ES2612749T3

ES2612749T3 - Organismos de diseño para la producción fotobiológica de butanol a partir de dióxido de carbono y agua

Info

Publication number: ES2612749T3
Application number: ES09712906.8T
Authority: ES
Inventors: James Weifu Lee
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-02-23
Filing date: 2009-02-21
Publication date: 2017-05-18
Anticipated expiration: 2029-02-21
Also published as: EP2250276B1; EA028407B1; US8735651B2; DK2250276T3; HK1145092A1; HUE031394T2; MY180599A; EA201070990A1; CN102124118A; WO2009105733A9; AU2009217293A1; EP2250276A4; PL2250276T3; US20100330637A1; AU2009217293B2; CN107529553A; US10519471B2; US20140212941A1; US9695448B2; EP2250276A2

Abstract

Un método para la producción fotosintética de butanol que comprende cultivar un alga transgénica de diseño en un medio líquido, en el que el alga está genéticamente modificada para que exprese un conjunto de enzimas que actúan sobre un producto intermedio del ciclo de Calvin y convierten el producto intermedio en butanol; en el que dicho conjunto de enzimas consiste en fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvatoferredoxina oxidorreductasa (o piruvato-NADP+ oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehído deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa; en el que dichas butiraldehído deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa pueden utilizar el NADPH, que es suministrado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido; en el que los nucleótidos que codifican dicho conjunto de enzimas se modifican genéticamente de modo que las enzimas expresadas se inserten en los cloroplastos del organismo fotosintético hospedante, dirigidas por un péptido señal estromático; y recuperar el butanol a partir de dicho medio líquido.

Description

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DESCRIPCION

Organismos de diseno para la produccion fotobiologica de butanol a partir de dioxido de carbono y agua Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, en general, a la tecnologfa de produccion de energfa de biocombustibles con proteccion de bioseguridad. De modo mas espedfico, la presente invencion proporciona una metodologfa de produccion fotobiologica de butanol basada en plantas transgenicas de diseno, tales como algas transgenicas, algas verdeazuladas (cianobacterias y oxiclorobacterias) o celulas vegetales que se crean para emplear el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) adquiridos del proceso fotosintetico para la smtesis inmediata de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) directamente a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O).

Antecedentes de la invencion

El butanol (CH3CH2CH2CH2OH), un alcohol de cuatro carbonos, puede emplearse como combustible lfquido para hacer funcionar motores, tales como coches. El butanol puede sustituir a la gasolina, y el contenido en energfa de ambos combustibles es casi el mismo (110.000 Btu por galon (3,78 litros) para el butanol; 115.000 Btu por galon (3,78 litros) para la gasolina). Ademas, el butanol tiene propiedades mucho mejores como combustible alternativo cuando se compara con el etanol. Estas incluyen: 1) el butanol tiene un mayor contenido energetico (110.000 Btu por galon (3,78 litros) de butanol) que el etanol (84.000 Btu por galon (3,78 litros) de etanol); 2) el butanol es seis veces menos “evaporable” que el etanol y 13,5 veces menos evaporable que la gasolina, haciendo mas segura su utilizacion en forma de un oxigenado y eliminando, con ello, la necesidad de mezclas muy especiales durante el verano y el invierno; 3) el butanol puede transportarse a traves de la infraestructura de combustibles existentes, que incluye los oleoductos, mientras que el etanol debe transportarse a traves de ferrocarril, barcazas o camiones; y 4) el butanol puede emplearse como sustituto de la gasolina litro a litro, por ejemplo, 100% o cualquier otro porcentaje, mientras que el etanol solo puede utilizarse como aditivo para la gasolina hasta aproximadamente 85% (E-85) y, en este caso, solo despues de una modificacion significativa del motor (mientras que el butanol puede servir al 100% como sustituto de combustible sin tener que modificar el motor del coche concreto).

