакцию. Поэтому определенный фрагмент(фрагменты) или субъединица(субъединицы) ферментного белка, который содержит такой активный каталитический центр, могут также быть выбраны для использования в данном изобретении. По различным причинам некоторые из естественных ферментов содержат не только важную каталитическую структуру, но также другие структурные компоненты, которые могут быть или не быть необходимыми для данного применения. Посредством техник молекулярного конструирования с помощью биоинформатики возможно выбрать важную каталитическую структуру (структуры) для использования при построении сконструированного ДНК-конструкта, кодирующего необходимый сконструированный фермент. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления сконструированный ген фермента создают посредством искусственного синтеза ДНК-конструкта согласно молекулярному конструированию последовательности с помощью биоинформатики. С помощью подхода синтетической биологии при помощи компьютера любую последовательность ДНК (и таким образом структура ее белка) сконструированного фермента можно избирательно модифицировать для достижения более желаемых результатов посредством конструирования. Поэтому, выражения сконструированные модифицированные последовательности и сконструированные модифицированные ферменты в данном документе определяются как последовательности ДНК и ферментные белки, которые модифицированы посредством молекулярного конструирования с помощью биоинформатики. Например, когда ДНК-конструкт для сконструированного хлоропласт-нацеленного фермента сконструирован из последовательности митохондриального фермента, предпочтительной практикой является модифицирование некоторых белковых структур посредством, например, избирательного вырезания определенного структурного компонента(компонентов), такого как его последовательность митохондриальных транзитных пептидов, которая является непригодной для данного использования, и/или путем добавления определенных пептидных структур, таких как экзогенная последовательность хлоропластного транзитного пептида (например, 135-по (пар оснований) транзитный пептид малой субъединицы КиЫкео (КЬе82)), которая необходима для предоставления способности сконструированного белка у хлоропласт-нацеленой вставки. Следовательно, один из различных вариантов осуществления гибко применяет ферменты, их изозимы, функциональные аналоги, сконструированные модифицированные ферменты, и/или их сочетания при построении сконструированного пути (путей) продуцирования бутанола.

Как показано в табл. 1, многие гены ферментов, указанных выше, были клонированы и/или секвенированы из различных организмов. Данные последовательностей как геномной ДНК, так и/или мРНК могут быть использованы при конструировании и синтезе сконструированных ДНК-конструктов для трансформации хозяйской водоросли, оксифотобактерии, растения, растительной ткани или клеток для создания сконструированного организма для фотобиологического продуцирования бутанола (фиг. 1). Однако из-за возможных вариаций, часто связанных с различными организмами-источниками и клеточными компартментами по отношению к отдельному организму-хозяину и его хлоропласт/тилакоидному окружению, где для работы с циклом Кальвина сконструирован(ы) путь(пути) продуцирования бутанола, для правильной работы сконструированного ДНК-конструкта при конструировании ДНК-конструкта (фиг. 2) часто необходима определенная работа из области техники молекулярной инженерии, включая оптимизацию использования кодона и модификацию последовательности. Например, при создании продуцирующей бутанол сконструированной эукариотической водоросли, в случае, если исходные последовательности происходят из цитозольных ферментов (последовательностей), функциональная хлоропластнацеливающая последовательность может быть присоединена для обеспечения способности сконструированного фермента, который кодируется внеядерным геном, вставляться в хозяйский хлоропласт для предоставления ему функции сконструированного пути продуцирования бутанола. Кроме того, для обеспечения способности переключаться на сконструированный путь продуцирования бутанола также важно включить функциональную последовательность индуцибельного промотора, например, промотора гидрогеназы (НуД1) или гена нитратредуктазы (Νία1)„ или гена нитритредуктазы (ηίτΑ) в определенном сконструированном ДНК-конструкте(конструктах), как проиллюстрировано на фиг. 2А, для контроля экспрессии сконструированного гена(генов). Кроме того, как указывалось ранее, определенные функциональные производные или фрагменты этих ферментов (последовательностей), последовательностей

- 12 028407 хлоропласт-нацеливающих транзитных пептидов и последовательностей индуцибельных промоторов можно также выбрать для использования полностью, частично или в их сочетаниях для создания сконструированных организмов согласно различным вариантам осуществления данного изобретения. Методы при создании и использовании сконструированных организмов дополнительно описаны далее в данном документе.

Табл. 1 перечисляет примеры ферментов для построения сконструированных путей продуцирования бутанола.

Фермент	Источник (организм)	Регистрационный номер ОепВапк, идентификатор белка (рго(еш ГО) по ΙΟΙ (Ιοίηΐ Оепоте 1п8(йи1е) или ссылка на него
Бутанолдегидрогеназа	С1о\1пскит 8асскагорегкиТу1асе1отсит; РгорютЪас1егшт /геидепгеТскИ; Тпскотопа/ να§ΐηα16>; Аеготопаз кудгоркИа; С1о$1гиИит ЪеуегтскИ; С1о$1гиИит асе1окМуксит	ОепВапк: АВ257439; ΑΙ508920; АР112135; АР388671; АР157307; М96946, М96945
Бутиральдегиддегидро -геназа	С1оМгкНит 8асскагорегкиТу1асе1отсит	ОепВапк: ΑΥ251646

Бутирил-КоА- дегидрогеназа	С1оМгкНит кеуегтски; Вмутйкпо βι6ή8θ1νβη8; продуцирующая бутират бактерия 132-50; Ткегтоапаегокас1егшт 1кегто8асскаго1уксит;	ОепВапк: АР494018; АВ 190764; ϋ(2987697; Ζ92974
Кротоназа	СкшпЛит кецегтски; Втутдкпо βι6ή8θ1νβη8; продуцирующая бутират бактерия 132-50; Ткегтоапаегокас1егшт 1кегто8асскаго1у11сит;	ОепВапк: АР494018; АВ 190764; ϋ(2987697; Ζ92974
3 -гидроксибутирил- СоА-дегидрогеназа	С1о$1гиИит кеуеппскИ; Вмутйкпо βι6ή8θ1νβη8; А]е11отусе8 сарэикииэ; Аярег§И1ия /итгуаШз; АзрегуШиз скпаШэ; Νβοζαηοτγα β^βή; продуцирующая бутират бактерия 132-50; АгаЫЛорыя 1 какапа; Тке гтоапае гокас1епит 1кегто8асскаго1у11сит;	ОепВапк: АР494018; АВ 190764; ХМ_001537366; ХМ_741533; ХМ_001274776; ХМ.001262361; ϋ(2987697; ВТ001208; Ζ92974
Тиолаза	Ви1уп\ккпо βί?ΓΪ$οΙνβη$; продуцирующая бутират бактерия 132-50; Ткегтоапаегокас1егшт 1кегто8асскаго1уксит;	ОепВапк: АВ 190764; ϋ(2987697; Ζ92974

- 13 028407

Глицеральдегид-З-	Мезозкута νίήάβ цитозоль;	СепВапк; 00873404;
фосфатдегидрогеназа	ТгМсит аезкуит цитозоль;	ЕР592180; Б27668;
	С1т1атуе1отопа8 геткаММ	ХМ_001549497;
	хлоропласт; ВоРуокта /искеИапа;	ГО1324; М18802;
	8асскаготусез сегехТпае;	Еи078558;
	Еутотопаз тоЫНз; Кагета Ъгеугз;	ХМ_001539393;
	А] еИоту се 8 сарзикМлз; РММа	ХМ_0013 86423,
	зПрМз; РММа уММегтопИН;	ХМ_001386568;
	КПлууеготусез тагхгапиз, ТгМсит	ХМ_001485596;
	аезП\>ит; АгаЪМорзгз ΜαΙΐαηα; Ζβα	00681075; ЕР592180;
	тауз цитозольная	ΝΜ_101214; Ш5857, ΖΜ1445856, ЕГ45855
Фософоглицераткиназа	СММтуИотопаз геигкагИМ	СепВапк; 1Л4912,
	хлоропласт; РМзтоИшт νίναχ;	АР244144;
	Вакезга коугз; ВоРуоПта	ХМ_001614707;
	/искеИапа; МопосегсотопоМез 8р.;	ХМ_001610679;
	ЬосМеготусез ектугзрогиз; РММа	ХМ_001548271;
	уММегтопИН; АгаМИорзгз	00665858;
	ΜαΙΐαηα; НеНапМиз аппииз; Огусд	ХМ_001523 843;
	8αΐίνα; О1с1уоз1е1шт сИзсоМеит;	ХМ_001484377;
	ЕиуМпа угасШз; СкопИгиз спзриз;	ΝΜ_179576;
	РкаеоИасТу1ит ИчсотМит;	00835564; ЕР122488;
	8о1апит мкегозит	АРЗ16577; ΑΥ647236; ΑΥ029776; АР108452; АР073473
Фосфоглицератмутаза	СМатуИотопаз геткагИМ	ГС1 СН1ге2 рго1ет Ю
(фосфоглицеромутаза)	цитоплазма; АзрегуШиз /итгуаМз;	161689, СепВапк;
	СоссНкоММз кптМз; ЬегзктаМа	АР268078;
	кгагШепзгз; А]е11отусез сарзиМмз;	ХМ_747847;
	МопосегсотопогИез зр.; АзрегуШиз	ХМ_749597;
	сШхаРлз; АгаЬМорзгз ΜαΙΐαηα; Ζβα	ХМ_001248115;
	тауз	ХМ_001569263; ХМ_001539892 00665859; ХМ_001270940 ΝΜ_117020; М80912
Энолаза	СМатуИотопаз геткагИМ	СепВапк; Х66412,
	цитоплазма; АгаЫИорзгз Макапа;	Р31683; АК222035;
	Ьегзктата МехМапа;	00221745;
	ЬоИИеготусез еМпугзрогиз;	ХМ_001528071;
	Вакезга ко\кз; 8с1егоНта	ХМ_001611873;
	зс1егойогит; РММа §иИИеппопсШ;	ХМ_001594215;
	8р1го1пскопутрка Ιβίάγί; Огусд	ХМ_001483612;
	8αΐίνα; Тптазкх руп/огтлз;	АВ221057; ЕР122486,
	ЕеисопозМс тезеШегоНМз;	1409450; 00845796;
	ΌανϊάίβΙΙα Шззгапа; АзрегуШиз	АВ088633; 1482438;
	огусде; ЗсМгозасскаготусез	064113; Ш3799;
	ротке; ВгаззМа париз; Ζβα тауз	ΑΥ307449; 1Л7973

- 14 028407

Пируваткиназа	СЫатуйотопаз гекгкагЛи цитоплазма; АгаЪЫорЛя ЛаНапа; 8асскаготусез сеге/Ыае; ВакеЛа Ηονί$; 8с1егоНЫа 8с1егойогит; Тпскотопаз ναρίηαΙΑ; РгсЫа §иИИеппопЛг; РгсЫа зкрШз; ЬоННеготусез ектрухроггля; СоссгЛогНез гттМз; ТптаЛх руп/огтр; С1усте тах (соя)	КЛ СЫгеЗ ρΐΌΐείη Ш 138105; СепВапк; АК229638; ΑΥ949876, ΑΥ949890, ΑΥ949888; ХМ_001612087; ХМ_001594710; ХМ_001329865; ХМ_001487289; ХМ_001384591; ХМ_001528210; ХМ_001240868; ОЦ845797; 1Ό8632
Фосфофруктокиназа	СЫатуНотопаз геткагЛН; АгаЪЫорыз ЛаНапа; АуеИотусез сарзглкгПгз; УаггоуАа Нро1уПса; РгсЫа зПрШз; ОкРуозгеПит ЛзсоЫеит; Те1гакутепа ЛегторкИа; Тгурапозота Ъгисег; РЫзтоЛггт /акграгит; Ξρίηαοία о1егасеа;	КЛ СЬ1ге2 ρΐΌΐείη Ш 159495; СепВапк; ΝΜ_001037043, ΝΜ_179694, ΝΜ_119066, ΝΜ_125551; ХМ_001537193; ΑΥ142710;ΧΜ_00138 2359, ΧΜ_001383014; ΧΜ_639070; ХМ_001017610; ХМ_838827; ХМ_001347929; ϋζ)437575;

- 15 028407

Фруктозодифосфат-	СЫатуйотопаз геткагЫИ	СепВапк; Х69969;
альдолаза	хлоропласт; Егауапа х апапазза	АР308587;
	цитоплазма; Ното заргепз;	ΝΜ_005165;
	Ваке зга ЬоНз; Тпскотопаз	ХМ_001609195;
	/аукгаИз; РгсЫа зкрМз;	ХМ_001312327,
	АгаЫсЫрзгз ЫаИапа	ХМ_001312338; ХМ_001387466; ΝΜ_120057, ΝΜ_001036644
Триозофосфатизомераз	АгакЫорзгз гкакапа;	СепВапк;
а	Ск1атус1отопаз геткагскИ;	ΝΜ_127687,
	8с1егокЫа зс1егопогит; Ск1оге11а	АР247559;
	ругегюЫоза; РгсЫа §Ы1ИегтопИИ;	ΑΥ742323;
	Еи§1епа кИегтеска; Еи§1епа Ιοηρα;	ХМ.001587391;
	8ртасга о1егасеа; 8о1апит	АВ240149;
	скасоепзе; НогЫеит уи1§аге; Огу-.а	ХМ_001485684;
	$αΐίνα	ϋζ)459379; ΑΥ742325; Ь36387; ΑΥ438596; 1183414; ЕР575877;
Г люкозо-1 -фосфат	АгакЫорзгз гкакапа; Ζβα тауз;	СепВапк;
аденилилтрансфераза	СЫатусИа Паскотакз; 8о1апит	ΝΜ_127730,
	Шкегозит (картофель); 8Ы§е11а	ΝΜ_124205,
	ββχηβή; Еусорегзгсоп езсгЫепШт	ΝΜ_121927, ΑΥ059862; ЕР694839, ЕР694838; АР087165; Р55242; ΝΡ_709206; Τ07674

- 16 028407

Крахмалсинтаза	СкМтусктопаз геткагМи; Рка8во1из хчкуапз; Οηζ,α 8αίϊνα; АгаЫ4орз13 Макета; Со1осазга езсМеМа; АтагаМкиз сгиеМиз; Рагаск1оге11а кеззкг'ц ТгМсит аезкхипп; 8ог§кит Ысо1ог; Аз1га§а1из теткгапасеиз; РегШа /пиезсепз; Ζβα тауз; 1ротоеа Βαΐαΐα8	СепВапк: АР026422, ΑΡ026421,ϋ<2019314, АР433156; АВ293998; 016202, АВ115917, ΑΥ299404; АР121673, АК226881; ΝΜ_101044; ΑΥ225862, ΑΥ142712; ϋ(078Ο26; АВ232549; Υ16340; АР168786; АР097922; АР210699; АР019297; АР068834
Альфа-амилаза	Ноге/еит ткуаге клетки алейронового слоя; Тпскотопаз να§ίηαΙΪ8; Ркапегоскае1е скгузозрогшт; СЫатукотопаз геткагМи; АгаЬМорзчз Макапа; Окауо§1отиз МегторкИит ген теплостойкой амилазы;	СепВапк; 104202; ХМ_001319100; ЕР143986; ΑΥ324649; ΝΜ_129551; Х07896
Бета-амилаза	АгаЫкорзгз ίίιαίίαηα; Ногкеит, хМуаге; Миза аситта1а	СепВапк: ΝΜ 113297; 021349;
0(066026
Крахмалфосфорилаза	Скгиз кукпе! сиМ+аг корень; 8о1апит мкегозит хлоропласт; АгаЫ4орз13 Макапа; ТгМсит авзкуит; Ιροιηοβα Ьа1а1аз	СепЬапк: ΑΥ098895; Р53535; ΝΜ_113857, ΝΜ_114564; АР275551; М64362

Фосфоглюкомутаза	()гу-,а 8αΐίνα пластида; А]еИотусез сарзи1а1из; РкМа зкрМз; Ьоййеготусез ектурзрогиз; Азрег§Миз /итуаШз; АгакМорз13 Макапа; Рориклз ЮтеШоза; Οτγζα 8αΐίνα; Ζβα тауз	СепВапк: АС 105932, АР455812; ХМ_001536436; ХМ.001383281; ХМ_001527445; ХМ_749345; ΝΜ_124561, ΝΜ_180508, ΑΥ128901; ΑΥ479974; АР455812; 1489342, и89341
Г люкозофосфат(глюко зо-6-фосфат)- изомераза	СЫатукотопаз геткагкМ; 8асскаготусез сегеНкае; РкМга зкрМз; А]е11отусез сарзикРиз; 8ρϊηαβία о1егасеа цитозоль; Οτγζα 8αΐίνα цитоплазма; АгаЪМорзгз Макапа; Ζβα тауз	1СП СЫгеЗ рго1ет ГО 135202; СепВапк: М21696; ХМ_001385873; ХМ_001537043; Т09154; Р42862; ΝΜ023638, ΝΜ_118595; 1Л7225

- 17 028407

Гексокиназа (глюкокиназа)	А] еИоту се у сарзикИиз; РгсЫа яйркЕ; РгсЫа ап§и$1а; Ткеггпозуггескососсиз е1оп§а1ез; Ваке.ка коур; 8о1апит скасоепзе; Огу-.а /αΐίνα; АгакЫорыз 1каНапа	ОепВапк: ХМ_001541513; ХМ_001386652, ΑΥ278027; ХМ_ОО1386О35; Ν0_004113; ХМ_001608698; ϋζ)177440; ϋζ)116383; ΝΜ_112895
НАДФ(Н)-фосфатаза	Мекгапососсиз /аппазскИ	Тке Аоигпа1 О/ ΒίοΙο§ίοαΙ СкепйМгу 280 (47): 39200-39207 (2005)
НАД-киназа	Ваке.ка ко\Ы; Тпскотопаз уа§Ыак$	ОепВапк: ХМ_001609395; ХМ_001324239
Пируват-НАДФ+- оксиредуктаза	Регапета Шскоркогит; Еи§1епа §гасИР	ОепВапк: ЕЕ114757; АВ021127, А1278425
Пируват-ферредоксин- оксидоредуктаза	Ма.Ыуатоека какипиМ; ОенЫ/оугкгю а/псагигу; Ешатоека Ышо1укса; Тггскотопаз \>аута1А; Сг'урЮуропкЫт рагуит; СгурЮзропкигт кайеуг; СкаксНа 1аткИа; Ешатоека Ышо1укса; ЕГукго§епокас1ег кгегторкИиз; СЫШгшкит раПеиггапит;	ОепВапк: ΑΥ101767; Υ09702; 1130149; ХМ_001582310, ХМ_001313670, ХМ_001321286, ХМ_001307087, ХМ_001311860, ХМ_001314776, ХМ_001307250; ЕЕ030517; ЕЕ030516; ХМ_764947; ХМ_651927; АВ042412; Υ17727

Нацеливание сконструированных ферментов на стромальную область хлоропластов

Некоторые из сконструированных ферментов, обсуждаемых выше, таких как, пируватферредоксин-оксидоредуктаза, тиолаза, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа, кротоназа, бутирилКоА-дегидрогеназа, бутиральдегиддегидрогеназа и бутанолдегидрогеназа, как известно, функционируют в определенных особых бактериях, таких как С1о§1пбшш; но растительные хлоропласты дикого типа, в общем, не обладают этими ферментами для функционирования с циклом Кальвина. Поэтому, в одном из различных вариантов осуществления при создании продуцирующего бутанол сконструированного эукариотического организма, сконструированные нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, экспрессируются в хлоропласте(хлоропластах) клетки-хозяина. Этого можно достичь посредством доставки сконструированного гена(генов) пути продуцирования бутанола в геном хлоропласта эукариотической клетки-хозяина, как правило, с помощью генной пушки. В определенной степени молекулярная генетика хлоропластов подобна таковой цианобактерий. После доставки в хлоропласт сконструированный ДНКконструкт, который содержит пару подходящих сайтов рекомбинации, как иллюстрируется на фиг. 2Р, может включаться в хлоропластный геном посредством естественного процесса двойной рекомбинации гомологичных ДНК.

В другом варианте осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, создаются посредством генной инженерии таким образом, чтобы экспрессированные ферменты вставлялись в хлоропласты для функционирования там с циклом Кальвина. В зависимости от генетического фона конкретного организма-хозяина, некоторые из сконструированных ферментов, обсуждаемых выше, такие как фосфоглицератмутаза и энолаза, могут существовать при некоторых фоновых

- 18 028407 уровнях в их природной форме в хлоропласте дикого типа. Однако по различным причинам, включая обычно недостаток их контролируемости, некоторые фоновые ферменты хлоропласта могут быть или не быть достаточными, чтобы служить в качестве значительной части сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Кроме того, ряд пригодных индуцибельных промоторов, как оказалось, функционируют в ядерном геноме. Например, и промотор гидрогеназы (Нуй1), и промотор нитратредуктазы (№а1), которые могут использоваться для контроля экспрессии сконструированных путей продуцирования бутанола, расположены в ядерном геноме СЫатуйотопаз ге1пЬагйШ, геном которой недавно был секвенирован. Поэтому, в одном из различных вариантов осуществления данного изобретения предпочтительно использовать сконструированные гены, которые могут кодироваться ядерным геномом, для предоставления переключаемого пути продуцирования бутанола. В результате нуклеиновые кислоты, кодирующие эти ферменты, также необходимо создать генной инженерией посредством соответствующей модификации последовательности так, чтобы ферменты контролируемо экспрессировались и вставлялись в хлоропласты для создания сконструированного пути продуцирования бутанола.

Согласно одному из различных вариантов осуществления лучше всего экспрессировать сконструированные ферменты продуцирующего бутанол пути только в хлоропластах (в стромальной области), как раз именно где необходимо действие ферментов для обеспечения возможности фотосинтетического продуцирования бутанола. Если экспрессировать без механизма вставки, нацеленной на хлоропласт, ферменты будут просто оставаться в цитозоле и не будут способны непосредственно взаимодействовать с циклом Кальвина для продуцирования бутанола. Поэтому, кроме очевидных отличительных признаков при конструировании и связанных подходах, другим значительным отличием является то, что один из различных вариантов осуществления инновационно задействует нацеленный на хлоропласт механизм для генетической вставки многочисленных сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола в хлоропласт для непосредственного взаимодействия с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования бутанола.

С помощью нацеленного на строму хлоропласта механизма клетки будут в состоянии не только продуцировать бутанол, но также расти и регенерировать сами себя, когда они возвращаются в определенные условия, при которых выключается сконструированный путь, например, при аэробных условиях, в случае, когда используются сконструированные гены пути продуцирования бутанола, контролируемые промотором гидрогеназы. Сконструированные водоросли, растения или растительные клетки, которые содержат нормальные митохондрии, должны быть в состоянии использовать восстановительную способность (НАДН) из органических запасов (и/или некоторого экзогенного органического субстрата, такого как ацетат или сахар) для снабжения энергией клеток сразу после возвращения в аэробные условия. В результате, когда сконструированные водоросли, растения или растительные клетки возвращаются в аэробные условия после использования в анаэробных условиях для фотосинтетического продуцирования бутанола, клетки прекратят образование ферментов продуцирующего бутанол пути и начнут восстанавливать нормальную фотоавтотрофную способность посредством синтеза новых и функциональных хлоропластов. Поэтому возможно использовать такие созданные посредством генной инженерией сконструированные водорослевые/растительные организмы для повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста при нормальных аэробных условиях и эффективного продуцирования бутанола непосредственно из СО₂ и Н₂О при определенных специфических сконструированных условиях для продуцирования бутанола, например, при анаэробных условиях и/или в присутствии нитрата, когда используется путь продуцирования бутанола, контролируемый промотором Νίη1.

Нацеленная вставка сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола может достигаться посредством использования ДНК-последовательности, которая кодирует стромальный сигнальный пептид. Сигнальный (транзитный) пептид белка стромы направляет транспорт и вставку вновь синтезированного белка в строму. В соответствии с одним из различных вариантов осуществления специфическая нацеливающая ДНК-последовательность предпочтительно расположена между промотором и последовательностью сконструированного фермента пути продуцирования бутанола, как показано в сконструированном ДНК-конструкте (фиг. 2А). Эта нацеливающая последовательность кодирует сигнальный (транзитный) пептид, который синтезируется в качестве части апобелка фермента в цитозоле. Транзитный пептид руководит вставкой апобелка сконструированного фермента пути продуцирования бутанола из цитозоля в хлоропласт. После того, как апобелок вставляется в хлоропласт, транзитный пептид отщепляется от апобелка, который затем становится активным ферментом.

Ряд последовательностей транзитных пептидов пригодны для использования для нацеленной вставки сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола в хлоропласт, включая, но без ограничений, последовательности транзитных пептидов: гидрогеназных апобелков (таких как НуйА1 (Нуй1) и НуйА2, регистрационный номер ОепВапк А1308413, АЕ289201, ΑΥ090770), апобелка ферредоксина (Ртх1, регистрационные номера Ь10349, Р07839), апобелка тиоредоксина т (Тгх2, Х62335), апобелка глютаминсинтазы (О§2, Ц42689), ЬксП апобелков (АВ051210, АВ051208, АВ051205), Р8П-Т апобелка (РкЪТ), ΡδΙΙ-δ апобелка (Р§Ъ8), Ρ8ΙΙ-Ψ апобелка (РзЪ^), апобелка γ-субъединицы СР₀СР₁ (А1рС). апобелка δ-субъединицы СР₀СР₁ (А1рЭ. И41442), апобелка субъединицы-ΙΙ СР₀СР₁ (А1рО), апобелков фотосис- 19 028407 темы I (ΡδΙ) (таких как генов РкаЭ, РкаЕ, РкаР, РкаО, РкаН, и РкаК), апобелков §§И КиЫксо (таких как КЬс82, Х04472). В этом описании, когда речь идет о последовательности транзитного пептида, такой как, например, любой из последовательности транзитного пептида, описанной выше, она включает их функциональные аналоги, модифицированные сконструированные последовательности и их сочетания. Функциональный аналог или модифицированная сконструированная последовательность в этом контексте относится к пептидной последовательности, полученной или модифицированной (посредством, например, консервативной замены, средней делеции или удаления аминокислоты, или модификации боковых цепочек аминокислот) на основе нативной последовательности транзитного пептида, такой как те, которые указаны выше, которая имеет такую же функцию как нативная последовательность транзитного пептида, т.е., выполнение нацеленной вставки необходимого фермента.

В определенных отдельных вариантах осуществления следующие последовательности транзитных пептидов используются для того, чтобы направлять вставку сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола в стромальную область хлоропласта: транзитный пептид НуД1 (имеющий аминокислотную последовательность: ткаМкрса аукидкксг агс.|уаргар1 аак!утуа1а Псарагг1д пуасаа (5>ЕО ГО N0: 54)), транзитные пептиды КЬс82 (имеющие аминокислотную последовательность: таа\ааккку каауатратк кугртаа1кр аукааруаар ас.]апс| (5>Е0 ГО N0: 55)), транзитный пептид ферредоксина (имеющий аминокислотную последовательность: тататгк (8Е0 ГО N0: 56)), транзитный пептид δ-субъединицы СР₀СР₁ (имеющий аминокислотную последовательность: пйаакДадр гаГкакауга аркадггНу ута (5>Е0 ГО N0: 57)), их аналоги, функциональные производные, сконструированные последовательности и их сочетания.

Применение генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированного продуцирующего бутанол пути

Другим ключевым признаком данного изобретения является применение генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированного продуцирующего бутанол пути(путей), как проиллюстрировано на фиг. 1. Эта переключающая способность достигается посредством использования извне индуцибельного промотора так, что сконструированные трансгены индуцибельно экспрессируются при определенных специфических индуцирующих условиях. Предпочтительно, промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов в хозяине, происходит от собственно хозяина или близкородственного организма. Активности и индуцибельность промотора в клетке-хозяине может проверяться посредством размещения промотора перед геном-репортером, введения этого конструктарепортера в ткань или клетки хозяина любой известной техникой доставки ДНК и оценки экспрессии гена-репортера.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения индуцибельный промотор, применяемый для контроля экспрессии сконструированных генов, является промотором, который индуцируется анаэробиозом, т.е., активным при анаэробных условиях, но неактивным при аэробных условиях. Сконструированный водорослевый/растительный организм может осуществлять автотрофный фотосинтез, используя С0₂ как источник углерода при аэробных условиях, а когда культура сконструированных организмов выращена и готова для фотосинтетического продуцирования бутанола, будут применены анаэробные условия для включения промотора и сконструированных генов, которые кодируют сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола.

Ряд промоторов, которые становятся активными при анаэробных условиях, пригодны для использования в данном изобретении. Например, промоторы генов гидрогеназ СЫатуДотопак геДЫагДШ (НуДА1 (НуД1) и НуДА2, регистрационный номер ОепВапк: АТ308413, АР289201, ΑΥ090770), которые активны при анаэробных условиях, но неактивны при аэробных условиях, могут использоваться в качестве эффективного генетического переключателя для контроля экспрессии сконструированных генов в водоросли-хозяине, такой как СЫатуДотопак геДЫагДШ. Фактически, клетки СЫатуДотопак содержат несколько ядерных генов, которые координационно индуцируются при анаэробных условиях. Они включают собственно структурный ген гидрогеназы (НуД1), ген Сус6, кодирующий апобелок цитохрома С₆, и ген Срх1, кодирующий копрогеноксидазу. Регуляторные участки для последних двух были хорошо охарактеризованы, а участок приблизительно из 100 по оказывается достаточным для предоставления регуляции посредством анаэробиоза у синтетических генных конструктов Юшпп, Ваггасо, Епскккоп апД МегсНаШ (2000). СоогДДкЦе соррег- апД охудеп-текропктуе Сус6 апД Срх1 ехртеккюп ш СЫатуДотопак 1к теД|а1еД Ьу (Не кате е1етеШ. ί Вю1 СНет 275: 6080-6089). Хотя вышеупомянутые индуцибельные водорослевые промоторы могут быть пригодны для использования в других растениях-хозяевах, особенно в растениях близкородственных к водорослям, промоторы гомологичных генов из этих других растений, включая высшие растения, можно получить и задействовать для контроля экспрессии сконструированных генов в этих растениях.

В другом варианте осуществления индуцибельный промотор, используемый в данном изобретении, является промотором водорослевой нитратредуктазы (№а1), который индуцируется ростом в среде, содержащей нитрат, и подавляется в среде с дефицитом по нитрату, но содержащей аммоний (Ьоррек апД КаДоих (2002) Тио кНоП гедюпк оГ 1Не ргото1ег аге еккепДа1 Гог асДуаДоп апД тертеккюп оГ 1Не п11га1е геДис1аке депе ш СЫатуДотопак гешЬагДЫ Мо1 Оепе1 Оепотюк 268: 42-48). Поэтому промотор №а1 (регистрационный номер гена АР203033) можно выбрать для использования, чтобы контролировать экс- 20 028407 прессию сконструированных генов в водоросли согласно концентрационным уровням нитрата и аммония в культуральной среде. Дополнительные индуцибельные промоторы, которые также можно выбрать для использования в данном изобретении, включают, например, промотор белка теплового шока ^Ρ70Α (регистрационный номер: ΌΡ059999, ΑΥ456093, М98823; 8сЬгоба, В1оскег, Веек (2000) ТЬе ^Ρ70Α ргото1ег а8 а Юо1 Гог 1Ье ипргоуеб ехрге88юп оГ 1гап8депе8 ίη СЬ1атуботопа8. ΡΕηιΙ Иигпа1 21:121-131), промотор гена СаЪП-1 (регистрационный номер М24072), промотор гена Са1 (регистрационный номер Р20507) и промотор гена Са2 (регистрационный номер Р24258).

В случае сине-зеленых водорослей (оксифотобактерий, включая цианобактерии и оксихлоробактерии), есть также ряд индуцибельных промоторов, которые можно выбрать для использования в данном изобретении. Например, промоторы генов Ьох анаэробно-чувствительной двухсторонней гидрогеназы №Лос 8р. Ρί'.’ί'.’ 7120 (ОепВапк: ΒΑ000019), Ρ^осЬ1о^оΗ^^x Ьо11апб1са (ОепВапк: И88400; промотор ЬохυΥΗ оперона), 8упесЬосу8Й8 8р. штамм Ρί'.’ί'.’ 6803 (СуапоВа8е: 8111220 и 8111223), 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρί'.’ί'.’ 6301 (СуапоВа8е: 8ус1235_с), Α^ιЬ^08р^^а р1а1еп818 (ОепВапк: ΑΒС26906), СуапоНесе 8р. СС'ЛО 110 (ОепВапк: ΖΡ_01727419) и 8упесЬососси8 8р. ΡΟΈ 7002 (ОепВапк: ΑΑΝ03566), которые активны при анаэробных условиях, но неактивны при аэробных условиях (8]оЬо1т, ОЬуета, апб ЬшбЫаб (2007) Тгап8спрРоп апб геди1абоп оГ Не ЫбиесРопа1 Ьубгодепа8е ш Не СуапоЪаНегшт №8Юс 8р. 81га1п Ρ^ 7120, Αрр1^еб апб Епупоптейа1 МюгоЪю1оду, 73(17): 5435-5446), могут использоваться как эффективный генетический переключатель для контроля экспрессии сконструированных генов в оксифотобактериихозяине, такой как №8Юс 8р. Ρ^ 7120, 8упесЬосу8Й8 8р. штамм Ρ^ 6803, 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρ^ 6301, СуапоНесе 8р. ССЛИК), Α^Η^08р^^а р1а1еп818 или 8упесЬососси8 8р. Ρ^ 7002.

В другом варианте осуществления при создании переключаемых сконструированных организмов для продуцирования бутанола, таких как переключаемые сконструированные оксифотобактерии, индуцибельный промотор, выбранный для использования, является промотором нитритредуктазы (ΗγΑ), который индуцируется ростом в среде, содержащей нитрат, и подавляется в среде с дефицитом по нитрату, но содержащей аммоний (Οί, Нао, Ν& 81а1ег, Β;·ΐ8/ί8, \Уе188, апб Уа1епРп (2005) 'Арр^а!^ оГ Не 8упесЬососси8 πίιΑ рготоЮг ю е81аЬЬ8Ь ап шбисИ1е ехрге88юп 8у81ет Гог епдшеегшд Не 8упесЬосу8Й8 ЮсорЬего1 раНгау, Αιτι^^ό апб Епупоптейа1 МюгоЪю1оду, 71(10): 5678-5684; Маеба, КатадисЫ, ОЬе, апб Ота!а (1998) Ήι-ΑλΗ§ 8ециепсе8 гецшгеб Гог №сВ-берепбеп1, ш1п1е-ге8роп81уе ро8Нуе геди1абоп оГ Не пЬга1е а881тбабоп орегоп ш Не СуапоЪас1егшт 8упесЬососси8 8р. 81га1п Ρ^ 7942, Иита1 оГ Вас1егю1оду, 180(16):4080-4088). Поэтому последовательности промотора ΗγΑ можно выбрать для использования, чтобы контролировать экспрессию сконструированных генов у ряда оксифотобактерий, согласно концентрационным уровням нитрата и аммония в культуральной среде. Последовательности ΗγΑ промотора, которые можно выбрать и модифицированы для использования, включают (но без ограничений) ΗγΑ промоторы из следующих оксифотобактерий: 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρ^ 6301 (ОепВапк: ΑΡ008231, участок 355890-255950), 8упесЬососси8 8р. (ОепВапк: Х67680.1, Ό16303.1, Ό12723.1 и Ό00677), 8упесЬосу8Й8 8р. Ρϋϋ 6803 (ОепВапк: ΝΡ_442378, ΒΑ000022, ΑΒ001339, Ό63999-Ό64006, Ό90899-Ό90917), Α^Ъаепа 8р. (ОепВапк: Х99708.1), №81ос 8р. Ρ^ 7120 (ОепВапк: ΒΑ000019.2 и Αί319648), Ρ1есΐоηета Ъогуапит (ОепВапк: Ό31732.1), 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρ^ 7942 (ОепВапк: Ρ39661, СΡ000100.1), ТЬегто 8упесЬососси8 е1опдаН8 ΒΡ-1 (ОепВапк: ΒΑС08901, ΝΡ_682139), ΡЬо^т^б^ит 1атНо8ит (ОепВапк: СΑΑ79655, Р51879), Ма8бдос1аби8 1атНо8И8 (ОепВапк: ΑΒΌ49353, ΑΒΌ49351, ΑΒΌ49349, ΑΒΌ49347), ΑηаЪаеηа уапаЬН8 ΑΤСС 29413 (ОепВапк: ΥΡ_325032), ΡιγΗΛιό^^^ тагши8 8ίτ. МГТ 9303 (ОепВапк: ΥΡ_001018981), 8упесЬососси8 8р. \УН 8103 (ОепВапк: ΑΑΟ7122), 8упесЬососси8 8р. \УН 7805 (ОепВапк: ΖΡ_01124915) и СуапоНесе 8р. ^Υ0110 (ОепВапк: ΖΡ_01727861).

В еще одном варианте осуществления индуцибельный промотор, выбранный для использования, является свето- и теплочувствительным промотором гена шаперона дгоЕ, который может индуцироваться теплом и/или светом (Корта апб Nакатоΐо (2007) Α поуе1 ЬдЬО апб Ьеа1-ге8роп81уе геди1абоп оГ Не дгоЕ Рап8спрРоп ш Не аЪ8епсе оГ НгЛ ог СЖСЕ ш суапоЬасЮпа, РЕВ8 Ьейег8 581 : 1871-1880). Ряд промоторов дгоЕ, таких как промоторы дгоЕ8 и дгоЕЬ (шаперонов), доступны для использования в качестве индуцибельного промотора при контроле экспрессии сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола. ОгоЕ промоторные последовательности, которые можно выбрать и модифицировать для использования в одном из различных вариантов осуществления, включают (но без ограничений) промоторы дгоЕ8 и/или дгоЕЬ из следующих оксифотобактерий: 8упесЬосу8Й8 8р. (ОепВапк: Ό 12677.1), 8упесЬосу8Й8 8р. Ρ^ 6803 (ОепВапк: ΒΑ000022.2), 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρ^ 6301 (ОепВапк: АР008231.1) 8упесЬососси8 8р (ОепВапк: М58751.1), 8упесЬососси8 е1опдаН8 Ρ^ 7942 (ОепВапк: СΡ000100.1), ΝθδίΘΟ 8р. Ρϋϋ 7120 (ОепВапк: ΒΑ000019.2), ΑηаЪаеηа уапаЬШз ΑΤСС 29413 (ОепВапк: СΡ000117.1), ΑηаЪаеηа 8р. Ь-31 (ОепВапк: ΑΡ324500); ТЬегто8упесЬососси8 е1опдаН8 ΒΡ-1 (СуапоВа8е: 1110185, 1110186), 8упесЬососси8 уи1сапи8 (ОепВапк: Ό78139), О8сШаНпа 8р. ЯКВО091600 (ОепВапк: ΑΡ054630), Ρ^осЬ1о^ососси8 тагши8 МЕТ9313 (ОепВапк: ВХ572099), Ρ^осЬ1о^ососси8 тагши8 8Н МкТ 9303 (ОепВапк: ΡΡ000554), Ρι^ιΚίΌ^^ν^ тагши8 8Н М£Т 9211 (ОепВапк: ΖΡ_01006613), 8упесЬососси8 8р. \УН8102 (ОепВапк: ВХ569690), 8упесЬососси8 8р. СС9605 (ОепВапк: ΡΡ000110), ΡιγΗΛιό^^^ тагши8 8иЪ8р. тагши8 штамм ССМΡ1375 (ОепВапк: ΑΞ017126) и Ρ^осЬ1о^ососси8 тагти8 МЕЭ4 (ОепВапк: ВХ548174).

- 21 028407

Дополнительные индуцибельные промоторы, которые могут быть также выбраны для использования в данном изобретении, включают: например, металл (цинк)-индуцибельный кт( промотор ЗупесНососсик РСС 7942 (ЕгЬе, АДатк, Тау1ог апД На11 (1996) СуапоЬас(епа саггушд ап кт(-1и\ 1гапкспрНопа1 Гикюп ак Ыокепкогк Гог 1Не Де(ес(юп оГ Неауу те(а1 саПопк, 1оигпа1 оГ 1пДик1г1а1 МюгоЬю1оду, 17:80-83); железочувствительный ίάίΑ промотор ЗупесНососсик е1опда(ик РСС 7942 (МюНе1, РШопик. апД Со1Деп (2001) Ипикиа1 геди1а(огу е1етеп(к Гог 1гоп Дейаепсу шДисйоп оГ 1Не 1Д1А депе оГ ЗупесНососсик е1опда(ик РСС 7942 1оигпа1 оГ Вас(епо1оду, 183(17):5015-5024); редокс-чувствительный цианобактериальный сгНК промотор (Райегкоп-Рогйп, СоМп апД О\\(1пт (2006) А Ье\А-ге1а(еД рго(еш геди1а(ек геДо\-кепк1Йуе е\ргеккюп оГ (Не суапоЬас(епа1 КЯА НеНсаке, сгНК, ЫисШс АаДк КекеагсН, 34(12):3446-3454); промотор гена теплового шока Нкр16.6 ЗупесНосукйк кр. РСС 6803 (Рапд апД Вагпит (2004) Е\ргеккюп оГ (Не Неа( кНоск депе Нкр16.6 апД ргото(ег апа1уык т (Не СуапоЬас(епит, §упесНосукйк кр. РСС 6803, Сштеп( ΜίсгоЫо1оду 49:192-198); промотор малого белка теплового шока (Нкр), такой как промотор гена НкрА §упесНососсик уи1сапик (Ыакато(о, διιζιιΐύ апД Коу (2000) Сопкй(ийуе ехргеккюп оГ а кта11 Неа(-кНоск рго(еш сопГегк се11и1аг (Негто(о1егапсе апД (Негта1 рго(есйоп (о (Не рНо(окуп(Нейс аррага(ик ш суапоЬас(епа, ЕЕВ8 Ье((егк 483:169-174); чувствительные к СО₂ промоторы гена оксифотобактериальной карбоангидразы (СепВапк: ЕАЙ90903, ЕАЙ90685, 2Р_01624337, ЕА№33650, АВВ17341, ААТ41924, САО89711, 2Р_00111671, УР_400464, ААС44830; и СуапоВаке: а112929, РМТ1568 к1г0051, к1г1347 и кус0167_с); промоторы гена нитратредуктазы (пагВ) (такие как с регистрационными номерами СепВапк: ВАС08907, ИР_682145, ААО25121; АВ146326, УР_732075, ВАВ72570, N1’ 484656); чувствительные к зеленому/красному свету промоторы, такие как светорегулируемый срсВ2А2 промотор РгетуеНа Д1р1ок1рНоп (Сакеу апД Сгокктап (1994) 1п у1уо апД ш уНго сНа^ас(е^^ζа(^οη оГ (Не НдН(-геди1а(еД срсВ2А2 ргото(ег оГ РгетуеНа Д1р1ок1рНоп( 1оигпа1 оГ Вас(епо1оду, 176(20):6362-6374); и чувствительные к УФ-свету промоторы цианобактериальных генов 1е\А, гесА и гиуВ (Ооташ, Ноио(, СНаиуа(, апД Сакыег-СНаиуа( (2004) Рипсйоп апД геди1айоп оГ (Не суапоЬас(епа1 депек 1е\А, гесА апД гиуВ: Ье\А 1к сййса1 (о (Не кигу1уа1 оГ се11к Гасшд шогдатс сагЬоп к(агуайоп, Мо1еси1аг МюгоЫо1оду, 53(1): 65-80).

Кроме того, также в одном из различных вариантов осуществления определенные полуиндуцибельные или конститутивные промоторы также можно выбрать для использования в сочетании с индуцибельным промотором (промоторами) для построения сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Также, например, промоторы оксифотобактериального оперона КиЫксо, например, гЬсЬ генов (СепВапк: Х65960, 2Р_01728542, Ц3М674, ВАР48766, №_895035, 0907262А; СуапоВаке: РМТ1205, РММ0550, Рго0551, (111506, 8ΥΝΑ1718, д1г2156, а1г1524, к1г0009), которые имеют определенную светозависимость, но могут быть расценены почти как конститутивные промоторы, также можно выбрать для использования в сочетании с индуцибельным промотором(промоторами), такими как промоторы тгА, Но\ и/или дгоЕ, для построения сконструированного пути (путей) продуцирования бутанола.

В этом описании, когда речь идет о индуцибельном промоторе, таком как, например, любой из индуцибельных промоторов, описанных выше, он включает их аналоги, функциональные производные, сконструированные последовательности и их сочетания. Функциональный аналог или модифицированная сконструированная последовательность в этом контексте относится к промоторной последовательности, полученной или модифицированной (посредством, например, замены, средней делеции или добавления, или модификации нуклеотидов) на основе собственной промоторной последовательности, такой как те, которые установлены в данном документе выше, которые сохраняют функцию нативной промоторной последовательности.

ДНК-конструкты и трансформация в организмы-хозяева

ДНК-конструкты образовывают с целью введения сконструированных генов пути продуцирования бутанола в хозяйскую водоросль, растение, растительную ткань или растительные клетки. То есть, нуклеотидную последовательность, кодирующую сконструированный фермент пути продуцирования бутанола, размещают в векторе в функциональный связи с промотором, предпочтительно индуцибельным промотором, и в функциональной связи с нуклеотидной последовательностью, кодирующей подходящую последовательность нацеливающего на хлоропласт транзитного пептида. В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновокислотные конструкты создают так, чтобы иметь элементы, расположенные в следующей от 5' (выше) к 3' (ниже) ориентации: индуцибельный извне промотор, транзитная нацеливающая последовательность и нуклеиновая кислота, кодирующая сконструированный фермент пути продуцирования бутанола, и, предпочтительно, подходящая последовательность терминации транскрипции. Один или более сконструированных генов (ДНК-конструкты) можно разместить в один генетический вектор. Пример такого конструкта изображен на фиг. 2А. Как показано в варианте осуществления, иллюстрируемом на фиг. 2А, сконструированный трансген пути продуцирования бутанола является нуклеиновокислотным конструктом, включающим: а) прямой ПЦР-праймер (ПЦР - полимеразная цепная реакция); Ь) индуцибельный извне промотор; с) транзитную нацеливающую последовательность; Д) сконструированную последовательность, кодирующую фермент пути продуцирования бутанола, с подходящей последовательностью терминации транскрипции и е) обратный ПЦР-праймер.

В соответствии с различными вариантами осуществления любой из компонентов от а) до е) этого

- 22 028407

ДНК-конструкта регулируются так, чтобы подходить для определенных специфических условий. На практике любой из компонентов от а) до е) этого ДНК-конструкта применяется полностью или частично, и/или в любой отрегулированной комбинации для достижения более желаемых результатов. Например, когда промотор водорослевой гидрогеназы используется как индуцибельный промотор в сконструированном ДНК-конструкте пути продуцирования бутанола, трансгенная сконструированная водоросль, которая содержит этот ДНК-конструкт, будет способна осуществлять автотрофный фотосинтез с помощью СО₂ окружающего воздуха в качестве источника углерода и нормально расти при аэробных условиях, например в открытом пруду. Когда водорослевая культура выращена и готова для продуцирования бутанола, то сконструированный трансген(трансгены) затем может экспрессироваться путем индуцирования при анаэробных условиях благодаря использованию промотора гидрогеназы. Экспрессия сконструированного гена(генов) продуцирует набор сконструированных ферментов пути продуцирования бутанола для работы с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования бутанола (фиг. 1).

Два ПЦР-праймера - это прямой ПЦР-праймер (ПР ПЦР-праймер), расположенный в начале (5' конец) ДНК-конструкта, и обратный ПЦР-праймер (ОБ ПЦР-праймер), расположенный на другом конце (3' конец), как показано на фиг. 2А. Эта пара ПЦР-праймеров сконструирована для обеспечения определенного удобства при необходимости относительно легкой ПЦР-амплификации сконструированного ДНКконструкта, что полезно не только во время и после того, как сконструированный ДНК-конструкт синтезируется при подготовке для генной трансформации, но также после того, как сконструированный ДНКконструкт доставлен в геном водоросли-хозяина для проверки сконструированного гена у трансформантов. Например, после завершения трансформации сконструированного гена у клетки-хозяина СЫатуботоиак геЙ1Йагб1й-агд7 с помощью техники электропорации и скрининга на комплементацию аргининосукцинат-лиазы (аг§7) продуцированные трансформанты можно затем проанализировать с помощью ПЦР ДНК-пробы их ядерной ДНК, используя эту пару ПЦР-праймеров для проверки, успешно ли включен в геном данного трансформанта весь ген сконструированного пути продуцирования бутанола ген (ДНК-конструкт). В случае, когда ПЦР-проба ядерной ДНК трансформанта может образовывать ПЦРпродукт, который совпадает с прогнозируемым размером и последовательностью ДНК в соответствии с сконструированным ДНК-конструктом, успешное включение сконструированного гена(генов) в геном трансформанта является проверенным.