Ya existe un significativo potencial de mercado para el butanol como combustible lfquido en los actuales sistemas de transporte y energfa. El butanol tambien se emplea como disolvente industrial. En los EEUU, en la actualidad, el butanol se produce principalmente a partir del petroleo. Historicamente (1900-1950), el biobutanol ha sido fabricado a partir de mafz y melazas en un proceso de fermentacion que tambien produce acetona y etanol y que se ha denominado una fermentacion ABE (acetona, butanol, etanol), realizada generalmente con ciertas bacterias productoras de butanol, tales como Clostridium acetobutylicum y Clostridium beijerinckii. Sin embargo, cuando EEUU perdio su suministro barato de azucar desde Cuba, aproximadamente en 1954, la produccion de butanol mediante fermentacion disminuyo principalmente debido a que el precio del petroleo bajo por debajo de el del azucar. En fechas recientes, existe un renovado interes en I+D para producir butanol y/o etanol a partir de biomasa, tal como almidon de mafz, empleando procesos de fermentacion con Clostridium y/o levaduras. Sin embargo, de modo similar a la situacion de la “produccion de etanol a partir de almidon de mafz,” el proceso de “produccion de butanol a partir de almidon de mafz” tambien requiere una serie de etapas que consumen energfa, que incluyen el cultivo de mafz agncola, la recoleccion del grano de mafz, el procesamiento del almidon del grano de mafz, y la fermentacion del almidon al azucar al butanol. Es probable que el proceso de “produccion de butanol a partir de almidon de mafz” gaste casi tanta energfa como el valor energetico de su producto, el butanol. Esto no resulta sorprendente, porque el almidon de mafz que puede emplear la tecnologfa actual representa solo una pequena fraccion de la biomasa del cultivo de mafz, que incluye los tallos, las hojas y las rafces del mafz. Normalmente, los tallos del mafz se dejan en los campos agncolas, en donde se descomponen lentamente para producir de nuevo CO2, debido a que representan materiales de biomasa en gran medida lignocelulosicos que la industria de biorrefinena actual no puede emplear de modo eficaz para la produccion de etanol o butanol. Se esta investigando la produccion de etanol o butanol a partir de materiales de biomasa vegetal lignocelulosicos, un concepto denominado “etanol celulosico” o “butanol celulosico”. Sin embargo, la biomasa vegetal ha desarrollado mecanismos eficaces para resistir el asalto a sus azucares estructurales de la pared celular por parte de organismos del reino microbiano y animal. Esta propiedad supone un recalcitrancia natural que crea barreras a la transformacion barata de biomasa lignocelulosica en azucares fermentables. Por tanto, uno de los problemas conocidos como “recalcitrancia lignocelulosica” representa una tremenda barrera tecnica para la conversion barata de biomasa vegetal en azucares fermentables. Es decir, debido al problema de la recalcitrancia, las biomasas lignocelulosicas (tales como tallos de mafz, pasto varilla y materiales vegetales lenosos) no pueden convertirse con facilidad en azucares fermentables para fabricar etanol o butanol sin cierto pretratamiento, que a menudo esta asociado con un alto coste de procesamiento. A pesar de mas de 50 anos de trabajos de I+D sobre el pretratamiento de biomasa lignocelulosica y el procesamiento para la produccion butanol fermentativa, el problema de la recalcitrancia lignocelulosica sigue siendo una tremenda barrera tecnica que aun no ha sido eliminada. Ademas, las etapas de cultivo de biomasa lignocelulosica, recoleccion, procesamiento del pretratamiento y fermentacion de la celulosa a azucar a butanol gastan energfa. Por tanto, cualquier nueva tecnologfa que pudiera sortear estos problemas de cuello de botella de la tecnologfa de la biomasa sena util.

Las oxifotobacterias (tambien conocidas como algas verdeazuladas, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias)

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y las algas (tales como Chlamydomonas reinhardtii, Platymonas subcordiformis, Chlorella fusca, Dunaliella salina, Ankistrodesmus braunii, y Scenedesmus obliquus), que pueden realizar la asimilacion fotosintetica del CO2 con emision de O2 a partir del agua en un medio de cultivo lfquido con una conversion de ene^a solar en biomasa teorica maxima de aproximadamente 10% presentan un potencial tremendo para convertirse en un recurso energetico limpio y renovable. Sin embargo, las plantas verdes fotosinteticas oxigenicas de tipo salvaje, tales como las algas verdeazuladas y las algas eucariotas, no poseen la capacidad de producir butanol directamente a partir de CO2 y H2O. La fotosmtesis de tipo salvaje emplea el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) procedentes de la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones a traves del sistema de membranas tilacoides de las algas para reducir el CO2 a carbohidratos (CH2O)n, tales como almidon, con una serie de enzimas denominadas colectivamente el “ciclo de Calvin” en la region estromatica del cloroplasto de las algas o las plantas verdes. El resultado neto del proceso fotosintetico de tipo salvaje es la conversion de CO2 y H2O en carbohidrato (CH2O)n y O2 empleando la energfa del sol segun el siguiente proceso de reaccion:

nCO2 + nH2O ^ (CH2O)n + nO2 [1]

Despues los carbohidratos (CH2O)n se convierten en muchos tipos de materiales celulares complejos (biomasa), que incluyen protemas, lfpidos y celulosa y otros materiales de la pared celular durante el metabolismo y el crecimiento de la celula.

En ciertas algas, tales como Chlamydomonas reinhardtii, algunas reservas organicas, tales como el almidon, pueden ser metabolizadas lentamente para producir etanol (pero no butanol) a traves de una via metabolica fermentativa secundaria. La via metabolica fermentativa de las algas es similar al proceso de fermentacion de levaduras, mediante el cual el almidon se degrada en azucares mas pequenos, tales como glucosa, que, a su vez, se transforman en piruvato por medio de un proceso de glicolisis. El piruvato despues puede convertirse en formiato, acetato y etanol por medio de una serie de etapas metabolicas adicionales (Gfeller y Gibbs (1984), “Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii,” Plant Physiol., 75:212-218). La eficacia de este proceso metabolico secundario es bastante limitada, probablemente debido a que solo puede utilizar una pequena fraccion de la reserva organica limitada, tal como el almidon en una celula de alga. Ademas, el proceso metabolico secundario de algas nativo no puede producir butanol.

El documento US 20020042111 describe una cianobacteria geneticamente modificada que presenta una construccion que comprende fragmentos de ADN que codifican las enzimas piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adh) obtenidas de Zymomonas mobilis plasmido pLO1295. Las cianobacterias son capaces de producir etanol en cantidades recuperables de al menos 1,7 |imol de etanol por mg de clorofila por hora.

Tal como se mencion anteriormente, el butanol presenta muchas mejores propiedades ffsicas para servir como sustituto de la gasolina como combustible. Por tanto, es necesario un nuevo mecanismo de produccion fotobiologica de butanol con una alta eficacia de energfa solar a butanol.

La presente invencion proporciona unos revolucionarios organismos fotosinteticos de diseno, que son capaces de sintetizar directamente butanol a partir de CO2 y H2O empleando la luz solar. El sistema de produccion fotobiologica de butanol proporcionado por la presente invencion puede sortear todos los problemas de cuello de botella de la tecnologfa de la biomasa mencionados anteriormente.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de produccion fotobiologica de butanol basados en plantas transgenicas de diseno (tales como algas y oxifotobacterias) o celulas vegetales. Los organismos fotosinteticos de diseno se crean mediante ingeniena genetica, de modo que se domestica el mecanismo de regulacion de la fotosmtesis endogeno, y el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) adquiridos de la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones se utilizan para la smtesis de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) directamente a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O). Los metodos de produccion fotobiologica de butanol de la presente invencion eliminan completamente el problema de la recalcitrancia lignocelulosica sorteando el problema de cuello de botella de la tecnologfa de la biomasa. Se espera que la tecnologfa de produccion fotosintetica de butanol de la presente invencion tenga una eficacia de conversion de energfa solar a butanol mucho mayor que la tecnologfa actual.

Una caractenstica fundamental de la presente metodologfa de produccion fotosintetica de butanol es crear plantas de diseno (tales como algas) o celulas vegetales que contengan transgenes que codifican un conjunto de enzimas que pueden actuar sobre un producto intermedio del ciclo de Calvin y convertir el producto intermedio inmediatamente en butanol, en lugar de producir almidon y otros materiales complejos de la biomasa. Por consiguiente, la presente invencion proporciona, entre otras cuestiones, metodos para producir butanol basados en una planta o celulas vegetales de diseno, construcciones de ADN que codifican genes de una via de produccion de butanol de diseno, asf como las plantas de diseno y las celulas vegetales de diseno creadas.

En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para la produccion fotosintetica de butanol mediante el cultivo de una planta (tal como un alga de diseno o un alga verdeazulada de diseno) o celulas vegetales de diseno

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en un medio de cultivo Ifquido, en el que la planta o las celulas vegetales se modifican geneticamente para que expresen un conjunto de enzimas que actuan sobre un producto intermedio del ciclo de Calvin y convierten el producto intermedio en butanol.

Segun la presente invencion, una planta de diseno, tal como un alga de diseno o una celula vegetal de diseno para su uso en la produccion fotosintetica de butanol, puede crearse empleando fundamentalmente cualquier planta, tejido vegetal o celula vegetal como hospedante, con la condicion de que dicha planta, tejido vegetal y celula vegetal tenga capacidad fotosintetica y pueda cultivarse en un medio lfquido. En una realizacion preferida, se emplea una planta acuatica (hidrofitos) para crear una planta de diseno, que incluyen, pero no se limitan a hierbas acuaticas sumergidas (tales como Hydrilla verticillata, Elodea densa, Aponogeton boivinianus, Hygrophila difformmis), lentejas de agua (tales como Spirodela polyrrhiza, Wolffia globosa, Landoltia punctata), lechugilla de agua (Pistia stratiotes), ranunculos (Ranunculus), castana de agua (Trapa natans y Trapa bicornis), lirios de agua (tales como Nymphaea lotus), jacintos de agua (Eichhornia crassipes), praderas marinas (tales como Heteranthera zosterifolia), y algas.

En una realizacion especialmente preferida, se emplean algas como hospedantes para crear algas de diseno para la produccion fotosintetica de butanol. Las algas adecuadas para su uso en la presente invencion pueden ser algas unicelulares o multicelulares (estas ultimas incluyen, pero no se limitan a algas marinas, tales como Ulva latissima (lechuga de mar), Ascophyllum nodosum, y Porphyra tenera), e incluyen algas verdes (Chlorophyta), algas rojas (Rhodophyta), algas marrones (Phaeophyta), diatomeas (Bacillariophyta), y algas verdeazuladas (Oxyphotobacteria que incluye Cyanophyta (cianobacterias) y Prochlorophytes (oxiclorobacterias)). Tanto las algas verdeazuladas procariotas (oxifotobacterias) como las algas eucariotas son muy adecuadas para su uso en esta invencion. Una especie particularmente preferida de algas para su uso en la presente invencion es una especie de alga verde, Chlamydomonas reinhardtii, cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado.