Поэтому различные варианты осуществления также раскрывают соответствующий способ для эффективного создания сконструированных трансгенных водорослей, растений или растительных клеток для фотобиологического продуцирования бутанола. Этот способ, в одном из вариантов осуществления, включает следующие этапы: а) выбирают подходящую хозяйскую водоросль, растение, ткань растения или растительные клетки с учетом их генетический фонов и особых признаков в связи с продуцированием бутанола; Ъ) вводят нуклеиновокислотные конструкты сконструированных генов в геном указанной хозяйской водоросли, растения, растительной ткани или растительных клеток; с) проверяют включение сконструированных генов в трансформированную водоросль, растение, растительную ткань или растительные клетки с помощью ПЦР-проб ДНК, используя указанные ПЦР-праймеры сконструированного ДНК-конструкта; б) измеряют и проверяют признаки сконструированного организма, такие как индуцибельная экспрессия сконструированных генов бутанолового пути для фотосинтетического продуцирования бутанола из диоксида углерода и воды посредством проб мРНК, белка, и характеристик продуцирования бутанола согласно специфическим сконструированным признакам ДНК-конструкта(конструктов) (фиг. 2А).

Вышеупомянутый вариант осуществления способа создания сконструированного трансгенного организма для фотобиологического продуцирования бутанола можно также повторно применять на протяжении множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов. В различных вариантах осуществления какой-либо из этапов от а) до б) этого способа, описанного выше, регулируются для того, чтобы соответствовать определенным специфическим условиям. В различных вариантах осуществления какой-либо из этапов от а) до б) этого способа применяют полностью или частично, и/или в каком-либо отрегулированном сочетании.

Примеры сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструктов) показаны в перечне последовательностей. 8Е0 ГО N0: 1 представляет собой детализированный ДНК-конструкт сконструированного гена бутанолдегидрогеназы (1809 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор Νίη1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид РЬс82 (283-417), последовательность, кодирующую фермент, (418-1566), выделенную и модифицированную из последовательности бутанолдегидрогеназы С1окОтбшт кассЬагорегЪиЩасеЮтсит (АВ257439), 223-по терминатор КЪс82 (1567-1789) и ОБ ПЦР-праймер (1790-1809). 262-по промотор №а1 (ДНКпоследовательность 21-282) используется как пример индуцибельного промотора для контроля экспрессии сконструированного гена бутанолдегидрогеназы пути продуцирования бутанола (ДНКпоследовательность 418-1566). 135-По транзитный пептид РЬс82 (ДНК-последовательность 283-417) используется как пример для направления вставки сконструированного фермента (ДНКпоследовательность 418-1566) в хлоропласт организма-хозяина. РЬс82 терминатор (ДНКпоследовательность 1567-1789) задействован так, чтобы правильно завершалась транскрипция и транс- 23 028407 ляция сконструированного гена для продуцирования необходимого сконструированного апобелка (КЪс82 транзитный пептид бутанолдегидрогеназы). Так как промотор №а1 является ядерной ДНК, которая может контролировать экспрессию только для ядерных генов, синтетический ген пути продуцирования бутанола в этом примере сконструирован согласно частоте использования кодона ядерного генома СЫатуйотопаз. Поэтому в этом случае, сконструированный ген фермента транскрибируется в ядре. Его мРНК по природе перемещается в цитозоль, где мРНК транслируется в апобелок, который включает транзитный пептид КЪс82 (соответствующий ДНК-последовательности 283-417), связанный своей С-концевой областью вместе с Ν-концевой областью белка бутанолдегидрогеназы (соответствующего ДНКпоследовательности 418-1566). Транзитный пептид апобелка направляет его транспорт через мембрану хлоропласта и в стромальную зону, где транзитный пептид вырезается из апобелка. Получаемая бутанолдегидрогеназа затем возобновляет свою функцию в качестве фермента для сконструированного пути продуцирования бутанола в хлоропласте. Два ПЦР-праймера (последовательности 1-20 и 1790-1809) получены и модифицированы из последовательности гена актина человека и могут соединяться друг с другом. Анализ ВЬА§Т последовательностей против ОепВапк СЫашуйошопаз не выявил наличия у них гомологичных последовательностей. Поэтому их можно использовать как подходящие ПЦР-праймеры в ПЦР-пробах ДНК для проверки сконструированного гена у трансформированной водоросли.

§ЕЦ ГО NО: 2 представляет пример 2 для сконструированного ДНК-конструкта бутиральдегиддегидрогеназы (2067 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор №а1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид КЪс82 (283-417), последовательность, кодирующую бутиральдегиддегидрогеназу (418-1824), выделенную и модифицированную из последовательности бутиральдегиддегидрогеназы С1озйтйшш засскаторегЬиЩасеЮтсиш ^Υ251646), 223-по КЪс82 терминатор (1825-2047) и ОБ ПЦР-праймер (2048-2067). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, 8ЕЦ ГО NО: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая бутиральдегиддегидрогеназу (418-1824), которая выделена и модифицирована из последовательности бутиральдегиддегидрогеназы С1озйтйшш засскагорегЬи1у1асеЮп1сит ^Υ251646).

§ЕЦ ГО NО: 3 представляет пример 3 для сконструированного конструкта бутирил-КоАдегидрогеназы (1815 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Х1о Ι NйеI сайт (283-291), 135-по транзитный пептид КЪс82 (292426), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (427-1563), выделенную/модифицированную из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы С1озйтйшш Ьеуеппски (АР494018), 9-по XЪаI сайт (1564-1572), 223-по КЪс82 терминатор (1573-1795) и ОБ ПЦР-праймер (17961815) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, 8ЕЦ ГО NО: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая бутирил-КоА-дегидрогеназу (427-1563), выделенная/модифицированная из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы С1озйтйшш Ъеуегтскп (АР494018), и добавляются сайты рестрикции Х1ю! NйеI и XЪаI для создания ключевых компонентов, таких как нацеливающая последовательность (292-426) и последовательность сконструированного фермента (427-1563) в качестве модульного элемента, который можно легко заменить, когда необходимо сэкономить расходы на генный синтез и повысить рабочую продуктивность. Обратите внимание, что фермент не обязательно должен быть бутирил-КоА-дегидрогеназой С1озйтйшш Ъеуегтскп; ряд бутирилКоА-дегидрогеназных ферментов (таких как те, которые перечислены в табл. 1), включая их изозимы, сконструированные модифицированные ферменты и функциональные аналоги из других источников, таких как ВШупНЬпо ПЬпзокепз, продуцирующая бутират бактерия Ь2-50, ТкегтоапаегоЬасЮпит 1Негшоз ассЬаго1уйсиш, могут также быть выбраны для использования.

§ЕЦ ГО NО: 4 представляет пример 4 для сконструированного ДНК-конструкта кротоназы (1482 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Х1о Ι NйеI сайт (283-291) 135-по транзитный пептид КЪс82 (292-426), последовательность, кодирующую кротоназу (427-1209), выделенную/модифицированную из последовательности кротоназы С1озйтйшш Ьеуеппски (ОепЪапк: АР494018), 21-по последовательность, кодирующую Ьишю-метку (1210-1230), 9-по ХЪа! сайт (1231-1239), содержащий стоп-кодон, 223-по КЪс82 терминатор (1240-1462) и ОБ ПЦР-праймер (1463-1482) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, §ЕЦ ГО NО: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая кротоназу (427-1209), выделенная/модифицированная из последовательностей кротоназы С1озйтйшш Ьеуеппски (ОепЪапк: АР494018), и 21-по последовательность, кодирующая Ьишю-метку (1210-1230) добавляется к С-концевой области последовательности энолазы. 21-по последовательность-метка Ьишю (1210-1230) задействована здесь для кодирования пептидной последовательности Ьишю О1у-Суз-Суз-Рго-О1у-Суз-Суз (8ЕЦ ГО NО: 58), которая может стать флуоресцентной при обработке Ьишю реагентом, который сейчас является коммерчески доступным от куйтодеи |ЬПрз://са1а1о8.1пу|1годеп.сот|. Технология молекулярного мечения Ьишю основана на соединенной с ЭДТ (1,2-этандитиол) димышьяковой производной (Ьишю реагент) флюоресцеина, которая связывается с сконструированной последовательностью тетрацистеина (Керрейро1а, СоГГтап, апй е1 а1. (2003). КарМ йеЮсйоп о! ш уйто ехргеззей ргоЮтз изшд Ьишю™ 1есйпо1оду, Оепе Ехртеззюп, 25.3: 7-11). Тетрацистеиновая последовательность состоит из Суз-Суз-Хаа-Хаа-Суз-Суз (8ЕЦ ГО NО: 59), где Хаа является любой нецистеиновой аминокислотой, такой как Рго или О1у в этом примере.

- 24 028407

ЭДТ-связанный Ьитю реагент позволяет свободное вращение атомов мышьяка, которое гасит флуоресценцию флюоресцеина. Образование ковалентной связи между тиолами мышьяковых групп Ьитю и тетрацистеинами препятствует свободному вращению атомов мышьяка, что выделяет флуоресценцию флюоресцеина (СПГйп, Абатк, апб Тйеп (1998), ЗресШс сота1ет 1аЬе1тд оГ гесотЫпай рго1еш то1еси1ек Ш81бе 1ке се11к, Заепсе, 281:269-272). Это также дает возможность визуализации тетрацистеин-меченых белков посредством флуоресцентного молекулярного изображения. Поэтому, использование Ьитю метки, таким образом, делает возможным мониторинг и/или отслеживание сконструированной кротоназы в случае, когда экспрессируется для проверки, действительно ли доставляется в хлоропласт организмахозяина сконструированный фермент пути продуцирования бутанола как конструировалось. Метка Ьитю (короткий пептид из 7 аминокислот), которая связана с С-концевой областью белка кротоназы, в этом примере должна иметь минимальное влияние на функцию сконструированного фермента, но давать возможность молекуле сконструированного фермента визуализироваться при обработке Ьитю реагентом. Применение Ьитю метки является полностью факультативным. Если Ьитю метка каким-либо образом оказывает влияние на функцию сконструированного фермента, эту метку можно удалить из конструирования ДНК-последовательности.

ЗЕЦ ГО N0: 5 представляет пример 5 для сконструированного ДНК-конструкта 3-гидроксибутирилКоА-дегидрогеназы (1367 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредуктазы (21-104), 9-по Х1о I Ше1 сайт (105-113) 135-по транзитный пептид КЬсЗ2 (114-248), последовательность, кодирующую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (249-1094), выделенную/модифицированную из 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности С1ок1пб1ит Ьереппскп (СепЬапк: АЕ494018), 21-по последовательность-метку Ьитю (1095-1115), 9-по ХЬа1 сайт (1116-1124), 223-по КЬсЗ2 терминатор (1125-1347) и ОБ ПЦР-праймер (1348-1367). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 4, ЗЕЦ ГО N0: 4, за исключением того, что используются 84-по промотор нитратредуктазы (21-104) и последовательность, кодирующая 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (249-1094), выделенная/модифицированная из 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности С1о8йгбшт Ьереппскп (СепЬапк: АЕ494018). 84-По промотор нитратредуктазы искусственно создан посредством соединения двух участков частично гомологичных последовательностей (-231 до -201 и -77 до -25 относительно сайта начала транскрипции) нативного промотора №а1 СЫатуботопак гетПагбШ. Экспериментальные исследования продемонстрировали, что 84-по последовательность является более активной, чем нативный промотор Νίη1 (Ьоррек апб Кабоих (2002) Τ\\ό кйой гедюпк оГ Ле ргото1ег аге еккепйа1 Гог асйуайоп апб гергеккюп оГ Ле Ы1га1е гебпс1аке депе т СЫатуботонак ге1н1агбЛ, Мо1 Сепе1 Сепописк 268: 42-48). Поэтому, это является также примером, где функциональные синтетические последовательности, аналоги, функциональные производные и/или сконструированные модифицированные последовательности, такие как синтетическая 84-по последовательность, можно выбрать для использования согласно различным вариантам осуществления в данном изобретении.

ЗЕС ГО N0: 6 представляет пример 6 для сконструированного тиолазного ДНК-конструкта (1721 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредуктазы (21-104), 9-по Х1о I Ыбе1 сайт (105-113) 135-по транзитный пептид КЬсЗ2 (114-248), последовательность, кодирующую тиолазу (248-1448), выделенную/модифицированную из последовательности тиолазы Ви1угшЬгю ПЬпкокепк (АВ 190764), 21-по последовательность-метку Ьитю (1449-1469), 9-по ХЬа1 сайт (1470-1478), 223-по терминатор КЬсЗ2 (1479-1701) и ОБ ПЦР-праймер (1702-1721). Этот ДНК-конструкт также подобен примеру 4, ЗЕЦ ГО N0: 4, за исключением того, что используют кодирующую последовательность, кодирующую тиолазу (249-1448) и 84-по синтетический промотор №а1 (21-104). Это другой пример того, что функциональные синтетические последовательности также можно выбрать для использования в сконструированных ДНК-конструктах.

ЗЕС ГО N0: 7 представляет пример 7 для сконструированного ДНК-конструкта пируватферредоксин-оксидоредуктазы (4211 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 2х84-по промотор нитратредуктазы (21-188), 9-по Х1о I №е1 сайт (189-197), 135-по транзитный пептид КЬсЗ2 (198-332), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (3333938), выделенную/модифицированную из последовательностей пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы МакПдатоеЬа Ьа1атиЛ1 (СепВапк: ΆΥ1 01767), 21-по последовательность-метку Ьитю (3939-3959), 9-по ХЬа1 сайт (3960-3968), 223-по терминатор КЬсЗ2 (3969-4191) и ОБ ПЦР-праймер (4192-4211). Этот ДНКконструкт также подобен примеру 4, ЗЕЦ ГО N0: 4, за исключением того, что используются сконструированный 2х84-по промотор N131 и последовательность, кодирующая пируват-ферредоксиноксидоредуктазу (333-3938), выделенная/модифицированная из последовательностей пируватферредоксин-оксидоредуктазы МакйдатоеЬа Ьа1атШЫ (СепВапк: ΆΥ101767). 2х84-по промотор №а1 построен в виде тандемной дупликации 84-по синтетической последовательности промотора №а1, представленной выше в ЗЕС ГО N0: 6. Экспериментальные тесты показали, что 2х84-по синтетический промотор №а1 является даже более сильным, чем 84-по последовательность, которая более активна, чем нативный промотор №а1 (Ьоррек апб Кабоих (2002) Τ\\ό кйой гедюпк оГ Ле ргото1ег аге еккеп11а1 Гог асйуайоп апб гергеккюп оГ Ле Ыйа1е гебис1аке депе ш СЫатуботопак ге1пйатбЛ, Мо1 Сепе1 Сепотюк 268:

- 25 028407

42-48). Применение этого типа последовательностей индуцибельных промоторов с различными промоторными силами может также помочь при регулировании уровней экспрессии сконструированных ферментов для пути(путей) продуцирования бутанола.

8Е0 ΙΌ N0: 8 представляет пример 8 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы (2021 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 84-по промотор нитратредуктазы (21-104), 9-по Хйо I Ше1 сайт (105-113), 135-по транзитный пептид РЬс82 (114-248), последовательность, кодирующую пируваткиназу (249-1748), выделенную/модифицированную из последовательности пируваткиназы §ассйаготусек сегеуыае (ОеиВаик: ΑΥ949876), 21-по последовательность-метку Ьитю (1749-1769), 9-по ХЪа1 сайт (1770-1778), 223-по терминатор РЬс82 (1779-2001) и ОБ ПЦР-праймер (2002-2021). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 6, 8Е0 ГО N0: 6, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая пируваткиназу (249-1748).

8Е0 ГО N0: 9 представляет пример 9 для сконструированного гена энолазы (1815 по), включающий ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Хйо I Хбе1 сайт (283-291), 135-по транзитный пептид РЬс82 (292-426), последовательность, кодирующую энолазу (427-1542), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы Сй1атуботоиак гетйагбШ (ОеиЪаик: Х66412, Р31683), 21-по последовательность, кодирующую метку Ьитю (1507-1527), 9-по ХЪа1 сайт (1543-1551) содержащий стоп-кодон, 223-по терминатор РЬс82 (1552-1795) и ОБ ПЦР-праймер (1796-1815) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, 8Е0 ГО N0: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая энолазу (427-1542), выделенная/модифицированная из последовательности цитозольной энолазы СЫатуботоиак гехийагбШ.

8Е0 ГО N0: 10 представляет пример 10 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицератмутазы (2349 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы (21-282), 9-по Хйо I №е1 сайт (283-291), 135-по транзитный пептид РЬс82 (292-426), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (427-2097), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы СЫатуботоиак гетйагбШ (1ΟΙ Сй1ге2 белок ГО 161689, ОеиЪаик: АР268078), 9-по ХЪа1 сайт (2098-2106), 223-по терминатор КЪс82 (2107-2329) и ОБ ПЦР-праймер (2330-2349) на 3' конце. Этот ДНК-конструкт подобен примеру 3, 8Е0 ГО N0: 3, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фосфоглицератмутазу (427-2097), выделенная/модифицированная из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы СЫатуботоиак гетйагбШ.

8Е0 ГО N0: 11 представляет пример 11 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицераткиназы (1908 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор N131 нитратредуктазы (21-282), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (283-1665), выделенную из последовательности фосфоглицераткиназы хлоропласта СЫатуботоиак гетйагбШ, включающей ее хлоропластный сигнальный пептид и последовательность зрелого фермента (ОеиВаик: И14912), 223-по терминатор РЬс82 (1666-1888) и ОБ ПЦР-праймер (1889-1908). Этот ДНК-конструкт подобен примеру 1, 8Е0 ГО N0: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фосфоглицераткиназу (283-1665), выделенная из последовательности фосфоглицераткиназы хлоропласта СЫатуботоиак ге1ийагбШ, включающей ее хлоропластный сигнальный пептид и последовательность зрелого фермента. Поэтому это также является примером того, что последовательность фермента хлоропласта, которая кодируется ядром, такого как фосфоглицераткиназа хлоропласта СЫатуботоиак гетйагбШ, может также использоваться при конструировании и построении сконструированного гена пути продуцирования бутанола, когда целесообразно, с подходящим индуцибельным промотором, таким как промотор №а1 (ДНК-последовательность 21-282).

8Е0 ГО N0: 12 представляет пример 12 для сконструированного гена глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы (1677 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор №а1 нитратредуктазы (21-282), 135-по транзитный пептид РЬс82 (283-417), последовательность, кодирующую фермент (418-1434), выделенную и модифицированную из последовательности (мРНК) цитозольной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Мекокйдта утбе (регистрационный номер ОеиВаик ΌΡ873404), 223-по терминатор РЬс82 (1435-1657) и ОБ ПЦР-праймер (1658-1677). Этот ДНКконструкт подобен примеру 1, 8Е0 ГО N0: 1, за исключением того, что используется последовательность, кодирующая фермент (418-1434), выделенная и модифицированная из последовательности (мРНК) цитозольной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Мекокйдта утбе (регистрационный номер ОеиВаик ΌΡ873404).

8Е0 ГО N0: 13 представляет пример 13 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицератмутазы, связанной с промотором НубА1 (2351 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид РЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (438-2108), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы СЫатуботоиак гетйагбШ ΟΟΙ Сй1ге2 белок ГО 161689, ОеиЪаик: АР268078), 223-по терминатор РЬс82 (2109- 2331) и ОБ ПЦР-праймер (2332-2351). Этот сконструированный ДНК-конструкт весьма подобен примеру 1, 8Е0 ГО N0:1, за исключением того, что используют 282-по промотор НубА1 (21-302) и последовательность, кодирующая фосфоглицератмутазу

- 26 028407 (438-2108), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной фосфоглицератмутазы СЫатуботопак гегпЪагФн. 282-По промотор НубА1 (21-302) доказан активным посредством экспериментальных испытаний в лаборатории изобретателя. Использование промотора НубА1 (21-302) делает возможным активацию экспрессии сконструированного фермента посредством использования анаэробных условий культуральной среды.

С помощью того же принципа использования индуцибельного анаэробного промотора и нацеливающей на хлоропласт последовательности, как это показано в 8ЕО ГО N0: 13 (пример 13), 8Е0 ГО N0: 14-23 показывает примеры сконструированных генов 14-23. Кратко говоря, 8Е0 ГО N0: 14 представляет пример 14 для сконструированного ДНК-конструкта энолазы, связанной с промотором НубА1 (1796 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую энолазу (438-1553), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы СЫатуботопак гегпЪагбйг (ОепЬапк: Х66412, Р31683), 223-по терминатор КЬс82 (1554-1776) и ОБ ПЦР-праймер (1777-1796).

8Е0 ГО N0: 15 представляет пример 15 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы под контролем промотора НубА1, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую пируваткиназу (438-1589), выделенную/модифицированную из последовательности цитозольной пируваткиназы СЫатуботопак гетйагФи (ГО1 СЫге3 белок ГО 138105), 223-по терминатор КЬс82 (1590-1812) и ОБ ПЦР-праймер (1813-1832).

8Е0 ГО N0: 16 представляет пример 16 для сконструированного ДНК-конструкта пируватферредоксиноксидоредуктазы, связанной с промотором НубА1 (4376 по), который включает ПР ПЦРпраймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (438-4133), выделенную/модифицированную из последовательности пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы ЭеыйГоОЬпо аГпсапих (регистрационный номер ОепБапк Υ09702), 223-по терминатор КЬс82 (4134-4356) и ОБ ПЦРпраймер (4357-4376).

8Е0 ГО N0: 17 представляет пример 17 для сконструированного ДНК-конструкта пируват-НАДФ'оксидоредуктазы, связанной с промотором НубА1 (6092 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (438-5849), выделенную/модифицированную из последовательности пируват-НАДФ' оксидоредуктазы Еид1епа дгасШк (регистрационный номер ОепВапк АВ021127), 223-по терминатор КЬс82 (5850-6072) и ОБ ПЦР-праймер (6073-6092).

8Е0 ГО N0: 18 представляет пример 18 для сконструированного ДНК-конструкта тиолазы, связанной с промотором НубА1 (1856 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую тиолазу (438-1613), выделенную/модифицированную из последовательностей тиолазы ТйегтоапаегоЬас(егшт 1йегто8ассйаго1уйсит (ОепВапк Ζ92974), 223-по терминатор КЬс82 (1614-1836) и ОБ ПЦР-праймер (1837-1856).

8Е0 ГО N0: 19 представляет пример 19 для сконструированного ДНК-конструкта 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, связанной с промотором НубА1 (1550 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (438-1307), выделенную/модифицированную из последовательностей 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы ТйегтоапаегоЬас(егшт 1йегто8ассйаго1уйсит (ОепВапк Ζ92974), 223-по терминатор КЬс82 (1308-1530) и ОБ ПЦР-праймер (1531-1550).

8Е0 ГО N0: 20 представляет пример 20 для сконструированного ДНК-конструкта кротоназы, связанной с промотором НубА1 (1457 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую кротоназу (438-1214), выделенную/модифицированную из последовательностей кротоназы ТНегтоапаегоЬасЮпит (йегтокассйагоЩгсит (ОепВапк Ζ92974), 223-по терминатор КЬс82 (1215-1437) и ОБ ПЦР-праймер (1438-1457).

8Е0 ГО N0: 21 представляет пример 21 для сконструированного ДНК-конструкта бутирил-КоАдегидрогеназы, связанной с промотором НубА1 (1817 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (438-1574), выделенную/модифицированную из последовательностей бутирил-КоА-дегидрогеназы ТНегтоапаегоЬасЮпит 1йегто8ассйаго1уйсит (ОепВапк Ζ92974), 223-по терминатор КЬс82 (1575-1797) и ОБ ПЦР-праймер (1798-1817).

8Е0 ГО N0: 22 представляет пример 22 для сконструированного ДНК-конструкта бутиральдегиддегидрогеназы, связанной с промотором НубА1 (2084 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НубА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЬс82 (303-437), последовательность, кодирующую бутиральдегиддегидрогеназу (438-1841), выделенную/модифицированную из

- 27 028407 последовательностей бутиральдегиддегидрогеназы С1о8йтйшт 5ассНагорегЪи1у1асеЮп1сит (СепВапк ΑΥ251646), 223-по терминатор КЪс82 (1842-2064) и ОБ ПЦР-праймер (2065-2084).

8ЕО ГО N0: 23 представляет пример 23 для сконструированного ДНК-конструкта бутанолдегидрогеназы, связанной с промотором НуйА1 (1733 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 282-по промотор НуйА1 (21-302), 135-по транзитный пептид КЪс82 (303-437), последовательность, кодирующую бутанолдегидрогеназу (438-1490), выделенную/модифицированную из последовательностей бутанолдегидрогеназы С1о81пйшт Ъецеппски (СепВапк АР157307), 223-по терминатор КЪс82 (1491-1713) и ОБ ПЦР-праймер (1714-1733).

С помощью того же принципа использования 2x84 синтетического промотора №а1 и механизма нацеливания на хлоропласт, как уже упоминалось ранее, δΕφ ГО N0: 24-26 показывают больше примеров ДНК-конструктов сконструированных ферментов. Вкратце, δΕφ ГО N0: 24 представляет пример 24 для сконструированного ДНК-конструкта фруктозодифосфатальдолазы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по промотор ΝΚ (нитратредуктаза) (21-188), последовательность, кодирующую фруктозодифосфатальдолазу (189-1313), выделенную/модифицированную из последовательности фруктоза-1,6-бисфосфатальдолазы хлоропласта С. геюНагйШ (СепВапк: Х69969), 223-по терминатор КЪс82 (1314-1536) и ОБ ПЦР-праймер (1537-1556).

8Ε0 ГО N0: 25 представляет пример 24 для сконструированного ДНК-конструкта триозофосфатизомеразы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по промотор ΥΒ (21188), последовательность, кодирующую триозофосфатизомеразу (189-1136), выделенную и модифицированную из последовательности триозофосфатизомеразы хлоропласта АтаЫйор818 ШаПапа (СепВапк: АР247559), 223-по терминатор КЪс82 (1137-1359) и ОБ ПЦР-праймер (1360-1379).

8Ε0 ГО N0: 26 представляет пример 26 для сконструированного ДНК-конструкта фосфофруктокиназы, который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по промотор ΥΒ (21-188), 135-по транзитный пептид КЪс82 (189-323), последовательность, кодирующую фосфофруктокиназу (3241913), выделенную/модифицированную из последовательности 6-фосфофруктокиназы АгаЫйор818 Ιΐκιΐίапа (СепВапк: ХМ_001037043), 223-по терминатор КЪс82 (1914-2136) и ОБ ПЦР-праймер (2137-2156).

Нуклеиновокислотные конструкты, такие как представленные в примерах выше, могут включать дополнительные подходящие последовательности, например маркерный ген для селекции и факультативные последовательности биомолекулярных меток (такие как метка Битю, описанная в примере 4, 8Ε0 ГО N0: 4). Селектируемые маркеры, которые можно выбрать для использования в конструктах, включают маркеры, придающие устойчивости к канамицину, гигромицину, спектиномицину, стрептомицину, сульфонилмочевине, гентамицину, хлорамфениколу, среди прочих, все из которых были клонированы и доступны специалистам данной области техники. Альтернативно, селективным маркером является маркерный ген усвоения, который может быть комплементарным дефишенси у организма-хозяина. Например, ген, кодирующий аргининосукцинатлиазу (аг§7) может использоваться в качестве маркерного гена для селекции в сконструированном конструкте, что дает возможность идентифицировать трансформантов в случае, когда используются ат§7- (минус) клетки СЬ1атуйотоиа8 ге1иЬагй1й в качестве клетокхозяев.

Нуклеиновокислотные конструкты, несущие сконструированные гены могут доставляться в хозяйскую водоросль, сине-зеленую водоросль, растение или растительную ткань или клетки с помощью доступных техник генных трансформаций, таких как электропорация, индуцированное ПЭГ поглощение и баллистическая доставка ДНК и опосредованная АдгоЪасЮгшт трансформация.

С целью доставки сконструированного конструкта в водорослевые клетки, техники электропорации, стеклянных бус и биолистической генной пушки можно выбрать для использования в качестве предпочтительных способов; а водоросль с единичными клетками или простой талломной структурой является предпочтительной для использования при трансформации. Трансформанты можно идентифицировать и протестировать на основе стандартных техник.

Различные сконструированные гены можно ввести в хозяйские клетки последовательно поэтапным образом, или одновременно, с помощью одного конструкта или за одну трансформацию. Например, десять ДНК-конструктов, показанных в δΕφ ГО N0: 13-16 (или 17) и 18-23 для десятиферментного пути продуцирования бутанола, ответвленного от 3-фосфоглицерата, можно разместить в генетический вектор, такой как р389-Ат§7 с одним маркером для селекции (Ат§7). Поэтому, путем использования плазмиды таким образом, возможно доставить все десять ДНК-конструктов (сконструированные гены) в нуждающегося в аргинине СЬ1атуйотопа8 гешйагй1п-ахд7 хозяина (СС-48) за одну трансформацию для экспрессии ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). При необходимости трансформант, содержащий десять ДНК-конструктов, можно дополнительно трансформировать для внесения большего количества сконструированных генов в его геномную ДНК с дополнительным маркером для селекции, таким как стрептомицин. Путем использования комбинаций различных ДНК-конструктов сконструированных ферментов, таких как представленные в δΕφ ГО N0: 1-26, в генетической трансформации с подходящим организмом-хозяином можно построить различные пути продуцирования бутанола, такие как проиллюстрированные на фиг. 1. Например, сконструированные ДНК- 28 028407 конструкты ЗЕф ГО N0: 1-12 можно выбрать для построения ответвленного от глицеральдегид-3фосфатов пути продуцирования бутанола (01-12 на фиг. 1); сконструированные ДНК-конструкты ЗЕф ГО N0: 1-12, 24 и 25 можно выбрать для построения ответвленного от фруктозо-1,6-дифосфата пути продуцирования бутанола (20-33); и сконструированные ДНК-конструкты ЗЕф ГО N0: 1-12 и 24-26 можно выбрать для построения ответвленного от фруктозо-6-фосфата пути продуцирования бутанола (19-33).

Дополнительные модификации хозяина для усиления фотосинтетического продуцирования бутанола

Механизм превращения НАДФН/НАДН

Согласно пути(путям) фотосинтетического продуцирования бутанола для продуцирования одной молекулы бутанола из 4СО₂ и 5Н₂О вероятно необходимо 14 АТФ и 12 НАДФН, обе из которых образовываются фотосинтетическим расщеплением воды и фотофосфорилированием посредством тилакоидной мембраны. Для функционирования ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1), предпочтительной практикой является использование фермента(ферментов) пути продуцирования бутанола, которые могут использовать НАДФН, который образовывается фотоуправляемым процессом транспорта электронов. Бутанолдегидрогеназа (регистрационный номер СепВапк: АВ257439) и бутиральдегиддегидрогеназа (СепВапк: ΑΥ251646) С1озДтбшт засскагорегЬШукюеЮшсит являются примерами фермента пути продуцирования бутанола, который способен принимать или НАДФ(Н), или НАД(Н). Такой фермент пути продуцирования бутанола, который может использовать как НАДФН, так и НАДН (т.е., НАД(Ф)Н), также можно выбрать для использования в данном ответвленном от 3-фосфоглицерата и каком-либо другом сконструированном пути(путях) продуцирования бутанола (фиг. 1). Бутирил-КоА-дегидрогеназа (СепВапк: АР494018) и 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназа (СепВапк: АР494018) С1оз1пбшт Ьеуегтскн являются примерами фермента пути продуцирования бутанола, который может принимать только НАД(Н). Когда задействован фермент пути продуцирование бутанола, который может использовать только НАДН, может понадобиться механизм превращения НАДФН/НАДН для правильного функционирования этого ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола. Однако, в зависимости от генетических фонов организма-хозяина, механизм превращения между НАДФН НАДН может существовать у хозяина, так что НАДФН и НАДН смогут взаимозаменяемо использоваться в организме. Кроме того, известно, что НАДФН может быть превращен в НАДН с помощью НАДФН-фосфатазной активности (Рабапауак апб СНайецее (1998) №собпапибе абешпе бшис1еойбе р1юзрк;йе рйозрйа1азе Гасбйа1ез багк гебисбоп о! пйга!е: гедикйюп Ьу пйга!е апб аттота, Вю1од1а РкпЛапит 41(1):75-84) и что НАД может быть превращен в НАДФ с помощью НАДкиназной активности (МШо. М1уасЫ, Изиба, Ебиагбз апб Ваззйат (1981) ЫдЫ-шбисеб сопуегзюп оГ шсоОпаппбе абешпе бтис1еоббе Ю шсоОпаппбе абешпе бшис1еоббе р1юзрка1е ш Ыдйег р1ап1 1еауез, Р1ап1 РЬузю1о§у 68(2):324-328; Ма1зитига-Кабо1а, Ми1о, МуасЫ (1982) ПдЫ-шбисеб сопуегзюп оГ ΝΑΌ+ 1о NΑ^Р' ш СЫоге11а се11з, ВюсЫтюа Вюрйузюа Ас1а 679(2):300-300). Поэтому в случае, когда необходимо повышенное превращение НАДФН/НАДН, хозяин может быть генетически модифицирован для усиления НАДФН-фосфатазной и НАД-киназной активностей. Таким образом в одном из различных вариантов осуществления сконструированное для фотосинтетического продуцирования бутанола растение, сконструированная водоросль или растительная клетка кроме всего содержит дополнительные сконструированные трансгены (фиг. 2В) для индуцибельной экспрессии одного или более ферментов для способствования взаимопревращения НАДФН/НАДН, таких как НАДФН-фосфатаза и НАД-киназа (СепВапк: ХМ_001609395, ХМ_001324239), в стромальной области хлоропласта водоросли.

Другим вариантом осуществления, который может обеспечить механизм превращения НАДФН/НАДН, является правильный выбор точки ветвления в цикле Кальвина для ответвления сконструированного пути продуцирования бутанола. Для предоставления этого механизма превращения НАДФН/НАДН с помощью конструирования пути согласно данному варианту осуществления предпочтительной практикой является ответвлять сконструированный путь продуцирования бутанола в или после точки глицеральдегид-3-фосфатов цикла Кальвина, как показано на фиг. 1. В этих конструированиях путей превращение НАДФН/НАДН достигается главным образом двухступенчатым механизмом: 1) использование этапа с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой цикла Кальвина, который использует НАДФН при восстановлении 1,3-дифосфоглицерата до глицеральдегид-3-фосфатов; и 2) использование этапа с НАД'-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой сконструированного пути 01, который продуцирует НАДН при окислении глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат. Конечным результатом двух этапов, описанных выше, является превращение НАДФН в НАДН, который может поддерживать необходимую восстановительную способность в форме НАДН для сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Для этапа 1) обычно достаточным является использование НАДФНзависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы цикла Кальвина естественной в организме-хозяине. В результате введение сконструированной НАД'-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы 01 для работы с НАДФН-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой цикла Кальвина может обеспечить способность функционирования механизма превращения НАДФН/НАДН, который необходим для правильного функционирования ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). По этой причине в одном из различных вариантов осуществления сконструированный

- 29 028407

ДНК-конструкт НАД'-зависимой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (пример 12, 5>Е0 ГО N0: 12) используется также в качестве сконструированного гена для превращения НАДФН/НАДН (фиг. 2В) для поддержки ответвленного от 3-фосфоглицерата пути продуцирования бутанола (03-12 на фиг. 1). Это также объясняет почему является важным использование НАД^'-зависимой глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы 01 для предоставления этому двухэтапному механизму превращения НАДФН/НАДН для сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Поэтому в одном из различных вариантов осуществления предпочтительной практикой является использование НАД^'зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ее изозимов, функциональных производных, аналогов, сконструированных модифицированных ферментов и/или их сочетаний в сконструированном пути(путях) продуцирования бутанола, как проиллюстрировано на фиг. 1.

Техники иРНК для дополнительного управления механизмом регуляции фотосинтеза

В другом варианте осуществления данного изобретения хозяйское растение или клетку дополнительно модифицируют для управления циклом Кальвина так, чтобы хозяин мог непосредственно продуцировать жидкое топливо бутанол вместо того, чтобы синтезировать крахмал (гликоген в случае оксифотобактерий), целлюлозы и лигноцеллюлозы, которые часто являются неэффективными и трудными для использования в биоперерабатывающей промышленности. Согласно одному из различных вариантов осуществления инактивация активности синтеза крахмала достигается супрессированием экспрессии какого-либо из ключевых ферментов, таких как, крахмалсинтаза (гликогенсинтаза в случае оксифотобактерий) 13, глюкоза-1-фосфат (О-1-Р) аденилтрансфераза 14, фосфоглюкомутаза 15 и гексозофосфатизомераза 16 пути синтеза крахмала, который соединяется с циклом Кальвина (фиг. 1).

Введение генетически передаваемого фактора, который может ингибировать активность синтеза крахмала, которая конкурирует с сконструированным путем(путями) продуцирования бутанола за продукты цикла Кальвина, может дополнительно усиливать фотосинтетическое продуцирование бутанола. В отдельном варианте осуществления генетически кодируемый (или который может кодироваться) ингибитор (фиг. 2С) для конкурентного пути синтеза крахмала представляет собой молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, например, крахмалсинтазу 16, глюкоза-1-фосфат (О-1-Р) аденилтрансферазу 15, фосфоглюкомутазу 14 и/или гексозофосфатизомеразу 13, как показано цифровыми отметками 13-16 на фиг. 1. Последовательности ДНК, кодирующие иРНК крахмалсинтазы, иРНК глюкоза-1-фосфат (О-1-Р) аденилтрансферазы, иРНК фосфоглюкомутазы и/или иРНК О-Р-изомеразы, соответственно, можно сконструировать и синтезировать на основе техник РНК интерференции, известных специалистам данной области техники (Ык/езукЫ (.Типе 1, 2003) Ргодгекк ш КNΑ ДиегГегепсе, ОепеДс ЕпдшееДпд №ик, Уо1. 23, питЬег 11, рр. 1-59). В общих чертах, молекула интерферирующей РНК (иРНК) является антисмысловой, но комплементарной нормальной мРНК конкретного белка (гена) так, чтобы такая иРНК молекула могла специфически связываться с нормальной мРНК конкретного гена, таким образом, ингибируя (блокируя) трансляцию генспецифичной мРНК в белок (Иге, Хи, МопГдотегу, КокГак, ЭДует, Ме11о (1998) РоГепГ апД кресШс депеДс ДиегГегепсе Ьу ДоиЫе-кГгапДеД КNΑ ш СаепогДаЬДШк е1едапк. №ииге 391(6669):806-11; ЭукхНоот, №уйга, §Дагр (2003) КШшд ГДе теккепдег: кДой КNΑк ГДаГ кДепсе депе ехртеккюп, №и Кеу Мо1 Се11 Вю1. 4(6): 457-67).

Примеры сконструированного ДНК-конструкта иРНК синтеза крахмала (фиг. 2С) показаны в приведенных в списке 5>Е0 ГО N0: 27 и 28. Вкратце, 5>Е0 ГО N0: 27 представляет пример 27 для сконструированного ДНК-конструкта иРНК крахмалсинтазы под контролем N131 промотора (860 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по №а1 промотор (21-282), последовательность иРНК крахмалсинтазы (283-617), включая старт-кодон аГд и обратную комплементарную последовательность двух фрагментов уникальной последовательности мРНК-последовательности крахмалсинтазы СЫатуДотопак ге1пДагДД1 (ОепВапк: АР026422), 223-по терминатор КЬс82 (618-850) и ОБ ПЦРпраймер (851-860). По причине использования №а1 промотора (21-282) этот сконструированный ген иРНК синтеза крахмала конструируют, чтобы экспрессировать только в случае необходимости усиления фотобиологического продуцирования бутанола в присутствии его специфического индуктора, нитрата (N03), который можно добавить в культуральную среду в качестве удобрения для индуцирования сконструированных организмов. Последовательность иРНК крахмалсинтазы (283-617) конструируют для связывания с нормальной мРНК гена крахмалсинтазы, таким образом, блокируя ее трансляцию в функциональную крахмалсинтазу. Ингибирование крахмал/гликогенсинтазной активности в 16 таким образом должно канализировать больше фотосинтетических продуктов цикла Кальвина в ответвленный от цикла Кальвина путь(пути) продуцирования бутанола, такие как ответвленный от глицеральдегид-3-фосфатов путь продуцирования бутанола 01-12, как проиллюстрировано на фиг. 1.

5>Е0 ГО N0: 28 представляет пример 28 для сконструированного конструкта иРНК крахмалсинтазы под контролем НуДА1 промотора (1328 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 282-по НуДА1 промотор (21-302), сконструированную последовательность иРНК крахмалсинтазы (303-1085), 223-по терминатор КЬс82 (1086-1308) и ОБ ПЦР-праймер (1309-1328). Сконструированная последовательность иРНК крахмалсинтазы (303-1085) включает: 300-по смысловой фрагмент (303-602), выделенный из первых 300-по уникальной кодирующей последовательности мРНК-последовательности

- 30 028407 крахмалсинтазы СЫатуйотоиак гешЫагЛи (ОепВапк: АР026422), 183-по сконструированную интронподобную петлю (603-785) и 300-по антисмысловую последовательность (786-1085), комплементарную к начальной 300-по кодирующей последовательности мРНК-последовательности крахмалсинтазы СЫ1атуботопак гетНагШи (ОепВапк: ЛР026422). Эту сконструированную последовательность иРНК крахмалсинтазы (303-1085) конструируют для ингибирования синтеза крахмалсинтазы с помощью следующих двух механизмов. Сначала, 300-по антисмысловая комплементарная последовательность иРНК (соответствующая ДНК-последовательности 786-1085) связывается с нормальной мРНК гена крахмалсинтазы, таким образом, блокируя его трансляцию в функциональную крахмалсинтазу. Затем, 300-по антисмысловая комплементарная последовательность иРНК (соответствующая ДНК-последовательности 7861085) может также связываться с 300-по смысловой комплементарной частью (соответствующей ДНКпоследовательности 303-602) в тождественной сконструированной молекуле иРНК, формируя шпилькоподобную двуцепочечную РНК-структуру с 183-по сконструированной интрон-подобной последовательностью (603-785) в виде петли. Экспериментальные исследования показывают, что этот тип шпилькоподобной двуцепочечной РНК может также запускать посттранскрипционный генный сайленсинг (РиЫгтапп, §1аЫ1Ьег§, Ооуогипоуа, Капк апб Недетапп (2001) 1оита1 о£ Се11 8с1епсе 114:3857-3863). По причине использования промотора НубА1 (21-302) этот сконструированный ген иРНК синтеза крахмала конструируют для экспрессии только при анаэробных условиях в случае необходимости усиления фотобиологического продуцирования бутанола путем канализирования большего количества фотосинтетических продуктов цикла Кальвина в путь(пути) продуцирования бутанола, такие как 01-12, 03-12 и/или 20-33, как проиллюстрировано на фиг. 1.

Сконструированные гены расщепления крахмала и гликолиза

В еще одном варианте осуществления данного изобретения фотобиологическое продуцирование бутанола усиливают путем включения дополнительного набора сконструированных генов (фиг. 2Ό), который может способствовать расщеплению крахмала/гликогена и гликолизу в сочетании с сконструированным геном(генами) продуцирования бутанола (фиг. 2А). Такие дополнительные сконструированные гены для расщепления крахмала включают, например, гены, кодирующие для 17: амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, и для 18: глюкозофосфатизомеразу (О-Р-изомеразу), как проиллюстрировано на фиг. 1. Сконструированные гены гликолиза кодируют нацеленные на хлоропласт ферменты гликолиза: глюкозофосфатизомеразу 18, фосфофруктокиназу 19, альдолазу 20, триозофосфатизомеразу 21, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу 22, фосфоглицераткиназу 23, фосфоглицератмутазу 24, энолазу 25 и пируваткиназу 26. Сконструированные гены расщепления крахмала и гликолиза в сочетании с каким-либо из путей продуцирования бутанола, которые показаны на фиг. 1, могут формировать дополнительный путь(пути) из крахмала/гликогена в бутанол (17-33). Следовательно, коэкспрессия сконструированных генов расщепления крахмала и гликолиза с генами пути продуцирования бутанола может также усиливать фотобиологическое продуцирование бутанола. Таким образом, этот вариант осуществления представляет другой подход для управления циклом Кальвина для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола. В этом случае некоторые из продуктов цикла Кальвина проходят по пути синтеза крахмала (13-16) и далее по пути крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33) как показано на фиг. 1. В данном случае крахмал/гликоген действует в качестве временного хранилищного пула продуктов цикла Кальвина перед тем, как они смогут быть превращены в бутанол. Этот механизм может быть вполне пригодным для максимизации выхода продукции бутанола в определенных случаях. Например, при высокой интенсивности солнечного света, например около полудня, скорость фотосинтетической фиксации СО₂ цикла Кальвина может быть настолько высокой, что может превышать максимально возможную скорость пути(путей) продуцирования бутанола; использование механизма синтеза крахмала также позволяет временно хранить избыток фотосинтетических продуктов, которые необходимо позже использовать для продуцирования бутанола.

Фиг. 1 также иллюстрирует использование сконструированного пути крахмал/гликоген-в-бутанол с сконструированными ферментами (как отмечено от 17 до 33) в сочетании с ответвленным от цикла Кальвина сконструированным путем(путями) продуцирования бутанола, таким как ответвленный от глицеральдегид-3-фосфатов путь продуцирования бутанола 01-12 для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола. Подобно преимуществам использования ответвленных от цикла Кальвина сконструированных путей продуцирования бутанола, использование сконструированного пути крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33) может также помочь превращать фотосинтетические продукты в бутанол перед тем, как сахара смогут быть превращены в другие сложные биомолекулы, такие как лигноцеллюлозные биомассы, которые не могут полностью использоваться биоперерабатывающей промышленностью. Таким образом, подходящее использование ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола (таких как 01-12, 03-12 и/или 20-33) и/или сконструированного пути крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33) может представлять собой принципиально новые, среди прочего, технологии, которые могут эффективно обходить проблемы узких мест современной технологии биомассы, включая проблему лигноцеллюлозной неподатливости.

Другим признаком является то, что активность ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути продуцирования бутанола (такого как, 01-12, 03-12 и/или 20-33) может происходить преиму- 31 028407 щественно днем, когда есть свет, потому что она использует промежуточный продукт цикла Кальвина, который нуждается в поставках восстановительной способности (НАДФН) и энергии (АТФ), образованных путем фотосинтетического расщепления воды и управляемого светом процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным перемещением, посредством системы тилакоидных мембран. Сконструированный путь крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33), который может использовать избыточный сахар, сохранявшийся в виде крахмала/гликогена во время фотосинтеза, может функционировать не только днем, но также и ночью. Следовательно, использование ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути продуцирования бутанола (такого как 01-12, 03-12 и/или 20-33) вместе с сконструированным путем(путями) крахмал/гликоген-в-бутанол (17-33), как проиллюстрировано на фиг. 1, делает возможным продуцирование бутанола как днем, так и ночью.

По причине того, что экспрессия как сконструированного пути(путей) крахмал/гликоген-в-бутанол, так и ответвленного от цикла Кальвина сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола контролируется использованием индуцибельного промотора, такого как анаэробный промотор гидрогеназы, этот тип сконструированных организмов также способен расти фотоавтотрофно при аэробных (нормальных) условиях. Когда сконструированные фотосинтетические организмы выращены и готовы для фотобиологического продуцирования бутанола, клетки затем помещают в специфические индуцирующие условия, такие как в анаэробные условия [или сдвигают использование удобрения от аммониевого к нитратному, если используется сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола под контролем №а1/ттА промотора] для усиления продуцирования бутанола, как показано на фиг. 1 и 3.

Примеры сконструированных генов расщепления крахмала (гликогена) показаны в приведенных в списке 8ЕО ГО N0: 29-33. Вкратце, 8Е0 ГО N0: 29 представляет пример 29 для сконструированного ДНК-конструкта амилазы (1889 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по ΝΚ промотор (21-188), 9-по Хйо I ΝάβΙ сайт (189-197), 135-по транзитный пептид КЬс82 (198332), последовательность, кодирующую амилазу (333-1616), выделенную и модифицированную из альфа-амилазы ячменя (ОеиВаик: Ι04202Α ту46 экспрессия протестирована в алейроновых клетках), 21-по последовательность-метку Ьитю (1617-1637), 9-по ХЬа1 сайт (1638-1646), 223-по терминатор КЬс82 (1647-1869) и ОБ ПЦР-праймер (1870-1889).

8Е0 ГО N0: 30 представляет пример 30 для сконструированного ДНК-конструкта крахмалфосфорилазы (3089 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по ΝΚ промотор (21-188), 135-по транзитный пептид КЬс82 (189-323), последовательность, кодирующую крахмалфосфорилазу (324-2846), выделенную и модифицированную из последовательности крахмалфосфорилазы корня цитруса (ОеиВаик: ΑΥ098895, экспрессия протестирована в корне цитруса), 223-по терминатор КЬс82 (2847-3069) и ОБ ПЦР-праймер (3070-3089).

8Е0 ГО N0: 31 представляет пример 31 для сконструированного ДНК-конструкта гексокиназы (1949 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NΚ промотор (21188), 135-по транзитный пептид КЬс82 (189-323), последовательность, кодирующую гексокиназу (3241706), выделенную и модифицированную из мРНК-последовательности гексокиназы А_)е11отусе8 сарки1а1и8 (ОепЬапк: ХМ 001541513), 223-по терминатор КЬс82 (1707-1929) и ОБ ПЦР-праймер (1930-1949).

8Е0 ГО N0: 32 представляет пример 32 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглюкомутазы (2249 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NΚ промотор (21-188), 135-по транзитный пептид КЬс82 (189-323), последовательность, кодирующую фосфоглюкомутазу (324-2006), выделенную и модифицированную из последовательности фосфоглюкомутазы ИсЫа δίίρίΐίδ (ОепВапк: ХМ 00 1383281), 223-по терминатор КЬс82 (2007-2229) и ОБ ПЦР-праймер (2230-2249).

8Е0 ГО N0: 33 представляет пример 33 для сконструированного ДНК-конструкта глюкозофосфатизомеразы (2231 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 2х84-по NΚ промотор (21-188), 135-по транзитный пептид КЬс82 (189-323), последовательность, кодирующую глюкозофосфатизомеразу (324-1988), выделенную и модифицированную из последовательности фосфоглюкоизомеразы 8. сетеу181ае (ОепВапк: М21696), 223-по терминатор КЬс82 (1989-2211) и ОБ ПЦР-праймер (2212-2231).

Сконструированные гены расщепления крахмала, такие как показанные в 8Е0 ГО N0: 29-33, можно выбрать для использования в сочетании с различными сконструированными генами пути продуцирования бутанола для построения различных сконструированных путей продуцирования бутанола расщеплением крахмала, таких как пути, показанные на фиг. 1. Например, сконструированные гены, показанные в 8Е0 ГО N0: 1-12, 24-26 и 29-33, можно выбрать для построения пути продуцирования крахмала в бутанол под контролем №а1 промотора, который включает следующие сконструированные ферменты: амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, фруктозодифосфатальдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазу (или пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу), тиолазу, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу, кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, бутиральдегиддегидрогеназу и бутанолдегидрогеназу. Этот путь крахмал/гликоген-в-бутанол 17-33 может использоваться самостоятельно и/или в сочетании с другим пу- 32 028407 тем(путями) продуцирования бутанола, таким как ответвленный от 3-фосфоглицерата путь продуцирования бутанола 03-12, как проиллюстрировано на фиг. 1.

Распределение сконструированных путей продуцирования бутанола между хлоропластом и цитоплазмой

В еще одном варианте осуществления данного изобретения фотобиологическую продуктивность бутанола усиливают посредством выбранного распределения сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола между хлоропластом и цитоплазмой у эукариотической растительной клетки. То есть, не весь(все) сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола (фиг. 1) должны функционировать в хлоропласте; при необходимости часть сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола может также функционировать в цитоплазме. Например, в одном из различных вариантов осуществления значительная часть активности сконструированного пути крахмал-в-бутанол от дигидроксиацетонфосфата до бутанола (21-33) сконструирована для прохождения в цитоплазме, в то время как этапы от крахмала до дигидроксиацетонфосфата (17-20) - в хлоропласте. В этом примере связь между хлоропластной и цитоплазматической частями сконструированного пути достигается путем использования триозофосфатфосфатного транслокатора, который способствует перемещению дигидроксиацетона через мембрану хлоропласта. Также путем использования триозофосфат-фосфатного транслокатора, также появляется возможность ответвленному от глицеральдегид-3-фосфата сконструированному пути продуцирования бутанола функционировать не только в хлоропласте, но также и в цитоплазме. Цитоплазматическую часть сконструированного пути продуцирования бутанола можно построить путем использования сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструктов фиг. 2А), при этом опускают их нацеливающую на хлоропласт последовательность, как показано на фиг. 2Е.

Сконструированные оксифотобактерии со сконструированными путями продуцирования бутанола в цитоплазме.

У прокариотических фотосинтетических организмов, таких как сине-зеленые водоросли (оксифотобактерии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии), которые обычно содержат фотосинтетическую тилакоидную мембрану, но не хлоропластную структуру, цикл Кальвина располагается в цитоплазме. В этом особом случае весь сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола (фиг. 1), включая (но без ограничений) ответвленный от глицеральдегид-3-фосфата путь продуцирования бутанола (01-12), ответвленный от 3-фосфоглицерата путь продуцирования бутанола (03-12), ответвленный от фруктоза1,6-дифосфата путь (20-33), ответвленный от фруктоза-6-фосфата путь (19-33) и пути крахмал (или гликоген)-в-бутанол (17-33) регулируют при конструировании для функционирования с циклом Кальвина в цитоплазме сине-зеленой водоросли. Построение цитоплазматических сконструированных путей продуцирования бутанола может достигаться путем использования сконструированных генов пути продуцирования бутанола (ДНК-конструкт фиг. 2А), при этом опускают всю их нацеливающую на хлоропласт последовательность. В случае, когда нацеливающая на хлоропласт последовательность у сконструированного ДНК-конструкта(конструктов) опускается, как проиллюстрировано на фиг. 2Е, сконструированный ген(гены) транскрибируется и транслируется в сконструированные ферменты в цитоплазме, тем самым придавая сконструированный путь(и) продуцирования бутанола. Сконструированный ген(гены) можно включить в хромосомную и/или плазмидную ДНК у хозяйских сине-зеленых водорослей (оксифотобактерии, включая цианобактерии и оксихлоробактерии) с помощью техник генной трансформации, известной специалистам данной области техники. Предпочтительной практикой является интегрирование сконструированных генов посредством интегративной трансформации в хромосомную ДНК, которая обычно может обеспечить лучшую генетическую стабильность для сконструированных генов. У оксифотобактерии, таких как цианобактерии, интегративная трансформация может достигаться посредством способа двойной рекомбинации гомологичных ДНК в хозяйскую хромосомную ДНК с помощью сконструированного ДНК-конструкта, как проиллюстрировано на фиг. 2Р, который обычно, от 5' выше к 3' ниже, включает: сайт рекомбинации 1, сконструированный ген(гены) пути продуцирования бутанола и сайт рекомбинации 2. Этот тип ДНК-конструктов (фиг. 2Р) может доставляться в оксифотобактерии (синезеленые водоросли) с помощью ряда доступных техник генетической трансформации, включая электропорацию, естественную трансформацию и/или конъюгацию. Трансгенные сконструированные организмы, созданные из сине-зеленых водорослей также называются сконструированными сине-зелеными водорослями (сконструированными оксифотобактериями, включая сконструированные цианобактерии и сконструированные оксихлоробактерии).

Примеры сконструированных оксифотобактериальных генов пути продуцирования бутанола показаны в приведенных в списке 8ЕЦ ГО ЫО: 34-45. Вкратце, 8ЕЦ ГО ЫО:34 представляет пример 34 для сконструированного оксифотобактериального ДНК-конструкта бутанолдегидрогеназы (1709 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 400-по промотор нитритредуктазы (тгА) из ТЬегтокуиесЬососсик е1оида1ик ВР-1 (21-420), последовательность, кодирующую фермент (421-1569), выделенную и модифицированную из последовательности бутанолдегидрогеназы С1о8Ьтбшт кассЬагорегЬи1у1асеЮшсит (АВ257439), 120-по терминатор гЬс8 из ТЬегтокуиесЬососсик е1ои§а!и8 ВР-1 (15701689) и ОБ ПЦР-праймер (1690-1709) на 3' конце.

§ЕЦ ГО ЫО: 35 представляет пример 35 для сконструированного оксифотобактериального ДНК- 33 028407 конструкта бутиральдегиддегидрогеназы (1967 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 400-по промотор нитритредуктазы тгА ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-420), последовательность, кодирующую фермент (421-1827), выделенную и модифицированную из последовательности бутиральдегиддегидрогеназы С1ок(пДшт кассЬагорегЬи(у1асе(отсит (ΑΥ251646), 120-по терминатор гЬс§ из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1828-1947) и ОБ ПЦР-праймер (1948-1967) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 36 представляет пример 36 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта бутирил-КоА-дегидрогеназы (1602 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по промотор нитратредуктазы ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую бутирил-КоА-дегидрогеназу (326-1422), выделенную/модифицированную из последовательности бутирил-КоА-дегидрогеназы С1ок1пДшт Ьецеппски (АР494018), 120-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1423-1582) и ОБ ПЦР-праймер (1583-1602) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 37 представляет пример 37 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта кротоназы (1248 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по промотор нитратредуктазы ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую кротоназу (326-1108), выделенную/модифицированную из последовательностей кротоназы С1ок(пД1ит Ьецеппскн (СепВапк: АР494018), 120-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (11091228) и ОБ ПЦР-праймер (1229-1248).

§Еф ГО N0: 38 представляет пример 38 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1311 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по тгА промотор из (21-325), последовательность, кодирующую 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу (326-1171), выделенную/модифицированную из кротоназы 3гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназной последовательности С1ок(пДшт Ьецеппски (СепВапк: АР494018), 120-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1172-1291) и ОБ ПЦР-праймер (1292-1311).

§Еф ГО N0: 39 представляет пример 39 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта тиолазы (1665 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую тиолазу (326-1525), выделенную/модифицированную из последовательности тиолазы ВШугЕзЬпо ПЬпкокепк (АВ 190764), 120-по терминатор гЬс§ из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1526-1645) и ОБ ПЦРпраймер (1646-1665).

§Еф ГО N0: 40 представляет пример 40 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4071 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую пируват-ферредоксин-оксидоредуктазу (326-3931), выделенную/модифицированную из последовательностей пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы МакйдатоеЬа ЬаНтиШ (СепВапк: ΑΥ101767), 120-по терминатор гЬс§ из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (39324051) и ОБ ПЦР-праймер (4052-4071).

§Еф ГО N0: 41 представляет пример 41 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта пируваткиназы (1806 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую пируваткиназу (326-1666), выделенную/модифицированную из пируваткиназы ТНегторго(еик (епа\ (СепВапк: АР065890), 120-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1667-1786) и ОБ ПЦР-праймер (1787-1806) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 42 представляет пример 42 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта энолазы (1696 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 231-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-251), последовательность, кодирующую энолазу (252-1556), выделенную/модифицированную из последовательностей цитозольной энолазы СН1атуДотопак геткагДШ (СепВапк: Х66412, Р31683), 120-по терминатор гЬс§ из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1557-1676) и ОБ ПЦР-праймер (1677-1696) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 43 представляет пример 43 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта фосфоглицератмутазы (2029 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 231-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-251), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (252-1889), выделенную/модифицированную из последовательностей фосфоглицератмутазы Ре1о(отаси1ит (Негторгорютсит §1 (СепВапк: ΥΈ_001213270), 120-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1890-2009) и ОБ ПЦР-праймер (2010-2029) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 44 представляет пример 44 для сконструированного оксифотобактериального ДНКконструкта фосфоглицераткиназы (1687 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 120), 231-по тгА промотор из ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (21-251), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (252-1433), выделенную из фосфоглицераткиназы Ре1о(отаси1ит (Негторгорютсит §1 (ВАР60903), 234-по терминатор гЬс§ ТНегтокупесНососсик е1опда(ик ВР-1 (1434-1667) и ОБ ПЦР-праймер (1668-1687).

§Еф ГО N0: 45 представляет пример 45 для сконструированного оксифотобактериального ДНК- 34 028407 конструкта глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1514 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 305-по тгЛ промотор ТЬегтокупесЬососсик е1опда!ик ВР-1 (21-325), последовательность, кодирующую фермент (326-1260), выделенную и модифицированную из НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы В1ак1осЫог1к νίτίάίκ (САС80993), 234-по терминатор гЪс8 из ТЬегтокупесЬососсик е1опда!ик ВР-1 (1261-1494) и ОБ ПЦР-праймер (1495-1514).

Сконструированные оксифотобактериальные гены, такие как показанные в §ЕЦ ГО N0: 34-45, можно выбрать для использования полностью или частично, и/или в сочетании с различными другими сконструированными генами пути продуцирования бутанола для построения различных сконструированных оксифотобактериальных путей продуцирования бутанола, таких как пути, показанные на фиг. 1. Например, сконструированные гены, показанные в §ЕЦ ГО N0: 34-45, можно выбрать для построения оксифотобактериального, управляемого тгА промотором и ответвленного от глицеральдегид-3-фосфата пути продуцирования бутанола (01-12), который включает следующие сконструированные ферменты: НАДзависимая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 01, фосфоглицераткиназа 02, фосфоглицератмутаза 03, энолаза 04, пируваткиназа 05, пируват-ферредоксин-оксидоредуктаза (или пируват-НАДФ+оксидоредуктаза) 06, тиолаза 07, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа 08, кротоназа 09, бутирил-КоАдегидрогеназа 10, бутиральдегиддегидрогеназа 11 и бутанолдегидрогеназа 12. Использование этих сконструированных оксифотобактериальных генов пути продуцирования бутанола (8ЕЦ ГО N0: 34-45) у термофильной и/или терморезистентной цианобактерии может представлять собой термофильную и/или терморезистентную продуцирующую бутанол оксифотобактерию. Например, использование этих сконструированных генов (8ЕЦ ГО N0: 34-45) у термофильной/терморезистентной цианобактерии, такой как ТЬегтокупесЬососсик е1опда1ик ВР-1 может представлять собой сконструированную термофильную/терморезистентную продуцирующую бутанол бактерию, такую как сконструированный продуцирующий бутанол ТЬегтокупесЬососсик.

Дополнительные модификации хозяина для помощи в обеспечении биологической безопасности

Данное изобретение также обеспечивает способы биобезопасного продуцирования фотосинтетического биотоплива на основе сконструированных трансгенных растений (таких как водоросли и оксифотобактерии) или растительных клеток с контролируемым клеточным делением. Сконструированный фотосинтетическое организм с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) создают посредством использования сконструированного гена(генов) контроля биологической безопасности (фиг. 2С) в сочетании с сконструированным геном(генами) пути продуцирования бутанола (фиг. 2А-2Р) так, чтобы его клеточное деление и функцию скрещивания можно было контролируемо остановить для обеспечения более хороших признаков биологической безопасности.

В одном из различных вариантов осуществления основным признаком является то, что сконструированный фотосинтетический организм с контролируемым клеточным делением (такой как водоросль, растительная клетка или оксифотобактерия) содержит две ключевые функции (фиг. 3А): сконструированный механизм(ы) биологической безопасности и сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива. Как показано на фиг. 3В, сконструированный признак(признаки) биологической безопасности придается с помощью ряда механизмов, включая: (1) индуцибельную вставку сконструированных протонных каналов в цитоплазматическую мембрану для постоянного блокирования какого-либо клеточного деления и способности к скрещиванию, (2) избирательное применение сконструированного регуляторного белка цикла клеточного деления или интерференционной РНК (иРНК) для постоянного ингибирования цикла клеточного деления и предпочтительно удерживания клетки в Οι фазе или О₀ состоянии и (3) инновационное использование фотосинтетического организма-хозяина нуждающегося в высоком содержании СО2 для экспрессии сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива. Примеры сконструированного пути(путей) продуцирования биотоплива включают сконструированный путь(пути) продуцирования бутанола, который работает с циклом Кальвина для синтеза биотоплива, такого как бутанол, непосредственно из диоксида углерода (СО2) и воды (Н2О). Сконструированная технология контроля клеточного деления может помочь обеспечить биологическую безопасность при использовании сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования биотоплива. Соответственно, данный вариант осуществления обеспечивает, среди прочего, биобезопасные способы продуцирования биотоплива на основе сконструированной, продуцирующей биотопливо, с контролируемым клеточным делением водоросли, цианобактерии, оксихлорбактерии, растения или растительных клеток.

В одном из различных вариантов осуществления сконструированную, продуцирующую бутанол, с контролируемым клеточным делением эукариотическую водоросль или растительную клетку создают путем введения сконструированного гена протонного канала (фиг. 2Н) в хозяйскую водоросль или растительную клетку (фиг. 3В). §ЕЦ ГО N0: 46 представляет пример 46 для детализированного ДНКконструкта сконструированного, под управлением №а1 промотора гена протонного канала (609 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 262-по промотор нитратредуктазы N131 (21-282), последовательность, кодирующую мелиттиновый протонный канал (283-366), 223-по терминатор КЪс82 (367-589) и ОБ ПЦР-праймер (590-609).

Экспрессия сконструированного гена протонного канала (фиг. 2Н) контролируется индуцибельным

- 35 028407 промотором, таким как промотор нитратредуктазы (№а1), который может также использоваться для контроля экспрессии сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива. Поэтому, перед тем, как индуцируют экспрессию сконструированного гена(генов), сконструированный организм может расти фотоавтотрофно, используя С0₂ в качестве источника углерода и Н₂О в качестве источника электронов, подобно организмам дикого типа. Когда культура сконструированного организма выращена и готова для фотобиологического продуцирования биотоплив, тогда клеточную культуру помещают в специфическое индуцирующее условие (например, путем внесения нитрата в культуральную среду, если в качестве индуцибельного промотора используется промотор нитратредуктазы (№а 1)) для индуцирования экспрессии как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена(генов) продуцирования биотоплива. Экспрессия гена протонного канала сконструирована так, чтобы осуществлять его транскрипцию в ядре и его трансляцию в цитозоле. Из-за специфического молекулярного конструирования экспрессированные протонные каналы автоматически включаются в цитоплазматическую мембрану, но оставляют интактной фотосинтетическую тилакоидную мембрану. Включение сконструированных протонных каналов в цитоплазматическую мембрану нарушает протонный градиент через цитоплазматическую мембрану так, чтобы клеточное деление и функция скрещивания были постоянно заблокированы. Однако фотосинтетическая тилакоидная мембрана внутри хлоропласта сохраняется интактной (функциональной) так, чтобы сконструированные ферменты пути продуцирования биотоплива, которые экспрессируются в стромальную область, могли работать с циклом Кальвина для фотобиологического продуцирования биотоплив из С0₂ и Н₂О. То есть, когда как сконструированный ген протонного канала, так и сконструированный ген(гены) пути продуцирования биотоплива запустятся, сконструированный организм станет невоспроизводимой клеткой для целенаправленного фотосинтетического продуцирования биотоплив. Из-за того, что клеточное деление и функция скрещивания на этой стадии постоянно заблокированы (устранены), культура сконструированного организма более не является живой материей, за исключением ее каталитической функции для фотохимического превращения С02 и Н2О в биотопливо. Он более не будет способен скрещиваться и обмениваться какими-либо генетическими материалами с какими-либо другими клетками, даже если он каким-либо образом войдет во взаимодействие с клеткой дикого типа, как это будет в случае непредвиденной утечки в окружающую среду.

Согласно одному из различных вариантов осуществления промотор нитратредуктазы (№а1) или промотор нитритредуктазы (тгА) является предпочтительным индуцибельным промотором для использования для контроля экспрессии сконструированных генов. В присутствии аммония (но не нитрата) в культуральной среде, например, сконструированный организм с сконструированным геном протонного канала под контролем №а1 промотора и геном(генами) пути продуцирования биотоплива может расти фотоавтотрофно, используя С02 в качестве источника углерода и Н2О в качестве источника электронов подобно организму дикого типа. Когда культура сконструированного организма выращена и готова для фотобиологического продуцирования биотоплив, тогда экспрессия как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива может быть индуцирована путем внесения некоторого количества нитратного удобрения в культуральную среду. Нитрат широко представлен в почвах и почти во всей поверхностной воде на Земле. Поэтому, даже если непредвиденно произойдет утечка сконструированного организма под контролем №а1 промотора в естественную окружающую среду, он вскоре умрет, так как нитрат в окружающей среде запустит экспрессию сконструированного, находящегося под контролем №а1 промотора гена протонного канала, который включит протонные каналы в цитоплазматическую мембрану, тем самым, убивая клетку. То есть, сконструированный фотосинтетический организм с находящимся под контролем №а1 промотора геном протонного канала запрограммирован умереть, как только встретится с нитратом в окружающей среде. Эта характеристика сконструированных организмов с контролируемым клеточным делением с находящимся под контролем №а1 промотора геном протонного канала обеспечивает дополнительное свойство биологической безопасности.

Недавно был раскрыта область техники построения гена протонного канала (фиг. 2Н) с нацеливающей на тилакоидную мембрану последовательностью Цатек Ьее (2007). Сконструированные трансгенные водоросли с протонным каналом для фотобиологического продуцирования водорода, международная публикация РСТ номер: \У0 2007/134340 А2]. В данном изобретении создания сконструированного организма с контролируемым клеточным делением при конструировании гена протонного канала должна быть упущена нацеливающая на тилакоидную мембрану последовательность. Например, важными компонентами сконструированного, находящегося по контролем №а1 промотора гена протонного канала может быть просто №а1 промотор, связанный с последовательностью, кодирующей протонный канал (без какой-либо нацеливающей на тилакодиную мембрану последовательности) так, чтобы протонный канал включался в цитоплазматическую мембрану, но не в фотосинтетическую тилакоидную мембрану.

Согласно одному из различных вариантов осуществления предпочтительной практикой является использование такого же индуцибельного промотора, например №а1 промотора, для контроля экспрессии как сконструированного гена протонного канала, так и сконструированного гена пути продуцирования биотоплива. Таким образом, сконструированный путь(пути) продуцирования биотоплива может ин- 36 028407 дуцибельно экспрессироваться одновременно с экспрессией сконструированного гена протонного канала, который ликвидирует определенные клеточный функции, включая клеточное деление и скрещивание.

В одном из различных вариантов осуществления индуцибельный промотор, который может использоваться в данном варианте осуществления сконструированной биологической безопасности, выбирают из группы, включающей промоторы гидрогеназ |НуйА1 (Нуй1) и НуйА2, регистрационный номер: А1308413, АР289201, ΑΥ090770], промотор гена Сус6, промотор гена Срх1, промотор белка теплового шока Н8Р70А, промотор гена СаЪП-1 (регистрационный номер М24072), промотор гена Са1 (регистрационный номер Р20507), промотор гена Са2 (регистрационный номер Р24258), промотор нитратредуктазы (№а1), промоторы гена нитритредуктазы (ийА), промоторы гена 1ох двухсторонней гидрогеназы, свето- и теплочувствительные дгоЕ промоторы, промоторы гЪсЬ оперона КиЫзсо, металл (цинк)индуцибельный зт1 промотор, чувствительный к железу ША промотор, редокс-чувствительный сг1К промотор, промотор, гена теплового шока 1зр16.6, промотор малого белка теплового шока (Нзр), промоторы чувствительного к СО₂ гена карбоангидразы, чувствительный к зеленому/красному свету промотор срсВ2А2, чувствительные к УФ-свету 1ехА, гесА и тиуВ промоторы, промоторы гена нитратредуктазы (пагВ) и их сочетания.

В другом варианте осуществления сконструированный фотосинтетический организм с контролируемым клеточным делением создают с использованием мутанта с дефицитом по карбоангидразе или мутанта, нуждающегося в высоком содержании СО₂, в качестве организма-хозяина для создания сконструированного организма для продуцирования биотоплива. Мутанты, нуждающиеся в высоком содержании СО₂, которые можно выбрать для использования в данном изобретении, включают (но без ограничений): 12-1С мутант с дефицитом по карбоангидразе СЫашуйошопаз геЫНагйЫ (СС- 1219 са1 т1-), аа3 мутант СЫашуйошопаз гешйатйЫ (Р1аЫ Рйузю1оду 2003, 132:2267-2275), нуждающийся в высоком содержании СО₂ М3 мутант Зупесйососсиз зр. штамм РСС 7942 или дефицитные по карбоксисомам клетки §упесйосузйз зр. РСС 6803 (Р1аЫ Ъю1 (δΐιιΐΐβ) 2005, 7:342-347), у которых отсутствует механизм концентрирования СО₂, могут расти фотоавтотрофно только при повышенном концентрационном уровне СО₂, таком как 0,2-3% СО₂.

При атмосферном концентрационном уровне СО₂ (380 ррш (частей на миллион)), мутанты с дефицитом по карбоангидразе или нуждающиеся в высоком содержании СО₂ как правило не выживают. Поэтому ключевым концептом здесь является то, что сконструированный, продуцирующий биотопливо организм, нуждающийся в высоком содержании СО₂, у которого отсутствует механизм коцентрирования СО₂, будет выращиваться и использоваться для фотобиологического продуцирования биотоплив всегда при повышенном концентрационном уровне СО₂ (0,2-5% СО₂) в герметизированном биореакторе с подачей СО₂. Такой сконструированный трансгенный организм не может выжить, если будет подвергнут атмосферному концентрационному уровню СО₂ (380 ррш = 0,038% СО₂) по причине того, что его СО₂концентрирующий механизм (ССМ) для эффективной фотосинтетической фиксации СО₂ был ослаблен мутацией. Даже если произойдет непредвиденная утечка такого сконструированного организма в естественную окружающую среду, его клетка вскоре не будет способна делиться или скрещиваться, но быстро умрет из-за углеродного голодания, так как она не может эффективно осуществлять фотосинтетическую фиксацию СО₂ при атмосферной концентрации СО₂ (380 ррш). Таким образом, использование такого мутанта, нуждающегося в высоком содержании СО₂, в качестве организма-хозяина для генной трансформации сконструированного гена(генов) пути продуцирования биотоплива представляет собой другой путь при создании сконструированных организмов с предусмотренным контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотобиологического продуцирования биотоплив из СО₂ и Н₂О. Здесь нет необходимости в сконструированном гене протонного канала.

В другом варианте осуществления сконструированный организм с контролируемым клеточным делением (фиг. 3В) создают путем использования сконструированного регуляторного гена цикла клеточного деления в качестве гена контроля биологической безопасности (фиг. 2О), который может контролировать экспрессию генов цикла клеточного деления (сйс) у организма-хозяина так, чтобы он мог индуцибельно останавливать свои репродуктивные функции, например, перманентно выключая клеточное деление и возможность скрещивания при специфическом индуцировании сконструированного гена.

Биологически это является экспрессией естественных сйс генов, которая контролирует клеточный рост и цикл клеточного деления у цианобактерий, водорослей и клеток высших растений. Наиболее основной функцией клеточного цикла является безошибочное удвоение огромного количества ДНК в хромосомах во время δ фазы (δ для синтеза) и затем точное разделение копий на две идентичные дочерние клетки во время М фазы (М для митоза). Митоз обычно начинается с хромосомной конденсации: удвоенные нити ДНК, упакованные в удлиненные хромосомы, конденсируются в намного более компактные хромосомы, необходимые для их расхождения. Затем ядерная оболочка разрушается и реплицированные хромосомы, каждая включающая пару сестринских хроматид, становятся прикрепленными к микротрубочкам митотического веретена. В ходе митоза клетка ненадолго делает паузу в состоянии, называемом метафаза, когда хромосомы выстроены в линию на экваторе митотического веретена, уравновешены для расхождения. Неожиданное расхождение сестринских хроматид обозначает начало анафазы, во время которой хромосомы движутся к противоположным полюсам веретена, где они деконденсируются, и за- 37 028407 ново формируется интактное ядро. Клетка затем перешнуровывается в две с помощью цитоплазматического деления (цитокинез), и после этого клеточное деление завершено. Следует отметить, что большинству клеток необходимо гораздо больше времени для роста и удвоения их массы белков и органелл, чем им нужно для репликации их ДНК (8-фаза) и деления (М-фаза). Поэтому существуют две промежуточные фазы: О^фаза между М-фазой и 8-фазой, и О₂-фаза между 8-фазой и митозом. В итоге цикл эукариотической клетки традиционно разделяют на четыре последовательные фазы: О_ь 8, О₂ и М. Физиологически две промежуточные фазы также обеспечивают время для клетки для наблюдения за внутренней и внешней окружающей средой для того, чтобы удостовериться, что условия являются пригодными и приготовления завершены перед тем, как клетка сама подвергнется 8-фазе и митозу. Фаза О₃ является особо важной в этом аспекте. Ее длительность может сильно варьировать в зависимости от внешних условий и внеклеточных сигналов из других клеток. Если внеклеточные условия неблагоприятны, например, клетки откладывают продвижение через О и могут даже войти в специализированное состояние покоя, известное как О0 (О ноль), в котором они остаются дни, недели или даже годы перед тем, как возобновить пролиферацию. Фактически многие клетки остаются постоянно в состоянии О0 до тех пор, пока не умрут.

В одном из различных вариантов осуществления сконструированный ген(гены), который кодирует сконструированный сбс-регуляторный белок или специфическую сбс-иРНК, используется для индуцибельного ингбирования экспрессии определенного сбс гена(генов) для остановки клеточного деления и блокирования возможности скрещивания в случае, когда сконструированный ген(гены) переключаются специфическим индуцирующим условием. Когда, например, сконструированные культуры с контролируемым клеточным делением выращены и готовы для фотосинтетического продуцирования биотоплив, предпочтительной практикой является индуцирование экспрессии специфического сконструированного гена(генов) сбс-иРНК наряду с индукцией сконструированного гена (гены) пути продуцирования биотоплива так, что клетки будут перманентно остановлены в О₃ фазе или О₀ состоянии. Таким образом, выращенные клетки сконструированного организма станут превосходными катализаторами фотосинтетического продуцирования биотоплив из СО₂ и Н₂О в то время как их функции клеточного деления и скрещивания перманентно выключены в О₃ фазе или О₀ состоянии, чтобы помочь обеспечить биологическую безопасность.

Применение вариантов осуществления биологической безопасности с различными сконструированными генами пути продуцирования биотоплива, которые перечислены в 8Е0 ГО: 1-45, может создать различные биобезопасные фотобиологические продуценты биотоплива (фиг. 3Α, 3Β и 3С). Следует отметить, что 8Е0 ГО NО: 46 и 1-12 (примеры 1-12) представляют собой пример сконструированного эукариотического организма с контролируемым клеточным делением, такой как сконструированная водоросль, с контролируемым клеточным делением (например, СЬ1атуботопа8), которая содержит находящийся под контролем №а1 промотора сконструированный ген протонного канала (8Е0 ГО NО: 46) и набор находящихся под контролем №а1 промотора сконструированных генов пути продуцирования бутанола (8Е0 ГО NО: 1-12). По причине того, что сконструированный ген протонного канала и сконструированный ген(гены) пути продуцирования биотоплива, все контролируются одними и теми же №а1 промоторными последовательностями, они могут одновременно экспрессироваться при индукции путем внесения нитратного удобрения в культуральную среду для обеспечения возможности биобезопасного фотосинтетического продуцирования биотоплива, как проиллюстрировано на фиг. 3Β. Применение сконструированных, находящихся под контролем №а1 промотора генов пути продуцирования бутанола (8Е0 ГО NО: 1-12) у нуждающегося в высоком содержании СО₂ хозяйского фотосинтетического организма, такого как 12-1С мутант с дефицитом по карбоангидразе СЬ1атуботопа8 ге1пЬагбН (СС-1219 са1 т(-) или иа3 мутант СЬ1атуботопа8 гешЬагбй, представляет собой другой пример при создании сконструированного фотосинтетического организма с контролируемым клеточным делением для обеспечения биологической безопасности.

Этот сконструированный признак биологической безопасности можно применять для продуцирования других биотоплив, таких как биомасла, биоводород, этанол, а также промежуточных продуктов. Например, этот вариант осуществления биологической безопасности в сочетании с набором сконструированных генов пути продуцирования этанола, таких как показанные в 8Е0 ГО NО: 47-53, может представлять собой продуцент этанола с контролируемым клеточным делением (фиг. 3С). Вкратце, 8Е0 ГО NО: 47 представляет пример 47 детализированного ДНК-конструкта (1360 пар оснований (по)) находящегося под контролем ΗγΑ промотора сконструированного гена НАД-зависимой глицеральдегид-3фосфат-дегидрогеназы, который включает: ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ΗγΑ промотор (21-108), выделенный из промоторной последовательности гена нитратредуктазы штамма Ρ^ 7942 8упесЬососси8 8р. (пресноводная цианобактерия), последовательность, кодирующую фермент (1091032), выделенную и модифицированную из последовательности цитозольной НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Суашбшт са1багшт (регистрационный номер ОепВапк: СΑС85917), 308-по гЪс8 терминатор штамма Ρ^ 7942 8упесЬососси8 8р. (1033-1340) и ОБ ПЦР-праймер (1341-1360) на 3' конце.

8ЕО ГО NО: 48 представляет пример 48 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицерат- 38 028407 киназы под контролем ηίτΆ промотора (1621 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΆ промотор нитратредуктазы штамма РСС 7942 §упесйососси8 8р. (21-108), последовательность, кодирующую фосфоглицераткиназу (109-1293), выделенную из последовательности фосфоглицераткиназы НТА426 СеоЬасй1и8 каи81орНйи8 (СепВапк: ΒΑΌ77342), 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 §упескососси8 8р. (1294-1601) и ОБ ПЦР-праймер (1602-1621).

§Еф ГО N0: 49 представляет пример 49 для сконструированного ДНК-конструкта фосфоглицератмутазы под контролем ηίτΆ промотора (1990 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΆ промотор нитритредуктазы штамма РСС 7942 §упескососси8 8р. (21-108), 9-по ХНо I Ше1 сайт (109-117), последовательность, кодирующую фосфоглицератмутазу (118-1653), выделенную из последовательности фосфоглицератмутазы ЭБМ 8903 Са1йюе11и1о8пир1ог 8ассНато1уйси8 (СеиΒαηΕ АВР67536), 9-по ХЬа1 сайт (1654-1662), 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 Бу^сНо^сс^ 8р. (1663-1970) и ОБ ПЦР-праймер (1971-1990).

§Еф ГО N0: 50 представляет пример 50 для сконструированного ДНК-конструкта энолазы под контролем ηίτΆ промотора (1765 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΆ промотор нитритредуктазы штамма РСС 7942 БугесНососсш 8р. (21-108), 9-по ХНо I Ше1 сайт (109117), последовательность, кодирующую энолазу (118-1407), выделенную из последовательности энолазы ССУ0110 СуатИесе 8р. (СеηΒаηк: 2Р_01727912), 21-по последовательность, кодирующую Ьитю-метку (1408-1428), 9-по ХЬа1 сайт (1429-1437), содержащий стоп-кодон, 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 БугесНососсш 8р. (1438-1745) и ОБ ПЦР-праймер (1746-1765) на 3' конце.

§Еф ГО N0: 51 представляет пример 51 для сконструированного ДНК-конструкта пируваткиназы под контролем ηίτΆ промотора (1888 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΆ промотор нитритредуктазы штамма РСС 7942 Бу^сНо^сс^ 8р. (21-108), 9-по ХНо I №е1 сайт (109-117), последовательность, кодирующую пируваткиназу (118-1530), выделенную из последовательности пируваткиназы Бе1еηотоηа8 гиттайшт (СеηΒаηк: АВ037182), 21-по последовательность-метку Ьитю (1531-1551), 9-по ХЬа1 сайт (1552-1560), 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 БугесНососсш 8р. (1561-1868) и ОБ ПЦР-праймер (1869-1888).

БЕС ГО N0: 52 представляет пример 52 для сконструированного ДНК-конструкта пируватдекарбоксилазы под контролем ηίτΑ промотора (2188 по), который включает ПР ПЦР-праймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΑ промотор нитритредуктазы штамма РСС 7942 БугесНососсш 8р. (21-108), 9по ХНо I Ч0е1 сайт (109-117), последовательность, кодирующую пируватдекарбоксилазу (118-1830), выделенную из последовательностей пируватдекарбоксилазной последовательности РюЫа 80рШ8 (СеηΒаηк: ХМ_001387668), 21-по последовательность-метку Ьитю (1831-1851), 9-по XЬаI сайт (1852-1860), 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 Бу^сНо^сс^ 8р. (1861-2168) и ОБ ПЦР-праймер (2169-2188) на 3' конце.

БЕС ГО N0: 53 представляет пример 53 для сконструированного ДНК-конструкта НАД(Ф)Нзависимой алкогольдегидрогеназы под контролем ηίτΑ промотора (1510 по), который включает ПР ПЦРпраймер (последовательность 1-20), 88-по ηίτΑ промотор нитритредуктазы штамма РСС 7942 БумесНососси8 8р. (21-108), последовательность, кодирующую НАД(Ф)Н-зависимую алкогольдегидрогеназу (109-1161), выделенную/модифицированную (удалена ее последовательность митохондриального сигнального пептида) из последовательности гена алкогольдегидрогеназы (ΑΌΗ3) К1иууетотусе8 1асО8 (СеηΒаηк: Х62766), 21-по последовательность-метку Ьитю (1162-1182), 308-по гЬсБ терминатор штамма РСС 7942 Бу^сНо^сс^ 8р. (1183-1490) и ОБ ПЦР-праймер (1491-1510) на 3' конце.

Следует отметить, что БЕС ГО N0: 47-53 (примеры ДНК-конструктов 47-53) представляют собой набор сконструированных генов, находящихся под контролем ηίτΑ промотора, пути продуцирования этанола, которые могут использоваться у оксифотобактерий, таких как штамм РСС 7942 БугесНососсш 8р. Применение этого набора сконструированных генов пути продуцирования этанола у нуждающейся в высоком содержании С0₂ цианобактерии, такой как БугесНососсш 8р. мутант М3 штамма РСС 7942 представляет собой другой пример сконструированной цианобактерии с контролируемым клеточным делением для биобезопасного фотосинтетического продуцирования биотоплив из С0₂ и Н₂О.

Применение сконструированных продуцирующих бутанол организмов способами фотобиореакторсбор бутанола.

Различные варианты осуществления, кроме того, раскрывают как сконструированные организмы, включая сконструированные организмы с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) могут применяться с помощью фотобиореактора и способа сепарации-сбора бутанола для фотосинтетического продуцирования бутанола (СН₃СН₂СН₂СН₂0Н) и О₂ непосредственно из С0₂ и Н₂О, используя солнечный свет. Существует ряд вариантов осуществления в отношении того, как сконструированные организмы могут применяться для фотобиологического продуцирования бутанола. Одним из предпочтительных вариантов осуществления является применение сконструированных организмов для непосредственного фотосинтетического продуцирования бутанола из С02 и Н2О с помощью системы фотобиологического реактора и сбора бутанола (фильтрация и перегонка/выпаривание), которое включает специфический технологический процесс, описанный в виде серии следующих этапов: а) выращивают сконструированный трансгенный организм фотоавтотрофно в минимальной культуральной среде, используя С0₂ возду- 39 028407 ха в качестве источника углерода в аэробных (нормальных) условиях перед индукцией экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; Ъ) когда культура сконструированных организмов выращена и готова для продуцирования бутанола, герметизируют или помещают культуры в специфическое условие, такое как анаэробное условие, которое может быть образовано удалением О₂ из фотобиологического реактора, для индукции экспрессии сконструированных генов продуцирования бутанола; с) когда сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола экспрессируются, обеспечивают видимую световую энергию, такую как солнечный свет, для клеток с экспрессируемыми сконструированными генами для работы в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из С02 и Н2О; б) собирают продукт бутанол каким-либо способом, известным специалистам данной области техники. Например, собирают продукт бутанол из фотобиологического реактора сочетанием техник мембранной фильтрации и дистилляции/выпаривания для сбора бутанола и гибко собирают газовый продукт О2 из реактора. Вышеуказанный способ применения сконструированных организмов для фотосинтетического продуцирования СН₃СН₂СН₂СН₂0Н и О₂ из С0₂ и Н₂О с помощью биологического реактора и сбора бутанола и сепарации газового продукта и системы сбора отходов может повторяться в течение множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов. Какой-либо из этапов а)-б) данного способа, описанного выше, можно также отрегулировать в соответствии с данным изобретением для того, чтобы удовлетворять определенным специфическим условиям. На практике, какой-либо из этапов а)-б) способа может применяться полностью или частично, и/или в каком-либо регулируемом сочетании, а также для усиления фотобиологического продуцирования бутанола в соответствии с данным изобретением. Источники С0₂ которые могут использоваться в данном способе, включают, но без ограничений, промышленный С02, (би)карбонаты и атмосферный С02. Например, С02 дымового газа из промышленного оборудования, которое работает на ископаемом топливе или биомассе, может вводиться через трубопровод в фотобиологический реактор в данном способе. Промышленное оборудование, которое может генерировать С02 ресурсы для сконструированного процесса фотосинтетического продуцирования бутанола, включает (но без ограничений): угольные электростанции, черную металлургию, производящие цемент заводы, оборудование нефтеперерабатывающих заводов, фабрики по производству химических удобрений, оборудование для перегонки/сепарации биотоплив (или промежуточных продуктов), работающее на биомассе и/или ископаемом топливе, способы пиролиза биомассы, дымовые трубы, ферментационные биореакторы, оборудование для производства биотоплива и их сочетания.

Альтернативно, этот сконструированный процесс фотобиологического продуцирования бутанола может также использовать С0₂ в окружающей среде, а также из атмосферы. Газообразный С0₂, растворённый С0₂, бикарбонат и карбонаты все могут использоваться с помощью технологии фотобиологического продуцирования бутанола сконструированным организмом.

Этот вариант осуществления иллюстрируется более детально в данном документе с помощью, например, сконструированных водорослей. Как описано выше, сконструированные водоросли по данному изобретению, такие как содержащая набор сконструированных генов под контролем НубА1 промотора пути продуцирования бутанола (например, ДНК-конструкты 8Е0 ГО N0: 13-16 (или 17) и 18-23), могут расти нормально в аэробных условиях с помощью автотрофного фотосинтеза, используя С0₂ воздуха путем, подобным таковому водоросли дикого типа. Сконструированные водоросли могут также расти фотогетеротрофно, используя также органический субстрат.

В предпочтительном варианте осуществления сконструированную водоросль выращивают фотоавтотрофно, используя С0₂ воздуха в качестве источника углерода в аэробных условиях в минимальной среде, которая содержит необходимые минеральные (неорганические) питательные вещества. Органический субстрат, такой как ацетат, не нужен для роста сконструированной водоросли в нормальных условиях перед тем, как экспрессируются сконструированные гены фотосинтетического пути продуцирования бутанола. Большинство водорослей могут быстро расти в воде посредством автотрофного фотосинтеза, используя С02 воздуха, поскольку есть достаточно минеральных питательных веществ. Питательными элементами, которые, как правило, нужны для водорослевого роста являются: N Р и К при концентрациях около 1-10 мМ, и Мд, Са, δ и С1 при концентрациях около 0,5 -1,0 мМ, плюс некоторые следовые элементы Ми, Ре, Си, Ζπ, В, Со, Мо среди прочих при μΜ концентрационных уровнях. Все минеральные питательные вещества могут поставляться в водную минимальную среду, которую можно сделать по общепринятым рецептам водорослевых культуральных сред, используя воду (пресную воду для сконструированных пресноводных водорослей; морскую воду для солетолерантных сконструированных морских водорослей) и относительно небольшие количества недорогих удобрений и минеральных солей, таких как аммония бикарбонат (МН₄НС0₃) (или аммония нитрат, мочевина, аммония хлорид), калия фосфаты (К₂НР0₄ и КН₂Р0₄), магния сульфат гептагидрат (Мд80₄-7Н₂0), кальция хлорид (СаС1₂), цинка сульфата гептагидрат ^и80₄-7Н₂0), железа (II) сульфата гептагидрат (Ре80₄-7Н₂0) и борная кислота (Н₃В0₃), среди прочих. То есть, большие количества клеток сконструированных водорослей можно недорого выращивать за короткий промежуток времени, потому что, при аэробных условиях, таких как в открытом пруду, сконструированные водоросли могут фотоавтотрофно расти сами по себе, используя С02 воздуха так же быстро, как и их родственные штаммы дикого типа. Это является значимым призна- 40 028407 ком (преимуществом) данного изобретения, который может предоставить экономичное решение при выработке фотоактивных биокатализаторов (сконструированные, фотосинтетические, продуцирующие бутанол водоросли) для продуцирования возобновляемой солнечной энергии.

Когда водорослевые культуры выращены и готовы для продуцирования бутанола, выросшие водорослевые культуры герметизируют или помещают в определенные специфичные условия, например, анаэробные условия, которые можно образовать удалением О₂ из герметизированного фотобиологического реактора, для индукции экспрессии сконструированных генов под контролем НуДА1 промотора пути продуцирования бутанола. В случае, когда экспрессируются сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола, видимая световая энергия, такая как солнечный свет, поставляется для того, чтобы экспрессирующие сконструированные гены водорослевые клетки работали в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из С02 и Н2О. В случае, когда экспрессируются сконструированные гены, водорослевые клетки могут главным образом стать эффективными и мощными зелеными машинами, которые являются превосходными для фотосинтетического продуцирования бутанола (СН3СН2СН2СН20Н) и О2 из С02 и Н2О. Продукт бутанол из водорослевого фотобиологического реактора можно собирать сочетанием техник мембранной фильтрации и перегонки/выпаривания для сбора бутанола, включая (но без ограничений) экстракцию жидкость/жидкость, отгонку газа, мембранное выпаривание, первапорацию и адсорбционные техники (Эигге, Р. 1998 Арр1 М1сгоЬю1 ВюГесДпо1 49: 639648; ОигекЫ, НидДек, МаДДох, апД Сойа 2005 Вюргосекк ВюкукГ Епд 27: 215-222).

Фотосинтетическое продуцирование СН₃СН₂СН₂СН₂0Н и О₂ непосредственно из С0₂ и Н₂О в соответствии с данным изобретением может, в принципе, иметь высокий квантовый выход. Теоретически, нужно только 48 фотонов для продуцирования СН3СН2СН2СН20Н и 6О2 из воды и диоксида углерода с помощью этого механизма. Максимальный теоретический КПД по энергии солнечный свет-в-бутанол способом непосредственного фотосинтетического продуцирования бутанола из С02 и Н2О составляет около 10%, что является наиболее высоким возможным среди всех биологических подходов. В результате этот подход имеет огромный потенциал, когда правильно осуществляется с помощью водорослевого реактора и способа сбора бутанола и кислорода.

Вышеуказанный способ применения сконструированных водорослей для фотосинтетического продуцирования СН3СН2СН2СН20Н и О2 из С02 и Н2О с помощью водорослевого реактора и сбора бутанола, и сепарации газового продукта, и системы сбора отходов можно повторять в течение множества технологических циклов для достижения более желаемых результатов.

Другим признаком является то, что сконструированный переключаемый организм продуцирования бутанола обеспечивает способность повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста культуры в нормальных аэробных условиях таким образом, который подобен таковому дикого типа, и эффективное фотобиологическое продуцирование бутанола (фиг. 1 и 3) в случае, когда сконструированный путь продуцирования бутанола включается индуцибельным промотором (таким как промотор гидрогеназы) при определенных специфических индуцирующих условиях (например, в анаэробных условиях) в биореактор. Например, переключаемая сконструированная водоросль с сконструированными, находящимися под контролем промотора гидрогеназы генами продуцирования бутанола содержит нормальную митохондрию, которая использует восстановительную способность (НАДН) из органических запасов (и/или экзогенного субстрата, такого как ацетат) для питания энергией клетку сразу после ее возвращения в аэробные условия. Таким образом, когда водорослевую клетку возвращают в аэробные условия после ее применения в анаэробных условиях для продуцирования бутанола, клетка остановит продуцирование ферментов пути продуцирования бутанола и начнет восстанавливать свою нормальную фотоавтотрофную способность посредством синтеза нормального функционального хлоропласта. Следовательно, возможно применение такого типа генетически трансформированного организма в течение повторяющихся циклов фотоавтотрофного роста культур в нормальных аэробных условиях и эффективное продуцирование бутанола в анаэробных условиях в анаэробном реакторе. То есть, эта технология фотобиологического продуцирования бутанола может находиться в действии в течение множества технологических циклов путем омоложения использованной культуры в аэробных условиях и вторичного использования омоложенной водорослевой культуры в условиях продуцирования бутанола для достижения более желаемых результатов. Факультативно, эта технология фотобиологического продуцирования бутанола находится в действии непрерывно путем циркуляции омоложенной водорослевой культуры из аэробного реактора в анаэробный реактор, в тоже время циркуляции использованной водорослевой культуры из анаэробного реактора (после ее применения для продуцирования бутанола) в аэробный реактор для омоложения путем синтеза нормальных функциональных хлоропластов посредством фотосинтетической фиксации С02 и фотоавтотрофного роста. Некоторые из сконструированных организмов могли расти фотоавтотрофно даже при включенном пути(путей) продуцирования бутанола. Сможет ли вообще или как быстро сконструированный организм расти в условиях продуцирования бутанола может зависеть от его генетического фона и того, насколько много продуктов цикла Кальвина все еще доступны для роста клеток после применения посредством сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола. Сконструированные организмы, которые могут в условиях продуцирования бутанола поддерживать важные клеточные функции с подходящей скоростью роста могут также использоваться для непрерывного фотобиологического

- 41 028407 продуцирования СН₃СН₂СН₂СН₂ОН и О₂ из СО₂ и Н₂О с помощью биореактора и способа сбора материала бутанола.

Существуют дополнительные пути, которые могут применяться переключаемыми сконструированными организмами, включая сконструированные организмы с контролируемым клеточным делением (фиг. 3) для биобезопасного фотобиологического продуцирования биотоплив. С помощью применения сконструированных признаков биологической безопасности, описанных ранее, например, использованная сконструированная водорослевая культура из реактора для фотобиологического продуцирования бутанола не должна циркулировать назад в реактор для роста культур. Вместо этого использованная водорослевая культура изымается для применения в качестве удобрений или исходного материала биомассы для другого технологического процесса, так как фотоавтотрофный рост переключаемой сконструированной водоросли в реакторе для роста культур способен непрерывно поставлять водорослевые клетки в реактор фотобиологического продуцирования бутанола для продуцирования биотоплива. Этот вариант осуществления является, в частности, полезным для применения некоторых сконструированных организмов, которые могут расти фотоавтотрофно только до, но не после того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола. Например, путем удерживания непрерывно растущей культуры сконструированной водоросли (которая может расти фотоавтотрофно только до того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола) в реакторе для роста культур можно обеспечить непрерывные подачи выращенных водорослевых клеток для применения в реакторе фотобиологического продуцирования бутанола. Этот подход также делает возможным применение таких сконструированных организмов, которые могут расти только до того, как включен путь(пути) продуцирования бутанола, для фотобиологического продуцирования бутанола.