La seleccion de las enzimas apropiadas para su uso para crear una via de produccion de butanol de diseno en un hospedante depende del producto intermedio del ciclo de Calvin del cual se bifurca la via de diseno a partir del ciclo de Calvin. En una realizacion, la via de diseno se bifurca desde el punto de la gliceraldehndo-3-fosfatasa y la convierte en butanol empleando, por ejemplo, un conjunto de enzimas que consiste en gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (o piruvato-NADP+ oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril- CoA deshidrogenasa, butiraldehudo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa. En esta via de diseno, para la conversion de dos moleculas de gliceraldehndo-3-fosfato en butanol, se generan dos moleculas de NADH a partir de NAD+ en la etapa desde el gliceraldehndo-3-fosfato hasta el 1,3-difosfoglicerato catalizada por la gliceraldehndo-3- fosfato deshidrogenasa; mientras, dos moleculas de NADH son convertidas en NAD+: una en la etapa catalizada por la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa para reducir la acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, y la otra en la etapa catalizada por la butiril-CoA deshidrogenasa para reducir la crotonil-CoA a butiril-CoA. Por consiguiente, en esta via de diseno, el numero de moleculas de NADH consumidas se equilibra con el numero de moleculas de NADH generadas. Ademas, tanto la etapa catalizada por la butiraldehudo deshidrogenasa para reducir la butiril-CoA a butiraldehudo como la etapa terminal catalizada por la butanol deshidrogenasa para reducir el butiraldehudo a butanol pueden utilizar NADPH, que puede ser regenerado por la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones. Por tanto, esta via de produccion de butanol de diseno puede funcionar de modo continuo.

En otro ejemplo, se crea una via de diseno que parte del producto intermedio 3-fosfoglicerato y lo convierte en butanol empleando, por ejemplo, un conjunto de enzimas que consiste en fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa, tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehudo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa. Para que esta via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato pueda funcionar, es importante utilizar una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y una butiril-CoA deshidrogenasa que puedan emplear NADPH, que puede ser suministrado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido. Como alternativa, cuando se emplea una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y una butiril-CoA deshidrogenasa que solo pueden emplear NADH, en este caso es preferible emplear otra realizacion que pueda conferir un mecanismo de conversion de NADPH/NADH para suministrar el NADH, convirtiendo NADPH en NADH para facilitar la produccion fotosintetica de butanol a traves de la via que se bifurca del 3-fosfoglicerato de diseno.

En otro ejemplo, se crea una via de diseno que parte de la fructosa-1,6-difosfato y la convierte en butanol empleando, por ejemplo, un conjunto de enzimas que consiste en aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceraldehudo- 3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato-NADP+ oxidorreductasa (o piruvato-ferredoxina oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehudo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa. La adicion de otra enzima mas al organismo de diseno, la fosfofructosa quinasa, permite la creacion otra via de diseno que se bifurca desde el punto de la fructosa-6-fosfato para la produccion de butanol. Al igual que la via de produccion de butanol que se bifurca desde el gliceraldehndo-3-fosfato, tanto la via que se bifurca desde la fructosa-1,6-difosfato como la via que se bifurca desde la fructosa-6-fosfato pueden generar NADH para su uso en la via en la etapa catalizada por la 3- hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa para reducir la acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, y tambien en la etapa catalizada por la butiril-CoA deshidrogenasa para reducir la crotonil-CoA a butiril-CoA. En cada una de estas vfas de produccion de butanol de diseno, el numero de moleculas de NADH consumidas se equilibra con el numero de

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moleculas de NADH generadas; y tanto la butiraldetudo deshidrogenasa (que cataliza la etapa que reduce la butiril- CoA a butiraldetudo) como la butanol deshidrogenasa (que cataliza la etapa terminal para reducir el butiraldetudo a butanol) pueden utilizar NADPH, que puede ser regenerado por la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones. Por tanto, estas vfas de produccion de butanol de diseno pueden funcionar de modo continuo. Puede advertirse que ciertos conjuntos de enzimas de diseno permiten dos o mas vfas de diseno, es decir, vfas que se bifurcan desde dos o mas puntos del ciclo de Calvin para la produccion de butanol.