В силу различных причин некоторые из сконструированных организмов для продуцирования бутанола смогут расти только фотогетеротрофно или фотомиксотрофно, но не фотоавтотрофно. Применение реактора для роста культур может также выращивать этот тип сконструированных организмов для продуцирования бутанола фотогетеротрофно или фотомиксотрофно, используя органические субстраты, включая, но без ограничений, сахарозу, глюкозу, ацетат, этанол, метанол, пропанол, бутанол, ацетон, крахмал, гемицеллюлозу, целлюлозу, липиды, белки, органические кислоты, материалы биомассы и их сочетание. Выращенные таким образом культуры могут также поставляться в реактор фотобиологического продуцирования бутанола для индукции сконструированных путей для продуцирования бутанола. Этот модифицированный вариант осуществления роста культуры также делает возможным применение таких сконструированных организмов, которые могут расти только фотогетеротрофно или фотомиксотрофно, также для фотобиологического продуцирования бутанола.

Для определенных специфических сконструированных организмов с сконструированными, находящимися под контролем промотора нитратредуктазы (№а1) генами пути продуцирования бутанола вышеупомянутый фотобиологический реакторный процесс может быть дополнительно кроме того отрегулирован для достижения более благоприятных результатов. Например, как сконструированная водоросль, которая содержит находящиеся под контролем Νίη1 (или тгА) промотора гены пути продуцирования бутанола, такие как показанные в примерах конструкции ДНК-последовательностей 1-12 (8Е0 ГО N0: 1-12), так и сконструированная оксифотобактерия, которая несет сконструированные, находящиеся под контролем тгА промотора гены пути продуцирования бутанола, показанные в 8Е0 ГО N0: 34-45, могут нормально расти в культуральной среде с аммонием (но не нитратом) с помощью автотрофного фотосинтеза, используя СО₂ воздуха таким образом, который подобен таковому водоросли дикого типа. Это по причине того, что экспрессия генов пути продуцирования бутанола у сконструированного организма будет запускаться только в присутствии нитрата в качестве необходимого владения для применения промотора нитратредуктазы (ΝίΗ1) или промотора нитритредуктазы (тгА) при контроле экспрессии сконструированного пути(путей). Значимым признаком сконструированных организмов с находящимися под контролем тгА или Νίη1 промотора генами пути продуцирования бутанола является то, что экспрессия сконструированных путей продуцирования бутанола может индуцироваться манипулированием концентрационными уровнями нитрата (Ν0₃ ^-) относительно таковых аммония (ΝΉ4⁺) в культуральной среде без необходимости каких-либо анаэробных условий. То есть, экспрессия сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола может индуцироваться как в аэробных так и в анаэробных условиях. Это позволяет сконструированному фотобиологическому способу продуцирования бутанола функционировать даже в аэробных условиях, используя атмосферный С02. Аналогичным образом этот тип сконструированных организмов с находящимися под контролем №а1 промотора генами пути продуцирования бутанола также может расти фотоавтотрофно как в аэробных, так и в анаэробный условиях. Поэтому, в качестве дополнительного варианта осуществления, технологический способ применения сконструированного организма с находящимися под контролем промотора нитратредуктазы (№а1) генами пути продуцирования бутанола настраивают следующим образом: а) выращивают сконструированный трансгенный организм фотоавтотрофно в минимальной культуральной среде в присутствии аммония (ΝΉ₄ ⁺), но не нитрата (Ν03^-) до индукции экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; Ь) когда культура сконструированного организма выращена и готова для продуцирования бутанола, добавляют нитратное (Ν03^-) удобрение в культуральную среду для повышения концентрации нитрата (Ν0₃ ^-)

- 42 028407 по отношению к таковой аммония (МН₄ ⁺) для индукции экспрессии сконструированных генов пути продуцирования бутанола; с) когда сконструированные ферменты пути продуцирования бутанола экспрессируются, обеспечивают видимую световую энергию, такую как солнечный свет для того, чтобы клетки с экспрессируемыми сконструированными генами работали в качестве катализаторов для фотосинтетического продуцирования бутанола из С0₂ и Н₂О; й) собирают продукт бутанол из фотобиологического реактора сочетанием техник мембранной фильтрации и сбора бутанола.

Дополнительно к продуцированию бутанола, также возможно применение сконструированного организма или части его сконструированного пути(путей) продуцирования бутанола для продуцирования определенных промежуточных продуктов, включая бутиральдегид, бутирил-КоА, кротонил-КоА, 3гидроксибутирил-КоА, ацетоацетил-КоА, ацетил-КоА, пируват, фосфоенолпируват, 2-фосфоглицерат, 1,3-дифосфоглицерат, глицеральдегид-3-фосфат, дигидроксиацетонфосфат, фруктоза-1,6-дифосфат, фруктоза-6-фосфат, глюкоза-6-фосфат, глюкозу и глюкоза-1-фосфат. Таким образом, дополнительный вариант осуществления включает дополнительный этап сбора промежуточных продуктов, которые можно получить также из индуцированного трансгенного сконструированного организма. Продуцирование промежуточного продукта можно избирательно усилить путем выключения активности сконструированного фермента, которая катализирует его потребление в сконструированном пути. Продуцирование указанного промежуточного продукта можно увеличить также путем применения сконструированного организма с одним или несколькими сконструированными ферментами, которые опущены из сконструированных путей продуцирования бутанола. Например, сконструированный организм с бутанолдегидрогеназой или бутиральдегиддегидрогеназой, опущенной из сконструированного пути(пути) фиг. 1, может применяться для продуцирования бутиральдегида или бутирил-КоА, соответственно.

Несмотря на то, что данное изобретение проиллюстрировано описанием нескольких вариантов осуществления и, несмотря на то, что иллюстративные варианты осуществления описаны относительно детально, намерением заявителя не является сужение или ограничение каким-либо образом объема прилагаемой формулы изобретения до таких деталей. Дополнительные преимущества и модификации будут полностью понятны специалистам данной области техники.

Данное изобретение в его широчайших аспектах, поэтому не ограничивается до специфических деталей, образцового аппарата и способов, и показанных и описанных иллюстративных примеров. Таким образом, можно сделать отступления от таких деталей без отступления от замысла или объема основной идеи заявителя данного изобретения.

- 43 028407

Перечень последовательностей Последовательность № 1

Пример 1: сконструированный ДНК-конструкт бутанолдегидрогеназы (1809 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС еаеаеддСад ддедсдадед ассссдсдсд асееддадсе 60 сдаеддсссс дддеедсеед дддсдСссдс сСсесдсдсе аеесСдадсе ддадассдад 120 дсдсаСдааа аедсаеесдс еессаСадда сдседсаССд Сддсеедаад деесааддда 180 адддеесааа сдассссдсс деасдаасее еедесддддд дсдсесссдд ссссдддсес 240 еедедсдсдс аееадддсее сдддесдсаа дсаадасдае асАТСССССС ССТСАТТССС 300

ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ ССАСССТССС ССССАТСССС 360

ССССТСААСС СССССС'ГСАА СССТСССССС СТСССТСССС ССССТСАССС СААССАСаед 420 дадааееееа даеееааедс аеаеасадад аедсееееед дааадддаса ааГададаад 480 сеессададд ееееааааад аГаЬддГааа ааеаеаееас еедсаеаедд еддеддааде 540 аеаааааада аЪддасЬсГа едаеасеаес саааадсЬаЬ едааадаеее еааеаеедее 600 дааееаадед деаеедаасс аааГссаада аеедааасед Саадасдедд адеедаасее 660 едсадааааа аГааадЬада едееаееееа дседееддед дадддадеас ааеадаседс 720 есаааддееа еаддддсадд ееаееаееае дсГддадаГд саедддассе едеаааааае 780 ссадсГаааа еаддедадде еееассааеа дЪдасадЫЛ еаасааеддс адсЪасЬддГ 840 еседаааеда аЪадаааГдс едееаееееа аадаеддаеа саааедаааа дсееддааса 900 ддаЬсассГа адаедаессс есааасеесе аееееадаес садааеаеее дЬаГасаЪЬд 960 ссадсааеес ааасадседс аддеедедсе даеаееаеде сасасаеаее едаасааеае 1020 еееааеаааа сГасадаЪдс еееедеасаа даеаааееед сддааддеее деедсааасе 1080 едеаеаааае аеедссседе едсеееааад даассааада аееаедаадс еададсааае 1140 аеааедеддд сеадеесаае ддсесееаас ддасееееад даадедддаа адседдадсе 1200 еддасеедес аессааеада асаедааееа адедсаееее аЬдаГаСаас есаеддадеа 1260 ддесеедсаа ееееаасесс аадееддаед адаеаеаесе еаадедаеде аасадеедае 1320 аадееедееа асдеаеддса еееадаасаа ааадаадаСа ааееедсесе едсаааедаа 1380 дсааСадаГд саасадаааа аеесеееааа дсеедеддеа еессааедас еееааседаа 1440 сееддааеад аеааадсааа сееедаааад аГддсаааад сЬдсадГада асаеддедсе 1500 ееадааеаед саеаедееес аееаааедсс даддаедеае аеааааееее адаааГдГсс 1560 сеьеааТААА ТССАСССССТ ССТТСАТСТС АСССТТСССС ССТСАССААС СССССТССАТ 1620

ССААСАТАСТ ССТСТСААСТ ССТСААСССС ТАССТТАССТ СССССТТТСС ТССТСАТСАС 1680

ТСТТТТТСАА САССТААААА ССССАССАСТ ТТТССААТТТ ТСТТССТТСТ ААССАТССТС 1740 ссттсатттт сссстстттс тссатссссс ссстссссст АтттедАССд деесесесее 18оо седссдееа 1809

Последовательность № 2

АСААААТСТС сдаеддсссс дсдсаЬдааа адддеесааа еедедсдсдс

ААСТССТССС

ССССТСААСС аееааадаса дссааЪсГаа ааСдсГаГаа сааададааа дсЬасааЬда дааееадеад даСаасдддс

СсЬасдааЪс аседеддеае аеаааеааад ссаасГаГдд асЪддадддс ддедседдаа адеаесаеед ееедееееед

Пример 2: сконструированный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы (2067 по) ССАССАСАСС еаеаеддеад ддедсдадед ассссдсдсд асееддадсе дддеедееед аедсаеесдс сдассссдсс аееадддсее тстссосссс ССССССТСАА сдсЬадееес адаас хасаа дсааГдссдГ аааЬсаГаас еесеедаада сеаааеасас ееасадееде сааседааас ееаасддаса сеаееаееес асесесеада саддааедде аессассаде ааддседеес адаасдеедс дддсдЬссдс еессаеадда деасдаасее сдддесдсаа сстссстссс состсссссс еаеаасаааа ддаедаеесе асасдсасаа едадаеаада аасасаеаед есседддаса адаааедесе едеааеаеде ессаддсдсе аедеддедде едсааееаее ааааасссес еаеедеадае еееедаеаае адаедаеееа сесесдсдсе сдседсаеед еедесддддд дсаадасдае

СССССССССТ стссстсссс даеееааааС есаедееесд аадаеаееае ааддссдсае ддаадаЬаЬд даадаеееаа ссаеаеддсд ааГадГаГад ааааааЬдЬд сседадааее аадсасссее ееаааеесед даеаседсед ааеееассее аГаСсГааса аееседадсе еддсеедаад дсдсЬсссдд асАТСССССС ССАСССТССС ССССТСАССС еааааасааа дадеееесда сссеесаееа ГадааааГаа аадаеаааае сСасеаседс ееаеаддедс дсаедаеадс седее (хе еде СадСаасаас сааСаааасе деаадааадс аеаСадаааа деаеедсада едсСаааааа ддадассдад деесааддда ссссдддсес

ССТСАТТССС

ССССАТСССС

СААССАСаед едеедаааае аааедеедаа еасаааадаа ададаеесСа аееааадсае ееддесадда ааеаасСссе едседдааае едесдаааед

Саеаааааае асееедсдда

Саеаддедсе ддседдеаад аааадаадеа еааедсСдеа

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 44 028407 аЬЬаЬаааЬд асЬсаадааЬ даааЬадаЬд саЪссаЪЬЬд аЬадаЬдаад а^ЬСасЬсаа

ЬЬЬдЪааада

ЪЬсасЬаеед адаадаЬдЬд

ТСАССААССС ссстттссто

ТТССТТСТАА

ТТСААССддЬ аадаСсаадЬ асЪсЬо.Ьааа

ССдадСсЬсс

ШаЪдг.сада сЪаЬЪдааЬа ааааЬг.Ьада аСдсЬс.ааес сЪддаЪссас

ЬасЬсдссдд ссстосатсс

СТСАТСАСТС

СОАТССТССС ъсесъсъъсь аесааадЬЬа аЬадаЪССад СаадаааЬдд дЬсддаааад еесаадедСЬ аааСдсаЬаа асЬсаСдаЕд ссаа/асЬас ЬдсаааааЬа дсадаасааа саассЪаааС аддШЬдааа ееьедссддЪ дШддЫзаЬд ЬддЬдаадда аЬаасЫзсЬд ЬЪааТАААТС САСССССТСС ААСАТАСТСС ТСТСААСТСС ТТТТТСААСА ССТАААААСС ТТСАТТТТСС ССТСТТТСТС дссдЬЪа

ЬаЬСасаааа аааЬааЪдаа аЬдсааааЬЪ аЬЬсЬЕадаЬ СсЕдсдааде аадЬдсаадд сааШдЬаад адЕЪааадаЬ аЬадааааса ЬадЬдссЬаЬ дадаааЬсда СасЪасСаЪс аадсадаадд сЬЪЪасаасЬ саадаааЬЬЪ Ьасаадасаа ТТСАТСТСАС ССТТСССССС ТСААССССТА ССТТАССТСС ССАССАСТТТ ТССААТТТТС САТССССССС СТСССССТАТ

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2067

Последовательность № 3

Пример 3: сконструированный ДНК-конструкт бутирил-КоАдегидрогеназы (1815 по) адааааЬсЬд дсассасасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60 ссатсссссс сссттстттс ссссстсссс стстсассст аттстсасст ссасасссас 120

ССССАТСААА АТССАТТССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССССТТ ССССТСССАА ССААСАССАТ АСсСсдадса САТССССССС 300

СТСАТТСССА АСТССТСССТ СТСССССССС СТСССТСССС ССССССССТС САСССТСССС 360

СССАТССССС СССТСААССС СССССТСААС ССТССССССС ТСССТССССС СССТСАСССС 420

ААССАСаСда аЬССссааСЬ аасСададаа саасааССад СасаасаааЬ ддСЪададаа 480

ССсдсадСаа аСдаасСЬаа дссааеадсЬ дсСдаааСсд асдааасада аадаССсссС 540 аЬддаааасд ЬЪдааз.аааС ддсЬаадсЬЬ ааааЪдаЪдд дСаСсссаСС ССсСааадаа 600

СССддСддад саддссдада СдЫзсСССса СаЬаСааЬад сЬдСддаада аЬСаЬсаааа 660 дЬСЬдСддСа сСасаддадС СаССсСССса дсдсаСасаС саЪСаСдСдс аСсадЬааЪС 720 ааСдааааСд даасЬг.асда асааададса аааЬаЬЬЬас седаЬсЬЬед садсддЬааа 780 аадаЬсддЬд сСССсддаЪС аасСдаасса ддСдсЬддЕа садаСдсСдс аддасаасаа 840 асаасЬдсЬд СаССадаадд ддаСсаССаС дЪаССаааСд дССсаааааЬ сСЬсаСааса 900 ааЬддЬддад ЪСдсСдааас ССЬсаСааСа СССдсЬаСда садаСаадад Ссааддааса 960 аааддааССС сСдсаССсаС адСадаааад СсаСЬсссад даССсСсааЪ аддааааССа 1020 дааааСаада СддддаСсад адсаСсСЬса асСасСдадЬ СадССаСдда ааасСдсаЬа 1080 дСассаааад аааассСасС Садсааадаа ддЬаадддаС ССддЬаСадс ааСдаааасС 1140 сСЪдаСддад даадааСЬдд СаЬадсСдсС саадсЬЬСад дСаЬСдсада аддадсССЬС 1200 даадаадсСд еЬаасТаЬаЬ дааадааада ааасааСССд дСааассаСС аСсадсаССс 1260 сааддаСГас ааЬддСаСаЬ адсСдаааСд даСдСЬаааа СссаадсЬдс СаааСасЬСа 1320 дЬаСассЬад сСдсаасааа даадсаадсЬ ддСдадссСЬ асЬсадЬада ЬдсСдсаада 1380 дсеаааЬСаС ШдсСдсада ЬдСЬдсааЪд даадССасаа сПааадсаде ЬсаааЦсЬЬЬ 1440 ддСддаСаСд дСЬасасЬаа адааЬассса дСадааадаа СдаСдадада СдсЬааааСа 1500

ЬдсдаааЬсЬ асдааддаас ЬСсадаадСС саааадаСдд ЬСаСсдсадд аадсаССЬСа 1560 адаТААТСТА САСаааСдда ддсдсСсдСС даСсСдадсс ССдсссссСд асдаасддсд 1620 дСддаЪддаа даСасСдсСс СсаадЬдсЬд аадсддЬадс ЬСадсСсссс дСССсдСдсС 1680 даСсадСсее ЪССсаасасд Сааааадсдд аддадСЬССд сааССЫздСС ддЫздСаасд 1740 аЪссСссдЬЬ даЬСЫзддсс СсСЬСсСсса СдддсдддсС дддсдСаЬСЬ даадсССТТС 1800

ТСТСТТСТСС ССТТА 1815

Последовательность № 4

Пример 4: сконструированный ДНК-конструкт кротоназы (1482 по) адааааЬсЬд дсассасасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60

ССАТСССССС СССТТСТТТС СССССТСССС СТСТСССССТ АТТСТСАССТ ССАСАСССАС 120

ССССАТСААА АТССА'ГТССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССССТТ ССССТСССАА ССААСАССАТ АСсЬсдадса ЬАТССССССС 300

СТСАТТСССА АСТССТСССТ СТСССССССС СТСССТСССС ССССССССТС САСССТСССС 360

СССАТССССС СССТСААССС СССССТСААС ССТССССССС ТСССТССССС СССТСАСССС 420

ААССАСаЬдд ааЪЕаааааа ЬдЬЬаеЕсЫ; дааааадаад ддсаЕСЬадс ЬаЕЕдЕЕаса 480 аЬсааЬадас саааддсаЫ; аааЬдсаЫзд ааЬЬсадааа сасЬаааада еееаааЬдЬЬ 540 деееЬадаЕд аЬЬСадаадс адасаасааЬ дЬдЬаЬдсад ЬЬаЬадЪЬас ЬддЬдсЬддЬ 600 дадаааЪсЬЬ еедЬЪдсЬдд адсадаЕаЬЬ ЪсадаааЬда аадаЕсЬЕаа (здаадаасаа 660

- 45 028407 ддЬааадааЬ ЬЬддЬазЬЬЬ аддаааЪааЬ ссадЬЬаЬсд садсЬа/аЬс аддаЬЬЬдсЬ ЬдЬдасаЬаа дааЬадсЬЬс адЬЬааадсЬ аЬаасЬссад даЬЬЬддЬдд аасЬсааада ааадааЬЬаа ЬЬЬаЬасЬЬд ЬдассЬЬаЬа дЬЪааЪааад ЬадЪЪдааЬЪ адаааааСЬд аЬЬдсадсЬа аЬдсЬссааа адсадЬЪдса саадЫ/даГа ЬадаЬдзадс ЪаЬаЬЬааЪа асадаадаЬс ааасадаадд ааЬдасЬдсд сааааЬаааС ССТССТЗССС ССССТССТСС стсасссттс ссссстзасс аасссссстс СССТАССТТА ССТСССССТТ ТССТССТСАТ асттттссаа ттттсттсст ТСТААСОАТС сссссстссс сотатттсаа ССддЬЬсЬсЬ дЬсЬЬсадаа даЬЬадаааа аЬЬддаЬаад сЬЬддЬддЬд даЬдЬдаасЬ ЬдсЬаЬдЬса аааЬЬЬддЬс аассадаадс аддасЬЬдда ЬЬадсаадаа ЬадЬЬддасс аддаааадсЬ ааЬдсадаад аадсЬЬаЬад ааЬаддсЬЬа аЬддаадаад саааадсааЬ ддсЬаасаад ЬаЬЬдЬааад аЬдсЬаЬада сададдааЬд даадсадаад асЬЬЬдддаа дЪдсЬЬЬдса ЬЬсЬЪадааа даададсада ааадааЬЬЬЬ ЬааЬсЬадаТ АААТССАССС ССТССТТСАТ САТССААСАТ АСТССТСТСА АСТССТОААС САСТСТТТТТ СААСАССТАА АААССССАСС СТСССТТСАТ ТТТССССТСТ ТТСТССАТСО сЬЬсЬдссдЬ Ьа

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1482

Последовательность № 5

Пример 5: сконструированный ДНК-конструкт 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназы (1367 по) адааааЬсЬд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС ССССССОАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТСТСС ССССССССТС ССССсЬсдад саЬАТССССС 120 ссстсаттос саастсстсс стстсссссс ссстссстса ссссасссас тссассстсс ιβο

СССССАТССС СССССТСААС СССССССТСА АСССТССССС ССТСССТССС СССССТСАСС 240

ССААССАСаЬ дааааа.даЬЬ ЬЬЬдЬасЬЬд дадсаддаас ЬаЬдддЬдсЬ ддЬаЬсдЬЬс 300 аадсаЬЬсдс Ьсаааа.аддЬ ЬдЬдаддЬаа ЬЬдЬаадада саЬаааддаа дааЬЬЬдЬЬд 360 асададдааЬ адсЬдсааЬс асЬаааддаЬ Ьадаааадса адЬЬдсЬааа ддаааааЬдЬ 420 сЬдаадаада Ьааада.адсЬ аЬасЬЬЬсаа дааЬЬЬсадд аасаасЬдаЬ аЬдаадЬЬад 480 сЬдсЬдасЬд ЪдаЫЛ.адЬа дЬЬдаадсЬд сааЬсдаааа саЬдааааСЬ аадааддааа 540

ЬсЬЬЪдсЬда дЬЬадг.Ьдда аЬЬЬдЬаадс садаадсдаЬ ЪЬЬадсЬЬса аасасЬЬсаЬ 600 сЬЬЬаЬсааЬ ЬасЪдаадЪЬ дсЬЬсадсЬа сааададасс ЬдаЬааадЬЬ аЬсддааЬдс 660 аЬЬЬсЬЬЬаа ЬссадсЪсса дЬааЬдаадс ЬСдЬЬдаааЬ ЬаЬЬааадда аЬадсЬасЬЬ 720 сЬсаадааас ЬЪЬЬдаЬдсЬ дЬЬааддааЬ ЬаЬсадЬЬдс ЬаЬЬддаааа даассадЬад 780 аадЬЬдсада. адсЬссадда ЬЬсдЬЬдЬаа асддааЬсЬЬ ааЬсссааЬд аЬЬаасдаад 840 сЬЬсаЬЬсаЬ ссЬЬсаадаа ддааЬадсЬЬ садЬЬдаада ЬаЬЬдаЬаса дсЬаЬдаааЬ 900 аЬддЬдсЬаа ссаЬссааЬд ддассЬЬЬад сЬЬЬаддада ЬсЬЬаЬЬдда ЬЬадаЬдЬЬЬ 960 дсЬЬадсЬаЬ саЬддаЬдЫ ЬЬаЬЬсасЬд ааасаддЬда ЬаасаадЬас ададсЬадса 1020 дсаЬаЬЬаад ааааЬаЬдЬЬ ададсЬддаЬ ддсЬЬддаад ааааЬсадда аааддаЬЬсЬ 1080 аЬдаЬЬаЬЬс ЪаааСОСТСС ТССССССССТ ССТССЬааЬс ЬадаТАААТС САСССССТСС 1140

ТТСАТСТСАС ССТТСССССС ТСАССААССС СССТССАТСС ААСАТАСТСС ТСТСААСТСС 1200

ТСААССССТА ОСТТАОСТСС СССТТТССТС СТСАТСАСТС ТТТТТСААСА ССТАААААСС 1260

ССАССАСТТТ ТССААТТТТС ТТССТТСТАА СОАТССТССО ТТСАТТТТСС ССТСТТТСТС 1320

САТССССССС СТСССССТАТ ТТСААССддЬ ЬсЬсЬсЬЬсЬ дссдЬЬа 1367

Последовательность № 6

Пример 6: сконструированный ДНК-конструкт тиол азы (1721 по) адааааЬсЬд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС ССССССОАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТСТСС ССССССССТС ССССсЬсдад саЬАТССССС 120

СССТСАТТОС СААСТССТСС СТСТСССССС СССТСССТСС СССССССССС ТССАСССТСС 180

СССССАТССС СССССТСААС СССССССТСА АСССТССССС ССТСССТССС СССССТСАСС 240

ССААССАСаЬ дддсааадаа адЬадЪЬЬЪа дсЬдЬдсаЬд ЬсдЬасадсс аЬсддаасаа 300

ЬдддЬддаЬс ЬсЬЬадсаса аЬЬссЬдсад ЬадаЬЬЬадд ЬдсЬаЬсдЬЬ аЬсааададд 360 сЬсЬЬаассд сдсаддЬдЬЬ ааассЬдаад аЬдЬЬдаЬса сдЬаЬасаЬд ддаЬдсдЬЬа 420

ЬЬсаддсадд асадддасад аасдЬЬдсЬс дЬсаддсЬЬс ЬаЬсааддсЬ ддЬсЬЬссЬд 480

ЬадаадЬасс ЬдсадЬЬаса асЬаасдЬЬд ЬаЬдЬддЬЬс аддЬсЬЬаас ЬдЬдЬЬаасс 540 аддсадсЬса даЬдаЬсаЬд дсЬддадаЬд сЬдаЬаЬсдЬ ЬдЬЬдссддЬ ддЬаЬддааа 600 асаЬдЬсасЬ ЬдсассаЬЬЬ дсасЬЬссЬа аЬддссдЬЬа сддаЬаЬсдЬ аЬдаЬдЬддс 660 саадссадад ссадддЬддЬ сЬЬдЬадаса сЬаЬддЬЬаа ддаЬдсЬсЬС ЬдддаЬдсЬЬ 720

ЬсааЬдаЬЬа ЬсаЬаЬдаЬс садасадсад асаасаЬсЬд сасададЬдд ддЬсЬЬасас 780 дЬдаададсЬ сдаЬдадЬЬЬ дсадсЬаада дссадаасаа ддсЬЬдЬдса дсааЬсдаад 840 сЬддсдсаЬЬ сааддаЬдад аЬсдЬЬссЬд ЬададаЬсаа даадаадааа дадасадЬЬа 900

ЬсЬЬсдаЬас адаЬдааддс ссаадасадд дЬдЬЬасасс ЬдааЬсЬсЬЬ ЬсааадсЬЬс 960 дЬссЬаЬсаа сааддаЬдда ЬЬсдЬЬасад сЬддЬаасдс ЬЬсаддЬаЬс аасдасддЬд 1020

- 46 028407 сСдсадсасР сЕасаЕЬсдр

СадсадсЕас

ЬсаЬсдаддс

ЬсдасдЬсса дадсРбсадд адаадддЬсЬ адЬасдааСС

ТСАСССТТСС

ССТАССТТАС

СТТТТССААТ ссссстсссс сдЬадСЬаЬд адсЕддадса

ЕсадааддсЬ

Еаасдаадса саадсадсес

ЬдсЕсдЕаЬс

ЬдсСасасЬЬ стсстссссс

ССССТСАССА стсссссттт

ТТТСТТССТТ

СТАТТТСААС

ЬсЪдаадада сСЬдсЬддбд аЕдаадаадд

ЬЬсдсадсЬс ааЬссЬаасд сЪЬдЪСасас

ЪдсаЕсддбд оостсстссе асссссстсс сстсстсатс

СТААСОАТСС

СддЬЬсЬсбс аддсРаадда бЬсдЬссЪда сЬддбаЬсда адЬсЬдЬадс дЬддбдсЪаЬ

ЪЪсЪЬсасда дсддЕаЬддд ааЪсЬадаТА

АТССААСАТА

АСТСТТТТТС

ТСССТТСАТТ

ЬЬсЬдссдЬЬ дсЕсддсдЬЬ адЕЬаЬдддб даасдЕабсЕ адЕЕддЬаад сдсЬсЪСдда даЕдсадаад аЬдсдсЬасб

ААТССАСССС

СТССТСТСАА

ААСАССТААА

ТТССССТСТТ аадссЬаЬдд аСсддЬссЕд дадбЬсдаЕа даЬсЬСддаа сасссадЕЕд ааадасдсЕа аЬсдЬЬдада

СТССТТСАТС

СТССТОААСС

ААССССАССА

ТСТССАТССС

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1721

Последовательность № 7

Пример 7; сконструированный ДНК-конструкт пируват-ферредокеиноксидоредуктазы (4211 по) адааааЕсЕд дсассасасс АТССТАССОТ СССАСТ САААССАССС СССССТАССА АСТТТТСТСС СССССС'

САСССССССС САСТТССААС ССТТСАААСС АССССС ССТСССССсЕ сдадсаРАТС СССССССТСА ТТСССА стсссссссс сссстссасс стссссссса тссссс ССССССТССС ТССССС'ООСТ САООССААСС АОаРдд асддаасдас адссасдасд сасдЬддссЬ асЬЬса ссаЬсасдсс садсЬсддЬс аЬдРссдадд Есдссс адаасдссЬЬ сддсса.дссс асдаЬддЕсс дссада дсдсссбдса сддсдсдсЪс адсдадддад сдсЬдд дссбдсЪдсЬ саЪдаЕсссс аасаЬдбаса адаЕсд ЬдсасаЬсдс сдсссдсасс дЬсдссассд аддссс аСдЪсЬасдс ддбдаддЬсд асддддЕЬсд сдЬЬсс дсаРссасаР дЕссдссдсс дсдсасдссд ссассс асСбсЕЕсда сддсЬЕссдс асдЬсссасд адаЬсс ссдассЕдсЕ ддссЬдсабд аасЬЪЬдасд асдЬсс дсСдсдадсд сссдсЕдсЕд сдсдддасдд сдсада ссдадСсдаа ссСддедасд сЕддссаддд Ессссд дЬдСдаасаа. ддСдЬЕсддд ассаасбаса ддассб ссасддасдб дабсдЕддсс аЬдддаадсд дсассд ЕссбсаасЕс дсдсдасдсд аасЬсдаддд Ьсддсд сдееедЬдЕс ддсддсдЬЕС дСддсЬдсдс Ьдссса Сддассдсдд дадддасддд саддсддссд сддасс сдсЪдддЪсС ддсадсдссс дддадддЬЕс аддЪдЬ сдЬссаадда сЬЬсаасссс дассасдЕда Ьсдссд дссссаадаа саддСЕсадс дбсддсаЬсд Есдасд Ьдддададса сдЪддасдсд сРдссдсадд ддасда дсддадасдд дассаРсддд дсдаасаада сддсса адсЕдсасдс дсаддддбас ЪЕЪдсдбасд асдсса сдсассСдсд дССсддсссд асдсддЬбсд аддсдс асдСддсдрд ссасаасРЬс ЬсдЬасдбдс асаддЬ ссдддддсас дЪСсдСдсСс аасбдсссдЬ дссдда бсссддЪдсд ссбдаддсдс дадабсдсса ддсддс сдассаадаС сдссааддас аасдддаСдд дсссдС ЕдРЕсбРсЬа СсСдСсссас дСдсЬсдабд Едаасд дсаЪссадаа дабдЪасдсд сдсаадддсд аддадд СсдасдсдСс дсСддаСссс ааддсдеедс Ьдсаса ЬСдсдсСддс сдасдадсас дЬдссссдса СдддСс адаадРЬсаа сдссдадсбд Ъасдадссда сссбсд ЁсадсаддСС сссСсдсддс ддсдадасдс сдасдд дсаЪсдссда дадсдбдссд сасбддаасс асдада сдбЬсдРдЬд сссдсасдсс дЕсаЬссддЪ сдбасс асдссссЬдс сддсЕЬсдас асРсЪЪаадС сдсдса асдЕсадсдс ссЪддасСдс асСддсСдса дсдбдЪ дссСддадаЬ даадссСсЕс дадЕссдадЕ Ссдада ЕссдсдадаЕ ддбсдсдссс аадсссдадс Ьдддад сдбсбсасас дссдсЬдЬЬс дадЬЬсссдд дадссЕ бддЬдсдссЬ сдбдасдсад аЬдЕЕсддЪд адсдса

ссссосоаст	тссаассстт	60
ССООАТССТА	СССТСССАСТ	120
АСОААСТТТТ	стсссссссс	180
стссатстсс	ссасссстсс	240
СААССССССС	СТСААСССТС	300
даддЬдсаад	дадсссдЬсд	360
сдасадсдсд	ЪЬсаЪсЪЬсс	420
дЬддбссаЬд	ааеддссдса	480
дадсдаддсЕ	дддЕсЬдссд	540
дасдЬЬсасд	адсадссадд	600
сдадсЕссЬд	сссЬдсдЕса	660
ЕаЬсЬЬсддс	дассасасдд	720
сЕссдсдасс	дбссаддадС	780
садсдаддЬс	ссдЬЬсдссс	840
даЬсдасРЬс	сссбсддасд	900
дЕЬссдЬддс	сдсЬсдсЬдб	960
сдасдЕсЬЬс	аСдсаддсдб	1020
сабсдасдад	дсдсСддсЬс	1080
дЬасЕаСддс	сассссдадд	1140
ддссаЬсСсд	асЬдссаасб	1200
дадддбдсдд	сбдССссддс	1260
сдЬсаададд	аЕсбдсдЬЬс	1320
дсассаддас	дРссбдЬсдд	1380
дддаддсдъд	еасддСсбде	1440
саддаассЬс	дсдСсддсда	1500
дасдсасаас	адссЕддаса	1560
дРдссбдсЬд	СддддсаРсд	1620
дсрдаЬсдсд	дассасасдд	1680
ддссддсддс	сЪдасадЬсЬ	1740
ссЬддРдаас	дасадсаасб	1800
ссЬдсСдЬсд	Рсдсбдсдса	1860
ддаддадсЪд	дасасддсас	1920
саадбЬсЬаб	дЕдабсдасд	1980
саасаеддЕс	сЕссаддссд	2040
адбддсасЕс	сСдаадаада	2100
саддаадаас	дЬддсаЬсдд	2160
дЬассссдса	дасаддЬддс	2220
сасЕдбсссс	дадсдссЬдс	2280
сдаЬддддад	адсабсссдд	2340
дасСсадсЬд	ддсаадсдбд	2400
сдЕдсадЕдс	аассадСдсЬ	2460
садсдаддад	дадаЬдаада	2520
сдддбаЬсдЬ	СЪссдсабса	2580
ддадсадСдс	ссадЪсаадЬ	2640
дааддасдсс	абсаддСЪсд	2700
саадасЕссс	дЬсддсаЬсд	2760
сдддСдсддЬ	дадассссдс	2820
саЬсдссдсд	дссасСдддЪ	2880

- 47 028407 дсаасбсдаб адддссссдс сдЬдбдсдба абдсдддабс сдсасдбсад асдсаабссс адсбдабсдс дсббсддбдд асасддаддб дсдссаадба бдассбасда бддасдсдсб сдбдсабдда сбдбддадас адаассссбб сдсадддссд аддсасбсас асдадсссдс аабсбадаТА

АТССААСАТА

АСТСТТТТТС

ТСССТТСАТТ ббсбдссдбб сбддддадсд дбддсасаас бсдссадсдс сдбдсадддб ддасббсдад адсдаасдсд дсдсасдадб асбддассас сбасбссаас сдсбдбдсбд дассдсдбас дадддаддсс дсассадабд дддсбасбдд сасссбсдас бббсаббасб ссдсбсбсбд бдссссбдсс

ААТССАСССС

СТССТСТСАА

ААСАССТААА

ТТССССТСТТ а

бсдббсссда бсдсбдббсд сдсдадсдсс сбдбсбдсбд аадасссдсд дасбдсаддд ббсбддабсс дбдабсдсса асбддбддсс ддсааддаса дбддссадса даддссбасс дбссдсддда сбдсбдбасс бсдаадссбс сбдсадсдсд дссасссдсб дсадсбссбд

СТССТТСАТС

СТССТСААСС

ААССССАССА

ТСТССАТССС аедбдеедба аддасдсддс бсабсддсаб адсбдааддс адсбссдсда ббсбддадсб бсддбддсда асаасдадда адсдсбссаа сбдддаадаа бсдсдсаддд адддссссбс бдааддадад дсббсаассс ссбсдаадсс адсассссда бедбдедеба ссасдсабСС

ТСАСССТТСС

ССТАССТТАС дТТТТЗСААТ ссссстсссс сасаассаас ддадсбсддд сдбдсддадс бебдебддбе саддабдаас садддадаад едддЬдддед сдбсаасабс дбсдасдссд ддассбдддд адссаассад дабедбеабб ссадаадаас сдассбсабс бсссааддад дсаддсссас ссадсдссбс стестссссс

ССССТСАССА стсссссттт тттеттоетт

СТАТТТСААС дсссдсдддд бабддсабба дбедбедаед дадбддсбсд ссссбдабсд сасаассдсд басдасабсд сббдббсбсд сбсддсдссс сдсабсдсда садсадбдса дсдбасасбс садаадсбдд сасдадддса ббссбддаса сбссббсасд дбдсадсбдб

СССТССТССб

АССССССТСС

ССТССТСАТС

СТААССАТСС

Сддббсбсбс

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4211

Последовательность № 8

Пример 8: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы (2021 по) адаааабсбд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС СССССССАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТОТСС ССССССССТС ССССсбсдад сабАТОСССС 120 ссстсаттос сааотсстсс стстсссссс ссстссстсс сссссссссс тссассстсс 18о

СССССАТССС СССССТОААС СССССССТСА АСССТССССС ССТСССТССС СССССТСАСС 240

ССААССАСаб дбсбасабба дааадаббда ссбсаббааа едббдббдеб ддббсбдасб 300 бдадаадаас сбссаб.сабб ддбассабсд дбссааадас саасаассса дааассббдд 360 ббдебббдад аааддсбддб ббдаасаббд беедбабдаа сббсбсбсас ддббеббаед 420 аабассасаа дбебдбеабб дасаасдсса дааадбссда адааббдбас ссаддбадас 480 саббддссаб бдсбббддас ассаадддбс садааабсад аасбддбасс ассассаасд 540 абдббдасба сссаабссса ссааассасд ааабдабебб сассассдаб дасаадбасд 600 сбааддсббд бдасдасаад абсабдбасд ббдасбасаа даасабсасс ааддбсабсб 660 ссдсбддбад аабсабсбас дббдабдабд дбдббббдбе бббссаадбб ббддаадбед 720 ббдасдасаа даебббдаад дбсааддсбб бдаасдссдд баадабсбдб бсссасаадд 780 дбдбсаасбб ассаддбасс дабдбедабб бдссадсббб дбебдаааад дасааддаад 840 абббдадабб сддбдбсаад аасддбдбсс асабддбсбб сдсббсбббс абсадаассд 900 ссаасдабдб бббдаесабс ададаадбеб бдддбдааса аддбааддас дбсаадабса 960 ббдбсаадаб бдаааассаа сааддбдбба асаасббсда сдааабсббд ааддбсасбд 1020 аеддбдббаб ддббдесада ддбдаеббдд дбаббдаааб сссадсссса даадбеббдд 1080 сбдбссаааа даааббдабб дебаадбеба асббддсбдд баадссадбб абсбдбдсба 1140 сссааабдбб ддаабесабд асббасаасс саадассаас сададсбдаа дбббссдабд 1200 бсддбаасдс бабеббддаб ддбдебдаеб дбдббабдбб дбебддбдаа ассдссаадд 1260 дбаасбассс аабсаасдсс дббассасба бддсбдааас сдсбдбсабб дсбдаасаад 1320 сбабсдсбба сббдсеааас басдабдаса бдадааасбд басбссааад ссаассбсса 1380 ссассдааас сдбсдебдсс бссдсбдбсд сбдсбдбббб сдаасаааад дссааддсба 1440 беаббдбебб дбссаеббсс ддбассассс саадаббддб ббссаадбас адассааасб 1500 дбссаабсаб сббддббасс адабдсссаа дадсбдсбад аббсбсбсас ббдбасадад 1560 дбдбсббссс аббсдббббс дааааддаас сбдбсбсбда сбддасбдаб дабдббдаад 1620 сссдбабсаа еббеддбабб дааааддсба аддааббедд бабеббдаад аадддбдаса 1680 сббасдбббс сабссааддб ббсааддссд дбдебддбеа сбссаасасб ббдсаадбсб 1740 сбассдббСО СТССТССССС СССТССТССб аабсбадаТА ААТССАСССС СТССТТСАТС 1800

ТСАСССТТСС ССССТСАССА АССССССТСС АТССААСАТА СТССТСТСАА СТССТСААСС 1860

ССТАССТТАС СТСССССТТТ ССТССТСАТС АСТСТТТТТС ААСАССТААА ААССССАССА 1920

СТТТТССААТ ТТТСТ'ГССТТ СТААССАТСС ТСССТТСАТТ ТТССССТСТТ ТСТССАТССС 1980

СССССТСССС СТАТТТСААС Сддббсбсбс ббсбдссдбб а 2021

- 48 028407

Последовательность № 9

Пример 9: сконструированный ДНК-конструкт энолазы (1815 по) адааааСсСд дсассасасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60 соатсссссс сссттсгттс ссссстсссс стстсасост аттстсасст ссасасссас 120

ССССАТСААА АТССАТТССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240 ттстессссс аттассзстт ссостсссаа ссаасассат АСсесдадса сатссссссс зоо

СТСАТТСССА АСТССТСССТ СТСССССССС СТСССТСССС ССССССССТС САСССТСССС 360

СССАТССССС СССТСААССС СССССТСААС ССТССССССС ТСССТССССС СССТСАСССС 420

ААССАСдСда ссааддсСдС СдадаасаЪс аасдсСаССа ЬСдсссссдс ссСдаадддс 480 аЬддассссд Ьсаадсаддс ддадаЬСдас садаадаСда аддассСдда сддсасСдас 540 аасаадддса адсЬдддЪдс саасдссаСс сСддссдЪсС ссаСддссдС дСдсааддсс 600 ддСдссдсСд адаадддсдС дссссЬдСас аадсасаСЬд сддассСддс сддсаасадс 660 аадсСдаСсс СдсссдЬдсс сСсдЬСсаас аЬсаСсаасд дсддсадсса сдссддсаас 720 дсссСддсСа СдсаддадСС саСдаЬссСд сссдССддсд ссСсдадсЬС сЬсСдаддсс 780 аСдсдсаСдд дсСдсдаддС дСассасдсс сСдаадддсс ЬдаСсааддс саадСасддс 840 саддасдссС дсаасдСддд ЬдаСдадддЬ ддсССсдссс ссаасаСсдд сСссаасдаС 900 дадддссСда асССддЬдаа сдаддссаСс дадааддссд дсЬасассдд сааддСдаад 960 аЬсддсаСдд асдСддссСс дСсддадССс Сасассдадд асддсаЬдСа сдассСддас 1020

ССсаадаасс адсссаасда СддсСсдсад аадаадасса аддадсадаЬ дсСддадсСд 1080

СасаасдадЬ ЦсЬдсаадаа дЬасссддСс аСсСссаСсд аддассссСС сдадсаддас 1140 дасСдддадс ссСдсдссаа дсСдассасс дадаасаСсС дссаддСддЬ сддсдасдас 1200 аСссСддСда ссаассссдС дсдсдЬдаад ааддссаСсд асдссааддс сдЬсаасдсС 1260 сСдсСдсСса аддСсаасса даСсддСасс аССассдадС ссаССдаддс сдСдсдсаЬд 1320 дссааддадд ссддседддд СдЦсаЬдасс адссассдс£ сдддЬдадас СдаддасесЬ 1380

ЬСсаСсдссд ассСддсддС дддссЦддсс Ьссддссада Ссаадассдд сдсссссСдс 1440 сдсЦсддадс дсааЦдссаа д(?асаассад сСдсЬдсдса Ссдаддадда дсСдддсдад 1500 аасдсСдЬдС асдсСддсда дадсСддсдс сасаЬсддсЬ ддСССТССТС СССССССТСС 1560

ТССЬааСсСа даТАААТССА СССССТССТТ САТСТСАССС ТТССССССТС АССААССССС 1620

СТССАТССАА САТАСТССТС ТСААСТССТС ААССССТАСС ТТАССТСССС СТТТССТССТ 1680

САТСАСТСТТ ТТТСААСАСС ТАААААСССС АССАСТТТТС СААТТТТСТТ ССТТСТААСС 1740

АТССТСССТТ САТТТТСССС ТСТТТСТССА ТССССССССТ СССССТАТТТ СААССддСЬс 1800

СсСсССсСдс сдСЬа 1815

Последовательность № 10

Пример 10: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы (2349 по) адааааСсСд дсассасасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60

ССАТСССССС СССТТОТТТС ОССССТСССС СТСТСССССТ АТТСТСАССТ ССАСАСССАС 120

ССССАТСААА АТССАТТССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССССТТ ССССТСССАА ССААСАССАТ АСсЬсдадса САТССССССС 300

СТСАТТСССА АСТССТСССТ СТСССССССС СТСССТСССС ССССССССТС САСССТСССС 360

СССАТССССС СССТСААССС СССССТСААС ССТССССССС ТСССТССССС СССТСАСССС 420

ААССАСаСдд сдсасдасСа саадсСдаад дсссасссдд сдаССссСдс дсссдадддс 480 ссдсСдсСдд ЬсСдсаССсС ддасддсЬЬс ддсдадаасд адСасаадда ЬдадССсаас 540 дссдСдсасд СддсСаадас дсссасСдСд дасдсдсЬдс дсдсЬдСдсс ссаЬсдсССс 600 сдЬСссаСса аддсдеасдд аааддсЬдСд ддссЬдссса дсдаСдссда саСдддсаас 660 адсдаддЕдд ддсасаасдс ссСдддсСсд ддссаддСдд Сддассаадд сдсдсдссЬд 720 деддассЬдд сдсСддадас сддссдСаед СЬсЬсддасс ссддсЬддаа дсЬсаЬсадс 780 даддссССсс ссСсссасас сдСссасССс аСсддссСдс ЪдЪссдасдд сддсдСдсас 840

Ссдсдсдссд аСсадсСдса сддсЬдссСд сдсддсдссд Ьддадсдсдд сдссаадсдс 900 дСдсдсдЬдс асаЬссСдас Сдасддссдс дасдСдссдд асддсадсад саСссддССс 960 дсддаддадс ПддаддсддЬ дсСддсддад сЕдсдсддса адддсСдсда саСсдссаЕс 1020 дссСсдддсд дсддссдсаС дсаддСсасс аСддассдсС асдаддсдда сСддадсаСд 1080 дСдаадсдсд дсСдддасдс дсасдСдсСд ддсааддсдс сссасСасСС сааддасдсс 1140 аадассдсдд СсассасссС дсдсддсСсс даддасдсдс сддСдСсСда ссадСасдСд 1200 дсссссССЬд СдаЪСдСдда сдаддсддас аадссддСдд дсассаССда ддасддсдас 1260 дсддСддСдс СдССсаасСС ссдсдсддас сдсаСддСдд адаСсадсаа ддссССсдад 1320

Сасдаддасд дсССсассдс сСССдадсдс дадсдсССсс ссаадддссС дсдсССсдСд 1380 ддсаСдаСдс адСасдасдд сдассСдаад сСдсссдсса асССссСддС дссдссдссс 1440 сСдаССдадс асдСдСсддд сдадСассСд Сдсаадаасд ддсСдадсас сССсдссСдс 1500

СссдадасСс адаадССсдд дсасдСдасд ССсССсСдда асддсаассд сСссддсСас 1560

- 49 028407 сЬддасдсса адсаддадса дСассСддад аСсссдСсдд асаадаСсда дСЬсаасаад 1620 дсСссддаса Ьдааддсдсд сдадаСсасс дссдссддса ЬСдаддсдсС саададсддс 1680 аадСасаадд ЪддСдсдсаС саасСасдсс аасссддаса СддЬсддсса сассддсдас 1740 аЪддсСдсса ссдЬссдсдс сСдсдадасс дСддасдддС дсдЪдаадда дсСдсСддад 1800 дСддСддаса дссЬдаасдд ссдсЬдда&с десасдЬссд ассасддсаа сдссдасдас 1860 аЬддСдсадс дсдасаадаа дддсаадссс с£дсЪдддсд аддасддсаа дссдсЪдссс 1920 сЬдассадсс асасдсСддс дсссдСдссд СЬсСЬсаСсд дсддсааддд ссСдссддас 1980 ддсдСддЬдс Ьдсдсдасда ссСдссддас дссдддсЪдд ссаасдСддс сдссассасс 2040 ССсаассСдс СдддсССсда ддсдсссддс аСсСасаадс ссадсаСддС сааддсдТАА 2100 ТСТАСАСааа СддаддсдсС сдССдаСсЪд адссССдссс ссСдасдаас ддсддЬддаС 2160 ддаадаЬасС дсСсСсаадЪ дсСдаадсдд ЬадсССадсС ссссдЬЫсд СдсСдаСсад 2220 ЪсССССЬсаа сасдСааааа дсддаддадС СЬСдсааСЫ; СдСЬддЬСдС аасдаСссЬс 2280 сдСЬдаСЬЫ ддссСсСССс СссаСдддсд ддсЬдддсдС аЬССдаадсС СТТСТСТСТТ 2340 стессеттА 2349

Последовательность № 11

Пример 11: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы (1908 по) адааааСсСд дсассасасс ТАТАТСОТАО ОСЗТСССАСТС АССССССОСе АСТТОСАССТ 60

ССАТСССССС СССТТСТТТС СССССТСССС СТСТСССССТ АТТСТСАССТ ССАСАСССАС 120

ССССАТСААА АТССАТТСОС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТОААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССССТТ ССССТСССАА ССААСАССАТ АСаСддсссС сСсСаСдаад 300 аСдсдсдсса асдсдсдсдС дСссддСсдс сдсдСсдссд сСдЬддсссс ссдсдСддСд 360 сссСЬсГсдГ сддссСссад сСссдСдсСд сдсСсСддсС СсдсдсСдад дСдСсСдСдд 420 асаСссдссд сдСдддссдс СсЬсдсаЬсс дЬсдЬсдадд сддСдаадаа дСсддСЬддс 480 дассСдсаса аддсЬдассС ддадддсаад сдсдЬдСЬсд Сссдсдсдда ссСдаасдСд 540 ссСсССдаса аддссасссС ддссаСсасс дасдасассс дсаСЬсдсдс ддссдЬсссс 600 асссСдаадС ассСдсСдда саасддЬдсС ааддСссСдс СдассЬсдса ссСдддСсдс 660 ссдаадддсд дЬсссдадда саадСассдс седасссссд СддСддсссд ссСдЬсддад 720 сСдсСдддса адсссдЬдас сааддСсдаС дасЬдсаСсд дссссдаддС ддадааддсд 780 дСдддсдсса Сдаадаасдд сдадсСдсЬд сСдсСддада асСдссдсЬС сСасааддад 840 даддадаада асдадсссда дССсдссаад аадсСддссд ссаасдссда ссСдСасдСд 900 аасдасдсдС ЬсддсасСдс ссассдсдсс сасдссСсса ссдадддСдС дассаадССс 960 сСдаадсссС ссдСддссдд сССссСдсЬд садааддадс СддасСассС СдаСддсдсс 1020 дСдСссаасс ссаадсдссс сССсдЬддсс аСЬдСдддсд дсСссааддС дЬссСссаад 1080 аЬсассдСса ССдаддсдсЬ даСддадаад Ьдсдасаада ЬсаСсаСсдд сддСддсаСд 1140 аСсСЬсассЬ СсЬасааддс ссдсдсдсСд ааддСдддсС ссСсдсСддС Сдаддасдас 1200 аада(?.сдадс Сддссаадаа дсСддаддад аЬддссаадд ссаадддСдС дсадсСдсСд 1260 сЬдсссассд асдСддСддС ддссдасаад еьсдасдсса асдссаасас ссадассдЬд 1320 сссаСсассд ссаСссссда СддсЬддаЬд ддСсЪддаса ССддсссдда сСссдСсаад 1380 ассЬСсаасд асдсссСддс сдасдссаад ассдЫздСдС ддаасддссс саЬдддЬдСд 1440

ЬСсдадЬССс сссаадССсд ссаасдсасс дСдЬсдаСсд ссаасасссЬ ддссддссСд 1500 асдсссаадд дсСдсаСсас саСсаССддЬ ддсддСдасС ссдСддсЬдс сдСсдадсад 1560 дссддсдССд ссдадаадаС дадссасаСс Ьссассддсд дсддЬдссСс ссСддадсСд 1620 сСддадддса аддСссСдсс сддсдСддсс дсссСддасд адаадТАААТ ССАСССССТС 1680

СТТСАТСТСА СССТТССССС СТСАССААСС ССССТССАТС СААСАТАСТС СТСТСААСТС 1740

СТСААССССТ АССТТАССТС ССССТТТССТ ССТСАТСАСТ СТТТТТСААС АССТАААААС 1800

СССАССАСТТ ТТССААТТТТ СТТССТТСТА АССАТССТСС СТТСАТТТТС СССТСТТТСТ 1860

ССАТСССССС ССТОССССТА ТТТСААССдд СЬсСсСсССс ЬдссдССа 1908

Последовательность № 12

Пример 12: сконструированный ДНК-конструкт НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1677 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС СаСаСддСад сдаСддсссс дддССаСССд дддсдСссдс дсдсаСдааа аЬдсаЬСсдс ССссаСадда адддССсааа сдассссдсс дСасдаасСЬ СЪдСдсдсдс аССадсдсСЬ сдддСсдсаа аастсстссс тстссосссс сстсастсас ССССТСААСС ССОСССТСАА СССТСССССС ддСдсдадСд сСсСсдсдсС сдсЬдсаеЬд

ССдСсддддд дсаадасдаС

СССССССССТ стссстсссс ассссдсдсд аССсСдадсС

СддсЬСдаад дсдсСсссдд асАТСССССС

ССАССОТССС

ССССТСАССС асССддадсС ддадассдад дССсааддда ссссдддсСс

ССТСАТТССС

ССССАТСССС

СААССАСаЪд

120

180

240

300

360

420

- 50 028407 дсЪсссаЬса адаЪсддсаЬ сааЬддЪЫзе ддИсдЬаЪЬд дссдсс+сдС дЬддсдЬдсс 480 асЬсЫзаасс д(здасда(здЪ сдаддЬсдбс дссаЬсааЬд аЕссабЬсаЬ ЬдаЬдЬдсса 540 ЬасаЬддбсЪ асаЬддссаа дЪабдасСсд дЬссасддса ассбдассса сдасдЫзсад 600 сааддсдасд дсаадс^даС ддбсааЪддс аадЬсаабса ссаЬсСЪсдд саадаСддаЬ 660 дссааддада СсссаСддаа ддаддссддс дсдассЬбсд 4зсд(з1здад(зс дасЬддЕдЬд 720 (зссассассс Сддадддсдс садсбсбсас сбддЬсддсд дСдсЬдадас сдЬсдбсаЬс 780 ЬссдссссаЪ сааасдаРдс ссссаЪдЫзс дЬсабдддРд (зсаасдадда дддсбасаад 840 ссадасабда аад(зддздрс саасдсдЪсб (здсассасса асСдссЪддд сссссбддсс 900 ааддбсабсс ассЫзаадЫз сддсаЪссЪд дадддссбда (здассассдЪ ссасдсдасс 960 ассдссассс адаадассдЬ сдасдддссд бссаадаадд асЬддсдсдд сдддсдсддс 1020 а(зсс(зддаса асабсаЬссс с(зсддсдас(з ддрдссдсса аддссдЬсдд саадд(здс(зд 1080 ссЬдсссЪда асддсаадсЪ сассддсабд дссЫзссдсд Ъдсссасссс сдабдСсЪсд 1140 д(зсдЬсдаЪс ЬдассдЬдсд ссбддадаад дд(здсд(зсд£ асдасдссаб сааддссдад 1200 абсаадсдсд сдадсдадаа сдадсЬсаад ддсаЬссЬдд ссЬасассда ддаЬдссдЬд 1260 д(зс(зссассд асЫзсаЬсдд саасаадсас адсЬссаЪсЕ Ьсдасдссда ддссддсабс 1320 дсссбсаасд асаасЪЫзде саадсЬддЬс ЪссЪддЬасд асаасдадбд дддсбасЪсс 1380 аассдЪдЪсд ЬсдассЬдаЬ сдсдсасабд дссааддбса аддссдссад ссасТАААТС 1440 САСССССТСС ТТСАТСТСАС ССТТСССССС ТСАССААССС СССЗТССАТСС ААСАТАСТОС 15 00 ТСТСААСТСС ТСААССССТА ССТТАССТСС СССТТТССТС СТСАТСАСТС ТТТТТСААСА 1560 ССТАААААСС ССАССАСТТТ ТССААТТТТС ТТССТТСТАА ССАТССТССС ТТСАТТТТСС 1620 ССТСТТТСТС САТОССССОС СТСССССТАТ ТТСААССддЪ (зсЪсЪсеесе дссдЬЪа 1677

Последовательность № 13

Пример 13: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы, связанной с промотором Нус1А1 (2351 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадс(зд(зса(з дсд(з(здс1зсс д(з(за(здЬд(зс дЬсааасдсс 60

ЬЬсдадсдсТ дсссддааса абдсдбасСа дСабаддадс сабдаддсаа дЪдаасадаа 120 дсдддсСдас (здд(зса.аддс дсасдаРадд дсЬдасдадс дбдс(здасдд дд(зд(зассдс 180 сдадедбссд сСдсаЫзссс дссддаРСдд дааабсдсда (зддЬсдсдса ЪаддсаадсЬ 240 сдсааабдсС д(зсадсТ(заС себасаЬдаа сасасаааса сбсбсдсадд сасЬадссбс 300 ааАТСССССС ССТСАТТССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360 ссассстссс ссссатсссс сссстсаасс сссссстсаа ссстсссссс стссстсссс 420

ССССТСАССС СААССАСаЪд дсдсасдасб асаадсЬдаа ддсссасссд дсдаГЕссЪд 480 сдсссдаддд сссдсбдсЬд дЬсЬдсаЬЬс (зддасддсЫз сддсдадаас дадЬасаадд 540 а(здад(збсаа сдссдГдсас дЬддсЪаада сдсссасбдЪ ддасдсдсЪд сдсдс+дГдс 600 сссаесдсее ссдЫзссаЬс ааддсдсасд даааддсЬдб дддссбдссс адсдабдссд 660 асабдддсаа садсдаддбд дддсасаасд сссбдддсЪс дддссаддбд дбддассаад 720 дсдсдсдссЬ ддбддассЬд дсдсбддада ссддссд(за{; д(з(зс!зсддас сссддсбдда 780 адсРсабсад сдаддссЪГс сссбсссаса ссдбссасЫз саЬсддссбд сЪдЬссдасд 840 дсддсдбдса сбсдсдсдсс да{зсадс(здс асддс!здсс(з дсдсддсдсс дЬддадсдсд 900 дсдссаадсд сдЕдсдсдГд сасаСссбда ссдасддссд сдасдГдссд дасддсадса 960 дсабссддЫ; сдбддаддад с(зддаддсдд Ьдсбддсдда дсЬдсдсддс аадддсбдсд 1020 аса(зсдсса(з сдссбсдддс ддсддссдса ЪдсаддЪсас сабддассдс Ъасдаддсдд 1080 асЬддадсаб ддрдаадсдс ддсбдддасд сдсасдбдсе дддсааддсд ссссас(зас1з 1140

Ьсааддасдс саадассдсд д(зсассассс (здсдсддсЬс сдаддасдсд ссддГдЬсбд 1200 ассадбасдС ддссссс1з(з(з дСдаРРдсдд асдаддсдда саадссддбд ддсассаЫзд 1260 аддасддсда сдсддзддГд сЬдеЪсаасЪ бссдсдсдда ссдсабддЬд дадабсадса 1320 аддссСЬсда дСасдаддас ддсС(зсассд ссЫЬдадсд сдадсдсСЬс сссаадддсс 1380 (здсдсГГсдГ дддсаздабд садГасдасд дсдассбдаа дсбдсссдсс аасЫзссСдд 1440 {здссдссдсс ссЬдасЬдад сасдрдрсдд дсдадбассе дбдсаадаас дддсГдадса 1500 ссЫзсдсс(зд сЪссдадас(з садаадЫзсд ддсасдСдас дЫзс(з(зс1здд аасддсаасс 1560 дсСссддсба ссЬддасдсс аадсаддадс адбассЬдда да(зсссд(зсд дасаадаЬсд 1620 адбЬсаасаа ддс(зссддас аЬдааддсдс дсдадаЬсас сдссдссддс аРЬдаддсдс 1680 (зсаададсдд саадбасаад дбддбдсдса (зсаасбасдс саасссддас а(зддГсддсс 1740 асассддсда саЪддсГдсс ассдЬссдсд ссбдсдадас сдеддасддд Ьдсдбдаадд 1800 адсбдсРдда ддрддЬддас адссГдаасд дссдс(зддаЬ сд(зсасд!зсс дассасддса 1860 асдссдасда саСддбдсад сдсдасаада адддсаадсс ссЪдсЕдддс даддасддса 1920 адссдсГдсс ссЬдассадс сасасдсбдд сдсссдбдсс дЬЬсЫзсабс ддсддсаадд 1980 дссбдссдда сддсдбддГд сбдсдсдасд ассбдссдда сдссдддсбд дссаасдЪдд 2040 ссдссассас сГЬсаассед сГдддсЫзсд аддсдсссдд са(зс(засаад сссадсабдд 2100 есааддсдТА аатссаоссс стсоттсатс тсасссттсс сссстсасоа ассоссотсс 2160

АТООААСАТА СТССТСТСАА СТССТСААСС 6СТАССТТАС СТССССОТТТ ССТОСТСАТС 2220

АСТСТТТТТС ААСАССТААА ААСССОАССА ОТТТТССААТ ТТТСТ'ГССТТ СТААССАТСС 2280 тсссттсатт ттсссстстт тстссатссй сссестсссс йтаттдсаас сддъесесъс 2340

- 51 028407

ЬЬсЕдссдЫ; а

2351

Последовательность № 14

Пример 14; сконструированный ДНК-конструкт энолазы, связанной с

АСААААТСТС ССАССАСАСС ЪЬсдадсдсЬ дсссддааса дсдддсСдас ЕддЕсааддс сдадЬдЬссд сЬдсаЬЬссс сдсаааЬдсЬ дСсадсЬЬаС ааАТСССССС ССТСАТТССС ссассстссс ссссатсссс ССССТСАССС СААССАСдЕд сссСдааддд саЬддасссс асддсасСда саасаадддс СдЬдсааддс сддЬдссдсЬ ссддсаасад саадсСдаЬс асдссддсаа сдсссЬддсЬ СсЬсСдаддс саЕдсдсаСд ссаадЬасдд ссаддасдсс дсЕссаасда ЬдадддссСд дсааддЬдаа даЬсддсаЬд асдассСдда сЬСсаадаас ЬдсЬддадсС дЬасаасдад Тсдадсадда сдасСдддад Ьсддсдасда саСссЬддЕд ссдСсаасдс СсЬдсЕдсСс ссдЪдсдсае ддссааддад сЩдаддасЬс ЬЬЬсаЕсдсс дсдсссссЕд ссдсЬсддад адсТдддсда даасдсЕдЕд ассссстсст тсатстсасс СТСААСТССТ СААССОСТАС СТАААААССС4 САССАОТТТТ стстттстсс атсссссссс промотором Нус1А1 (1796 по) дадсЬдСсаЬ аедсдеасСа дсасдаЬадд дссддаССдд сСЬасаЬдаа

ААСТССТССС

ССССТСААСС ассааддсЬд дСсаадсадд аадсСдддСд дадаадддсд сЬдсссдСдс аСдсаддадС ддсСдсдадд

ЬдсаасдЬдд аасСЬддСда дасдСддссЬ садсссаасд

ЬЬсСдсаада сссСдсдсса ассаассссд ааддЬсаасс дссддсЬддд дассЬддсдд сдсааЬдсса

ЬасдсЬддсд сттсссссст

СТТАССТССС

ОСААТТТТСТ

ТССОССТАТТ дсдЫздЪЬсс дЬаЕаддадс дсСдасдадс даааСсдсда сасасаааса

ТСТССССССС

ССССССТСАА

ЬЬдадаасаЬ сддадаССда ссаасдссаС

СдссссЬдСа ссСсдЬЬсаа

ЬсаЬдаЬссЬ

ЬдЕассасдс дЬдаСдаддд асдаддссаЪ сдСсддадЪС аЬддсСсдса адЬасссддЬ адсЬдассас

ЬдсдсдСдаа адаЬсддСас дЬдСса^дас (здддсседдс адЬасаасса ададсЬддсд

САССААСССС

ССТТТССТСС

ТССТТСТААС

ТСААССддСЬ дЪЬаЬдЬдСс саЬдаддсаа дСдсСдасдд

СддСсдсдса сСсЬсдсадд сстссстссс ссстсссссс саасдсЪаСЕ ссадаадаСд ссСддссдЬс саадсасаСЬ саЬсаЬсаас дсссдЬЬддс ссЪдаадддс

ЬддсЬЬсдсс сдадааддсс сЬасассдад даадаадасс саСсЬссаСс сдадаасаСс дааддссаСс сае^ассдад садссассдс сЬссддссад дсЬдсСдсдс ссасаЬсддс

ССТССАТССА

ТСАТСАСТСТ

САТССТСССТ сСсЬсСЕсЬд

дЬсааасдсс	60
дЬдаасадаа	120
ддСдЪассдс	180
ЬаддсаадсЬ	240
сасСадссСс	300
СССССССССТ	360
СТСССТСССС	420
аЬСдсссссд	480
ааддассСдд	540
ЬссаСддссд	600
дсддассЬдд	660
ддсддсадсс	720
дссСсдадсС	780
сСдаЬсаадд	840
сссаасаЬсд	900
ддсСасассд	960
дасддсаСдЕ	1020
ааддадсада	1080
даддассссС	1140
ЬдссаддСдд	1200
дасдссаадд	1260
ЬссаСЬдадд	1320
СсдддСдада	1380
аСсаадассд	1440
аЬсдаддадд	1500
ЬддТАААТСС	1560
АСАТАСТССТ	1620
ТТТТСААСАС	1680
ТСАТТТТССС	1740
ссдЬСа	1796

Последовательность № 15

Пример 15: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы, связанной с промотором Ну4А1 (1832 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадсСдСсаЬ дсдСЬдСЪсс дЬЬаСдЬдСс дЪсааасдсс 60

ССсдадсдсС дсссддааса аЬдсдСасЬа дЬаСаддадс саЬдаддсаа дЬдаасадаа 120 дсдддсСдас ЬддСсааддс дсасдаСадд дсЬдасдадс дСдсСдасдд ддЬдЬассдс 180 сдадЬдСссд сСдсаЕСссс дссддаЬСдд даааЬсдсда ЬддЬсдсдса ЬаддсаадсЬ 240 сдсаааПдсе дссадсЬАас сССасаЬдаа сасасаааса сСсЬсдсадд сасСадссЪс 300 ааАТСССССС ССТСАТТССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТСССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

ССССТСАССС СААССАСаСд СдсдадаЬдс (зддасдсддд сдСддЕдддс ЬдссдсдЬдд 480 ассЪдасдСд дддсссдсЬд дадЬСссасс дсаадЬсдсе ЬдссааЬсСд садсаддсса 540

Ьдсдсаадад ссдссдссСд ЬдЬСдсасса ЬддЬддасас дсЬдддссдс дадсСсаСда 600

Сссдссдсса дададдддса ддсСддассс адсдссадад дддСддддСд аесаЬсасса 660 сдсдсасдда сдЬддасдсс адсадсаасд ЬдсЕдссса!: сасЬЕасадс аадСЬсасдд 720 адаСддсддС саадддсдас ассаЪсСаса ЬсддссдсЬа ссСддЬдИдс ддсдсадаса 780 дсдссТсдсе дГассЕддад дСсаЬддасд едсадддсда сдасдСдеас ЪдсаЬсдсса 840 адаасдасдс ддЬдссддас ддссЬдседа сддЬдСЬсса сдсддадсдс ТссдТддадд 900 ддсСддссаа сдСдсадаас дассЬдссдс ЬдсЬдЬссда сЬасдасаад дадСдссЬдс 960 асаЬссЬддс дсаддасЬЬс дадсдсдсдс ссЬасаЬсЕс саадсЬддад ЬссаСсдссЬ 1020 ссСссдссдЬ дсдсдссдсс дассдсдСдд дсдссадссС даЬСдСддЪд Ьасасдсаса 1080 ссддсаадас ддсдсадсСд дСддссаадС ассддссдсс саЬдсссаЬс сСдасдсЬдд 1140

СддСдссдса ссЬддсдСсЪ дассадсЬса адСддаадсС ддадддсадд Ъссадсдсдс 1200 дссадЬдссС саЬсадЕсдс дсдсЬдсЬдс сддСдсСддс сдсдсссСсд сссадсддсд 1260 ассадсЕдсЕ дсаддаддсд дЬддссаЪдд сдддссдсдС саадсЪддЬс аадссдсасд 1320

- 52 028407 ассасдЬддЬ дЬдсдЬдсад сдсаЬссасд асдасаЬддд сдсдддсаЪс аадсдсдасд дсадссссаЬ ддссдЬдсад ддсЬсдЬссд ссаЬсддсаа саадЪЪсддс сссаЬдссдс сссЬдддсдд саЬдддсдЬд ддсдЬдсЬдТ СССССТОАСС ААССОСОСТС САТССААСАТ ОСТСССССТТ ТССТССТСАТ САСТСТТТТТ ттттсттсет тстаасоатс стсссттсат ССТАТТТОАА ССддЬЬсЬсЬ сЬЬсЬдссдЬ асдасЬЬсЬд асасддЬсаЬ дсЬасдасЬс ссдссаЬсаЬ

АААТССАССС

АСТССТСТСА

СААСАССТАА тттассстст ьа сдЬсаадаЬс дЬсдсасадс дссдсдсдЬд сассассддс

ССТСОТТСАТ

АСТССТСААС

АААССССАСС ттстссатсс аЬсЬссдЬдд дЬдЬЬЬддса сасаасаасс ааЬадсЬЬса

СТСАОССТТО

СОСТАССТТА

АСТТТТССАА сссссстссс

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1832

Последовательность № 16

Пример 16: сконструированный ДНК-конструкт пируватферредоксиноксидоредуктазы, связанной с промотором НуйА1 (4376 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадсЬдЬсаЬ дсдЬЬдЬЬсс дЬЬаЬдЬдЬс дЬсааасдсс 60

ЬЬсдадсдсЬ дсссддааса аЬдсдЬасЬа дЬаЬаддадс саЬдаддсаа дЬдаасадаа 120

9^с999сЬдас ЬддЬсааддс дсасдаЬадд дсЬдасдадс дЬдсЬдасдд ддЬдЬассдс 180 сдадЬдЬссд сЬдсаЬЬссс дссддаЬЬдд даааЬсдсда ЬддЬсдсдса ЬаддсаадсЬ 240 сдсаааЬдсЬ дЬсадсЬЬаЬ сЬЬасаЬдаа сасасаааса сЬсЬсдсадд сасЬадссЬс 300 ааАТСОСССС ССТСАТ7ССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТОССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

СООСТСАССС СААССАОаЬд ддааадаааа ЬдаЬдасдас ЬдаЬддсааЬ асадсдасад 480 сдсасдЬддс дЬаЬдссаЬд адсдаадЬсд ссдссаЬсЬа ссссаЬсасс ссЬЬссЬсда 540 ссаЬдддсда ддаддсЬдас дасЬдддсдд сдсааддасд саадаасаЬс ЬЬЬддссада 600 сссЬдассаЬ асдсдаааЬд садЬссдадд ссддсдссдс сддсдсддЬд сасддддссс 660

Ьддсддссдд сдсссЬдасс асдассЬЬса сддсдЬсдса дддЬсЬдсЬд сЬдаЬдаЬсс 720 ссаасаЬдЬа саадаЬсЬсс ддсдаасЬЬс ЬдсссддсдЬ дЬЬссасдЬс ассдсссдсд 780 ссаЬсдссдс дсасдсссЬд ЬссаЬсЬЬсд дЬдассасса ддаЬаЬсЬас дссдсдсдсс 840 адасаддсЬЬ сдссаЬдсЬс дссЬссадсЬ сддЬдсадда ддсссасдас аЬддсссЬдд 900

ЬддсссасЬЬ ддсддссаЬс дадЬссаасд ЬдссдЬЬсаЬ дсасЬЬсЬЬс дасддаЬЬсс 960 дсассЬсдса сдаааЬссад аадаЬсдадд ЬссЬддасЬа сдсддасаЬд дссЬсдсЬдд 1020

Ьдаассадаа ддсссЬддсд дааЬЬссдсд ссаадЬссаЬ даассссдад сасссссасд 1080

Ьдсдсддсас ддсссадаас сссдасаЬсЬ асЬЬссаддд Ьсдсдаддса дссаассссЬ 1140 асЬассЬсаа ддЬдсссддс аЬсдЬЬдссд адЬасаЬдса дааддЬсдсс ЬсссЬсасдд 1200 дссдсадсЬа саадсЬеЬЬЬ дасЬасдЬдд дЬдсЬсссда сдссдадсдс дЬсаЬсдЬдЬ 1260 ссаЬдддсЬс сЬсдЬдсдад ассаЬсдадд аддЬсаЬсаа ссассЬсдсд дссаадддсд 1320 аааадаЬсдд ссЬдаЬсаад дЬссдссЬдЬ асаддсссЬЬ сдЬаадсдад дссЬЬсЬЬсд 1380 сЬдсЬсЬдсс сдсЬЬсддсс ааддЬсаЬса сддЬссЬсда ссдсассаад даасссддсд 1440 сдсссддсда ЬссдсЪсЪас сЬсдасдЬдЬ дсЬсддссЬЬ сдЬддадсдс ддсдаадсса 1500

ЬдсссаадаЬ ссЬддссддс сдсЬасддсс ЬдддЬЬссаа ддааЬЬсадс ссддссаЬдд 1560

ЬсаадЬссдЬ дЬасдасаас аЬдЬссддсд сЬаадаадаа ссасЬЬсасс дЬдддсаЬсд 1620 аадасдасдЬ дассддсасЬ ЬсдсЬдссдд Ьддасаасдс сЬЬсдссдас ассасдссса 1680 адддсассаЬ ссадЬдссад ЬЬсЬддддсс Ьсддсдссда сддсасЬдЬд ддсдссааса 1740 адсаддссаЬ саадаЬсаЬс ддсдасааса сддассЬдЬЬ ЬдсссадддЬ ЬасЬЬсЬссЬ 1800 асдасЬссаа даааЬсдддс ддсаЬсасса ЬсЬсдсассЬ дсдсЬЬсддс дадаадссса 1860 сссадЬссас сЬассЬддЬс аасадддссд асЬаЬдЬсдс сЬдЬсасаас ссддссЬасд 1920 ьдддсаЬаЬа сдасаЪссЬс дааддсаЬса аддаЬддсдд аассЬЬсдЬд сЬсаасЬсдс 1980 сЬЬддадсад ссЬсдаддас аЬддасаадс ассЬдсссЬс сддсаЬсаад сдсассаЬсд 2040 сдаасаадаа дсЬсаадЬЬс ЬасаасаЬсд асдсддСдаа ааСсдссасс даСдСдддас 2100 гдддсддссд саСсаасаСд аСсаСдсада сддссССсСС саадсСддсс ддадЬдсСдс 2160 ссССсдаааа ддссдСддаС сСдсСсаада адСссаСсса сааддссСас ддсааааадд 2220 дсдадаадаС сдСсаадаСд аасассдасд ссдСддасса ддссдСсасс СсссСдсадд 2280 ааССсаадСа СссддаССсс Сддааддасд сСсссдсСда дассааддсс дадсссаСда 2340 сдаасдадСС сССсаадаас дСсдСсаадс ссаСссСдас ссадсадддс дасаадсСдс 2400 сддСдадсдс сССсдаддсс дасддссдСС СсссссСсдд сассадссад ССсдадаадс 2460 дсддсдСддс саСсаасдСд ссдсадСддд Сссссдадаа сСдсаСссад СдсаассадС 2520 дсдссССсдС сСдСссдсас адсдссаСсс СдсссдСдсС ддссааддаа даддадССдд 2580

Ссддсдсдсс ддсдаасССс асддсссСдд аадссааддд сааддадсСс аадддсСаса 2640 адССссдсаС ссадаСсаас асссСддасС дсаСдддсСд сддсаасСдс дссдасаСсС 2700 дСссдсссаа ддааааддсС сСддСсаСдс адссссСдда Сасссадсдс дасдсдсадд 2760

СдсссаассС ддадСасдса дсдсдсаСсс сддСсаааСс сдаддСдсСд ссдсдсдасЬ 2820 одсЬсааддд садссадЬЬс саддадссЬс ЬсаЬддааЬЬ сЬсдддсдсс ЬдсЬсдддсЬ 2880 дсддсдадас дсссЬасдЬд сдсдЬсаЬса сссадсЬсЬЬ сддсдадсдс аЬдЬЬсаЬЬд 2940 ссаасдссас дддЬЬдсЬсд ЬссаЬсЬддд дсдсдЬсддс ЬссЬЬссаЬд ссЬЬасаада 3000 ссаассдссЬ сддасааддс ссддссЬддд дЬаасЬсссЬ дЬЬсдаадас дсддссдааЬ 3060

- 53 028407 •асддсССсдд саСдаасаСд ТссаСдССсд осааддсссС ддададсдаЬ дссЬссддсд ссддсаадаа сдаСссеаСс аадЬссаадд сЪддСсадаа ддаСддСсСд сбсддасада ададсдСдСд даЬсССеддС ддсдасддсС ассаЬдСдсС сдссбсдддс даддасдбда ссаасассдд сддссадСсс Ьссааддсаа сддссддсаа дсдбаседдс аадааддасс ЬсЬасдСддс ТасддСсСсс аСдддССаса аадссдааад сССссссддс сссСсдсСдд дСсЬдсдсаа дддсаСдддс аададссадд асЪддссдсС дССссдсСас даЪссдсдсС ЬсдасТссаа ддсСссСдас ддССссдСсд ссдСссСсда СсддСссССс сссдаддасд ааТСддасдС дсдСССеаад дадСЬддадс Ьсдсдссадс дддсддсаад дссдаСддСС дсасдсдсда сдаСасСссс аСдаСддссс ассдсдсСдд сасдадсдаа садсадддад АСССССТССТ ТСАТСТСАСС СТТССССССТ СТСААСТССТ СААССССТАС СТТАССТССС СТАААААССС САССАСТТТТ ССААТТТТСТ СТСТТТСТСС АТСССССССС ТСССССТАТТ сссдссдсас дсаСССддсс даЬсСЬдссд аСдСсаадда адсссСдсад ддсСддсССд ааСасддсда саадсСсаад аадсСдсСдд СсдссдссаС дСссдассСд Сасассаада дддссСасда саСсддССас ддсддссСдд асдСсССсдЬ саСддаСасс даддСсСасС сдсссасддд сдссдЬддсс аадССсдсдд СддсдсдсаС ддСсаСдасс СасддсСасд дсаадсадса дЬЬссСсаад дСдсСсаадд СсаЬсдссЬа СдсСассСдс аСсаассадд асдСсаСдаа сассдсддЬс аадСссддСС Сддссдссса дддсаадаас сссССссадс аддадСЪссТ даТддсссад аассдсССсд ссаададасТ дсдсдсссад дСсдсСсасд асабддссдс сасдаасаСс ССсдадСссС сддСддаССТ сддсдааддС дсддадССсС дассСдаССс сддЪдаддсс Сдсдассада ассТсадсаа дсддасдаад аадТАААТСС САССААСССС ССТССАТССА АСАТАСТССТ ССТТТССТСС ТСАТСАСТСТ ТТТТСААСАС ТССТТСТААС САТССТСССТ ТСАТТТТССС ТСААССддСС сСсСсССсСд ссдТСа

3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4 02 0 4080 4140 4200 4260 4320 4376

Последовательность № 17

Пример 17: сконструированный ДНК-конструкт пируват-НАДФ-Ьоксидоредуктазы, связанной с промотором Нус1А1 (6092 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадсСдСсаС дсдССдССсс дССаСдСдЬс дСсааасдсс 60

ЬСсдадсдсС дсссддааса аСдсдЬасСа дСаСаддадс сабдаддсаа дСдаасадаа 120 дсдддсСдас ЬддСсааддс дсасдаСадд дсСдасдадс дСдсСдасдд ддСдСассдс 180 сдадЬдСссд сСдсаСЬссс дссддаССдд даааЬсдсда СддСсдсдса СаддсаадсС 240 сдсаааСдсС дСсадсЬТаС сССасаСдаа сасасаааса сСсЬсдсадд сасСадссСс 300 ааАТСССССС ССТСАТ'ГССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТСССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

ССССТСАССС СААССАСаСд аадсадСсСд СссдсссааС СаЬССссааС дСасСдсдса 480 аддаддСЪдс СсСдЬасСса асааСсаЫзд дасаадасаа ддддааддаа ссаасСддЬс 540 даасаСасас садСддссса ааассддсаС сЬсасаЬСда адССссссаб саСдСдасСд 600

Ьдссбдссас Сдассдсасс ссдааСсссд аСдсСсааСС сЬТСсадЬсЬ дСадабдддб 660 сасаадссас садСсасдСС дсдСасдсСс ЬдЬсСдасас адсдСЬсаЫ; ЬасссааЬЪа 720 сасссадЬСс СдСдаЬдддс дадсСддсСд аТдТССддаС ддсСсааддд аддаадаасд 780 ссССЬддСса ддССдСддаС дСссдЬдада СдсааЬсСда ддсСддадсс дсаддсдссс 840

Ьдсабддддс асСддсЬдсС ддадсЬаССд сСасаассСС сасЬдссСсС саадддССдС 900 едСТдаСдаС СсссаасаСд СаСаадаССд саддСдадсЬ даСдсссСсС дСсаСссасд 960

ЬСдсадсссд ададсСЬдса ддссасдсЬс СдСссаСССС Сддаддасас дсЬдаСдСса 1020

ЬддсСдСссд ссааасадда СдддсЬаСдс СдСдсСссса сасадСдсад садСсСсасд 1080 асаСддсСсС саСсСсссас дСддссассс СсаадСссад саСссссССс дССсасССсС 1140 еСдаСддССС ссдсасаадс сасдаадбда асааааТсаа ааСдсЬдссС СаСдсадаас 1200 сдаадааасС ддСдссбссС ддсассабдд аасадсасбд ддсСсдСТсд сСдаасссса 1260

Ьдсассссас саСссдадда асааассадЬ сСдсадасаС сСасСЬссад ааСаСддааа 1320 дТдсааасса дЬасбасасС даСсСддссд аддСсдССса ддадасааСд дасдаадТТд 1380 сассаСасаЬ сддСсдссас ТасаадаЬсТ ЬЬдадСаЬдЬ ЪддСдсасса даЬдсадаад 1440 аадТдасадЬ дсСсаЬдддС СсЬддСдсаа ссасадСсаа сдаддсадСд дассССсСЬд 1500

ЬдаадсдСдд ааадааддЫ; ддСдсадЬсЬ СддЬдсассЬ сСассдасса СддСсаасаа 1560 аддсаСССда аааддСссСд сссаадасад СдаадсдсаТ ЬдсСдсСсСд даСсдсСдса 1620 аддаддСдас СдсасСдддС дадссСсТдС аСсСддаЬдС дСсддсаасС сСдааСССдС 1680

Тсссддаасд ссадаабдЬд ааадСсаЬСд даддасдТСа сддаССдддс СсаааддаСС 1740

ЬсаСсссдда дсаСдсссСд дсааСССасд ссаасССддс садсдадаас сссаССсааа 1800 даССсасСдЪ дддСаСсаса даСдаСдТса сТддсасаСс сдЬСссСССс дСсаасдадс 1860 дЬдССдасас дССдсссдад ддсасссдсс адСдСдЬсЫ: сСддддааСС ддССсадаСд 1920 даасадСддд адссаабсдс СсСдссдТда дааСсаТСдд адасаасадс даССЬдаСдд 1980

ТТсаддссЬа сТЬссааССЬ даСдсССбса адСсаддСдд СдТсасСТсс СсдсаСсСсс 2040 дТТТТддасс ааадссоаСс асадсдсааС ассТСдССас сааСдсСдас СасаСсдсдТ 2100 дссасСЬсса ддадСаСдСс аадсдсСССд асаСдсТбда ЬдссаСссдТ даддддддса 2160 ссТСТдССсТ сааСТсСсдд Ьддассасдд аддасаТдда дааддадаЫ: ссддсСдасТ 2220

Сссддсдсаа дсСддсасад аадааддбсс дсТТсТасаа СдЬддаЬдсС сдааадаЬсТ 2280 дСдасадССС СддСсСЬддд аадсдсабса аСаСдсСдаС дсаддсЬСдС СЬсСЬсаадс 2340

- 54 028407

ЬдЬсСддддЬ дсЬссс.асЬд дссдаадсЬс адсддсЬдсЪ даасдадЬсс аЬЪдЬдсаЬд 2400 адЪаЬддааа даадддЬддс ааддЕддЕдд адаЕдаасса адсадЕддЕд ааЕдсЕдЬсС 2460 еедседдСда ссЕдссасад даадЬЬсаад ЬсссЬдссдс сбдддсааас дсадеедаба 2520 аабссасссд Ьассссзасс дддаЫздаде еедЬСдасаа дабсаЬдсдс ссдсЬдаЬдд 2580 аЪСЬсааддд ЬдассадсЪс ссадЬсадЬд ЬдаЪдасЬсс ЬддЬддаасс ЬЬсссЬдЬсд 2640 ддасаасаса дЬаЬдсааад сдЬдсааЬЪд сЪдсЪЪЬсаС СссссадЬдд аЪЬссЬдсса 2700 аседсасаса дЬдсаааеаЬ ЬдеесдбаСд ееедссссса сдссассаес сдассЬССсд 2760 ЬдсЬдасада ссаддаддЬд садсЪддссс сддададсЬЬ ЬдЬдасасдс ааддсдаадд 2820 дЪдаЬЬасса ддддаЬдааЬ ЬЬссдсаЬсс аадеЪдсЬсс ЬдаддаЬЪдс асЕддсЬдсс 2880 адд^д^дсщ ддадасдЬдс сссдаЬдаЪд сссЬддадаЬ дассдасдсЬ ЪЬсассдсса 2940 ссссЬдбдса асдсассаас ЪдддадЬЬсд ссаЬсааддЬ дсссаассдс ддсассаЬда 3000 сддассдсЬа сЬсссЬдаад ддсадссадЬ Ьссадсадсс ссЪссЬддад ЬЬсЬссдддд 3060 ссбдсдаддд сЕдсддсдад ассссаЕаЕд ЬсаадсЬдсЕ сасссадсЬс Ызсддсдадс 3120 ддасддЬсаЬ сдссааодсс ассддсЪдса дбЬссаЬсЪд дддСддсасЬ дссддссСдд 3180 сдссдЬасас сассааодсс аадддссадд дсссддссЬд дддсаасадс сЬдССсдадд 3240 асаасдссда дЬЬсддсЬЬЬ ддсаЬЬдсад Ьддссаасдс ссадаададд ЬсссдсдЪда 3300 дддасЬдсаб ссЬдсаддса дЬддадаада аддбсдссда ЬдадддЬЫзд ассасаЬЬде 3360 ЬддсдсааЬд дсбдсаддаб Ьддаасасад дадасаадас сЬЬдаадбас саадассада 3420 ЬсаЬЬдсадд дсЬддсасад садсдсадса аддабссссЬ ЬсЬддадсад абсЬаЬддса 3480 ЬдааддасаЬ дсЬдссЬаас аСсадссаде ддаЬсаЬЬдд ЬддЬдаЬддс Ьдддссаасд 3540 асаГЬддЬИ: сддЬдддсЬд дассасдЬдс ЬддссЬсбдд дсадаассЬс аасдЬссЕдд 3600 бдсбддасас сдадаЬдЬас адсаасассд дЕдддсаддс сЬссаадЬсс асссасаЬдд 3660 ссЬсЬдЬддс саадЪЬЬдсс сЬдддаддда адсдсассаа саадаадаас ЬЬдасддада 3720 ЬддсааСдад сЕаЬддсаас дСсЕаЬдЬдд ссассдЬсЕс ссаЬддсаас аЬддсссадЬ 3780 дсдЬсааддс дЬЬЬдЬддад дсбдадЬсЬЬ аЬдаСддасс ЬЕсдсбсаЬЬ дЬЬддсЬаЬд 3840 сдссаЬдсаЪ сдадсаЬддЬ сЪдсдЪдсСд дЬаЬддсаад дабддЬЕсаа дадЬсЬдадд 3900 сЬдссаЬсдс сасдддаЬас (зддссссЬдЬ ассдсЬЬЬда сссссдссбд дсдассдадд 3960 дсаадаассс сЬЬссадсЬд дасЬссаадс дсабсааддд саассЬдсад дадЬассбдд 4020 ассдссадаа ссддЬабдЪс аассЬдаада адаасаассс даадддЬдсд дабсЬдсЬда 4080 адЬсбсадаЬ ддссдасаас аЬсассдссс ддЬГсаассд сЬассдасдс аЬдЪЬддадд 4140 дссссааЬас аааадссдсс дсссссадсд дсаассаЬдЪ дассаЬссЬд Ьасддсбссд 4200 ааасЬддсаа садЬдадддЬ сЬддсааадд адсЬддссас сдасЬЬсдад сдссдддадб 4260 асбссдЬсдс адЬдсаддсЬ ЬЬддаЬдаса ЬсдасдЬЬдс бдасЬбддад аасаЬдддсЬ 4320 ЬсдЬддЬсаЬ ЪдсддЬдЬсс ассЬдЬдддс адддасадШ сссссдсаас адссадсбдЬ 4380 ГсЕддсддда дсЕдсадсдд дасаадссЕд адддсЬддсЕ даадаасЕЕд аадЕасасЕд 4440 бсЬЬсдддс!; дддсдасадс асаЬасбасЬ ЬсЬасЬдсса сассдссаад садаЬсдасд 4500 сЬсдссЬддс сдссЫдддс дсЬсадсддд ЬддЬдсссаЬ ЬддсЬЬсддс дасдаЬдддд 4560 абдаддасаС дССссасасс ддсШсааса асЬддаГссс садСдбдЬдд ааЬдадсЬса 4620 адассаадас Ьссддаддаа дсдсЪдЬЬса ссссдадсаЬ сдссдЬдсад сЬсассссса 4680 асдссасссс дсаддаЬЬЬс саЬЬЬсдсса адЬссасссс адЬдсЬдбсс аЬсассддЪд 4740 ссдаасдсаЬ сасдссддса дассасассс дсаасЫзсдЬ сасЬаЬссда Ъддаадассд 4800 аееедСсдба ссаддеддде дасЕсЬсЬСд дСдЕсЬСссс (здадаасасс сддЕсадбдд 4860 ЬддаддадЪЬ ссЬдсадЬаЬ ЬасддсЬЬда ассссаадда сдЬсаСсасс абсдааааса 4920 адддсадссд ддадЫдссс сасЬдсабдд сЬдЫздддда СсЬсЬЪсасд ааддЬдЬЬдд 4980 асаЪсЬЬддд саааоссаас аассддЬЬсб асаадасссЬ ЬЬсЬЬасЬЬЬ дсадЬддаса 5040 аддссдадаа ддадсссЫзд СЬдаадаЕсд ссдадаЬддд дссддадСас адсаасаЬсс 5100 ЬдбсЬдадас дЬасса.сЬас дсддасаЬсЬ ЬссасаЬдЫ; сссдЬссдсс сддсссасдс 5160 ЬдсадЬассЬ саЬсда.даЬд аЪссссааса Ьсаадссссд дЪасЪасЬсс аЪсЬссЬссд 5220 сссссабсса сассссЬддс даддЬссаса дссЬддЪдсЪ сабсдасасс Ьддабсасдс 5280 Ьдбссддсаа дсассдсасд дддсЬдассЬ дсассабдсЬ ддадсассЬд саддсдддсс 5340 аддЬддЬдда ЬддсЬдсаЪс сассссасдд сдаЬддадЬЬ ссссдассас дадаадссдд 5400 ЬддЬдабдЬд сдссабдддс адЬддссЬдд сассдЪЬсдЬ ЬдсЪЪЪссЬд сдсдасддсЬ 5460 ссасдсЬдсд даадсадддс аадаадассд ддаасабддс аЬЬдЬасЬЬс ддсаасаддЬ 5520 абдадаадас ддадЕГссСд аЬдааддадд адсЬдааддд ЬсасаЬсаас даЬддЬЬЬдс 5580 ЬдасасЬЬсд аГдсдсЫСс адссдадабд ассссаадаа дааддЬдЬаЬ дЬдсаддасс 5640 ссаЕсаада! ддасдаааад аЪдаЕдЕасд аЪЕассСсдЕ ддбдсадаад ддСЬсЬаедЕ 5700 аЬЪдсЬдЬдд аЬсссдсадЬ ЪТсаЬсаадс сбдЬссадда дЬсаЫздааа саЬЬдсббса 5760 ЕдааадсЬдд ЬдддсЬдасЬ дсададсаад сЪдадаасда ддесаЬсдаЬ абдЕЬсасда 5820 ссдддсддба. сааЬаЬсдад дсаЬддЬааТ АААТСЗСАССС ССТССТТСАТ СТСЗАСССТТС 5880 СССССТСАСС ААССССОСТСЗ СЛТССААСАТ АСТССТСТСА АСТОСТСААС ССОТАССТТА 5940 ССТСССССТТ ТССТ6СТ0АТ САОТСТТТТТ СААСАСОТАА АААСС6САСС АОТТТТССАА 6000 ттттсттест тстаассатс стсссттсат тттсесстст ттстссатсс ссассстссс бобо ССТАТТТСАА еСддЕЬсЬсЬ сЬЬсЬдссдЬ Ъа 6092

- 55 028407

Последовательность № 18

Пример 18: сконструированный ДНК-конструкт тиолазы, связанной с промотором НуйА1 (1856 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадсЪдЬсаС дсдСЪдеесс дееаЪдЪдСс дЬсааасдсс 60

ССсдадсдсС дсссддааса аСдсдЪасСа дЪаСаддадс саЪдаддсаа дЪдаасадаа 120 дсдддсЬдас ЬддЬсааддс дсасдабадд дсбдасдадс дСдсСдасдд ддбдГассдс 180 сдадЕдСссд сСдсаСЬссс дссддаСГдд даааСсдсда ЬддГсдсдса СаддсаадсС 240 сдсаааСдсС дСсадсЬСае сеСасаСдаа сасасаааса сСсСсдсадд сасСадсеСс 300 ааАТСССССС ССТСАТ'ГССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТ'ЗССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

ССССТСАССС СААССАСаЪд ааадаадбад ЬСаССдсаад ЪддЬдЪаадд асСдсСдСсд 480 ддаааееъдд СддсасдсСС сЪаааЪдСас сЪдсадСада еееаддЬдсе дЬдааСааСа 540 ааадаадсаЬ ааааададсс ааСдСдааас сЪдаадаЪдЪ СадедаадСд аЬааЪдддаа 600 аСдеаССдса ддсаддЬсСС дддсадаасс ссдсаадаса адсСдаааСа ааадсдддса 660

ЪассадСада адЪЕссддсЪ аСдасСдСаа асаСддСаСд еддаЬсаддЪ сССададсСд 720

ЬдасасСЬдс СдсСсаддса дЬСаСдсСед дСдаСдсЬда саССдеедСа дссддЬддаа 780

ЬддааааЬаГ дСсаададса ссабаСаСаС СаааЬдаЬдс ЬсдсЪЫзддд ЬасаддаГда 840 асааЬддсса дсеедЬадаЬ дааабддеаЬ аСдаСддеее аасадаСдСГ ГГСаассааС 900 аСсасаЬддд ааЬсасЬдсс дааааЬсЬЪд сСдаааааСа сддсаСаСса ададаададс 960 аддаЬдааее СдсаСаГада адссаааааЬ СадсдЬсада адсдабаСса СсаддаадаС 1020

ЕЕдаддаСда даСадСГссС дСдаССдедс сдсадааааа аддСдаассд аСадааШЬа 1080 аадГГдаГда асаЬдбдада ссбааЬасда сааГГдаадс асЬЬдсаааа ГЬаааассад 1140 саГГссаааа адаСддаасС дСаасСдсСд даааСдсаСс аддааССаас даСдсадсСд 1200 садсадСадЬ ЬдСдаСдСса ааадаааадд саЬдЪдаасе ЬддааСааад ассаСЬдсаа 1260 сдаССаааес аеЬЕддЬЪае дсаддГдГГд ассссадсаЪ сасдддааЬС ддСссадСаС 1320 аЬдсСасдад аааддсаЪСа дааааадсСа аСсЬаасГдЪ адаСдаСССа даСССааССд 1380 аадсаааСда адсаСССдса дсасааЬсас ЕддсЕдЪедс аааадааЪСа аааееЪааЪа 1440