Segun la presente invencion, los acidos nucleicos que codifican estas enzimas se modifican geneticamente de modo que las enzimas expresadas se insertan en los cloroplastos del hospedante para lograr alcanzar una localizacion celular diana. La insercion dirigida de las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno puede lograrse mediante el uso de una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido “senal” estromatico, que esta dispuesto en un enlace operable con la secuencia de nucleotidos que codifica una enzima de diseno. Son adecuadas una serie de secuencias de peptidos de transito para su uso en la insercion dirigida de las enzimas de produccion de butanol de diseno en el cloroplasto, que incluyen, pero no se limitan a las secuencias de peptidos de transito de las apoprotemas de hidrogenasa (tales como Hyd1), la apoprotema de ferredoxina (Frx1), la apoprotema m de tiorredoxina (Trx2), la apoprotema de glutamina sintasa (Gs2), las apoprotemas de LhcII, la apoprotema de PSII-T (PsbT), la apoprotema de PSII-S (PsbS), la apoprotema de PSII-W (PsbW), la apoprotema de la subunidad y de CF0CF1 (AtpC), la apoprotema de la subunidad 8 de CF0CF1 (AtpD), la apoprotema de la subunidad II de CFoCFi (AtpG), las apoprotemas del fotosistema I (PSI) (tales como de los genes PsaD, PsaE, PsaF, PsaG, PsaH, y PsaK), y las apoprotemas de la subunidad pequena (SSU) de rubisco (tal como RbcS2). Las secuencias de peptidos de transito preferidas incluyen el peptido de transito Hyd1, el peptido de transito Frx1, y los peptidos de transito de SSU de rubisco (tal como RbcS2).

Tambien segun la presente invencion, la expresion de la via de produccion de butanol de diseno se controla a traves del uso de un promotor externamente inducible, de modo que los transgenes de diseno son expresados de modo inducible bajo ciertas condiciones espedficas. En una realizacion, el promotor inducible empleado para controlar la expresion de los genes de diseno es un promotor que es inducible por anaerobiosis, que incluye, por ejemplo, los promotores del gen de hidrolasa (Hyd1), el gen Cyc6 que codifica la apoprotema del citocromo Ca, y el gen Cpx1 que codifica la coprogeno oxidasa. Otros promotores inducibles para su uso en la presente invencion incluyen el promotor de la nitrato reductasa (Nia1), el promotor de la protema de choque termico HSP70A, el promotor de CabII- 1, el promotor de Ca1, el promotor de Ca2, los promotores de la nitrito reductasa (nirA), los promotores hox del gen de hidrogenasa bidireccional, los promotores groE que responden a la luz y al calor, los promotores rbcL del operon de rubisco, el promotor smt inducible por metales (cinc), el promotor idiA que responde al hierro, el promotor crhR que responde a redox, el promotor hsp16.6 del gen de choque termico, el promotor de la protema del choque termico pequena (Hsp), los promotores del gen de anhidrasa carbonica que responden a CO2, el promotor cpcB2A2 que responde a la luz verde/roja, los promotores lexA, recA y ruvB que responden a la luz UV, los promotores del gen de la nitrato reductasa (narB), y sus combinaciones.

En otro aspecto de la presente invencion se proporcionan construcciones de ADN de diseno, que contienen una o mas secuencias de nucleotidos que codifican una o mas enzimas de la via de produccion de butanol de diseno, cada una de las cuales esta colocada en enlace operable con un promotor inducible y con una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido de transito que se dirige al cloroplasto. Las construcciones pueden contener otras secuencias apropiadas, tales como un gen marcador de seleccion para facilitar la seleccion e identificacion de los transformantes. Las construcciones de acidos nucleicos que portan genes de diseno pueden introducirse en un alga, organismo vegetal o tejido o celulas vegetales hospedantes empleando las tecnicas de transformacion de genes disponibles, tales como electroporacion, transformacion natural, conjugacion, captacion inducida por PEG, y transporte balfstico de ADN, y transformacion mediada por Agrobacterium.

Las plantas de diseno (por ejemplo, algas de diseno), los tejidos vegetales de diseno y las celulas vegetales de diseno que han sido creados para contener una o mas construcciones de diseno forman otra realizacion de la presente invencion. En otro aspecto, la presente invencion proporciona otros metodos para la produccion fotosintetica potenciada de butanol, las construcciones de diseno relacionadas, y plantas, tejidos y celulas vegetales de diseno.

En una realizacion espedfica, una planta de diseno (por ejemplo, un alga de diseno), un tejido o una celula o celulas vegetales de diseno que producen butanol de modo fotosintetico, tal como se describio anteriormente, se han modificado aun mas para que contengan transgenes de diseno para expresar, de modo inducible, una o mas enzimas para facilitar la conversion de NADPH/NADH, tal como la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+, la NADPH fosfatasa y la NAD quinasa. Como alternativa, la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, la butiril-CoA deshidrogenasa, la butiraldehfdo deshidrogenasa y la butanol deshidrogenasa de la planta, tejido, celula o celulas vegetales de diseno puede seleccionarse y modificarse de modo que tambien pueda utilizar NADPH.

En otra realizacion, una planta, un tejido o una celula o celulas vegetales de diseno que producen butanol de modo fotosintetico se han modificado aun mas para inactivar la actividad de smtesis de almidon. En una realizacion espedfica, dicha modificacion adicional incluye la introduccion de una construccion de ADN de diseno que codifica y

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expresa de modo inducible una molecula de ARN de interferencia (ARNi) que inhibe espedficamente la smtesis de una enzima de la via de smtesis del almidon, por ejemplo, almidon sintasa, glucosa-1-fosfato adenililtransferasa, glucosa fosfato isomerasa y/o fosfoglucomutasa para la produccion fotobiologica potenciada de butanol.