ЬддасададЬ дааСдСааае ддЬддсдсаа ССдсдаГадд ЪсаЪссааЬс ддсдссадсд 1500 даСдеадааС СсСадСдасд сЪееЪаЪаед адабдсадаа даддааЪЕсд саСасСддас 1560

ЕЬдсаасаее дСдсаСсддс ддаддааЬдд дааСадсааС ддЪедЕсдаа адаТАААТСС 1620

АСССССТССТ ТСАТСТСАСС СТТССССССТ САССААСССС ССТССАТССА АСАТАСТССТ 1680

СТСААСТССТ СААСССЗТАС СТТАССТССС ССТТТССТСС ТСАТСАСТСТ ТТТТСААСАС 1740

СТАААААОСС САССАСТТТТ ССААТТТТСТ ТССТТСТААС САТССТСССТ ТСАТТТТССС 1800 стстттстсс атсссссссс тссссстатт тсАлссддее сСсСсеесед ссдъеа 1856

Последовательность № 19

Пример 19: сконструированный ДНК-конструкт 3-гидроксибутирил-КоАдегидрогеназы, связанной с промотором НуйА1 (1550 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС дадсСдСсаС дсдССдЫзсс дССаСдСдЬс дСсааасдсс 60

ГСсдадсдсС дсссддааса аСдсдеасЪа дбаСаддадс саЬдаддсаа дЪдаасадаа 120 дсдддсСдас СддСсааддс дсасдаСадд дсЪдасдадс дСдсСдасдд ддСдСассдс 180 сдадЬдСссд сСдсаССссс дссддаССдд даааЪсдсда ЬддСсдсдса СаддсаадсС 240 сдсаааСдсЬ дСсадсССаС сЬСасаСдаа сасасаааса сСсСсдсадд сасСадссСс 300 ааАТСССССС ССТСАТТССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТСССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

ССССТСАССС СААССАСаСд саааадаСЬЬ дЪдГааСадд СдсЬддааса аЬдддсЬсад 480 дсаЬсдсЕса адСаСССдса сааааЬддсС ССдаадСааЬ СССасдсдаС аССдаСаСда 540 адСЕсдСада ааааддаССС ддсасааССд ааааааЬЬСа сааадаааЪд ССдасааадд 600 дааааЬСаса дсадабдада ааасдааССС ЕаадсадааЪ сададдЬаса асаааЬССдд 660 аадасдсааа адаадсадаЪ СЬСдСадеед аадсддсбаЬ адааааЪаГд даЬсСсаада 720 аасаааСаСС сааададсЬа даСдаааеаС дсааааЕдда аасааЬссСС дсдЪсаааЬа 780 саГсаЕсасЕ аЬссабааса дааабадсаа дбдсдасааа аадассЕдад ааадСсаЬад 840 дааЬдсаеее сССсаассса дССссадЬаа СдааасСедС ГдаадСсаСа аааддаГЬаа 900 адасаЬсада дсааасагее ааСдСсдСса дадааССддс еегаааадЕа дасаааасас 960 сСаГададдС сааадаадса сседдаСССд еедеаааЬад даеСССааСс ссааСдаССа 1020 аГдаадсааЬ СддааГасее дсадСддСдС ГддсаасЬда саададсаЕа даЬдаадсба 1080

ЬдааасЪЪдд СдсааэСсаС ссааЪаддас сСССддсаес дСсСадееСд аСаддсааЬд 1140 асдСсдССсС СдсЬаГааСд ааСдСдсСЬе аСдаададСа сддсдаССсд ааабасадас 1200 сасаГссасГ ГсСааа.аааа дГддСаадад дсддаССдсС дддЬадаааа асСддсааад 1260 дЫзСсееЬда аСасаа.ааее ааСсСеССаа ддаддадааС аЬсаСдаТАА АТССАССССС 1320

ТССТТСАТСТ САСССТТССС СССТСАССАА ССССССТССА ТССААСАТАС ТССТСТСААС 1380

ТССТСААССС СТАССТТАСС ТСССССТТТС СТССТСАТСА СТСТТТТТСА АСАССТАААА 1440

АССССАССАС ТТТТСС'ААТТ ТТСТТССТТС ТААССАТССТ СССТТСАТТТ ТССССТСТТТ 1500

- 56 028407

СТССАТСССС ССССТССССС ТАТТТСААСС ддСЬсесесЬ СсСдссдССа

Последовательность № 20

Пример 20: сконструированный ДНК-конструкт кротоназы, связанной с промотором НуйА1 (1457 по)

АСААААТСТС ОСАССАСАСС дадсЬдЪсаЪ дсдЬЬдЬЬсс дЬЁаСдЕдСс гСсдадсдсС дсссддааса аЬдсдЪасЬа дЬаЬаддадс саЪдаддсаа дсдддсСдас СддСсааддс дсасдаЬадд дсЬдасдадс дЬдсЬдасдд сдадСдСссд сСдсаССссс дссддаЬЬдд даааЬсдсда ЬддСсдсдса едсаааСдсС дЬсадс’зСаЬ сЪСасаСдаа сасасаааса сСсЬсдсадд ааАТСССССС ССТСАТТССС ААОТССТССС тстссссссс сстссстссс ССАСССТССС ССССАТСССС ССССТСААСС СССССОТСАА ссстсссссс ССССТСАССС СААССАСаСд даЬЬЬСааЬа аЪдЪЪЫзаЪЪ аааСааддаС сЬсСсаСсаЕ ЬаЬааа'зсдЬ ссаааддсЬЪ ЬаааЬдсаЬЬ ааасСаЬдад адЬЬадаЪад едедсездаЬ аЬадЬЬдааа аЬдаеааада даеаааадЦЬ сСддсадсдд Сдаааааасс ССсдЬЬдсад дЬдсЬдаЬаЬ адсСдадаЪд сассасССда адсдаадаад еЬсЬсЬсСЬЬ аСддасадаа адЬаСЬЪадд здсЬаадСаа дссЬд(2~аЬа дсадсддЬаа аЬддЬЪЕЕдс асЕСддСддС зЬЕсСаСддс аСдСдасаСа сдеаЫздсаа дЬаааааСдс ааааСССдде саддасЬЬдд ааЬааЬассЬ ддсЬЬЬЬсад даасЬсааад аЪЬассасдЪ сЬЬсЬааадс СааададсЪЪ аЬСЬЬсасад дЪдасаЪдаЬ аааеесЪдаЬ аааЬаддссЬ Ьа):а(;с:ааа дЫздЬЬдаас ЬаесЪдаЬсЕ саСЕдаадаа ссдсдааааа ааСдаСдЬса аааадСсааа ЬадсааЬЬЬс ЬсЬадсааад аСаадддааС ддааасадас (зСадаЬасад дсааЬасЬаС адаадсСдад саЕдССеСас аасадаздаЪ сааааадаад дЬаЬдаЬЬдс дЬЬЬСсЬдаа сЬаааЬЬЬдд саааТА,\АТС САСССССТСС ТТСАТСТСАС ССТТСССССС СОСТССАТСО ААСАТАСТСС ТСТСААСТОС ТСААОСССТА ССТТАССТСС СТСАТСАСТС ТТТТТС.1АСА ССТАААААСС ССАОСАСТТТ ТССААТТТТС ссатсстссо ттсаттттсс сстстттстс сатссссссс стссссстат зсесесСЬсС дссдССа

1550

десааасдсс	60
дЬдаасадаа	120
ддСдЬассдс	180
ЬаддсаадсЪ	240
сасЬадссСс	300
СССССССССТ	360
СТСССТСССС	420
даСдддаСад	480
асасЬаааад	540
ЪЬааЪЪаЪаа	600
адЬааЬаЬда	660
аадаЪадааа	720
ддаЪдсдадс	780
саассЦдаад	840
сЪЬаЬаддса	900
даадсаЬаЪа	960
дсааааааас	1020
даадсааЪаа	1080
аааЬСЬЬссЬ	1140
аададддсдс	1200
ТСАССААССС	1260
СССТТТССТС	1320
ТТССТТСТАА	1380
ТТСААССддЬ	1440 1457

Последовательность № 21

Пример 21: сконструированный ДНК-конструкт бутирил-КоАдегидрогеназы, связанной с промотором Нус1А1 (1817 по)

АСААААТСТО ОСАССАСАСС дадсСдСсаЬ дсдЫздЬЬсс дЬЬаЬдЪдСс дЬсааасдсс 60

ЬЬсдадсдсЬ дсссддааса аЬдсдЕасЬа дЬаЬаддадс саЬдаддсаа дЬдаасадаа 120 дсдддсЪдас ЬддЬсааддс дсасдаЬадд дсЪдасдадс дЬдсСдасдд ддЬдЬассдс 180 сдадСдСссд сСдсаССссс дссддаьедд даааЬсдсда ЬддЬсдсдса Ьаддсаадс); 240 сдсаааЬдсЬ дЬсадсССаС сЬЬасаЬдаа сасасаааса сЬсЬсдсадд сасСадссЬс 300 ааАТСССССС ССТСАТТССС ААОТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТСССС ССССТСААСС СССССОТСАА СССТСССССС СТСОСТСССС 420

ССССТСАССС СААССАОаЪд дасьеьесаь еаасааадда дсаадаааЬд д(;ааддсдЬд 480

ЫздЪдадада аЪЬсдсЬдаа ааадаадШд сЪссЬааадс аааадаааЬа даЬаЬсасад 540 аададЬЕЬсс аЪдддаЬаса дСаадааааа ЬддсЬсаааа сдаЬаЬдаЬд ддЬаЕЕссЬЬ 600 аЬссадаада дЪаЬдд’здда дсаддЬддад аЬЬасЬЬдад ЬСаЪаЬсаЬа дсЪдЫздаад 660 адаЬаЪсаад адсЬЬд+дсЬ асдасЬддад СааСЬЫаЬс ЪдсЪсаЬасС ЬсаЬЬдддаа 720 дССЬСссааС аЪаЬсааЬдд ддаасадаад аасаааааад ааааСаЬсЬа дЬдссасЫзд 780 сааааддЬда ааааСЬдддс дсЬЬЬЬддсс ЬЬасадаасс ЬаасдсаддЬ асадаЬдсад 840 седдасадса дасаас+дса дЬаеСадаЕд дедаЕсасСа сдЕаСЬааас ддсЬсааЕаЕ 900

ЫзаеЬасааа сддаддаааа дсЬдасаеаЬ аЬаЬааЬсеъ ЬдсааЬдаса дасаааЬсаа 960 ааддсасаад аддсаС;ад(; дсаЬЪЬаЬад ЬЬдадааада еЬЬСссдддЬ ЬЪЬадсаЬЬд 1020 дсааааЬЬда адааааааЪд ддЬаЬаадад сСЬсаЬсаас ЦдссдаасЫ: дедеыздаад 1080 аЬЬдСаСЬде ассаааадаа ааеъеасЫзд деааадаадд адааддЬЬЫ: ааааЬЬдсда 1140 еддсЬасасС адаЬддсдда адааЬаддаа Садсадсдса асдссЬЬдда аЬадсЬсадд 1200 сСдсЪЬЪада ЬдаададаЬа аааёаЕдсаа аддааадаса асадЬШдда адассааШд 1260 дааааСССса аддсаЬссаа ЬддЬаЬаЬад сЬдаЬаЬддс аасдадааЬа ааЬдсЬЬсаа 1320 да&ддсеедЬ аЬасаасдсс дсЫзддадаа адсаддЬадд ЬсЬЬссдЬас асааЬддаад 1380 садсЬаЬддс ааааЬЬаеае дсЬЬссдааа садсааЬдЬЬ ЬдЬаасдаса аааасадЬЬс 1440 адаЬаЬеЬдд сддсЬасддс ЬЪЬасаааад аеЬаЬссадЬ ддааадаСЬЬ аЬдададаЬд 1500 саааааЪаас адаааЬсЬаЬ дааддсасаЬ сддаадЬсса дааааЬддСЪ аЬЬЬссддЬа 1560 ассСаССдаа ааЬдТА^АТС САСССССТСС ТТСАТСТСАС ССТТСССССС ТСАССААССС 1620

- 57 028407

СССТССАТСС ААСАТАСТСС ТСТСААСТСС ТСААССССТА ССТТАССТСС СССТТТССТС 1680 СТОАТСАСТС ТТТТТСААСА ССТАААААСС ССАССАСТТТ ТССААТТТТС ТТССТТСТАА 1740 ССАТССТССС ТТСАТТТТСС ССТСТТТСТС САТССССССС СТЗС0С0ТАТ ТТСААССддб 1800 бсбсбсббсб дссдбба 1817

Последовательность № 22

Пример 22: сконструированный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы, связанной с промотором Ну<ЗА1 (2084 по)

АСААААТСТС ОСАССАСАСС дадсбдбсаб дсдббдббсс дббабдбдбс дбсааасдсс 60 ббсдадсдсб дсссддааса абдсдбасба дбабаддадс сабдаддсаа дбдаасадаа 120 дсдддсбдас бддбсааддс дсасдабадд дсбдасдадс дбдсбдасдд ддбдбассдс 180 сдадбдбссд сбдсаббссс дссддаббдд дааабсдсда бддбсдсдса баддсаадсб 240 сдсааабдсб дбсадсббаб сббасабдаа сасасаааса сбсбсдсадд сасбадссбс 300 ааАтсссссс сстсаттссс аастсстссс тстссссссс сстссстссс ссссссссст збо ссАОсетесе ссссатоссс сссстсаасс сссссстсаа ссстессссс стссстсссс 420 ССССТСАССС СААССАСабд аббааадаса сдсбадбббс бабаасаааа дабббааааб 480 бааааасааа бдббдааааб дссаабсбаа адаасбасаа ддабдаббсб бсабдбббсд 540 дадббббода ааабдббдаа аабдсбабаа дсаабдссдб асасдсасаа аадабаббаб 600 сссббсабба басаааадаа сааададааа ааабсабаас бдадабаада ааддссдсаб 660 бадаааабаа ададаббсба дсбасаабда ббсббдаада аасасабабд ддаадабабд 720 аадабааааб аббааадсаб дааббадбад сбааабасас бссбдддаса даадабббаа 780 сбасбасбдс ббддбсадда дабаасдддс ббасадббдб адааабдбсб ссабабддсд 840 ббабаддбдс аабаасбссб бсбасдаабс саасбдааас бдбаабабдб аабадбабад 900 дсабдабадс бдсбддаааб асбдбддбаб ббаасддаса бссаддсдсб аааааабдбд 960 ббдсббббдс бдбсдааабд абааабааад сбаббабббс абдбддбддб ссбдадаабб 1020 бадбаасаас бабааааааб ссаасбабдд асбсбсбада бдсааббабб аадсасссбб 1080 саабаааасб асбббдсдда асбддадддс саддаабддб ааааасссбс ббаааббсбд 1140 дбаадааадс бабаддсдсб ддбдсбддаа абссассадб баббдбадаб дабасбдсбд 1200 абабадаааа ддсбддсаад адбабсаббд ааддсбдббс ббббдабааб аабббассбб 1260 дбаббдсада аааадаадба бббдбббббд адаасдббдс адабдаббба абабсбааса 1320 Ьдсбаааааа баабдссдба аббабааабд аадабсаадб абсааадбба абадабббад 1380 баббасаааа ааабаасдаа асбсаадааб асбсбабааа баадааабдд дбсддаааад 1440 абдсаааабб аббсббадаб дааабадабд ббдадбсбсс ббсаадбдбб ааабдсабаа 1500 бсбдсдаадб аадбдсаадд сабссабббд ббабдасада асбсабдабд ссаабаббас 1560 сааббдбаад адббааадаб абадабдаад сбаббдааба бдсаааааба дсадаасааа 1620 абадааааса бадбдссбаб абббаббсаа аааабабада саассбаааб аддбббдааа 1680 дадааабсда басбассабс бббдбааада абдсбааабс ббббдссддб дббддббабд 1740 аадсадаадд сбббасаасб ббсасбаббд сбддабссас бддбдаадда абаасббсбд 1800 саадаааббб басаадасаа адаадабдбд басбсдссдд 6ТАААТССАС ССССТССТТС 1860 АТСТСАОССТ ТССССССТСА ССААСССССС ТССАТССААС АТАСТССТСТ СААСТССТСА 1920 АССССТАССТ ТАССТССССО ТТТССТССТС АТСАСТСТТТ ТТСААСАССТ АААААССССА 1980 ЗСАСТТТТСС ААТТТТСТТС СТТСТААССА ТССТСССТТО АТТТТССССТ СТТТСТССАТ 2040 ЗСССССССТС СССОТАТТТС ААССддббсб сбсббсбдсс дбба 2084

Последовательность № 23

Пример 23: сконструированный ДНК-конструкт бутанолдегидрогеназы, связанной с промотором НубА1 (1733 по)

АСААААТСТС ОСАССАСАСС дадсбдбсаб дсдббдббсс дббабдбдбс дбсааасдсс 60 ббсдадсдсб дсссддааса абдсдбасба дбабаддадс сабдаддсаа дбдаасадаа 120 дсдддсбдас бддбсааддс дсасдабадд дсбдасдадс дбдсбдасдд ддбдбассдс 180 сдадбдбссд сбдсаббссс дссддаббдд дааабсдсда бддбсдсдса баддсаадсб 240 сдсааабдсб дбсадсббаб сббасабдаа сасасаааса сбсбсдсадд сасбадссбс 300 ааАТССССОС ССТСАТГССС ААСТССТССС ТСТССССССС ССТСССТССС СССССССССТ 360

ССАСССТССС ССССАТЗССС ССССТСААСС ССССССТСАА СССТСССССС СТСССТСССС 420

ССССТСАССС СААССАЗабд аааддббббд саабдсбадд баббаабаад ббаддабдда 480 бсдааааада ааддссадбб дсдддббсаб абдабдсбаб бдбасдссса ббадсадбаб 540 сбссдбдбас абсадабаба сабасбдббб ббдадддадс бсббддадаб аддаадааба 600 бдаббббадд дсабдаадсб дбаддбдаад ббдббдаадб аддаадбдаа дбдааддабб 660 ббааассбдд бдасададбб абадббссбб дбасаасбсс адаббддада бсбббддаад 720 ббсаадсбдд ббббсаасад сасбсааасд дбабдсбсдс аддабддааа ббббсааабб 780 бсааддабдд адбббббддб даабаббббс абдбааабда бдсддабабд аабсббдсда 840

- 58 028407 ббсбассбаа адасабдсса дабббсабдд адсадаасбб ббддадсбдб бддсббаабд ббддадбддд дадсаддссд ббсбааабба бааааабддб дсдббдассд сдбааббабд бддббааасс аддаддааба саабассасд бдбадаабдд дбссбддддд асдбббдада абсбаадбаа аббадббаса баббаабдаа адасаадсса СССТСОТТСА ТСТСАСССТТ .лАСТССТСАА ССССТАССТТ аааассссас састтттсса ТТТСТССАТС СССССССТСС ббадаааабд сбдббабдаб дсадабаббс ааабдддббс ддаабадсад дбдсбааабб абббдбдббд аддсбдсааа сабабадббд абсаадббаб дсаддсддбд дббсбдааас абббсбааба баааббабса ддабдбддаа бддсбсасаа дсадааабдб баададабаб сабдбабабс абддабббда ааадасббаа ббааадсадб ССССССТСАС СААССССССТ АССТСССССТ ТТССТССТСА АТТТТСТТОС ТТСТААССАТ СССТАТТТСА АССддббсбс аасадабабд аадбдббдбд асдбддадса аббббабдда даааббаасд аббабсссаа бддаадбдда дасбабаааа ддбадбабаб бсасабадаа адббабабба

ССАТССААСА

ТСАСТСТТТТ

ССТСССТТСА бсббсбдссд абдасбасбд дбааббддса ддбадаабаа дсаасадаба аабддаааад дсадбабсба дабдсбббас ддаддбсббб аабсдбдббд даадсасбдб

ТАААТССАСС

ТАСТССТСТС

ТСААСАССТА

ТТТТССССТС бба

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1733

Последовательность № 24 Пример 24: сконструированный ДНК-конструкт фруктозодифосфатальдолазы (1556 по) адаааабсбд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС СССССССАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТОТСС ССССССССТС ССССАТССТА СССТСССАСТ 120

САСССССССС САСТТСОААС ССТТСАААСС АССССССССТ АССААСТТТТ СТСССССССС 180

ССТСССССаб ддсссбдабд абдаадбсдб сддссадссб дааддсбдбд бсдсбддссд 240 сбсбсдссдс дссдбсдббд бдсдсдссдд дсаадбасда бдаддадсбд аббаадассд 300 сбддсассдб бдссбссаад ддссдсддба бссбддссаб ддасдадбса аасдссассб 360 дсддсааасд ссбддасбсс абсддсдбдд адаасассда ддадаассдс сдсдссбасс 420 дсдадсбдсб ддбдассдсс сссддссбдд дссадбасаб сбссддсдсб абссбдббсд 480 аддадасссб дбабсадбсс ассдссбссд дсаадаадбб сдбсдабдбд абдааддадс 540 адаасабсдб дсссддсабс ааддбсдаса адддссбддб дсссбдбсса асассаасда 600 бдадсбддбд сабдддссбд дасддсбдда саадсдсбдс бдадбасбас ааддссддсд 660 сбсдсббсдс саадбддсдс бсддбсдбсб сдабссссса сддссссбсд абсабдсбдс 720 сдсдасбддс сбасддссбд дсссдсбасд ссдссабсдс ссадаасдсс ддбсбддбдс 780 ссаббдбдда дсссдаддбс сбдсбддасд дбдадсасда сабсдассдс бдссбддадд 840 бдсаддаддс сабсбдддсс дадассббса адбасабддс сдасаасаад дбсабдббдс 900 адддбабссб дсбдаадссс дссабддбса сссссддсдс бдасбдсаад аасааддссд 960 дссссдссаа ддббдссдад басасссбда адабдсбддс сдсдсдбдсс сссссддбсс 1020 ссддсабсаб дббссбдбсд ддсддссадб ссдадсбдда дбсдасссбд аассбдаасд 1080 ссабдаасса дадссссаас ссдбддсасд бдбсдббсбс дбасдсссдс дсбсбдасда 1140 асассдббсб даадассбдд саддсаадсс сдадаасддб ссаддсдссс аддсбсдсбд 1200 сбсаадсдсд сааддссаас бсддасдсбс адсадддсаа дбасдасдсс ассассдадд 1260 дсааддаддс бдсссадддс абдбасдада адддаааадд сбасдбсбас бааТАААТСС 1320

АСССССТССТ ТСАТСТСАСС СТТССССССТ САССААСССС ССТССАТССА АСАТАСТССТ 1380

СТСААСТССТ СААССССТАС СТТАССТССС ССТТТССТСС ТСАТСАСТСТ ТТТТСААСАС 1440

СТАААААССС САССАСТТТТ ССААТТТТСТ ТССТТСТААС САТССТСССТ ТСАТТТТССС 1500

СТСТТТСТСС АТСССССССС ТСССССТАТТ ТСААССддбб СбСбСббСбд ссдбба 1556

Последовательность № 25

Пример 25: сконструированный ДНК-конструкт триозофосфатизомеразы (1379 по) адаааабсбд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС СССССССАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТОТСС ССССССССТС ССССАТССТА СССТСССАСТ 120

САСССССССС САСТТССААС ССТТСАААСС АССССССССТ АССААСТТТТ СТСССССССС 180

ССТСССССаб ддсадссасс бсбсбсасбд ссссбссббс бббсбссддб сбссдссдса 240 бббсбсссаа дсбсдасдсб дссдссдбсб ссбсссасса абссббсббс сассдсдбса 300 аббссбсбас ссдбсбсдбб бсббссбсбб сббсббсбса бсдсбссссс ададдбдббд 360 ббдссабддс бддабссдда аадбббббсд ббддаддааа сбддаадбдб аасдддасба 420 аддасбссаб сдссаадсбб абсбссдабс бсаасадбдс аассббддаа дсадабдбад 480 абдббдббдб дбсассссса бббдбсбаса бсдассаддб сааабссбсд ббдасадасс 540 дбаббдасаб абсаддссад аасбсббддд ббдддааадд бддадссббс асбддбдааа 600 бсадсдбдда асадсбсааа дассббддсб дсаадбдддб саббсббддд саббссдаас 660 ддадасабдб сабсддадаа ааадабдадб ббабсдддаа дааадсбдса бабдсаббда 720 дбдадддбсб бддадбдаба дсббдбаббд дддаааадсб адаадададд даадсаддса 780

- 59 028407 адасдеееда едееедсССс дсдсааседа асааеаеаде Сдеедсаеас дадсседеае сесадсаадс асаадаадес саедеадсед аддаадеедс еессаааасд адааесаеае сададсеедс сааадаадаа дасаеедаед десседадее едсаассаее дедаасесад ТССАСССССТ ССТТСАТСТС АСССТТСССС ССТСТСААСТ ССТСААСССС ТАССТТАССТ (САССТААААА ССССАССАСТ ТТТССААТТТ ССССТСТТТС ТССАТССССС СССТСССССТ аддсдСеедс дддсааеедд ессдсддеед аеддаддеес даееесееде есасдЬсдаа

ССТСАССААС

СССССТТТСС

ТСТТССТТСТ

АТТТСААССд

ЪдаедсЬдед ааседдеааа дсЪааадаад едесааедда

Сддеддедсс дааадеедсе

СССССТССАТ

ТССТСАТСАС

ААССАТССТС деесесесее ссеадседдд деедсаесес ааедесесед ддсаасадед ессеедаадд дсеедаТААА

ССААСАТАСТ

ТСТТТТТСАА

ССТТСАТТТТ седссдееа

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1379

Последовательность № 26

Пример 26: сконструированный ДНК-конструкт фосфофруктокиназы (2156 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС аеддеаддде дсдадедасс ссдсдсдасе еддаадддее 60 сааасдассс сдссдеасда асеееедСсд дддддсдсес ссддаеддеа дддедсдаде 120 дассссдсдс дасееддаад ддеесааасд ассссдссде асдаасееее десддддддс 180 дсесссддАТ ССССССССТС АТТСССААСТ ССТСССТСТС ССССССССТС ССТССССССС 240

СССССТССАС ССТССССССС АТСССССССС ТСААСССССС ССТСААСССТ СССССССТСС 300

СТСССССССС ТСАССССААС САОаеддаад сеесдаееес деееседддд есаасаааас 360 ссааеаееес сеедеееаас ссеесеесаа асдессеесс есдеададае еесссесеес 420 седсееедаа аеедаадааа дееесадедс едссесдаае сеедсассад ааасдасеса 480 есададсеса дедсеседае ддаеесааас сададдаада сдаедддеее дессеадаад 540 асдеессеса сеСдассааа ееесесссед аеееассдес аеаессааае ссаеедааад 600 ааадссаадс аеаедссаее дееаадсдаа сеееедесад еессдаадае деддеедсдс 660 ааааеаееде адессадаад ддаадеаадс даддадеаса сеееаддсда дсадддссес 720 дадааададе деасеесада есадаедаад еаааадсеед саеадедасе едедддддсе 780 едедссседд ааесааеасе дееаеасддд аааеедеаед еддаеедаас ааеаедеаед 840 дедееааеаа саеесесддс аеесадддад даеаеададд сееееасесс ааааасасеа 900 едаасседас ассеааадеа дееаасдаеа еесаеааасд сддеддсасе ееесеесааа 960 ссесаададд аддасаедае асадсдаада еедеедаеаа еаеесаадае ададдааеаа 1020 аесаддеаеа еаееаеедда ддеддеддда сдсааааддд едсададаад аеаеасдадд 1080 аадеедадад дсдеддесее саадеддсдд еееседдсае ессеаадаса аеедаеааед 1140 аеаеедседе даеедасааа есаеееддсе еедаеасддс ддеедаддаа дсасаасдад 1200 сеаееааедс едсасаедеа даддесдада дсдеддаааа еддадеедде аесдееааас 1260 есаедддсад аеасадедде еееаеедсса едаеедсаас еееадсдаае сдедаедедд 1320 аеедеедсее даеессадад есессаееее еесеедаадд ааадддеддд сесееедаде 1380 ееаеедаада асдасесааа дадааеаддс асаеддееае едСдаеадсе дааддадсед 1440 дасаддаееа едеедсесаа адсаедсдед саеседааас еааадасдсс есаддаааеа 1500 дасесеедсе едаедеедде сеаеддееда сесаасадае аааддаесас еееасаааед 1560 еесддаааае даедаеааае аедаадеаса еадасссаас деаеаедаеа ададсааеас 1620 сдадеаасдс аесадасаае десеаеедса сесеесеедс ссааадедса деесаеддад 1680 сааеддседд деасесадде еесаседеад дассадееаа садеадасае дсееасаесс 1740 сааеееседе дасддаадед асаааеасдд едаадееаас едаеаддаед едддсеадас 1800 ессеедсаСс дасаааесаа ссдадееесе едаседдеда аддадсаеед садааедеда 1860 есдасаедда аасесаадаа аадаесдаеа асаедаадае сесеесеаес еааТАААТСС 1920

АСССССТССТ ТСАТСТСАСС СТТССССССТ САССААСССС ССТССАТССА АСАТАСТССТ 1980

СТСААСТССТ СААССССТАС СТТАССТССС ССТТТССТСС ТСАТСАСТСТ ТТТТСААСАС 2040

СТАААААССС САССАСТТТТ ССААТТТТСТ ТССТТСТААС САТССТСССТ ТСАТТТТССС 2100 стстттстсс атсссссзссс тссссстатт тсллссддее сесесеесед ссдееа 2156

Последовательность № 27

Пример 27: сконструированный ДНК-конструкт иРНК крахмалсинтазы, связанной с №а1 промотором (860 по) адааааесед дсассасасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60

ССАТСССССС СССТТСТТТС СССССТСССС СТСТСССССТ АТТСТСАССТ ССАСАСССАС 120

ССССАТСААА АТССАТТССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССОСТТ сеастсеСАА ССААСАССАТ АСаедссадс сддсесасса 300 ссдссассад сддсеедсдд дддессассе ссаддсссад асссееседс адааасессе 360 хдсасадсдс сеесссддсд дддсддесдд сдесдаадее ддседдсадс адсдсдесад 420 хддссдддее ссасессеса садесааедс сдеесаддае дссдеддаас ееддадсдса 480

- 60 028407 дсбсддддсд сдсдааддбд дабсбсдссд бсссадсддб бсдсаббсдб дсббдаддсс сбсаабсбдд бссббдддса абдассдбса сдаадбдТАА АТССАССССС ТССТТСАТСТ ССССССТССА ТССААСАТАС ТССТСТСААС ТССТСААССС ЗТССТСАТСА СТСТТТ’ГТСА АСАССТАААА АССССАССАС ТААССАТССТ СССТТСАТТТ ТССССТСТТТ СТССАТСССС адсссббддд ддсасбсдба

САСССТТССС

СТАССТТАСС

ТТТТССААТТ сссстссссс сассбсдабд даасддсадс

СССТСАССАА

ТСССССТТТС ттсттссттс

ТАТТТОААОС ддббсбсбсб бсбдссдбба

540

600

660

720

780

840

860

Последовательность № 28

Пример 28: сконструированный ДНК-конструкт иРНК крахмалсинтазы, связанной с НуйА1 промотором (1328 по)

АСААААТСТС ОСАССАСАСС ббсдадсдсб дсссддааса дсдддсбдас бддбсааддс сдадбдбссд сбдсаббссс сдсааабдсб дбсадсббаб ааАТОААСАС СТТСАТСССС САААСССССТ СТСААСЗСТС СССААСТТСС СААССТЗСАТ АССАСААССА ССТССТЗССС ТСССТССССС тсссстгссс ССбаадбаас сбааССЗТСА ЗСАССССАТС АССССАСССА ТССТОТССАА СССССАЗААС ссбааССССС СССССТТСТС ЗСАСССАССС АССССТЗСТС ТТСТССТТСС ССАСАСЗАСТ АСТТСССАСС САСТССЗСТА есстттстсс тссстссасс ТТСАТбаааб ддаддсдсбс даадабасбд сбсбсаадбд сбббббсаас асдбааааад дббдаббббд дссбсбббсб ТССССТТА дадсбдбсаб дсдббдббсс абдсдбасба дбабаддадс дсасдабадд дсбдасдадс дссддаббдд дааабсдсда сббасабдаа сасасаааса АСССАТСССС ТССССССССС СССАСССТСА ССССТССССС САААТССТСТ СССТССАТСА ССССААСТСС СССТСТАССА СССССТССТС СССССАССАА ССАССАТССА АТАТТТТАСС ТОТТССССТТ ССТСТСССАС ССССССАССС сссссстссс САССАССТТС СТССССССАС СТТСТССТСС ТАСАСССССА ААССТССТСА ТССАСССАСА СССССТАССС ССАССССТСА ССССАССССС ССССССАССС дббдабсбда дссббдсссс сбдаадсддб адсббадсбс сддаддадбб ббдсаабббб ссабдддсдд дсбдддсдба

дббабдбдбс	дбсааасдсс	60
сабдаддсаа	дбдаасадаа	120
дбдсбдасдд	ддбдбассдс	180
бддбсдсдса	баддсаадсб	240
сбсбсдсадд	сасбадссбс	300
ССТССССССТ	ССАСССАССА	360
ТАСССССТАС	СССАСТСССТ	420
ССАССТТАСТ	ССТСТССССА	480
ССАСААССАС	САССССТССС	540
ССТССТССАС	ААСССССССС	600
СТССАТАСТС	ССАААСТАТА	660
ССССААСССТ	СССАСССССС	720
ССТССТСТСС	ССАбаадбаа	780
САСССССССС	ААССССАССС	840
СТТССССССС	САССАССТСС	900
ССАТТТСАТС	САССТТСССА	960
СССТССССАС	ССТТСАСАСС	1020
САТСССТССС	САТСААССТС	1080
сбдасдаасд	дсддбддабд	1140
сссдбббсдб	дсбдабсадб	1200
дббддббдба	асдабссбсс	1260
бббдаадсСС	ТТСТСТСТТС	1320 1328

Последовательность № 29

Пример 29: сконструированный ДНК-конструкт амилазы (1889 по) адаааабсбд дсассасасс АТССТАСССТ СССАСТСАСС СССССССАСТ ТССААСССТТ 60

САААССАССС СССССТАССА АСТТТТСТСС ССССССССТС ССССАТССТА СССТСССАСТ 120

САСССССССС САСТТСЗААС ССТТСАААСС АССССССССТ АССААСТТТТ СТСССССССС 180

ССТСССССсб сдадсабАТС СССССССТСА ТТСССААСТС СТСССТСТСС СССССССТСС 240

СТСССССССС ССССТССАСС СТСССССССА ТССССССССТ СААССССССС ОТСААСССТС 300

ССССССТССС ТСССССЗССТ САССССААСС АСабддсдаа сааасасабд бсссбббсбс 360 бсббсабсдб ссбссббддс сбсбсдбдса дсббддссбс сдддсаадбс сбдбббсадд 420 дббббаасбд ддадбсдбдд аадсасаабд дсдддбддба саасббссбд абдддсаадд 480 бддасдасаб сдссдссдсб ддсдбсасдс асдбдбддсб ссссссддсд бсдсадбссд 540 бсдссдадса адддбасабд ссдддссддс бсбасдассб ддасдссбсс аадбасддса 600 асааддсдса дсбсаадбсс сбсабсддсд сдсбссасдд саадддсдбс ааддссабсд 660 ссдасабсдб сабсаассас сдсасддсдд адсдсаадда сддссддддс абсбасбдса 720 бсббсдаддд сддсассссд дасдсдсдсс бсдасбдддд сссссасабд абсбдссдсд 780 асдассддсс сбасдссдас ддсассддса асссддасас сддсдссдас ббсддддссд 840 сдссддасаб сдассассбс аасссдсдсд бссадаадда дсбсдбсдад бддсбсаасб 900 ддсбсаддас сдасдбсддс ббсдасддсб ддсдсббсда сббсдссаад ддсбасбссд 960 сддасдбддс саадабсбас дбсдассдсб ссдадсссад сббсдссдбс дссдадабаб 1020 ддасдбсдсб ддсдбасддс ддддасддса адссдаассб саассаддас ссдсассддс 1080 аддадсбддб даасбдддбд аасааддбдд дсддсбссдд ссссдссасс асдббсдасб 1140 бсассассаа дддсабссбс аасдбддссд бддадддсда дсбдбддсдс сбдсдсддса 1200 ссдасддсаа ддсдссдддс абдабсдддб ддбддссддс сааддсддбд ассббсдбсд 1260 асаассасда сассддсбсс асдсадсаса бдбддсссбб сссббссдас адддбсабдс 1320 адддабабдс сбасабссбс асдсасссад ддассссабд сабсббсбас дабсабббсб 1380 бсдасбдддд сббдааддад дадабсдабс дбсбддбдбс аабсаддасс сдасадддда 1440

- 61 028407 басасадбда дадсаадсбд бсдасддсаа ддбсабсдбс ааддсббсаа ддбддбсдсд ССТССССССС СТССТССбаа ССТСАССААС СССССТССАТ ссссстттсе тсстсатсас ТСТТССТТСТ ААССАТССТС АТТТСААССд дббсбсбсбб садабсабдд аддссдасдс аадсбсдддс саадабасда сабддсаабд асбабдссдб бсбадаТААА ТССАСССССТ ССААСАТАСТ ССТСТСААСТ ТСТТТТТСАА САССТААААА ССТТСАТТТТ ессстстттс сбдссдбба сдассбббас сббдссдада бдбсддасас сбсаббссбд абдддадааа дбабааСССТ ССТТСАТСТС АСССТТСССС ССТСААСССС ТАССТТАССТ ССССАССАСТ ТТТССААТТТ ТССАТССССС ссстссссст

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1889

Последовательность № 30

Пример 30: сконструированный ДНК-конструкт крахмалфосфорилазы (3089 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС абддбадддб дсдадбдасс ссдсдсдасб бддаадддбб 60 сааасдассс сдссдбасда асббббдбсд дддддсдсбс ссддабддба дддбдсдадб 120 дассссдсдс дасббддаад ддббсааасд ассссдссдб асдаасбббб дбсддддддс 180 дсбсссддлт ССССССССТС АТТСССААСТ ССТСССТСТС ССССССССТС ССТССССССС 240

СССССТССАС ССТССССССС АТСССССССС ТСААСССССС ССТСААСССТ СССССССТСС 300

СТСССССССС ТСАССССААС САОабддсдд абдсдааадс ааасддааад аабдаддсдд 360 ссааасбддс дааааббссд дсддсбдсда абссаббддс баабдаасса бсддсдаббд 420 сабсааабаб аадббаосас дбдсадбаса дбссбсаббб сбсдссдасб аадббсдадс 480 сддадсаадс бббсбббдсс асддсддадд ббдбссдсда бсдбсббабб саасаабдда 540 абдадасаба ссассабббб аабааадббд абссдаадса аасабасбас сбабсаабдд 600 аабббсббса аддааддасб ббдасбаабд сааббддсад бббддасабб садаабдсаб 660 абдсбдабдс бббааабааб ббддддсабд бссббдадда дабадсбдаа саддааааад 720 абдсбдсасб аддааабддб дддсбдддса ддсбадсббс абдсббсбба дасбссабдд 780 саасаббдаа бббдссбдса бддддббабд дбббдадаба ссддбабддд сбдббсаадс 840 адаадабсас саадсадддб саадаадаад ббдсбдаада ббддсббдад ааабббадбс 900 сббдддаадб бдбсаддсаб дабдбддбаб ббссддбсад аббббббддд адбдббабдд 960 ббаабссааа бддаасдада ааабдддббд ддддбдаадб бдбссаадсс дбадсббабд 1020 абабассааб бссадддбас аааассаада асасбабсад бсббсдбсбс бдддасдсба 1080 аадсбадсдс бдаддабббс аабббабббс адбббаабда бддасаабас даабсбдсбд 1140 сасадсббса ббсбсдадсб саасадаббб дбдсбдбдсб сбассссддд даббсбасбд 1200 аадаадддаа дсббббаадд сбдааасаас ааббсбббсб сбдсадбдсб бсасббсадд 1260 абабдаббсб бадаббсаад дададдаааа дбддааддса дбддбсбдаа бббсссадса 1320 аддбадсбдб асаасбдааб дабасбсабс саасасббдс ааббссадад ббдабдсдаб 1380 бдсбаабдда бдаддаадда сббддабддд абдаадсабд ддабабааса асааддасбд 1440 ббдсббабас саабсаоаса дбасббссбд аадсасббда даадбддбса саадсадбаа 1500 бдбддаадсб бсббссбсдс сабабддааа бааббдаада даббдасаад адаббсаббд 1560 саабддбссд сбссасаадд адбдассббд ададбаадаб бсссадсабд бдсабсббдд 1620 абаабаабсс сааааадссд дббдббадда бддсааасбб абдбдбадба бсбдсдсаба 1680 сддбааабдд бдббдсбсад ббдсасадбд абабсббааа ддссдасббд ббсдсбдасб 1740 абдбббсбсб абддссааас ааасбссааа абаааасбаа бддсаббасб ссбсдбсдаб 1800 ддсбссддбб ббдсаабссб дадсбсадса аааббабсас аааабддбба аааассдабс 1860 адбдддббас даассббдас сбдсббдбад дбсббсдбса дбббдсбдас аасасадаас 1920 бссаадсбда абдддаабсб дсбаадабдд ссадбаадаа асабббддса дасбасабаб 1980 ддсдадбаас сддбдбаасд аббдабссба абадсббабб бдасабасаа дбсаадсдса 2040 ббсабдааба саададасаа сбдсбаааба ббббдддсдс аабсбасада басаадаадб 2100 бдааддадаб дадсссбсад дадсддаада ааасбасбсс асдсассабб абдбббддад 2160 ддааадсабб бдсаасабаб асааасдсаа ааадаабадб ааадббддбб аабдабдббд 2220 дбдаадбсдб саасассдаб ссбдаддбса абадббаббб дааддбддба бббдббссаа 2280 аббасаабдб сбсбдббдсд дадббдсбба ббссаддаад бдадсбабсб садсабабба 2340 дсасадсадд сабддаддса адбддсасаа дсаасабдаа аббббсбсба аабддббдсс 2400 бсаббабадд аасаббддаб ддадсбаабд бддааабсад дсаддадаба ддададдада 2460 абббсбббсб сбббддбдса ддадсадасс аадбсссбаа дсбдсддаад дааададаад 2520 абддаббдбб сааассадаб ссбсддбббд аададдссаа дсаабббаба адаадбддад 2580 сабббддаад сбабдасбас аасссдсббс ббдаббсссб ддаддддаас асбддббабд 2640 дбсдбддбда ббаббббсба дббддббабд асббсссаад ббасббадад дсбсаддаса 2700 дадббдасса адсббасаад дассддаада адбддсбдаа дабдбсбаба ббаадбасад 2760 сбддсадбдд даааббсадс адбдабсдса сааббдсаса дбабдсбаад дааабсбдда 2820 асабаасада абдссдбаса бсабдаТААА ТССАСССССТ ССТТСАТСТС АСССТТСССС 2880

ССТСАССААС СССССТССАТ ССААСАТАСТ ССТСТСААСТ ССТСААСССС ТАССТТАССТ 2940 ссссстттсе тсстсатсас ТСТТТТТСАА САССТААААА ССССАССАСТ ТТТССААТТТ 3000

ТСТТССТТСТ ААССАТССТС ССТТСАТТТТ ССССТСТТТС ТССАТССССС СССТСССССТ 3060

АТТТСААССд дббсбсбсбб сбдссдбба 3089

- 62 028407

Последовательность № 31

Пример 31: сконструированный ДНК-конструкт гексокиназы (1949 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС аСддСадддЬ дсдадСдасс ссдсдсдасС СддаадддСС 60 сааасдассс сдссдСасда асССССдСсд дддддсдсЬс ссддаЪддЬа дддЬдсдадС 120 дассссдсдс дасССддаад ддССсааасд ассссдссдС асдаасСССС дСсддддддс 180 дсЬсссддАТ ССССССССТС АТТСССААСТ ССТСССТСТС ССССССССТС ССТССССССС 240

СССССТССАС ССТССССССС АТСССССССС ТСААСССССС ССТСААСССТ СССССССТСС 300

СТСССССССС ТСАССОСААС САСаСддсЬа Саасассссд ссдаааассС Ссссддаадд 360 даСсааСддс СдаСаЬдссд ааддаЬдСдс ССдассадсС саадасдсСд даададсЬсЬ 420

ЬсасадССда ссаддадаад сСдаадсада СсдЬСдадса СССсаСсаад дадЬЬасада 480 адддссСсад СдСсдааддс ддааасаСЬс ссаСдаасдС дасССдддСС сСдддаСССс 540 ссасСддсса СдадаааддС асаЬСЬсСдд сСсСддасаС ддддддсасс аассСдсдсд 600

ЬсСдсдаааЬ СдадсСсСсс даададаадд дсдадЬССда СдСсасасад СссаадЬаЬс 660 дааСссссда ададсСсаад адсддСдааС саЬсадаасС аСдддааЬаС аССдссдасС 720 дЬдЬасадса дССсаСадаа ЬасЬассаЪд асддССдсас ддсСЫздсса дасс^дссдс 780

ЬдддсСССас сССССсдСас ссСдсЬасес аадааСаЬдС ЬдассасддС дСссСасада 840 даСддассаа дддСССздаС аССдасддсд Ссдадддсаа адасдЬсдСс ссааСдССад 900 аадаадсССС ддсСаадаад дСЬаааааГС садсСсСССс сссаССССЬс ССЬддсСаСа 960

ЬддСдсСааЬ СасСССасад ддСсСсссса ССааадССдс сдсСсСадЬа аасдасасда 1020 сЬддсасасЬ СаЬСдсзСсс дссСасасЦд асссададаС дааааСсддс ЬдСаЦсССсд 1080 дсасаддсдС саасдссдсс ЬасаСддааа аСдсдддсСс СаСсссСааа аСадсссасС 1140 асааЬЬСасс Ссссдасасс ссадСсдсСа СсаасСдсда аСасддсдсс ССсдасаасд 1200 аасЬсаССдС ссСсссссда асдсадСаЬд асдасдСаСс ссаасСасдС ааассаСасС 1260 сссСддасСс сСссССссСа дссССсаСсд аадаадаСсс сЬСсдадаас сСдСсадааа 1320 одсдадаЬсС сССсдаасдс асссСдддда ЬсСасдсаСС дсссСсддад сСадааЬСсЬ 1380 дсадасдссС ддсддааССд аЬсддсасас дСдссдсасд ссСсСссдсС СдсддСдССд 1440 зддссаСсЬд саадаадааа ааСаЬсассс аССдссаСдС сддадсддас дддСсддСдЬ 1500

ЬсдадаадЬа сссдсазССс ааддссаддд дсдссададс ссСдсдддад аСссССдасЬ 1560 ддссадаСад СдаассддаС сдддССдЬда Ьдадсддадс ддаддаСддд СсСддсдССд 1620 дСдсддсдсС СаССдсддсС ССдасдсССд ададддССаа асаадсССсС СдддааСдда 1680 адСасаЬсдд аадсддесСд СсССааТААА ТССАСССССТ ССТТСАТСТС АСССТТСССС 1740

ССТСАССААС СССССТССАТ ССААСАТАСТ ССТСТСААСТ ССТСААСССС ТАССТТАССТ 1800

СССССТТТСС ТССТСА'ГСАС ТСТТТТТСАА САССТААААА ССССАССАСТ ТТТССААТТТ 1860

ТСТТССТТСТ ААССАТССТС ССТТСАТТТТ ССССТСТТТС ТССАТССССС СССТСССССТ 1920

АТТТСААССд дССсСс;сСС сСдссдССа 1949

Последовательность № 32

Пример 32: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглюкомутазы (2249 по)

АСААААТСТС сааасдасес дассссдсдс дсСсссддАТ

СССССТССАС

СТСССССССС ссССсасада адссСсасСа ааддСдссас

ЬдаЬсдссаа

ЬЬсеССссас

ЬСсЬсасЬдс

Цдддааасдд ааСЬдасССс

ЪдсааЬСддд

ЬдааддаСаС адддаСЬсаа

СсЬЬсдЬСда асСССддСдд

ЬсдаСаадда

ЬсСасддЬдс ссдаСЬссаЬ

ССАССАСАСС сдссдПасда дасСЬддаад

ССССССССТС

ССТССССССС

ТСАССССААС ссаааадссС сасСдаааас

СсССдСЬдСа ааСсдссСсд

ЬссадсаасС

ЬСсасасаас

ЬдсассадсС дСасаадсЬс сссСсСЬдаа сЬССдасССс ддССССаСЬС адааСЬадда

СССасассса дааСаСЬдсс

ЬддСассССС сссССасССс аСддСадддС асЬЬСЬдЬсд ддССсааасд

АТТСССААСТ

АТСССССССС

САСаСдЬссд ддаассСсЬд

ССсаССсадд ддаддСдаЬд дссаасддад

СсдсаЬдЬаа сссддаддсс ссадааСсдд аССдаСССас дСддаааСса сссССдаЬса даССсдсСса

ЬЬдссЬсЬЬа даСссааасЬ

ЬССддСдсЬд дССЬсдссед аадаадсаад дсдадСдасс дддддсдсЬс ассссдссдС

ССТСССТСТС

ТСААСССССС аСССсЬссдС дЬсЬсадааа сЬаСЬсСсда дссдСЫзсСа

СЬЬссаадСС

СсаддаСсад ссааааасда

ЬСассаасаа ссдасаЬСда

ЬСдасСссас адЬсдЬСссС аСддСдСсас асСсааЬсса

СдассЬаЬдс саСсСдаСдд дСдасСсЬдС дЬдСсСасдд ссдсдсдасС ссддаСддЬа асдаасСССС

ССССССССТС

ССТСААСССТ ссадассаЬС дааадССасЬ

СдссаССссд саасдасаад даССССддде дддЬдсаасС ееедддЪаЫ:

даСсСаСдаС

ЬССдСссааа сСсСдаееас сдадасСдсс

СддссссЬас аааЬСассас

СсаСасССЬд

ЪдасддЬдас адссаСсаСс

СЫзддссада

СддаадддСС дддедсдаде дСсддддддс

ССТССССССС

СССССССТСС дссассасдд дСдСССсаас дааддСдссс дСсаСсаасС саадасддда ддаддааССа аадЬасаасЬ дЬсСссаадд асссадассд дСадссаЬдС асСааддадс ддсСасаада ссаЫздссЬд дСсдададдд адааасаСда

СсддааСасд

СссаСдссСа

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 63 028407 ссЬсЬддадс саСсдаЬСЬд дСадсааадд ссддЬЬддаа дЪСсССеТдс аассЬСЪЬсд ад£сд£££дд аасаддсЬсс аассасаЬса ссЬддСЛдаа сдЬдсЬадса даЬСасаасд сЕдЬадЬдса даасСсдССС ЪддаадаааЬ асдаааасдЬ аЪсдСсЬдаа ддСдсСдссд асЬсЬаадаа ассаддаадЬ адсЬЬадсОд ЬсЪсдСасас сдаССЬддас ддсЬсЬдЬСЬ ааадсддсТЬ дадаЪЪсаЪа дСаадаСЕдЬ даССаЬаЬсС сдаааадсас ЬсСдссдасд асЪЕадСЬда ЪдасаЬсаад ЫЛдЬсССдд аддаЬдаасс адаЬдЬасдС ассЬадТААА ССТСАССААС СССССТССАТ ССААСАТАСТ СССССТТТСС ТССТСАТСАС ТСТТТТТСАА ГСТТССТТСТ ААССАТССТС ССТТСАТТТТ АТТТСААССд дССсСс^сСС сСдссдСЬа сЬаааддаЬЬ асдсЬдасаа дадаааадда

СсаадааЬсс асддаадаас адсЬсаЬсаа аСддсСасдЪ сдСссаасса сЬддСасЪдд ааЬссассЬа асССдЬСдаа тесАсссест

ССТСТСААСТ

САССТААААА сссстстттс дааСдСЪСас дЬСдадСаСс сддссЬЬЬдд адааСссаад

СЬесСЪсасЬ сСЬдЬЬдСсЬ сдСсааддаа аддЬЬСдССс аЬсаСссддЪ

ЕддсЬЬаддс дЪЬсаадсад

ССТТСАТСТС

ССТСААСССС

ССССАССАСТ тссатссссс даадЬдссаа

ЬдЬддЬдаад дсЬдеадСед асаСсСаЬЫ;

адаЬаСдасЬ ьсъаесдеед дсЬдсЬаасе аСсаадЬСЬд дсЬасадЬса дЬадассадЬ

ЪСсЬСдддаа

АСССТТСССС

ТАССТТАССТ

ТТТССААТТТ ссстссссст

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2249

АСААААТСТС ССАССАСАСС сааасдассс сдссдЬасда дассссдсдс дасССддаад дсСсссддАТ ССССССССТС СССССТССАС ССТСССТССС СТСССССССС ТСАССССААС сЬдааЬСдсс адссСддЬсС сЬдЬсаадса адааССссаа ссаасСаСда СддСЬссааа ЕсаЬСдсЬдс аЫздаЬСдаа СдЫсааадд ЬдаасасаЕс дааасададс Ьаасаадсса сЬдЬсЬЬдаа дсасаЬдаад аЬассддСаа даадаЬсасс садЬсаЬддЪ сасЬдаддсЬ ссаасаЪСда сддЬасСсас Ъдеееесдае ЬдсССссаад ссаадаасЬд дССсСЬдЬсд седсСЬЬдСс сасСаасдаа ЫзддСЬСсда аадССдддСс ЕЬдссЪСдЬа саССддсСаЪ асаассасЫ: сасссааасс седЬсСддСа саасаасССс асСЬдсасад аСЬсссадсс ееассададд Ьаасд+дЬЬЬ сЬассаасдс ЬсаасасСсЬ сЬдаЬЬЬсаЕ сСЬадсЬдсЬ ЬдеЬддсЫзс ааасЫзсЬЬС аадЬЬааддс ЬдааддЬдсс дассаасЕас сЬсСаСсЬСд ссЬасЪасда асаСд(;1;асе ааСддддЕдЬ сдааШдддГ ссЬссассаЬ ЬЪсСасссас ддаЬдТдаТА. ААТССАСССС АТССААСАТА СТССТСТСАА АСТСТТТТТС ААСАСОТААА ТСССТТСАТТ ТТССССТСТТ ССсСдссдЪс. а

Последовательность № 33

Пример 33: сконструированный ДНК-конструкт глюкозофосфатизомеразы (2231 по) аЬддЬадддС дсдадЬдасс асъсеедЕсд дддддсдсЬс ддСЬсааасд ассссдссдС АТТСССААСТ ССТСССТСТС АТСССССССС ТСААСССССС САСаЬдЪсса аСаасЪсаСС аадЬЬдсааа аааШТасда ааадаЪдсса адсдСССЬда аЪсЪСдСЬсд асЕасГсааа сСддссаадд аддсЬаасдЬ аасЕссасЬд аадаЬсдЬдс аЬдСасдЬЬд аЕддЬдСсаа дадЬЬсЬсЬд аасаадЪЬсд даСдСЪдЬЬа асаЪсддЬаС ЬЬдаадсасЬ асдсЕддЬд!: аССдсЬдааа ссЬЬдааддС асСЬЬсасЬа ссдсЬдааас аадасаддСа аСдаСссаСс ассдаадЬСд ссаадСЬсдд ддСддСсдЬС асСсЬдЬсЬд дасаасССЕд аддсЬЫзсСС ссаССддаад асаасаССсс СЬСддСдсЬс ааасссаЬЫ; ЬасССдсаас ааСЬдЬсааЬ асЬдасЬасЬ сЬасбддШс ЬЬсПЬссаае еддССсасса сааЬсЬсаЬа асссааЕСда дсЕсаадсСд аадсЫНзааС асСддЬддЬе СддСсссаса дсСсаааада ЬСасСссадс ССсасЪдаад дедссаСССд ааадЬсССдд сЪааадЬсаЪ даЬдсССсСа ссаасддСЬЬ СТССТТСАТС ТСАСССТТСС ОТССТОААСС ОСТАССТТАС ААССССАССА СТТТТССААТ ТСТССАТССС СССССТСССС ссдсдсдасЬ СддаадддЬЬ ссддаЬддСа дддЬдсдадЬ асдаасСЬЬЬ дСсддддддс ССССССССТС ССТССССССС ССТСААСССТ СССССССТСС сасСаасЬЬс ааасСддсса аСсСсааддЬ аадасЫЛдЪ ааааЫздаас аадасЬССса даасЬСддСс аасдаЬдааа сассддССЬд ададаСдсСа ЕдЬсЬассас десдсаЬЬда сдЬСдсЪсса даадЕсдасЪ ЪЕсСддЪдаа СддаадддЪЪ ЬддЬддСЪсс даЬССдддЬс сЕЬддаСдЬс сасЬЬсдЬЕС ЬдССдассса дааасСасЬС СаЬсасСаас дсЬаасасЬд СсасаССдсС аадсаСЫзсд ЬаССдасасс ааааасаСдС дЪсддсСаСе ддЬСЬдСсСд даадддСдсЬ даадссдЪсд аЫздЫздддС ддЬССдеСдС ддЬСдсСсса ССсдассааЬ ддааЬсСаас ддСаадЬсЬд ЬаСсб+дЫЛ: ддЬдаассад аддЬассаад СЬдаЬЬссаЬ даасаааЬСа саЬсаааада ддЬСддЬаад даСдаадаас сааддЬсЬСс СсаддЬааса СасЬСЬдддС дсс+ЬдаГЬд дааЬаСсаас СсССЬсдасс сддсааддаа ССддасаасЬ ааЬсааЬсаа СЬсааддааС ССССТСАССА АССССССТСС СТСССССТТТ ССТССТСАТС ТТТСТТССТТ СТААССАТСС СТАТТТСААС СддеесЬсСс

120 180 24 0 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2231

Последовательность № 34

Пример 34: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт

- 64 028407 бутанолдегидрогеназы (1709 по) адааааЬсЪд дсассасасс АТССАААСТС СССАСССССА ААССААТССС АТСССССАСС 60

ССТССААССС ТСССАТТССС ААСАТТСТСС СТССТСАССС СТТТСТСТСС ССТССТСАТС 120

ТССААСАСАС ССТСАССССА ТАССТСТССС ССТССААТСА ССССАТТССС СААСССССТТ 180

ТСССССАСАТ САСССССАТС САСАСАСТСС СААССТСССА ААТССАСССА ССАСАСТТСТ 240

ТСАСТТСАСА ССТАСАТААТ СТССССССТС ТТСАТАСТТА ССААТАААТА САСТТТСАСА 300

АТАТСТСТАА ТАСААА21АСТ СТАТССАСАС ААСААААААС ТАССААААТТ ТАСАААТСТТ 360

САТСАТТСАТ СТСССТ^кААТ ТССАТСТТСА АСТСАСССАТ ТСААСАСААС СССААСААСС 420 аЬддадааШ ЫзадаГПЬаа ЬдсаЬаЬаса дадаЬдсССс Шддаааддд асаааЬадад 480 аадсЬЪссад аддЬЫзЪааа аадаЬаЬддЬ аааааЪаЬаЬ ЬасЬЬдсаЬа ЬддЬддЬдда 540 адЬаСааааа адааЬддасЬ сЬаЬдаЬасЬ аЬссаааадс СасСдааада ЬЬЪЬааЬаЫ; 600 дсЬдааЬЬаа дЬддЬаЬЬда ассаааЬсса адааЬЬдааа сЬдЬаадасд ЬддадЫздаа 660 сЬЬЬдсадаа ааааЬааадЬ адаЬдЫзаСЬ ССадсСдССд дЬддадддад ЪасааЬадас 720

1:дсЬсааадд сЬаЬаддддс аддЪЬаЪЬаЬ ЬаЬдсЬддад аЬдсаЬддда ссЬЬдЬаааа 780 ааЪссадсЪа аааЬаддЬда ддЕЕЕЕасса аЕадСдасад ееееаасааС ддсадсЬасЬ 840 ддЬЬсЬдааа ЬдааЬадааа ЬдсЬдССаЬЬ ЬсааадаЬдд аЬасаааЬда ааадсЪЬдда 900 асаддаЪсас сЬаадаЪдаЬ сссЬсааасЬ ЪсЬаЬЬЬеад аЬссадааЬа ЪЬЬдЬаЪаса 960

СЬдссадсаа ЬЬсааасадс ЬдсаддЬЬдЬ дсЬдаСаССа ЬдЬсасасаЬ аЬЬЬдаасаа 1020

ЬаеьеЬааЬа ааасЬасада ЬдсЬЬЬЬдЬа саадаЬаааЬ ЬЬдсддаадд ЬЬЬдЬЬдсаа 1080 асЫздЬаЬаа ааЪаЬЪдссс СдССдсСССа ааддаассаа адааЬЬаЬда адсЬададса 1140 ааЪаСааЪдЬ дддсЬадЫзс ааЬддсЬсЫ; аасддасЪЬЪ ЬаддаадЬдд дааадсЬдда 1200 дсЬеддасЬЬ дЬсаЬссааЬ адаасаЬдаа ЬЬаадЬдсаЬ ЬЬЬаЬдаЬае аасЬсаЪдда 1260 дСаддЬсЪЬд сааЪЪЫ;аас ЬссаадЬЬдд аЬдадаЬаЬа ЬсЬЬаадЬда ЬдЬаасадЫ: 1320 даЬаадСЫзд ЫаасдСаЪд дсаЬЬЬадаа сааааадаад аЪаааееЬдс ЬсССдсаааЬ 1380 даадсааЬад аСдсаасада ааааЫхсЬЫ: ааадсСЬдЬд дСаССссаае дасеъЬаасЬ 1440 даасГЬддаа СадаЬааадс ааасЬЫздаа аадаЬддсаа аадсЬдсадЬ адаасаЬддЬ 1500 дсЪЬЕадааЪ аЬдсаЪаЦдЪ ЬЬсаЬЬаааЬ дссдаддаЬд ЬаСаЬааааЬ ЬЬЬадаааЬд 1560 ссссесеаат ААСССТСАСА ТСТТСТТСАС ТССАТТСТАС ТТСААТСААС ССТТАССССС 1620

СААА'ГССССС ССТАТТТТТТ СТСТАСССАТ ССТСССАССТ ТТСАСАСССТ АССААТТТСС 1680

АСАССАТАСд дЪЪсЪсСсЪЪ сЪдссдЬЪа 1709

Последовательность № 35

Пример 35: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт бутиральдегиддегидрогеназы (1967 по) адааааЬсЬд дсассасасс АТССАААСТС СССАСССССА ААССААТССС АТСССССАСС 60

ССТССААССС ТСССАТ'ГССС ААСАТТСТСС СТССТСАССС СТТТСТСТСС ССТССТСАТС 120

ТССААСАСАС ССТСАССССА ТАССТСТССС ССТССААТСА ССССАТТССС СААСССССТТ 180

ТСССССАСАТ САСССССАТС САСАСАСТСС СААССТСССА ААТССАСССА ССАСАСТТСТ 240

ТСАСТТСАСА ССТАСА’ГААТ СТССССССТС ТТСАТАСТТА ССААТАААТА САСТТТСАСА 300

АТАТСТСТАА ТАСААА1АСТ СТАТССАСАС ААСААААААС ТАССААААТТ ТАСАААТСТТ 360

САТСАТТСАТ СТСОСТ.1ААТ ТССАТСТТСА АСТСАСССАТ ТСААСАСААС СССААСААСС 420 аЕдаСЬааад асасдс+адЬ ЪЬсЪаЬааса ааадаСССаа ааЫзааааас аааСдСЕдаа 480 ааЬдссааЬс ЪааадаасСа сааддаЬдаЬ ЬсЬЬсаЬдЪС ЬсддадЬЫзЬ сдааааЪдЫ; 540 дааааЪдсЬа ЬаадсааЬдс сдЬасасдса саааадаЬаЬ ЪаЬсссЬЬса ЬСаЬасаааа 600 даасааадад ааааааасаЬ аасЬдадаЬа адаааддссд саЬЬадаааа ЬааададаЬЪ 660 сСадсЬасаа ЬдаЬЬсаЬда адааасасаЬ аЬдддаадаЬ аЬдаадаЬаа ааЬаЬЬааад 720 саСдааЪЬад ЪадсЁаааЪа сасЬссЬддд асадаадаЬС СаасЪасЬас ЬдсСЬддЬса 780 ддадаЪаасд ддсееасаде ЪдЬадаааЬд есЬссаСаСд дсдЬЬаЬадд ЬдсааЬаасЬ 840 ссЬЪсЕасда аессаасЬда аасЕдЕааЕа ЕдЕааЕадЕа ЬаддсаСдаЕ адсЕдсЕдда 900 ааЬасЬдЬдд ЬаЬЬЬаасдд асаЬссаддс дсЬаааааа!; дЬдЬЬдсЬЬЬ ЪдсЬдЬсдаа 960 аЬдаЬаааЪа аадсЬааЬаЬ ЫзсаЬдЬддС ддЬссЬдада аЫХадЬаас аасЬаЬаааа 1020 ааЬссаасЪа ЬддасХсЕсЪ адаЬдсааЬС аСЕаадсасс сЬЬсааЬааа асЬасЬЪЪдс 1080 ддаасЬддад ддссаддааЬ ддЬааааасс сЬсЬЬаааЫ; сЬддЬаадаа адсЬаЬаддЬ 1140 дсСддСдсГд даааЬссасс адЫзаШдСа даЬдаЬасСд сЪдаЕаЬада аааддсЕддЕ 1200 аададЬаЬса еедааддсЪд (ХсШШдаЪ ааЬааЪЬСас сЫздЬаЬЬдс адааааадаа 1260 дЬаЬЬЬдЬЬе ЬЬдадаасдЬ ЬдсадаЪдаЪ ЬЬааЬаЬсЬа асаЬдсЬааа аааЬааЪдсЬ 1320 дЬааЬЬаЬаа аЬдаадаЬса адЬаЬсааад ЬЬааЬадаЬЬ (задЬаЬЬаса ааааааЬааЬ 1380 дааасЪсаад ааЬасЬсЬае аааЬаадааа ЬдддЬсддаа аадаЬдсааа аЬЬаЬЬсЪЕа 1440 даЬдаааСад аЬдЬЬдадЬс ЬссЫзсааде дЬЬаааЬдса ЬааЬсЬдсда адЪаадЬдса 1500 аддсаессае ЬСдЬЕаздас адаасЬсаЬд аЬдссааЬаЬ ЬассааЬедС аададЬСааа 1560 даЪаЬадаЪд аадсЕааЬда аЬаЬдсаааа аЬадсадаас ааааЪадааа асаЬадЕдсс 1620 гаЬаЫгЛасЬ сааааааЬаЬ адасаассЬа ааЬаддЫХд ааададаааЬ сдаЬасЬасЬ 1680 аСсеЫздЬаа адааЬдсЪаа аСсСЫзСдсс ддЬдСЬддЫ; аЬдаадсада аддсССЬаса 1740 асЫ?ссасЬа ЬЬдсЬддаЬс сасЬддЬдаа ддааЬаас.ЬЬ сЬдсаадааа ШЪЪасаада 1800

- 65 028407 сааадаадаЬ дЬдЬасЬсдс сддЬЬааТАА СССТСАСАТС ТТСТТСАСТС САТТСТАСТТ 1860

СААТСААССС ТТАСССОССА ААТССССССС ТАТТТТТТСТ СТАСССАТСС ТСССАССТТТ 1920 (ЗАСАСССТАС СААТТТССАС АССАТАСддЬ ЬсЬсЬсЬЬсЬ дссдЬЬа 1967

Последовательность № 36

Пример 36: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт бутирил-КоА-дегидрогеназы (1602 по) адааааЬсЬд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60

ЗХАТСАССССА ТТССССЗкАСС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСС 120

ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180

АСТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240 аааастасса ааатттасаа атсттсатса ттсатстссс таааттссат СТТСААСТСА 3 00

СССАТТСААС АСААССССАА СААССаЬдаа ЬЬЬссааЬЬа асЬададаас аасааЬЬадЬ 360 асаасаааЬд дЬЬададааЬ ЬсдсадЬааа ЬдаадЬЬаад ссааЬадсЬд сЬдаааЬсда 420 сдааасадаа адаЬЬсссЬа ЬддаааасдЬ ЬдааааааЬд дсЬаадсЬЬа аааЬдаЬддд 480

ЬаЬсссаЬЬЬ ЬсЬааадааЬ ЬЬддЬддадс аддсддадаЬ дЬЬсЬЬЬсаЬ аЬаЬааЬадс 540

ЬдЬддаадаа ЬЬаЬсаааад ЬЬЬдЬддЬас ЬасаддадЬЬ аЬЬсЬЬЬсад сдсаЬасаЬс 600 аЬЬаЬдЬдса ЬсадЬааЬЬа аЬдааааЬдд аасЬаасдаа сааададсаа ааЬаЬЬЬасс 660

ЬдаЬсЬЬЬдс адсддЬаааа адаЬсддЬдс ЬЬЬсддаЬЬа асЬдаассад дЬдсЬддЬас 720 адаЬдеЬдса ддасаасааа саасЬдсЬдЬ аЬЬадааддд даЬсаЬЬаЬд ЬаЬЬаааЬдд 780

ЬЬсаааааЬс ЬЬсаЬаасаа аЬддЬддадЬ ЬдсЬдааасЬ ЬЬсаЬааЬаЬ ЬЬдсЬаЬдас 840 адаЬаададЬ сааддаасаа ааддааЬЬЬс ЬдсаЬЬсаЬа дЬадаааадЬ саЬЬсссадд 900 аЬЬсЬсааЬа ддааааЬЬад ааааЬаадаЬ ддддаЬсада дсаЬсЬЬсаа сЬасЬдадЬЬ 960 адЬЬаЬддаа аасЬдсаЬад Ьассаааада ааассЬасЬЬ адсааадаад дЬаадддаЬЬ 1020 сддЬаЬадса аЬдаааасЬс ЬЬдаЬддадд аадааЬЬддЬ аЬадсЬдсЬс аадсЬЬЬадд 1080 аЬЬдсадаа ддадсЬЬЬЬд аадаадсЬдЬ ЬаасЬаЬаЬд ааадааадаа аасааЬЬЬдд 1140 сааассаЬЬа ЬсадсаЬЬсс ааддаЬЬаса аЬддЬаЬаЬа дсЬдаааЬдд аЬдЬЬааааЬ 1200 ссаадсЬдсЬ аааЬасЬЬад ЬаЬассЬадс Ьдсаасааад аадсаадсЬд дЬдадссЬЬа 1260 сЬсадЬадаЬ дсЬдсаадад сЬаааЬЬаЬЬ ЬдсЬдсадаЬ дЬЬдсааЬдд аадЬЬасаас 1320 тааадсадЬЬ саааЬсЬЬЬд дЬддаЬаЬдд ЬЬасасЬааа дааЬасссад ЬадааадааЬ 1380 даЬдададаЬ дсЬааааЬаЬ дсдаааЬсЬа сдааддаасЬ ЬсадаадЬЬс аааадаЬддЬ 1440 заЬсдсадда адсаЬЬЬЬаа даТААСССТС АСАТСТТСТТ САСТССАТТС ТАСТТСААТС 1500

ААСССТТАСС ССССАААТСС СССССТАТТТ ТТТСТСТАСС САТССТСССА ССТТТСАСАС 1560

ССТАССААТТ ТССАСАССАТ АСддЬЬсЬсЬ сЬЬсЬдссдЬ Ьа 1602

Последовательность № 37

Пример 37: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт кротоназы (1248 по) адааааЬсЬд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60

ААТСАССССА ТТССССААСС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСС 120

ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180

АСТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240

ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТССС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 300

СССАТТСААС АСААССССАА СААССаЬдда аЬЬааааааЬ дЬЬаЬЬсЬЬд ааааадаадд 360 дсаЬЬЬадсЬ аЬЬдЬЬасаа ЬсааЬадасс аааддсаЬЬа ааЬдсаЬЬда аЬЬсадааас 420 асЬаааадаЬ ЬЬаааЬдЬЬд ЬЬЬЬадаЬда ЬЬЬадаадса дасаасааЬд ЬдЬаЬдсадЬ 480

ЬаЬадЬЬасЬ ддЬдсЬддЬд адаааЬсЬЬЬ ЬдЬЬдсЬдда дсадаЬаЬЬЬ садаааЬдаа 540 адаЬсЬЬааЬ даадаасаад дЬааадааЬЬ ЬддЬаЬЬЬЬа ддаааЬааЬд ЬсЬЬсадаад 600 аЬЬадааааа ЬЬддаЬаадс садЬЬаЬсдс адсЬаЬаЬса ддаЬЬЬдсЬс ЬЬддЬддЬдд 660 аЬдЬдаасЬЬ дсЬаЬдЬсаЬ дЬдасаЬаад ааЬадсЬЬса дЬЬааадсЬа ааЬЬЬддЬса 720 ассадаадса ддасЬЬддаа ЬаасЬссадд аЬЬЬддЬдда асЬсааадаЬ ЬадсаадааЬ 780 адЬЬддасса ддаааадсЬа аадааЬЬааЬ ЬЬаЬасЬЬдЬ дассЬЬаЬаа аЬдсадаада 840 адсЬЬаЬада аЬаддсЬЬад ЬЬааЬааадЬ адЬЬдааЬЬа даааааЬЬда Ьддаадаадс 900 аааадсааЬд дсЬаасаада ЬЬдсадсЬаа ЬдсЬссаааа дсадЬЬдсаЬ аЬЬдЬааада 960

ЬдсЬаЬадас ададдааЬдс аадЬЬдаЬаЬ адаЬдсадсЬ аЬаЬЬааЬад аадсадаада 1020 сЬЬЬдддаад ЬдсЬЬЬдсаа садаадаЬса аасадаадда аЬдасЬдсдЬ ЬсЬЬадааад . 1080 аададсадаа аадааЬЬЬЬс ааааЬаааТА АСССТСАСАТ СТТСТТСАСТ ССАТТСТАСТ 1140

ТСААТСААСС СТТАСССССС АААТСССССС СТАТТТТТТС ТСТАСССАТС СТСССАССТТ 1200

ТСАСАСССТА ССААТТГССА САССАТАСдд ЬЬсЬсЬсЬЬс ЬдссдЬЬа 1248

- 66 028407

Последовательность № 38

Пример 38: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт

3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы (1311 по) адааааЬсЬд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60

ААТСАССССА ТТССССААСС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСС 120

ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180

АСТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240

ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТССС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 300

СССАТТСААС АСААССССАА СААССаЬдаа ааадаЬЬЬЬЬ дЬасЬЬддад саддаасЬаЬ 360 дддЬдсЬддЬ аЬсдЬЬзаад саЬЬсдсЬса ааааддЬЬдЬ даддЬааЬЬд ЬаададасаЬ 420 аааддаадаа ЬЬЬдЬЬдаса даддааЬадс ЬддааЬсасЬ аааддаЬЬад аааадсаадЬ 480

ЬдсЬааадда ааааЬдЬсЬд аадаадаЬаа адаадсЬаЬа сЬЬЬсаадаа ЬЬЬсаддаас 540 аасЬдаЬаЬд аадЬЬадсЬд сЬдасЬдЬда ЬЬЬадЬадЬЬ даадсЬдсаа ЬсдаааасаЬ 600 дааааЬЬаад ааддаааЬсЬ ЬЬдсЬдадЬЬ адаЬддааЬЬ ЬдЬаадссад аадсдаЬЬЬЬ 660 адсЬЬсааас асьЬсаЬсЬЬ ЬаЬсааЬЬас ЬдаадЬЪдсЬ ЬсадсЬасаа ададассЬда 720

ЬааадЬЬаЬс ддааЬдсаЬЬ ЬсЬЬЬааЬсс адсЬссадЬа аЬдаадсЬЬд ЬЬдаааЬЬаЬ 780

ЬаааддааЬа дсЬасЬЬсЬс аадааасЬЬЬ ЬдаЬдсЬдЬЬ ааддааЬЬаЬ садЬЬдсЬаЬ 840

Ьддаааадаа ссадЬадаад ЬЬдсадаадс ЬссаддаЬЬс дЬЬдЬааасд дааЬсЬЬааЬ 900 сссааЬдаЬЬ аасдаадсЬЬ саЬЬсаЬссЬ Ьсаадаадда аЬадсЬЬсад ЬЬдаадаЬаЬ 960

ЬдаЬасадсЬ аЬдаааЬаЬд дЬдсЬаасса ЬссааЬддда ссЬЬЬадсЬЬ ЬаддадаЬсЬ 1020

ЬаЬЬддаЬЬа даЬдЬЬЬдсЬ ЬадсЬаЬсаЬ ддаЬдЬЬЬЬа ЬЬсасЬдааа саддЬдаЬаа 1080 саадЬасада дсЬадсадса ЬаЬЬаадааа аЬаЬдЬЬада дсЬддаЬддс ЬЬддаадааа 1140 аЬсаддаааа ддаЬЬсЬаЬд аЬЬаЬЬсЬаа аТААСССТСА САТСТТСТТС АСТССАТТСТ 1200

АСТТСААТСА АСССТТАССС СССАААТССС ССССТАТТТТ ТТСТСТАССС АТССТСССАС 1260

СТТТСАСАСС СТАССААТТТ ССАСАССАТА СддЬЬсЬсЬс ЬЬсЬдссдЬЬ а 1311

Последовательность № 39

Пример 39: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт тиолазы (1665 по) адааааЬсЬд дсассг.сасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60

ААТСАССССА ТТССССААСС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСС 120

ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180

АСТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240

ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТССС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 3 00

СССАТТСААС АСААССССАА СААССаЬддд сааадааадЬ адЬЬЬЬадсЬ дЬдсаЬдЬсд 360

ЬасадссаЬс ддаасааЬдд дЬддаЬсЬсЬ ЬадсасааЬЬ ссЬдсадЬад аЬЬЬаддЬдс 420

ЬаЬсдЬЬаЬс ааададдсЬс ЬЬаассдсдс аддЬдЬЬааа ссЬдаадаЬд ЬЬдаЬсасдЬ 480 аЬасаЬддда ЬдсдЬЬаЬЬс аддсаддаса дддасадаас дЬЬдсЬсдЬс аддсЬЬсЬаЬ 540 сааддсЬддЬ сЬЬссЬдЬад аадЬассЬдс адЬЬасаасЬ аасдЬЬдЬаЬ дЬддЬЬсадд 600

ЬсЬЬаасЬдЬ дЬЬаассадд садсЬсадаЬ даЬсаЬддсЬ ддадаЬдсЬд аЬаЬсдЬЬдЬ 660

ЬдссддЬддЬ аЬддааааса ЬдЬсасЬЬдс ассаЬЬЬдса сЬЬссЬааЬд дссдЬЬасдд 720 аЬаЬсдЬаЬд аЬдЬддссаа дссададсса дддЬддЬсЬЬ дЬадасасЬа ЬддЬЬаадда 780

ЬдсЬсЬЬЬдд даЬдсЬЬЬса аЬдаЬЬаЬса ЬаЬдаЬссад асадсадаса асаЬсЬдсас 840 ададЬддддЬ сЬЬасасдЬд аададсЬсда ЬдадЬЬЬдса дсЬаададсс адаасааддс 900

ЬСдЬдсадса аЬсдаадсЬд дсдсаЬЬсаа ддаЬдадаЬс дЬЬссЬдЬад адаЬсаадаа 960 даадааадад асадЬЬаЬсЬ ЬсдаЬасада Ьдааддссса адасадддЬд ЬЬасассЬда 1020 аЬсЬсЬЬЬса аадсЬЬсдЬс сЬаЬсаасаа ддаЬддаЬЬс дЬЬасадсЬд дЬаасдсЬЬс 1080 аддЬаЬсаас дасддЬдсЬд садсасЬсдЬ адЬЬаЬдЬсЬ даададаадд сЬааддадсЬ 1140 сддсдЬЬаад ссЬаЬддсЬа саЬЬсдЬадс ЬддадсасЬЬ дсЬддЬдЬЬс дЬссЬдаадЬ 1200

ЬаЬдддЬаЬс ддЬссЬдЬад садсЬасЬса дааддсЬаЬд аадааддсЬд дЬаЬсдадаа 1260 сдЬаЬсЬдад ЬЪсда/аЬса ЬсдаддсЬаа сдаадсаЬЬс дсадсЬсадЬ сЬдЬадсадЬ 1320

ЬддЬааддаЬ сЬЬддааЬсд асдЬссасаа дсадсЬсааЬ ссЬаасддЬд дЬдсЬаЬсдс 1380

ЬсЬЬддасас ссадЬсддад сЬЬсаддЬдс ЬсдЬаЬссЬЬ дЬЬасасЬЬс ЬЬсасдадаЬ 1440 дсадаадааа дасдсЬаада адддЬсЬЬдс ЬасасЬЬЬдс аЬсддЬддсд дЬаЬдддаЬд 1500 сдсЬасЬаЬс дЬЬдадаадЬ асдааТААСС СТСАСАТСТТ СТТСАСТССА ТТСТАСТТСА 1560

АТСААСССТТ АСССССОААА ТСССССССТА ТТТТТТСТСТ АСССАТССТС ССАССТТТСА 1620

САСССТАССА АТТТССАСАС САТАСддЬСс ЬсЪсЬЬсЪдс сдЬЬа 1665

- 67 028407

Последовательность № 40

Пример 40: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы (4071 по) адааааСсСд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА СССОАТАССТ стеассетос 60

ААТСАССОСА ТТСССС7кАСО СССТТТСООС САСАТОАССС ССАТССАСАО АСТСССААСС 120

ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180

АСТТАССААТ АААТАСАОТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240

ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТССС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 300

СССАТТСААС АСААССОСАА СААССаЬддс дсададдЬдс ааддадсссд Ъсдасддаас 360 дасадссасд асдсасдЬдд ссЬасЬЬса!: дадсдасадс дсдСЬсаЬсЪ ЬссссаЬсас 420 дсссадсЬсд дЬсаСдСссд аддСсдссса сдадЬддСсс аЬдаасддсс дсаадаасдс 480 сЬЪсддссад сссасдаедд СссдссадаС дсададсдад дсЬдддСсСд ссддсдсссЪ 540 дсасддсдсд сЪсадсдадд дадсдсСддс дасдасдЫзс асдадсадсс адддссЬдсЬ 600 дсСсаСдаЬс сссаасаЬдЬ асаадаЪсдс сддсдадсЬс сСдсссЪдсд СсаЬдсасаС 660 сдссдсссдс ассдЪсдсса ссдаддсссЬ сЬсСаесСЬс ддсдассаса сддаЬдЬсЬа 720 едсддЬдадд ЬсдасддддЬ СсдсдЫзссС дСдсСссдсд ассдЬссадд адЬдсаЪсса 780 саЬдСссдсс дссдсдсасд ссдссасссЬ дЬссадсдад дЬсссдЬСсд сссасССсСе 840 сдасддсССс сдсасдСссс асдадаСсса даадаЬсдас ЪЬссссЬсдд асдссдассЪ 900 дсЬддссЪдс аЬдаасЬЪЬд асдасдЬссд саддЬСссдЪ ддссдсЬсдс СдЪдсЪдсда 960 дсдсссдсСд сСдсдсддда сддсдсадаа ссссдасдСс СЪсаЬдсадд сдСссдадЪс 1020 даассЬддсд асдсСддсса дддСссссдс ддссаСсдас даддсдсЬдд сСсдСдЬдаа 1080 сааддСдСЪс дддассаасС асаддассЬа сдадЬасеаЪ ддссассссд аддссасдда 1140 сдСдаСсдЪд дссаСдддаа дсддсассда адЪддссаСс СсдасЪдсса асССссСсаа 1200 сЬсдсдсдас дсдаасЬсда дддЬсддсдЬ сдЬдадддСд сддсЪдЫзсс ддссдЬЬЬдЬ 1260 дЬсддсддсд ееедЪддсЪд сдсСдсссаа дассдЪсаад аддаЬсСдсд ЬСсСддассд 1320 сдддадддас дддсаддсдд ссдсддассс ссЬдсассад дасдЪссЬдЬ сддсдсЬддд 1380

ЬсЪддсадсд сссдддаддд ЪСсаддедСд сдЬдддаддс дСдСасддСс ЬдСсдСссаа 1440 ддасСЬсаас сссдассасд СдаЬсдссд! дЪасаддаас сЪсдсдСсдд сдадссссаа 1500 даасаддЫзс адсдСсддса ЬсдЬсдасда сдЬдасдсас аасадссЬдд асаЬдддада 1560 дсасдЬддас дсдсЬдссдс аддддасдаа дсадЬдссЬд сЬдЬддддса Ьсддсддада 1620 сдддассаЪс ддддсдааса адасддссаЬ саадсЬдаЬс дсддассаса сддадсЬдса 1680 сдсдсадддд СасЬЬЬдсде асдасдссаа сааддссддс ддссЪдасад ЬсЬсдсассЪ 1740 дсддЫсддс ссдасдсддЬ Ьсдаддсдсс дСассСддЬд аасдасадса асЬасдЬддс 1800 дЬдссасаас СЪсЬсдГасд ЬдсасаддЫ саассСдсСд ЬсдЬсдсЬдс дсассддддд 1860 сасдЬЪсдСд сСсаасСдсс сдСдссддас сдЬддаддад сСддасасдд сасЬсссддЪ 1920 дсдссЪдадд сдсдадаЪсд ссаддсддса ддссаадССс СаСдСдаСсд асдсдассаа 1980 даЬсдссаад дасаасддда ЬдддсссдЫ. саЬсаасаЪд дСссЬссадд ссдедЬСсЫ; 2040 сЬаСседСсс сасдСдсСсд аСдСдаасда ддсадЬддса сЪссЬдаада ададсаСсса 2100 даадаСдСас дсдсдсаадд дсдаддаддС ЬдЬсаддаад аасдСддсаС сддСсдасдс 2160 дЬсдсСддаЬ сссааддсдС СдсСдсасаС сдадЬасссс дсадасаддЬ ддсЪЬдсдсС 2220 ддссдасдад сасдСдсссс дсаЬдддЪсЬ дсЬсасЬдЬс сссдадсдсс ЬдсадаадСЬ 2280 саасдссдад сСдЬасдадс сдасссЬсдс дСасдаЬддд дададсаСсс сддСсадсад 2340 дЬЬсссЬсдс ддсддсдада сдссдасддд сасдасЬсад сЬдддсаадс дСддсаЪсдс 2400 сдададсдЬд ссдсасСдда ассасдадаа дЬдсдЬдсад СдсаассадЪ дсЪсдЪЬсдЬ 2460 д^дсссдсас дссдЬсаСсс ддЬсдЬасса даСсадсдад даддадаада адаасдсссс 2520

СдссддсЪСс дасасЬсСЬа адЬсдсдсаа дсссдддЬаС сдСЫзссдса ЬсаасдСсад 2580 сдсссЪддас СдсасСддсЬ дсадсдЬдЪд сдЬддадсад СдсссадЪса адСдссЪдда 2640 даЬдаадссЬ сСсдадСссд адЪСсдадаС дсадааддас дссаЬсаддС ЬсдСссдсда 2700 даСддЬсдсд сссаадсссд адсСдддада ссдсаадасС сссдСсддса ЪсдсдСсСса 2760 сасдссдсСд еесдадСЪсс сдддадссСд сдссдддЪдс ддЬдадассс сдсЪддЪдсд 2820 ссЬсдСдасд садаСдССсд дЬдадсдсаЬ ддСсаЬсдсс дсддссасСд ддЬдсаасЪс 2880 даСсЬдддда дсдЪсдССсс сдаасдЬдсс дЪасасаасс аасдсссдсд дддадддссс 2940 сдсдСддсас аасСсдседС Ссдаддасдс ддсддадсЬс дддЪаЬддса ЬЬасдСдедс . 3000 дЬаЪсдссад сдссдсдадс дссСсаЬсдд саСсдЬдсдд адсдЬсдСсд асдаЬдсддд 3060 аСссдЬдсад ддСсСдСсед сСдадсСдаа ддсЪсЬдсЬд дСсдадЬддс ЬсдсдсасдС 3120 садддасЬЬс дадаадассс дсдадсЬссд сдасаддаСд аасссссСда ЬсдасдсааС 3180 сссадсдаас дсддасЬдса дддЬСсСдда дсЬсадддад аадсасаасс дсдадсСдаС 3240 сдсдсдсасд адЬЬЬсЬдда ЬссЬсддЬдд сдасдддЬдд дсдСасдаса ЬсддсЬЬсдд 3300 сддасЬддас сасдЬдаСсд ссаасаасда ддасдЬсаас аСссЬЬдЪЪс Ьсдасасдда 3360 ддСсСасЪсс аасасЬддЪд дссадсдсЪс саадСсдасд ссдсЬсддсд сссдсдссаа 3420 дСасдсСдСд сЬдддсаадд асасСдддаа дааддассЬд дддсдсаСсд сдаЬдассСа 3480 сдадассдсд ЪасдСддсса дсаСсдсдса дддадссаас садсадсадС дсаСддасдс 3540 дсСдадддад дссдаддссЬ ассадддссс сЪсдаЬсдЪс аЫздсдЬаса сЬссдСдсаС 3600 ддадсассад аСддЬссдсд ддаСдаадда дадссадаад аассадаадс ЬддсЬдЪдда 3660 дасдддсЪас ЪддсЬдсЪдЬ ассдсЬСсаа ссссдассЬс аСссасдадд дсаадаассс 3720 сЬСсасссЬс дасЬсдаадс сСсссЬсдаа дссСсссаад дадЬЬссСдд асасдсаддд 3780

- 68 028407 ссдЬГСсаГЬ асЪсСдсадс дсдадсассс сдадсаддсс сассСссЪСс асдаддсасС 3840 сасссдсЬсЬ сЬддссассс дсССсдСдсд сЬассадсдс сСсдСдсадс ЪдЬасдадсс 3900 сдсСдссссС дссдсадсЬс сЬдссасдса СТААСССТСА САТСТТСТТС АСТССАТТСТ 3960 АСТТСААТСА АСССТТАССС СССАААТССС ССССТАТТТТ ТТСТСТАССС АТССТСССАС 402 0 СТТТСАСАСС СТАССААТТТ ССАСАССАТА СддЪЪсЬсЬС ГЬсЕдссдЬЕ а 4071

Последовательность № 41

Пример 41: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт пируваткиназы (1806 по) адааааЬсЪд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60 ААТСАССССА ТТСССС71АСС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСС 120 ТСССАААТСС АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180 АСТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 24 0 ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТСОС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 3 00 СССАТТСААС АСААССССАА СААССдСдСЕ сасСааааее дСадсСасаС СддддссЬЬс 360 дасГдаГада сГдссддаба ГаасддсссГ дССдадсаад дЫзсасддсд СдсддаЬааа 420 СаСдЬсесас дсабсдссаС сддаддЪада ддсссдсдЬд аасдссдЪда ддаадЕаСда 480 ддадассадс дддаддСаСа СадссаеСаГ адсддаСсЬа аддддсссса дсдСсаддас 540 сддссЬСаСд сдсссЪсСас адаСаасддс дддсдсссдс дЕсЪссЪееа ааЕЕадссда 600 даадддддас ддсСЪсдСас сЬдСдссдсд дсдЬдадЬСс еесдаадСаа Ьсдаддаддд 660 адасдаддСС сеСаСдССад асддаааасГ сдЬсССдадд аЪааГсадсд садсдсадас 720 сЕсддссдад дссдадГсдС СаСссСссдд сдЕсаСаСсс адсааСаадд сааСадСддС 780 саааддсаад дааСаСсаеа Сададсадсс СдСддаддаа дасаСааддд сдсССсадас 840 дсГсЬсЬсдд ССсададасд асдбадасЕа сдСддсссбс адссЪЪдСда дадасддадс 900 адасдЪдадд ааааСдадда дсдСсдЬсда ддаддсСддд сЕсассЕссд дсаЪааСддс 960 сааааЕадад асдаададсд садСадаСаа ааЪсдаддад аЬааСсааЪд сддссдасСа 1020 саСадССаСа дсдададдсд аЬсЪддсдсС дсасСасдда сСддадбаса ьессСааадЪ 1080 асададдсЪс ЪСддСддада даЬсЪсесес ддсаддаадд сссдбддсдд Ьддссасдса 1140 дсеееЪддас ЪсСаСдсада ссаасасдас дсссасСадд дсддаддбса асдасдбдСа 1200 сасаасддсд адСсЬсддад ЕддасЕсЬсе дЬддсЪдасс аасдадасбд сдадсддада 1260 дсасссдЪСа даддсадЬдд аЬЕддсЬдад даддаСадСд СсдсаддЕсд адСЪсдддад 1320 асЬГааддсЬ дсдСсдссдд ссдасдсасд сдаСаддЕЪс дссааадссд ЪддСадаСае 1380 ддссдаддас аСдддадддд аааЬсдсадб аЬасЬсааСд асдддаасСс Ьддсдаадад 1440 ааГадсЕааа СШаддесда ЪдасдасадС сСасдСсдда дЪсаасдада ддаддсЬсдс 1500 даддаСдССд дадсСссдсд аддаЕдСЕдд адсЬсаЪаед дддссЪадад ссСдСддСсд 1560 гдссддсдса ГасЕСасдад дадддссбсд ададдсбссЪ сессадаШс Сссдасааад 1620 гсСГдаСадс сасдЬаГддд сЬсададдсд дсасасаСас ЕаГСааТААС ССТСАСАТСТ 1680 ТСТТСАСТСС АТТСТАСТТС ААТСААСССТ ТАССССССАА АТСССССССТ АТТТТТТСТС 1740 ТАСССАТССТ СССАССТТТО АСАСССТАСС ААТТТСОАСА ССАТАСддСС сбсЬсГГсСд 1800 ссдСЪа 1806

Последовательность № 42

Пример 42: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт энолазы (1696 по) адааааесед дсассасасс ТСАСССССАТ ССАСАСАСТС ССААССТССС АААТССАССС 60

АССАСАСТТС ТТСАОТТСАС АСОТАСАТАА ТСТССССССТ СТТСАТАСТТ АССААТАААТ 120

АСАСТТТСАС ААТАТСТСТА АТАСАААААС ТСТАТССАСА СААСАААААА СТАССААААТ 180

ГТАСАААТОТ ТСАТСА'ГТСА ТСТСССТААА ТТССАТСТТС ААСТСАСССА ТТСААОАСАА 240

ССССААСААС СЬСаСЪсССС сССсаадСеа аадааСдсдС ЬсаССссадд аЪааасддса 300 аЬдсЕдссаа дсЕсеесСЬс ааСЬсСсаад адсСдаеЪдЪ аССеедсСас есЪдЬседЪе 360 сЬсдасддГд сассСдссСС СаСсЕдасса дсаШСасСд саасаасаад дСсадсааСС 420 дЫздЕаСсее садЕсСсасс СдаСсСдедд даЬасаасСд садСдСадсс СдсСсеаСее 480 дссаСССсаа СадсССсСаа адееесСдСа адЬдЪЪссеа СсСдаССаад сССааСсааС 540 аССдадгеСд саасдссаад еесСаССссс СССдсаадсс СсееедСдее СдСаасааас 600 аааЬсаСсас ссасаадсСд ааСсШсЫзд ссаадЪдсЬС садССадсаС сЬСссадссЕ 660 есссадЬссЕ сССсСдсаас ассдСсССса аЬЬдаСасаа еедддЪасЪЬ СЬсаасаадЕ 720 еееасссада аСЬсСассаЬ еесСесЬСее деЬсЪаасее СассеесСсе еесдаааЪда 780 еасССЪссае сеесеесаСе дГададсЪса даСдЪСдсад ддСсаадсдс ааССдсааСа 840

ЬссСЕассад дадСаСаасс адсСССееса аССдсСЬсда сааССасеСс сааСддсСсЪ 900

ЬсдсСадасС СсаадЪГСдд СдсаааСсса ссССсаЪсас ссасЪдЬСде дССдСаессЬ 960 сСГдссССса аГасаСЬСсе СааССдаСдд ааСдЪсСсад сасасаСссС дадЬдсССсд 1020

- 69 028407 сЬаааадаСС ЬСдсасеаас ЬддсаЪЬаЪс аЬааасЬсЬЬ дЬаддбсаас ададССдСса 1080 дсаСдсСССс сассдЫзсаа ааСаЬСсаЪс аСЬддсасад дЪаааЬасЬЬ ЬдсаЬЬдаса 1140 ссассааЬдЬ аЪЪддЬасад Ьддаадасса адСдсдсеед ссдсЬдссЬЬ сдсаасЬдсс 1200 ааадабасас ссааааСЬдс аЫЩдсасса адсЬЪдсЪсЬ СдеЪсСсЬдЬ сссаЬсаадс 1260 ссааЬсаСаа дссСдЬсааГ сГсаасЬСдд ЬЬаададсдЬ ЬсаЬЬссааЬ ЬаСЬЬсЬддс 1320 дсааСаассС сдСССасаСС ЫзсдасЬдсС Ыдадаассс сССССсссаЪ аСаСсСЬССЬ 1380 сбабсассдЬ сЬсСдадЬСс аасадссСсд аасабассЬд ЬЬдасдсасс ЬдаЬддааса 1440 дсадсГсбас сбасаааЪЪс аЬсаЬЬЬаса асаасЬСсСа сССсаасадС ЬдддЬЬЬссЬ 1500 сЬЬдааЬсса дааССЪсСсС ЪдсССЪСаса дсСдЪааГСд ааадаЬсаас сЬСсаСТААС 1560 ССТСАСАТСТ ТСТТСАОТСС АТТСТАСТТС ААТОААСССТ ТАССССССАА АТСССССССТ 1620 АТТТТТТСТС ТАСССАТССТ СССАССТТТС АСАСССТАСС ААТТТССАСА ССАТАСддЬГ 1680 сЬсСсСЬсЬд ссдЬСа 1696

Последовательность № 43

Пример 43: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы (2029 по) адааааСсСд дсассасасс ТСАСССССАТ ССАСАСАСТС ССААССТССС АААТССАССС 60