En otra realizacion, una planta, un tejido o una celula o celulas vegetales de diseno que producen butanol de modo fotosintetico se han modificado aun mas para que contengan otro conjunto de genes de diseno que facilitan la degradacion del almidon y la glicolisis en el estroma. Estos genes de diseno adicionales incluyen, por ejemplo, genes que codifican la amilasa, la almidon fosforilasa, la hexoquinasa, la fosfoglucomutasa, y la glucosa fosfato isomerasa.

En otra realizacion, una via o vfas de produccion fotobiologica de butanol se distribuyen en partes en el cloroplasto y en el citoplasma. La distribucion de las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno entre el cloroplasto y el citoplasma se controla mediante el uso y/o la delecion de las secuencias de peptidos de transito en las construcciones de ADN de diseno.

En otra realizacion, una via o vfas de produccion fotobiologica de butanol se distribuyen totalmente en el citoplasma, como es el caso de las oxifotobacterias (algas verdeazuladas) de diseno, que incluyen cianobacterias de diseno y oxiclorobacterias de diseno.

Esta invencion tambien proporciona una tecnologfa de produccion fotobiologica de butanol con proteccion de bioseguridad basada en plantas transgenicas, algas, algas verdeazuladas (cianobacterias y oxiclorobacterias) o celulas vegetales transgenicas de diseno controlables por medio de la division celular. Los organismos fotosinteticos de diseno controlables por medio de la division celular contienen dos funciones clave: un mecanismo o mecanismos de bioseguridad de diseno y una via o vfas de produccion de biocombustible de diseno. La caractenstica o caractensticas de bioseguridad de diseno son conferidas por una serie de mecanismos que incluyen: (1) la insercion inducible de canales de protones de diseno en la membrana citoplasmica para inutilizar permanentemente cualquier capacidad de division celular y/o apareamiento, (2) la aplicacion selectiva de una protema reguladora del ciclo de division celular de diseno o aRn de interferencia (ARNi) para inhibir permanentemente el ciclo de division celular y preferiblemente mantener la celula en la fase Gi o el estado Go, y (3) el uso innovador de un organismo fotosintetico hospedante que requiere una alta cantidad de CO2 para la expresion de la via o vfas de produccion de biocombustible de diseno. La tecnologfa de control de la division celular de diseno puede ayudar a asegurar la bioseguridad cuando se emplean los organismos de diseno para la produccion fotosintetica de biocombustible.

La presente invencion proporciona ademas un proceso para utilizar un organismo fotosintetico de diseno (tal como una cianobacteria o alga de diseno), en combinacion con un sistema de reactor fotobiologico y un proceso de separacion/recoleccion de butanol para la produccion fotobiologica de butanol y O2 directamente a partir de CO2 y H2O empleando la luz solar. Pueden emplearse fuentes industriales de CO2 y/o CO2 atmosferico del entorno en el proceso de produccion fotobiologica de butanol.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 presenta vfas de produccion de butanol de diseno que se bifurcan del ciclo de Calvin que emplean el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) adquiridos de la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones para reducir el dioxido de carbono (CO2) a butanol CH3CH2CH2CH2OH con una serie de reacciones enzimaticas.

La figura 2A presenta una construccion de ADN para un gen o genes de la via de produccion de butanol de diseno.

La figura 2B presenta una construccion de ADN para un gen de diseno de conversion de NADPH/NADH para la interconversion de NADPH/NADH.

La figura 2C presenta una construccion de ADN para un gen de un inhibidor o inhibidores de la smtesis de ARNi del glucogeno/almidon de diseno.

La figura 2D presenta una construccion de ADN para un gen o genes de la glicolisis de degradacion del almidon de diseno.

La figura 2E presenta una construccion de ADN para un gen o genes de la via de produccion de butanol de diseno para la expresion citosolica.

La figura 2F presenta una construccion de ADN para un gen o genes de la via de produccion de butanol de diseno con dos sitios de recombinacion para la transformacion genetica integradora en oxifotobacterias.

La figura 2G presenta una construccion de ADN para un gen o genes de control de la bioseguridad de diseno.

La figura 2H presenta una construccion de ADN para un gen o genes del canal de protones de diseno.

La figura 3A ilustra un organismo de diseno controlable por medio de la division celular que contiene dos funciones clave: un mecanismo o mecanismos de bioseguridad de diseno y una via o vfas de produccion de biocombustible de

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diseno.

La figura 3B ilustra un organismo de diseno controlable por medio de la division celular para la produccion fotobiologica de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O) con un mecanismo o mecanismos de bioseguridad de diseno.