АССАСАСТТС ТТСАСТТСАС АССТАСАТАА ТСТССССССТ СТТСАТАСТТ АССААТАААТ 120

АСАСТТТСАС ААТАТСТСТА АТАСАААААС ТСТАТССАСА СААСАААААА СТАССААААТ 180

ТТАСАААТСТ ТСАТСАТТСА ТСТОССТААА ТТССАТСТТС ААСТСАСССА ТТСААСАСАА 240

ССССААСААС СсГасдссдд сдссЬдсГЬс ЬссЬссЬдсс ддсадсасЬЬ сГссаааддд 300

ЬдсасдГГсд сССсСсССдС ааЪсадддЪс ЬддссддЪса ЬсЬсддссдд ЬССсдддаЬд 360 сссадсаддС дсаддаЕддС дддддссаса Гсссдсаддс ЬдссдЬсссд садсдсааГд 420 ссддсддСаЬ сссдсседаС саддаЬдаас ддсассдддс ЬддЬддСдСд ддссдСаЪда 480 ддсЬдЬсссС сССсдЪссас саСсЬсаЬсс дсаЬЬдссдС ддЬсЬдссдС ЬаЬсаддадс 540 дСдссдСссЬ СССссаддас ддсссдсдсс ассЬЬЬссаа ддсадсддЬс даЬЬдСеЬсГ 600 аЬддссЬГЬа ссдССдссЪС сабдбсдссд дбаЬдсссда ссаСдЬсддд аСЬддсдСаа 660 еесаГСаСда ССасдЪсдСа сСГдсссдад дссадссдсС ссадаааддЬ дссддбдасс 720 есдГГддсдс СсабЬЬсддд сЬЬсаддГсд ЬаддСддсса сссдсдддда дддсассадд 780 аЬссГдГсСГ сдссддддЪа ЪддсбЬЪесЪ аадссдссдЬ Ьдаадаадаа ддЬсасабдд 840 дсдСасСССС ссдСССсддс саддсддадс ЬдддЬсаГдс сдСдссСдсС СаааассГсд 900 сссадддСаЪ ЬдсдсадсСс сСдсддсЬда аасдссассд дсдссЬЬааЬ ддбсЬСдЬсд 960

ЬааадддГса Ъдсаддсааа аГдсасддса дддЬадсссЬ дсЬЬЬсСддс ааасссддЬд 1020 аааГссбсдЬ ссасаааддс ссЬддЬааЬс Гддсдддссс ддбссддссд даадГГааад 1080 ааааГаасдд сдЬсдсссСС саССаССССд дсддссддсс сасссдассс дГГЬассасд 1140 асддЬдддсб ддаСааасЬс дГсддСЬЬса ГсссЪГссдЬ ассссаддбс аассдссЬсс 1200 адсдддсЬЪд ССдссСдааС дсссбсдссС аааассаЬЬд сдГСдЬасдс ссдсЬсддЬд 1260 сддЬсссадс ддсддЬсСсЬ дЬссаЬддсд ЬааЬадсдсс ссаССассдЬ Сдссассдсс 1320 ссааадссса дЬСсдсссад сбЬсеСссЬЬ аасЬдсГсда адЬаЬЬсЬЫ: ЬдсдЕЬддсс 1380 ддсддсасдС сдсдсссдСс саддааддса (зддасааада сдШдсдсаС. дЬЬсСсдсдд 1440 дсддссаддС ссаддадддс дааааддЬдд сЬдаСаЬддс ГдбдсасЬсс дссдЬссдаГ 1500 аааадсссса ЬсаддЬдаад ддссЬЬаЬЬа ЬЬсСсссЬдд сдЬаЬсЪсас сдссЬссадс 1560 аддасСЬсде Ьсббдааааа ддЬсссдЬсс Шдабддсдс ддсЬЬаЬГс!: ддбаадсЬсс 1620

ЬддЬасасса сссбдссддс дссбаСдССс аадЬдСссса ссГсддааЪЪ дсссаЪсЬдд 1680 сссГсдддаа дссссасдСс сЬсдссддаа садсбсаддд сасадбдддд дСаассддсс 1740 адааадсЬсГ ГдаааЬСсдд ГдЬдсЬддсс адддсЪаЬдд саЫздссссд дасаССддаа 1800 сГдаддсссс адссдЬзсад аассассадс ассаддддсс Ьдссдссддс аЬассддссд 1860 садддсдГЬд садсСаздГс ЬСссСЬсааТ ААСССТСАСА ТСТТСТТСАС ТССАТТСТАС 1920

ТТСААТСААС ССТТАССССС САААТССССС ССТАТТТТТТ СТСТАСССАТ ССТСССАССТ 1980

ТТСАСАССОТ АССААТГТСС АСАССАТАСд дССсЬсЬсЫ; сСдССд(Ха 2029

Последовательность № 44

Пример 44: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы (1687 по) адааааСсГд дсассасасс ТСАСССССАТ ССАСАСАСТС ССААССТССС АААТССАССС 60

АССАСАСТТС ТТСАСТТСАС АССТАСАТАА ТСТССССССТ СТТСАТАСТТ АССААТАААТ 120

АСАСТТТСАС ААТАТСТСТА АТАСАААААС ТСТАТССАСА СААСАААААА СТАССААААТ 180

ТТАСАААТСТ ТСАТСАТТСА ТСТОССТААА ТТССАТСТТС ААСТСАСССА ТТСААСАСАА 240

ССССААСААС ССЬаЬГЬаес дадсадсдсс сГЬасЪсссд дсадЫздсГС сссЬЬссада 300 аасГссаддд аадсдссдсс дссддЬЬдад аГаЬдддЬса ССССдссддс Ъасдссддсс 360 еЬсЬЬддссд ссдссдссдЬ дЬсассдссд ссдаЫзасдд ЬдасддсдЬЬ ЬааЬСсддсс 420

- 70 028407 адсдСссддд сСаССдсССс ддСдссссСд дсааааддаС ссаЬССсааа аасдсссаСС 480 ддСссдССсс адассасддС ссСддссдсс сСдадддсСС сддСдаааад СсСдаСддас 540 СсдддсссСа СаСссадддс саСссасСсс дссдддаССС даСсдассдд сассдСссСС 600 СдсСссСддс сдддсдссдд ссссддсдсс ассассасаС ссассддсад даддадсССС 660 асССсссСдс ССсСддсССс СдсааСсадс ССссСддсса ддСсааСсСС дСсддссСсс 720 адсадддасС СассдасдсС дСасссССдС дссССсадаа аддСаССддс саСсссдссд 780 ссааСдаСаа ссдСаСсдас СССддСсадс аддССдаааа ССасСсссад сССдСсддаа 840 асСССсдадс сдсссаодас ддсСдсаааа дддсдсСссд ддсСддСсад садссСдссс 900 адСаСЪСсса дсСсСССССс саСсадсадд ссСдссасдд ссддсааааа сссддсаасд 960 сссСсддСдд аддсдСдддс ссддСдСдсд дССссааасд саСсдСССас ааадасаСсС 1020 дссадсСсад ссадССдссд ддсааасССс СсдСсдСССС СсСссСссСс сдддСддааа 1080 сддасдСССС ссадсадсас сасдСссссд СссСдсаСсС дддсаасддс ддассСддсд 1140 дсССсСссса сдсадСсдсс ддссССаасс ассдССССсс ссадсадССс ддаааддсдс 1200 сСддсаасдд даСссаСССС дСассСсСсд СссасссСдс ссССдддссд дсссаддСдс 1260 дааассадаа СаасссСддс СССССдЬссд аСааддСадЬ ССаСддСддд сасддссСсс 1320 СССаССССаа сдСсаСсддс сасссддссд ССССссаСсд дсасдССдаа дСссасссдс 1380 аасаддассс дсССдсссСС СасаСсСаСа СсссССассд СССССССддс сасТААСССТ 1440 (ЗАСАТСТТСТ ТСАСТССАТТ СТАСТТСААТ СААСССТТАС СССССАААТС ССССССТАТТ 1500 ТТТТСТСТАС ССАТССТССС АССТТТСАСА СССТАССААТ ТТССАСАССА ТАСССТССТС 156 0 ТАСТОТТТТТ ТССТССТСАС ССТТСССТТТ ТСТСАТССАС АСССААССАТ ТССАСТСССТ 1620 ССТСААТААТ ССССАСТТСС ТСТТССССАС СССССААТТС ССССТСАддС СсСсСсССсС 1680 дссдССа 1687

Последовательность № 45

Пример: сконструированный оксифотобактериальный ДНК-конструкт глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (1514 по) адааааСсСд дсассасасс ТСАТСТССАА САСАСССТСА ССССАТАССТ СТСССССТСС 60 ААТСАССССА ТТСССС^СС СССТТТСССС САСАТСАССС ССАТССАСАС АСТСССААСО 120 ТОССАААТСО АСССАССАСА СТТСТТСАСТ ТСАСАССТАС АТААТСТССС СССТСТТСАТ 180 АОТТАССААТ АААТАСАСТТ ТСАСААТАТС ТСТААТАСАА АААСТСТАТС САСАСААСАА 240 ААААСТАССА АААТТТАСАА АТСТТСАТСА ТТСАТСТССС ТАААТТССАТ СТТСААСТСА 300 СССАТТСААС АСААССОСАА СААССааСдд аСЬСдддсдд аСсддасдСС СадсаССсад 360 аадааССсаа даСдСадаад дСсССдаадС адССдсадСС аасдасССаа садаСдасда 420 гаСдСЬадсС саСССаССаа ааСасдаСас СаСдсааддС сдСССсасСд дадаадССда 480 адССаЬсдаа ддСддаССсс дСдССаасдС аааадаааСС аааСсаССсд аСдассадаС 540 дсСдддСааа ССассаСддд дсдаСССада СаСсдасдСа дСаССадааС дСасСддССС 600 сСаСасСдаС ааадааааад сасаадсСса саСсдаСдса ддСдсСаааа аадСаССааС 660 сСсадсСсса дсСаааддСд аСдСааааас ааСсдСаССс аасасСаасс аСдасдсаСС 720 адасддССса дааасадССд СССсаддСдс ССсССдСасС асСаасСсаС ЬадсассадС 780 СдсаааадСС ССаадСдаСд ааССсддССС адССдааддС ССсаСдасСа сааССсасдс 840 ССасасСддС дассааааСа сасаадасдс ассСсасада аааддСдаса аасдСсдСдс 900 асдСдсадса дсадааааСа ССаСсссСаа сСсаасаддС дсСдсСааад сСаСсддСаа 960 адССаССсса даааСсдаСд дСаааССада сддСддадса саасдСдССс садССдсСас 1020 ЬдддСсСССа асСдааССаа сСдСадСаСС адасааасаа даСдСаасСд ССдассаадС 1080 СаасадСдсС аСдааасаад сССсадасда аСсаССсддС СасасСдаад асдаааСсдС 1140 аСсССсСдаС аСсдССддСа СдасССасдд ССсаССаССс даСдсдасСс ааасСсдСдС 1200 СаСдасСдСС ддадаСсдСс ааССадССаа адССдсадсС СддСасдаса аададСдддд 1260 ТААСССТСАС АТСТТС'ГТСА СТССАТТСТА СТТСААТСАА СССТТАСССС ССАААТСССС 1320 СССТАТТТТТ ТСТСТАСССА ТССТСССАСС ТТТСАСАССС ТАССААТТТС САСАССАТАС 1380 ССТССТСТАС ТСТТТТТТСС ТССТСАСССТ ТСССТТТТСТ САТССАСАСС СААССАТТОС 1440 АСТСССТССТ СААТАА'ГССС САСТТССТОТ ТССССАСССС ССААТТСССС СТСАддССсС 1500 сСсССсСдсс дССа 1514

Последовательность № 46

Пример 46: сконструированный ДНК-конструкт протонного канала под контролем №а1 промотора (609 по) адааааСсСд дсассазасс ТАТАТССТАС ССТСССАСТС АССССССССС АСТТССАССТ 60

ССАТСССССС СССТТСТТТС СССССТСССС СТСТСССССТ АТТСТСАССТ ССАОАСССАС 120

ССОСАТСААА АТССАТ’ГССС ТТССАТАССА СССТССАТТС ТСССТТСААС СТТСААСССА 180

АСССТТСААА ССАССССССС СТАССААСТТ ТТСТСССССС ССССТССССС ССССССССТС 240

ТТСТСССССС АТТАССССТТ ССССТСССАА ССААСАССАТ АСаСддссдд саСсддсдсс 300

- 71 028407 д(здс1здаадд СссСдассас сддссСдссс дсссЬдаЬса дсЬддаЬсаа дсдсаадсдс 360 садсадТААА ТССАСССССТ ССТТОАТСТС АСССТТСССС ССТСАССААС СССССТССАТ 420 ССААСАТАСТ ССТСТС7ЛСТ ССТСААСССС ТАССТТАССТ СССССТТТСС ТССТСАТСАС 480 ТСТТТТТСАА САССТА7ЛАА ССССАССАСТ ТТТССААТТТ ТСТТССТТСТ ААССАТССТС 540 ссттсатттт сссстстттс тссАтаааса ссстссссст Атттсллссд деесесссьь еоо сбдссдЫза 609

Последовательность № 47

Пример 47: сконструированный ДНК-конструкт НАД-зависимой глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы под контролем тгА промотора (1360 по) адааааЪсСд дсассасасс СТТСТТССАС ААСАТССАТС АТТТАСАААА АСТТСТАСТТ 60

ТСТСТТАССА АТТССС7кАТС САСААСТССС ТААТСТСССС АСТАТАТСаа сддаЫТддс 120 адда(заддас дасСддСдЫз дсдддсддсд дСддадаадд дсасдд(здда дд£дд(зддсд 180 дбдаасдабс сдЪСсаСсЫз сссддасдсд дсдбасдс{зд сдРасабдсб дсад(засдас 240 ссдасдсасд дддсдЫзссс дддЪдадд(зд ддсадсдасд дддадсасЫз ддЬддЬдаас 300 дддаадаадс (зддсдбдсЫз (здсдабссдс дабссддсдд адаЬсссдбд дддсбсддбс 360 ддсдссдасС асдЬсдСдда дбссассддс дЬдЫзсассд (здассдадаа ддсдбсдЫзд 420 сасдЬсаадд дсддсдсдаа даадд+ддЫ; а(за(зсддсдс сдбсдаадда ЪдсдсссаЪд 480 ззЫздбдаСдд дсдСдаасса 1здасдсс(зас ассааддас(з (здасддСддЬ д(зсдааЬдсд 540

ЬсЫздсасса ссаас<з1зд(з{з СддсдссдсС ддссаадаСс аСсдасдадд сд(з£сддсаЪ 600 сдддаЬдддс сРсабдадса ссабссасдс ддбдасддсс асдсаааада сддЪддабдд 660 дссдадсбсс ааадасЕддс дсддСдСсдс ддсдсдСЕсс адЬсдаССае Есссадсадс 720 ассддсдсбд сдааадсддб сддсааддбд (засссдаадс Сдаасддсаа дсЪдассддс 780 аСддсдССсс дсд(здссдд(з дсссдасд(зд (зссд(здд(зад ас(з(здасад(з дассс(здаад 840 ааддадасса ас(засдадда да(зсааааад дсбдЬсаадс аддсдЬсдса дадсссдсас 900 [засаадддса (зсдЪддсдба сассдадсас ссса(зсд1зд(з сддссдассЪ ддбдсасаас 960 ссд!зас(зсд(з сдд(зд(з1зсда Ьдссдаадсс дд(заЪса1здс (зд(зсдсссас дЬ4з(зд(здааа 1020 сЬддбсадс(3 ддТААТАСТС АТСССССССС СТАСТАААСС СТСАТТТСТС ТТОАТАССТС 1080

СТССТСССТТ ТССССАСССС СТТТТТТСТС ТСТСССАТТС ТТСАССАТСС СССАСТСТТТ 1140

СССТТТТССТ СТАСССССАТ СААТСССАТС ССАСТСТССС СТСТССАССА ССТТССАСТС 1200

АТТСОТССТС СССАСТТАСС ТТСОАТССТС ССАССАССАС СССААСАСТТ ССССАТСТСС 1260

СТССАССТТС АААСАСССАА ТСАТСАССАС ССАССАСТАС ССАТСССССА ТСАААСССТА 1320

ТТАССАССАС ТТССТСАССС ддЪГзсЪс1зс1з (зсбдссдЫза 136 0

Последовательность № 48

Пример 48: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицераткиназы под контролем тгА промотора (1621 по) адааааЬс(зд дсассасасс СТТСТТССАС ААСАТССАТС АТТТАСАААА АСТТСТАСТТ 60

ТСТСТТАССА АТТСССААТС САСААСТССС ТААТСТСССС АСТАТАТСЬС а(з(:Ьд(ЗСЫзс 120 дадсдсдасд асасссддса дсОдСЕЫзсс МзссаТааас (зсдадсдаад сдссдссдсс 180 дд(зддадаСа 1зда(зсса1з(з(з (зд(зсддссаа дссдааееес (зсаассдссд ссдссдаа(зс 240 сссдссдссд а(здассдаа(з адд(зд(зсддд сдсЫзссдсс адбдсЫзсдд сда(зсдс(з(з(з 300

1зд(зссса(здд дсдаасдс(з(з сса(з(з(зсааа дасдссса(зс дддссд(з(зсс адасаасдад 360 с(з(зсда(з(зда сдаа(здасаб сдсдд(засаа (з(зсдсдсд(з(з (з(зсдддссда (зд(зсаадсдс 420 с(зсссаа(зсд с(зсддаа(здд сд(зсда(зддс дасдас(з(з(зс д(зд(з(зддсд(з сд(з(зсдсааа 480 ссдд(зсддсд асдассасд(з ссассддса(з а(зааааасдд асдсс(з(з(з(з(з с(з(з(зсдсс(з(з 540

ЪЬссаЪааас даЫзСддсда д(з(зсда(з(з(з(з д(зсс(зсс(зса адсадсдасб (здссдасдбс 600 а(зддссдадс дс(з(з(здасда асд(за(засдс сад(зссдссд ссда(зда(зса ад(з(зд(зсдас 660 (з(з(з(з(зсаадс ааа(з(зд(зсда (здасдссда(з (з(з(зд(зс(з(з(зс ас(з1з)зсдсдс сдссда!зда(з 720 сдссдСааас дддсдд(зссд даЫзсдадад сдс(з(з(здссд адсасССсда д(з(зс(з(;1з(з(:с 780 са(зсааааас ссддссассд саддсаад(за а(здддсда(зд ссЫзссдСсд асдсабдадс 840 дсдд(здддсд дсдссдаасд са(зсд(з(здас а(засадаЪсс дсдадсбссд сааасдс(з(з(з 900 ддссадсСсС дда(зсд(з(з(з(з (зс(зс(з(зсдсс аддд(зааааа сддасдЫзсЬ саадсаадад 960 сасд(зсдсс(з тзсд(згзсааас дд(зсдассдс сдс(з(з(зсасс (зса(зсдссда ссдс(з(зса(з(з 1020 сд(з(з(з(зддсд ассддссдЫз саадсадсбс дссдадссдс Ызсдсаасдд сабссааасд 1080 саа(з(зс(з(зсд ассасб(з(з(зс с(з(з(зсдддсд дссдадд(здд с(зсдссаааа (здас(зс(зсдс 1140 сссдбдсСсд а(зсааа(задс дда(зсд(зсдд дад(здсддсд сдаабдсдсд (зд(зса(зсдд(з 1200 да(зддсдсс(з 1здс(зсса(зсд даасд(з(здаа абсдасдсдд саааадасдс дс(зЫзсссс(з 1260 сассСсаасд (зсдсдда(зсд 1зс(з(зс(з(зд(з(з са(зТААТАСТ САТССССССС ССТАСТАААС 1320

ССТСАТТТСТ СТТСАТАССТ ССТССТСССТ ТТССССАССС ССТТТТТТСТ СТСТСССАТТ 1380

- 72 028407

СТТСАССАТС ССОСАСТСТТ ТСССТТТТСС ТСТАСССССА ТСААТСССАТ СССАСТСТСС 1440 ССТОТССАСС АССТТССАСТ САТТССТССТ ССССАСТТАС СТТССАТССТ СССАССАССА 1500 ССССААСАСТ ТССССАТСТС ССТССАССТТ САААСАСССА АТСАТСАССА СССАССАСТА 1560 сссатссссо атсааассст аттассасса сттсстсасс Сддеьсъсъс еъседссдеъ 1620 а 1621

Последовательность № 49

Пример 49: сконструированный ДНК-конструкт фосфоглицератмутазы под котролем тгА промотора (1990 по)

адааааСсЬд дсассасасс	СТТСТТССАС	ААСАТССАТС	АТТТАСАААА	АСТТСТАСТТ	60
ТСТСТТАССА АТТССС.^АТС	САСААСТССС	ТААТСТСССС	АСТАТАТСсЬ	сдадсаСТТА	120
ТТТААТААТА АСССАССТТС	ССТТСАТСТС	ТСААССТТТТ	ТСТААСССТА	АСАТСТСТАА	180
САТТСТТССА	ССААТС'ГСТС	СТААСАТТСС	АТСАТСТСТТ	ААТТТААСАТ	ТСССАТАТСС	240
САСААСАТАС	АААСССАССТ	ТАТТТСТТСТ	АТСАССТСТА	ТСАСССТСАС	СТСТСТСАТА	300
АТСААТСАТС	ТСТТСАСАСТ	ТСССАТССТС	АССАСТААТА	АТААССАСТС	САСССТТТТС	360
ТААААССТТС	ТТААСААСТТ	ТТССААТАСА	СТСАТСТАСА	СССТСААСТС	ССТТТАТТСС	420
АСССТСТААА	АССССТЗТСТ	ССССТАССАТ	СТСАССАТТТ	ССАТАСТТАС	АТАТТАТСАС	480
АТСАТАТТСА	ТСТСТТТСАА	ТТСТСТСААС	ТАААССТТСТ	СТТАССТССТ	АТССАСТСАТ	540
СТСАССТТТА	АСАТСАГАТС	ТТССААССТТ	ТССТСАТССТ	АССААТАССС	ТСТСТТСТСС	600
САСАТТТССТ	АСТТССАСАС	СССССТТСАА	САААААССТС	АСАТСАССАТ	АСТТТТСТСТ	660
СТСАССААТТ	ССААСТТСТТ	ТТААСССТАА	СТТССТАААА	ТАСТСТСССА	ААСТСТТТСТ	720
САССТТСТСТ	ССТТТСААТС	СААСАТСССА	АТТТТТТАТТ	СТСАСАТСАТ	АСТСАСТСАТ	780
ССАТАСАААС	ААСАСТТССА	ААТАТССТТТ	ТТТССТТТСА	АААСССТСАА	АТТСААСАТС	840
АСААААСССТ	СТТСТААОСТ	СТСТТССТСТ	СТСАССТСТС	ААСТТАААСА	АААТААТАСТ	900
СТСАТСТТСА	ТТТАТТСТТС	ССАСАССТТТ	ТССАТТТТСА	АССАСААСАС	ТСССААТТАС	96 0
АААСТСАТСА	СТСТТАССТТ	ТТТТАТАССА	СТТТТСААСС	СССТСТААТС	СТСАССТТСС	1020
АТАСТССССТ	ТСАССАААСА	ССАТТССАТТ	АТАТСССТТТ	ТСААСТСТТТ	СССАТСТТТТ	1080
етстстстсс	АТТССА.ТАСТ	АТСТССССАТ	САСТСТТССА	АТСТТАССАС	ААССААТТТС	1140
ТТТТАТСТТС	ТСТТСААССТ	СТТСААТСТА	ААТТТТТССС	СТССААССТС	СААСАТСТСС	1200
СССАТССААА	ААССАА.ТСАА	САТАТАСТТТ	ТТСААСАТТС	ТСССТСТТТС	СААСТТТТАА	1260
ААСТСССТАА	АСАТСТСТСТ	ТСТСССТСТС	ААСАССАССА	ТСТСАТАААА	СТСССАТСАС	1320
АТОААСАСАА	САСТТАТАТТ	ТТТТССААТТ	СТСТАТТССС	АТСАААААСТ	СТТСТТТТТС	1380
АААААААТСА	СССТСТТТАА	ТТСАСТТТСТ	ТАТТСТТСТА	ААТТСТТССТ	АААСААТТСТ	1440
ТССТССАССС	АССТТСАСАТ	СТССААСТТС	АСААТТСССС	АТТТСТССТТ	ССССААСАСС	1500
ААСАТССАТА	ССАСТССТАС	СААТСАСССТ	АТАТСССТАА	ТТСТТТТССТ	ААТАСТСААС	1560
СТТАССССТС	ТТАССС'АААС	СААСАСССТТ	ТСССТСТТСС	ТТТСССТТАТ	ААССССААСС	1620
СТССАТСАТА АТСААСАСАА	САССТТТТТТ	САТЬааЬсЬа	даТААТАСТС	АТСССССССС	1680
СТАСТАААСС	СТСАТТТСТС	ТТСАТАССТС	СТССТСССТТ	ТССССАСССС	СТТТТТТСТС	1740
ТСТСССАТТС	ттсасс;атсс	СССАСТСТТТ	СССТТТТССТ	СТАСССССАТ	СААТСССАТС	1800
ССАСТСТССС	СТСТССАССА	ССТТССАСТС	АТТССТССТС	СССАСТТАСС	ТТССАТССТС	1860
ССАССАССАС	СССААСАСТТ	ССССАТСТСС	СТССАСОТТС	АААСАСССАА	ТСАТСАССАС	1920
ССАССАСТАС Сседссдеьа	ССАТСССССА	ТСАААСССТА	ТТАССАССАС	ТТССТСАССС	ддеесесесе	1980 1990

Последовательность № 50

Пример 50: сконструированный ДНК-конструкт энолазы под контролем тгА промотора (1765 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС сЪЬсЬЬдсад аасаСдсаЬд а+.ЬСасаааа адЪЬд£ад££ 60

ЕсЬдЪеасса аССдсдааСс дадаасЪдсс ЪааЬсЬдссд адЕаЪаедСТ ССАССАТаЪд 120 сСаааСааас ссдСсдССЬс саСЪдаадаа аССассдсСа дадаааЬЪЫ адасес£сд£ 180 ддссдЬссЪа ссаССдаадс адаадСсЫза сЬддааасад дддсеЬСсдд ЬаЬЬдсссад 240 дьесссадЪд дсдсдЬсаас еддЬадсЬес даддсссасд ааЬЬасддда ЬдаЬдасссс 300 аассдсСасд дЬддЕааадд сдЫзсЕсааа дсддСЬадеа асдЪЬаЬада сдаааЬЬдсс 360 ссЬааааЫза ЬсддааЕдда СдддСЬадаС сааасСдсда ЬсдаЪсасас са^даСЬдад 420

ЬЬадасддЬЬ сСасЬааЬаа аааадааЪЪа ддддссааЬд сЬаЪссЪСдс сдЬСЬссЪЬа 480 дссасЬдсаа аадсЬдссдс сдаЪдааЪЬа дсссСЕсссс ЬдЬассдЬЬа еЬЬадддддЕ 540 ссс+Сддсса аЬдСсеЪасс сдЬссссаЬд аЬдаасдЕда ЬСаасддддд ЫзсСсасдсд 600 даеааеаасд ЬадасЬСсса ддадЬЬНаЬд аССаСдссад ЬдддЬдсдда сЕсЬЬСЬааа 660 даадсеееда дд+ддддддс сдаадСдееь дсЬЬсссЕса дЬааадЬЬсС аааададсдЬ 720 аааССдсСсС сЪддддСадд адасдадддд ддаЬасдссс сдаассЬддд аСсдаассад 780 даадссЬСад аЬЬСдсСсаС адаадссаъе дааааддсдд ддСаСаадсс аддддаасад 840

- 73 028407 дСддсСССад сдаСддаСдС ддсЬСсаадЬ дадСССЬаСа аддаСддсда аСаЪаЬЫзаЪ 900 даСддССсСс сссаССсссс СсаадааСЫ: аСсдаССаСС ЬаддЬаааЪЬ адСддаСсаа 960 СаСссЬаССа ЬЫзссаЫзда адаСддсЪСа саадаадаСд асСдддаЬад сСддаааадС 1020 ССдассдаСа сдССаддаСс СсдсаЬСсад ЬСадСЬдддд асдаСсССЬС СдСсасдаас 1080 оссасСсдСс (здсааааадд саЬСдаСаСд ддСдСдддСа аЬадСаСЬсС саССааасСс 1140 ааСсаааССд дСадСССаас ддааасдЬЬа даЬасдаЫзд сСЫзадсдас СсдСсаСсаа 1200 (заСадЫзссд Ыза(з(з1зс:сса СсдЫзссдда дааассдаад асас(зассаС ЬдсадасЫза 1260 дссдСадсСа сасдсдсСдд асаааСсааа. ассддЫзсСс ЬдСдСсдСад Сдаасддд(за 1320 дссаааЬаЪа ассдас1:аСС асдСаЫздаа даадааСЬад дсдаСсдсдс адЫзСаСдсб 1380 дсаааад(здд дСССаддссс (зсааСааССС ТССТСССССС ССТССТСССа аЬсСадаТАА 1440 ТАСТСАТССС ССССССТАСТ АААСССТСАТ ТТСТСТТСАТ АССТССТССТ СССТТТСССС 1500 АСССОСТТТТ ТТСТСТСТСС САТТСТТСАС САТСССССАС ТСТТТСССТТ ТТССТСТАСС 1560 СССАТСААТС ССАТСССАСТ СТССССТСТС САССАССТТС САСТСАТТСС ТССТССССАС 1620 ТТАССТТССА ТССТСССАСС АССАССССАА САСТТССССА ТСТСССТССА ССТТСАААСА 1680 СССААТСАТС АССАСССАСС АСТАСССАТС ССССАТСААА СССТАТТАСС АССАСТТССТ 1740 САСССддЫзс СсСсССсСдс сд(з1за 1765

Последовательность № 51

Пример 51: сконструированный ДНК-конструкт пируваткиназы под контролем тгА промотора (1888 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС сССсСЬдсад аасаСдсаСд аЬЫзасаааа ад(з(зд(задС(з 60

СсСдССасса аТ(здсдаа(зс дадаасСдсс СааСсСдссд ад(за(за1здСТ ССАССАТаСд 120

1зСаааааада сдааааСсдС Ыздсасдсад ддСссдСсса сададааасс дддсдСааСС 180 даёдсасСда СЬдссаасдд саСдаасСдс дсасдс(зСса аСЫзсСссса СддСдассас 240 даадаасаСс ЫзддссдСаС сааСаСддЫз сдСдаадсГзд ссаадааддс СддсааддСС 300 аСсСсСССаа СссСсдаСас саааддСссд даааСдсдСс СдддсдадЫз сааадаСддс 360 ааадЫзаСдс Ссдааааддд саасаадЫзс асЫзСдассС аСдасдаСда ассдддСдаС 420 дааасСсаЬд ЪЫзссдСааа ссасааадд!; сЫЛасасдд аадЫзаадсс дддсдасасс 480 сСдсбссСсб ссдаСддссС сдСадсСсСс ааадС(зда(зд аааСсааддд сааддаСаСс 540 дЫзасдасда Ызсадаасад сддСаадаЬд адсасдсдса адсдсдЬадс СдсСссдддс 600 дСассссЫзд дСсСдссСсс (заСсЬссдаа саддаЬдс(за аддасабсаС сСЫзддсЬдс 660 даасаддаСа (зддаСЫзсдС адсСдсЫзсс ЫзсаСссадс дСссддаСда СдЫзаЬсдсс 720 аЬссдсаадс ЬсаСсдаада дсасааСддс сасаСддааа ЫзсСдссдаа даСсдаааас 780 сЬсдааддСд ССаадаасЫз сдаСдсааСс сЬддаадЫЛз ссдасддсаС саСддЫздсс 840 сдСддСдасс СдддсдСада адССссддса даадаСдСдс ссс(з(заЫзса дааддаааСс 900 аСссдсаадС дсаасдсСдс Сддсаадссд дЬСаСсдССд сСасдсадаС дсЬсдасСсс 960 аСддаасдса асссдсдСсс дасссдСдса даадЫзСсЬд асдССддСаа сдссаСссСс 1020 да(зддСасдд а(здсса(зсаС дс(зд(зссддс дааасддсЫз ссддСдасСа СссддСадаа 1080 дсадЫздсса сдаСдаассд саЫздсасад сдсаСддааа дсСсссССда аСасааддаа 1140 сСсСабдСад аасдСддСсС дсадсасаСд дааСсссдСа сдсдСдсСаС сдсСсаСдсС 1200 асддССсада СддсССаСда дсСсдаСдсС ссддсСаЫза Ссасдссдас сдааСссддС 1260

Басасдасда аддСсдЫзСс саадСаСсдС ссдааддсСд сСаЬсдСадс ССасасдссд 1320 адсдааааад ЫзсСдсдСса дсЬдаассЬд сдЫзддддсд СаСаСссддС асСсддсасс 1380 садСддадсд аСдСддаСда ааСдаСсадс аабдсаасдд сСдсЬдсСдС Сааддаадас 1440 сСсдбасадс дсддсдассЬ сасса(зса(зс ассСссддСд (здаада(здда а(зсссд(засд 1500 сдСдсСаСсд с£са<зде<зас ддасаСсСаа СССТССТССС СССССТССТС ССааСсСада 1560

ТААТАСТСАТ СССССССССТ АСТАААСССТ САТТТСТСТТ САТАССТССТ ССТСССТТТС 1620

СССАСССССТ ТТТТТСТСТС ТСССАТТСТТ САССАТСССС САСТСТТТСС СТТТТССТСТ 1680

АСССССАТСА АТСССАТССС АСТСТССССТ СТССАССАСС ТТССАСТСАТ ТССТССТССС 1740

САСТТАССТТ ССАТССТССС АССАССАССС СААСАСТТСС ССАТСТСССТ ССАССТТСАА 1800

АСАСССААТС АТСАССАССС АССАСТАССС АТСССССАТС АААСССТАТТ АССАССАСТТ 1860

ССТСАСССдд ЫзсСсСсЫзс СдссдССа 1888

Последовательность № 52

Пример 52: сконструированный ДНК-конструкт пируватдекарбоксилазы под контролем тгА промотора (2188 по)

АСААААТСТС ССАССАСАСС сССсССдсад аасабдсаСд аСЫзасаааа адССдСадСС 60

Ьс(зд(з4засса аЫздсдааСс дадаасСдсс (зааСсСдссд адСаСаСдСТ ССАССАТаСд 120 дСаСсаассС асссадааСс ададдЫзасС сСаддааддС ассСсССЬда дсдасЬссас 180 сааССдааад СддасассаС ЫзСсддсССд ссддд(здас(з СсаассЫзЬс сССаЫзддас 240 ааадСдСаСд аадЫзссдда (заСдаддСдд дсСддаааЬд ссаасдааЫз дааЬдсСдсс 300

- 74 028407

РаРдсРдссд а£дд££с1сЪс садааРааад ддаЪЬдЪсЁЁ. дс££ддЬсас аасЬРРРддЬ 360 дЬРдд£даа£ РдРсЬдоЬМ: ааасддадъе ддрддрдсср аСдсРдааса сдЪаддасИ: 420 сРасаРдРсд РРддадКРсс аРссаРаРсд £сасаддсРа аасадРРдРР дсЬссассаР 480 ассЫздддЬа аРддЬдасРР сасЪдЫХРР сасадааЪдР ссааРадсаР РРсРсааасР 540 асадсаРРРс РсРсадаРаР сРсРаРРдса ссаддРсааа РадаРадаРд саРсададаа 600 дсаРаРдРРс аРсададасс адРРРаРдРР ддРРРассдд саааРаРддР РдаРсРсаад 660 дРРссРРсРа дРсРсРРада аасРссааРР даРРРдаааР Рдааасаааа РдаРссРдаа 720 дсРсаддаад аадРРдРРда аасадРссРд аадррддрдр сссаадсРас ааассссаРР 780 аРсРРддрад асдсРРдРдс ссРсадасас ааРРдсааад аддаадРсаа асааРРддРР 840 даРдссасРа аРРРРсаадР сРРРасаасР ссааРдддРа ааРсРддРаР сРссдааРсР 900 саРссаадаР РРддсддРдР сРаРдРсддд асаардрсда дРссРсаадР саааааадсс 960 дррдаааард ссдаРсРРаР асРаРсРдРР ддРРсдРРдР РаРсддасРР сааРасаддР 1020

РсаРРРРсаР асРссРасаа дасдаадааР дРРдРРдааР РссасРсрда сРаРаРдааа 1080 аРсадасадд ссассРРссс аддадРРсаа аРдааадаад ссРРдсааса дРРдаРаааа 1140 адддРсРсРР сРРасаРсаа РссаадсРас аРРссРасРс дадРРссРаа ааддааасад 1200 ссаРРдааад сРссаРсада адсРссРРРд асссаадааР аРРРдРддРс РааадРаРсс 1260 ддсРддРРРа дададддрда РаРРаРсдРа ассдааасРд дРасаРсРдс РРРсддааРР 1320 аРРсааРссс аРРРРсссад саасасРаРс ддРаРаРссс аадРсРРдРд дддсРсааРР 1380 ддрррсасад Раддрдсаас адррддрдср дссаРддсад сссаддаааР сдасссРадс 1440 аддададРаа РРРРдРРсдР сддрдарддр РсаРРдсадР РдасддРРса ддаааРсРсР 1500 асдРРдРдРа ааРдддаРРд РаасааРасР РаРсРРРасд РдРРдаасаа РдаРддРРас 1560 асРаРадааа ддРРдаРсса сддсаааадр дссадсРаса асдаРаРаса дссРРддаас 1620 саРРРаРссР РдсРРсдсРР аРРсааРдсР аадаааРасс ааааРдРсад адРаРсдасР 1680 дсРддадааР рддасРеРРР дРРсРсРдаР аадаааРРРд сРРсРссада РаддаРаада 1740 аРдаРРдадд РдаРдРРаРс дадаРРддаР дсассадсаа аРсРРдРРдс Рсаадсааад 1800

РРдРсРдаас дддРааассР РдааааРРда СССТССТОСС СССССТССТС СРааРсРада 1860

ТААТАСТСАТ СССССССССТ АСТАААСССТ САТТТСТСТТ САТАССТССТ ССТСССТТТС 1920

СССАСССССТ ТТТТТСТСТС ТСССАТТСТТ САССАТСССС САСТСТТТСС СТТТТССТСТ 1980

АСССССАТСА АТСССАТССС АСТСТССССТ СТССАССАСС ТТССАСТСАТ ТССТССТССС 2040

САСТТАССТТ ССАТССТССС АССАССАССС СААСАСТТСС ССАТСТСССТ ССАССТТСАА 2100

АСАСССААТС АТСАССАССС АССАСТАССС АТСССССАТС АААСССТАТТ АССАССАСТТ 2160

ССТСАСССдд РРсРсРсРРс рдссдрра 2188

Последовательность № 53

Пример 53: сконструированный ДНК-конструкт НАД(Ф)Н-зависимой алкогольдегидрогеназы под контролем тгА промотора (1510 по) адааааРсРд дсассасасс СТТСТТССАС ААСАТССАТС АТТТАСАААА АСТТОТАСТТ 60

ТСТСТТАССА АТТСС&^АТС САСААСТССС ТААТСТСССС АСТАТАТСРР адсРассРсР 120 дрдссадааа сссааааддд РдРРаРРРРс РаРдадааРд дРддРаааРР ддааРасаад 180 дасаРРссад РРссааадсс ааадссаааР даааРсРРда РсаасдРсаа дРасРссддР 240 дрдрдрсара ссдаРРздса сдсаРддаад ддрдасрддс саРРдссаас саадРРдсса 300

РРддРсддРд дРсасдаадд РдсРддРдРс дРРдРРдсРа рдддрдаааа сдрсаадддс 360

РддаасаРРд дРдасРБРдс дддРаРсааа РддРРдаасд дРРсРРдРаР дРссРдРдаа 420

ЬасРдРдааР РдРссааРда аРссаасРдР ссадаРдсРд асРРдРсРдд РРасасссас 480 даРддРРсРР РссаасааРа ссдРассдса даРдсРдбРс аадсрдссад ааррссааад 540 ддРассдаРР РддсРдаадР РдсРссаасс сРаРдРдссд дРдРРасРдР РРасааддсР 600

ЬРдаааадРд сРаасРЕдаа ддсРддРдас РдддРРдсса РсРсРддРдс РдсРддРддР 660 сРаддРРсРс РадсРдРсса аРасдссаад дссаРдддРР асададРсдР РддРаРсдас 720 ддрддрдаад аааадддРаа дРРддРсаад сааррдддрд дРдаадссРР РдРРдаРРРс 780 ассаааасса аддасаРддР РдсРдаааРс саадаааРса ссаасддрдд РссасасддР 840 дРсаРРаасд РсРсРдЬРРс РдаадсРдсс аРдаасдсРР ссасРсааРР сдрсадасса 900 асРддРасРд РсдРаРЕддР сддРРРдсса дсРддРдссд РсаРсаадРс сдаадРсРРс 960

ЬсссасдРсд РРаадРсРаР РаасаРсаад ддРРсРРасд РсддРаасад адсРдасасс 1020 ададаадсРа РсаасРЬсРР сдсРаасддР сасдРссасР сРссааРсаа ддРРдРРддР 1080

РРдРссдаас РассаааддР РРасдааРРд аРддаасаад дРаадаРРРР дддРадаРас 1140 дРРдРРдаса ссРссаасРа дСССТССТСС ССССССТССТ ССРааРадРд аРсссддссд 1200 сРасРааадс сРдаРРЬдРс РРдаРадсРд сРссРдссРР Ьдддсадддд сРРРРРРсРд 1260

ЬсРдссаРРс РРдаддаРдд сддасРсРРР сссРРРРдсР сРасдсссаР дааРдсдаРс 1320 дсадРсРссс сРдРссадса сдРРддадРд аРРддРддРд дссадРРадс РРддаРдсРд 1380 дсассадсад сдсаасадРР ддддаРдРсд сРдсасдРРс ааасасссаа РдаРсасдас 1440 ссадсадрад сдаРсдздда РсааассдРа РРадсадсад РРдсРдасдс ССТТСТСТСТ 1500

ТСТССССТТА 1510

Последовательность № 54

Пример 54: сконструированный выделенный транзитный пептид НусН (последовательность аминокислот):

М8АЬУЬКРСА АУ81КО88СК АКрУАРКАРЬ ААЗТУКУАЬА ТЬЕАРАККЬО NУАСАА

Последовательность № 55

Пример 55: сконструированные выделенные транзитные пептиды КЬс82 (последовательность аминокислот):

МААУ1АК88У 8ААУАКРАК8 8УКРМААЕКР АУКААРУААР Αζ>ΑΝ(2

Последовательность № 56

Пример 56: сконструированный выделенный транзитный пептид ферредоксина (последовательность аминокислот): МАМАМК8

Последовательность № 57

Пример 57: сконструированный выделенный транзитный пептид 8субъединицы СЕ₀Ср1 (последовательность аминокислот): ΜΕΑΑΚ8ΙΑΟΡ КАРКА8АУКА АРКАСККТУУ УМА

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм, выбранный из оксифотобактерий или водорослей, для фотобиологического получения бутанола, содержащий набор нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 1-26, 34-45, кодирующий сконструированный с помощью методов генной инженерии набор ферментов, которые превращают промежуточный продукт цикла Кальвина, выбранный из группы, включающей глицеральдегид-3-фосфат, 3фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат в бутанол; и индуцибельный промотор нитраредуктазы, функционально связанный с кодирующими последовательностями указанных ферментов.
2. 2. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД+-зависимой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНКконструкция имеет последовательность 8Еф ГО N0: 47.
3. 3. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ'оксидоредуктазы, тиолазы, 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоАдегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.
4. 4. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидные последовательности, выбранные из группы, состоящей из 8Еф ГО N0: 29-33, кодирующие набор сконструированных с помощью методов генной инженерии ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный набор содержит ферменты, выбранные из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их сочетания.
5. 5. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, выбранный из цианобактерий.
6. 6. Трансгенный фотосинтетический гидрофитный организм по п.1, дополнительно включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из 8Еф ГО N0: 54-57, кодирующую стромальный сигнальный пептид, функционально связанную с кодирующими последовательностями указанных ферментов.
7. 7. Способ фотобиологического продуцирования бутанола, согласно которому конструируют с помощью методов генной инженерии набор нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферменты, обеспечивающие превращение промежуточного продукта цикла Кальвина, выбранного из группы, включающей глицеральдегида-3-фосфат, 3-фосфоглицерат, фруктоза-1,6-дифосфат или фруктоза-6-фосфат, в бутанол с получением трансгенного фотосинтетического гидрофитного организма из оксифотобактерий и водорослей по п.1, который помещают в фотобиологический реактор для инициирования фотосинтетического расщепления воды и процесса транспорта электронов, сопряженного с протонным градиентом в фотобиологическом реакторе, для синтеза бутанола, и выделяют синтезированный бутанол из фотобиологического реактора.
8. 8. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм выбран из группы оксифотобактерий, включающей ТЬегтокупесЬососсик е1опда1и8 ВР-1, №81ос 8р. РСС 7120, 8упес1юсосси8 е1опда1и8 РСС 6301, 8упсесЬососси8 8р. штамм РСС 7942, 8упсесЬососси8 8р. штамм РСС 7002, 8упсесЬосу8118 8р. штамм РСС 6803, РгосЬ1огососси8 тагши8 МЕЭ4. РгосЬ1огососси8 тагши8 М1Т 9313, РгосЬ1огососси8 тагши8 NΑТ^1Α, РгосЬ1огососси8 88120, 8р1гиНпа р1а1еп818 (Аг1Ьго8рца р1а1еп818), 8р1ги1та расШса, ЬупдЬуа та|и8си1а, АпаЬаепа 8р., 8упесЬосу8Й8 8р., 8упесЬососси8 е1опда1е8, 8упесЬососси8 (МС-А), ТпсЬо0е8тй.1т 8р., КтсЬеНа т1гасе11и1ап8, 8упесЬососси8 \УН7803, 8упесЬососси8 \УН8102, №81ос рипсйГогте, 8упсесЬососси8 8р. штамм РСС 7943, дефицитный по фикоцианину мутант РИ-1 8упесйосу8118 РСС 6714, СуапоИесе штамм 51142, СуапоИесе 8р. СОУСИК), 08сН1аЮпа Пто8а, 8утр1оса ти8согит, О1оеоЬас1ег ую1асеи8, РгосЬ1огоп йШетт, РгосЫогоКтх Ьо11апФса, 8упесЬососси8 (МС-А), РгосЬ1огососси8 тагши8, 8упесЬососси8 Ыдгапи1а1и8, криофильную 08сН1а1опа 8р., РЬогтМшт 8р., №8Юс 8р.-1, Са1о1йп\ рапеКпа, термофильный 8упесЬососси8 Ь^д^аии1аΐи8, 8упесЬососси8 1ίνίάυ8, термофильный Ма8Йдос1айи8 1ат^ио8и8. СЬ1огод1оеор818 ГпЪсйй РСС 6912, 8упесЬососси8 уи1сапи8, 8упесЬососси8 8р. штамм МА4, 8упесЬососси8 8р. штамм МА19 и ТЬе^то8уиесЬососси8 е1опда1и8.
9. 9. Способ по п.7, где указанный трансгенный фотосинтетический организм дополнительно включает сконструированный ген протонного канала, контролируемый промотором №а1, который вставляет протонный канал в цитоплазматическую мембрану для блокирования клеточного деления и скрещивания.
10. 10. Способ по п.7, где указанный набор ферментов выбран из группы, состоящей из глицеральде- 76 028407 гид-3-фосфатдегидрогеназы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы, энолазы, пируваткиназы, пируват-ферредоксин-оксидоредуктазы, пируват-НАДФ+-оксидоредуктазы, тиолазы, 3 -гидроксибутирилКоА-дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, бутиральдегиддегидрогеназы и бутанолдегидрогеназы.
11. 11. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм включает ДНК-конструкцию, кодирующую по меньшей мере один фермент, выбранный из НАД+-зависимой глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы, НАДФН-фосфатазы и НАД-киназы, который способствует НАДФН/НАДН превращению для усиленного фотобиологического продуцирования бутанола, где ДНК-конструкция имеет последовательность 8Ер ГО ЫО: 47.
12. 12. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют для инактивации активности синтеза крахмала посредством ввода ДНК-конструкции, которая кодирует и индуцибельно экспрессирует молекулу интерферирующей РНК (иРНК), которая специфически ингибирует синтез фермента пути синтеза крахмала, где ДНК-конструкция выбрана из группы, состоящей из ДНК-конструкций 8Ер ГО ЫО: 27 и 8Ер ГО ЫО: 28.
13. 13. Способ по п.7, где трансгенный фотосинтетический организм модифицируют путем включения дополнительного набора сконструированных генов, выбранных из группы, состоящей из 8Ер ГО ЫО: 2933, для индуцибельной экспрессии дополнительного набора сконструированных ферментов, которые способствуют расщеплению крахмала и гликолизу в стромальной области хлоропласта, где указанный дополнительный набор сконструированных ферментов включает по меньшей мере один из ферментов, выбранных из группы, включающей амилазу, крахмалфосфорилазу, гексокиназу, фосфоглюкомутазу, глюкозофосфатизомеразу, фосфофруктокиназу, альдолазу, триозофосфатизомеразу, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназу, фосфоглицераткиназу, фосфоглицератмутазу, энолазу, пируваткиназу и их соче-