La figura 3C ilustra un organismo de diseno controlable por medio de la division celular para la produccion fotobiologica con proteccion de bioseguridad de otros biocombustibles, tales como etanol (CH3CH2OH) a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se dirige a una tecnologfa de produccion fotobiologica de butanol basada en organismos fotosinteticos de diseno, tales como plantas, algas y oxifotobacterias o celulas vegetales transgenicas de diseno. Las plantas, algas y celulas vegetales de diseno se crean empleando tecnicas de ingeniena genetica, de modo que se domestica el mecanismo de regulacion de la fotosmtesis endogeno, y el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) adquiridos de la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones pueden utilizarse para la smtesis inmediata de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) directamente a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O) segun el siguiente proceso de reaccion:

4CO2 + 5H2O ^ CH3CH2CH2CH2OH + 6O2 [2]

Los metodos de produccion fotobiologica de butanol de la presente invencion eliminan completamente el problema de la recalcitrancia lignocelulosica sorteando el problema de cuello de botella de la tecnologfa de la biomasa. Tal como se muestra en la figura 1, el proceso fotosintetico en un organismo de diseno emplea de modo eficaz el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP) adquiridos de la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones para la smtesis inmediata de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) directamente a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O) sin drenaje hacia otra via para la smtesis de materiales lignocelulosicos no deseados que son muy duros y, a menudo, ineficaces para su uso por la industria de las biorrefinenas. Esta estrategia tambien es diferente del proceso de “produccion de butanol a partir del almidon de mafz” existente. Segun esta invencion, puede producirse directamente butanol a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O) sin tener que atravesar muchas etapas consumidoras de energfa, etapas que debe atravesar el proceso de produccion etanol a partir de almidon de mafz, que incluyen el cultivo de mafz, la recoleccion del grano de mafz, el procesamiento del almidon del grano de mafz, y la fermentacion del almidon al azucar al butanol. Como resultado, se espera que la tecnologfa de produccion fotosintetica de butanol de la presente invencion tenga una eficacia de conversion de energfa solar a butanol mucho mayor (mas de 10 veces mayor) que la tecnologfa actual. Suponiendo una eficacia de conversion de energfa solar del 10% para el proceso de produccion fotosintetica de butanol propuesto, la maxima productividad teorica (rendimiento) puede ser de aproximadamente 72.700 kg de butanol por acre (4046,86 m2) por ano, lo cual puede mantener a aproximadamente 70 coches (por ano por acre (4046,86 m2)). Por tanto, esta invencion puede ofrecer a la sociedad una capacidad significativa que ayude a asegurar la seguridad energetica. La presente invencion tambien puede ayudar a proteger el entorno del planeta frente a la acumulacion peligrosa de CO2 en la atmosfera, ya que los presentes metodos convierten el CO2 directamente en energfa de butanol limpia.

Una caractenstica fundamental de la presente metodologfa es la utilizacion de una planta (por ejemplo, un alga o una oxifotobacteria) o celulas vegetales, la introduccion en la planta o las celulas vegetales de moleculas de acidos nucleicos que codifican un conjunto de enzimas que pueden actuar sobre un producto intermedio del ciclo de Calvin, y convertir el producto intermedio inmediatamente en butanol, tal como se ilustra en la figura 1, en lugar de que la via fotosintetica de tipo salvaje produzca, como productos finales, almidon y otros materiales celulares complejos (biomasa). Por consiguiente, la presente invencion proporciona, entre otras cuestiones, metodos para producir butanol basados en una planta de diseno (tal como un alga de diseno o una oxifotobacteria de diseno), un tejido vegetal de diseno o celulas vegetales de diseno, construcciones de ADN que codifican genes de una via de produccion de butanol de diseno, asf como las algas de diseno, las oxifotobacterias de diseno (que incluyen cianobacterias de diseno), las plantas de diseno, los tejidos vegetales de diseno, y las celulas vegetales de diseno creadas. Los diversos aspectos de la presente invencion se describen con mas detalle a continuacion.

Organismos fotosinteticos hospedantes

Segun la presente invencion, puede crearse un organismo o celula de diseno para la produccion fotosintetica de butanol de la invencion empleando como hospedante cualquier planta (que incluye algas y oxifotobacterias), tejido vegetal o celulas vegetales que tengan capacidad fotosintetica, es decir, un aparato fotosintetico activo y una via enzimatica que capture la energfa de la luz a traves de la fotosmtesis, empleando esta energfa para convertir sustancias inorganicas en materia organica. Preferiblemente, el organismo hospedante debe tener una tasa de fijacion fotosintetica de CO2 adecuada, por ejemplo, para mantener la produccion fotosintetica de butanol a partir de CO2 y H2O al menos a aproximadamente 1.450 kg de butanol por acre (4046,86 m2) por ano, mas preferiblemente a 7.270 kg de butanol por acre (4046,86 m2) por ano, o aun mas preferiblemente a 72.700 kg de butanol por acre (4046,86 m2) por ano.

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En una realizacion preferida, se utiliza una planta acuatica para crear una planta de diseno. Las plantas acuaticas, tambien denominadas plantas hidrofitas, son plantas que viven en entornos acuaticos o sobre entornos acuaticos, tales como en el agua (que incluye sobre o debajo de la superficie del agua) o en un terreno permanentemente saturado. Tal como se emplea en la presente, las plantas acuaticas o algas incluyen, por ejemplo, algas verdeazuladas (cianobacterias y oxiclorobacterias), hierbas acuaticas sumergidas (Hydrilla verticillata, Elodea densa, Hippuris vulgaris, Aponogeton boivinianus, Aponogeton rigidifolius, Aponogeton longiplumulosus, Didiplis diandra, Vesicularia dubyana, Hygrophilia augustifolia, Micranthemum umbrosum, Eichhornia azurea, Saururus cernuus, Cryptocoryne lingua, Hydrotriche hottoniiflora, Eustralis stellata, Vallisneria rubra, Hygrophila salicifolia, Cyperus helferi, Cryptocoryne petchii, Vallisneria americana, Vallisneria torta, Hydrotriche hottoniiflora, Crassula helmsii, Limnophila sessiliflora, Potamogeton perfoliatus, Rotala wallichii, Cryptocoryne becketii, Blyxa aubertii, Hygrophila difformmis), lentejas de agua (Spirodela polyrrhiza, Wolffia globosa, Lemna trisulca, Lemna gibba, Lemna minor, Landoltia punctata), lechugilla de agua (Pistia stratiotes), ranunculos (Ranunculus), castana de agua (Trapa natans y Trapa bicornis), lirios de agua (Nymphaea lotus, Nymphaeaceae y Nelumbonaceae), jacintos de agua (Eichhornia crassipes), Bolbitis heudelotii, Cabomba sp., praderas marinas (Heteranthera zosterifolia, Posidoniaceae, Zosteraceae, Hydrocharitaceae, y Cymodoceaceae). El butanol producido a partir de una planta acuatica puede difundirse hacia el agua, permitiendo el crecimiento normal de las plantas y una produccion mas robusta de butanol a partir de las plantas. Los cultivos lfquidos de tejidos de plantas acuaticas (que incluyen, pero no se limitan a algas multicelulares) o celulas (que incluyen, pero no se limitan a algas unicelulares) tambien son muy preferidos para su uso, puesto que las moleculas de butanol producidas a partir de una via de produccion de butanol de diseno pueden difundir con facilidad fuera de las celulas o los tejidos hacia el medio acuoso lfquido, en donde pueden actuar como un gran deposito para almacenar el producto de butanol que posteriormente puede recolectarse mediante filtracion y/o tecnicas de destilacion/evaporacion.

Aunque las plantas acuaticas o sus celulas son los organismos hospedantes preferidos para su uso en los metodos de la presente invencion, tambien pueden emplearse tejidos y celulas de plantas no acuaticas, que sean fotosinteticos y que puedan cultivarse en un medio de cultivo lfquido, para crear tejido o celulas de diseno para la produccion fotosintetica de butanol. Por ejemplo, tambien pueden seleccionarse los siguientes tejidos o celulas de plantas no acuaticas para su uso como organismo hospedante en esta invencion: cultivos de tejido de brotes fotoautotrofos de la manzana de madera Feronia limonia, cultivos de callos clorofilosos de la planta del mafz Zea mays, cultivos de rafces verdes de especies de Asteraceae y Solanaceae, cultivos de tejidos de parenquima del tallo de la cana de azucar, cultivos de tejidos del briofito Physcomitrella patens, cultivos en suspension de celulas fotosinteticas de la planta de soja (Glycine max), cultivos fotoautotrofos y fotomixotrofos de celulas del tabaco verde (Nicofiana tabacum L.), cultivos en suspension de celulas de Gisekia pharmaceoides (una planta C4), lrneas cultivadas en suspension fotosinteticas de Amaranthus powellii Wats., Datura innoxia Mill., Gossypium hirsutum L., y el hfbrido de fusion Nicotiana tabacum * Nicotiana glutinosa L.

Un “medio lfquido” significa agua lfquida mas cantidades relativamente pequenas de nutrientes inorganicos (por ejemplo, N, P, K etc., habitualmente en sus formas salinas) para cultivos fotoautotrofos; y, a veces, tambien incluye ciertos sustratos organicos (por ejemplo, sacarosa, glucosa, o acetato) para cultivos fotomixotrofos y/o fotoheterotrofos.

En una realizacion especialmente preferida, la planta utilizada en el metodo de produccion de butanol de la presente invencion es un alga o un alga verdeazulada. El uso de algas y/o algas verdeazuladas tiene varias ventajas. Pueden cultivarse en un estanque abierto en grandes cantidades y a bajo coste. La recoleccion y la purificacion del butanol de la fase acuosa tambien pueden realizarse con facilidad mediante destilacion/evaporacion o separacion con membrana.

Las algas adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen algas unicelulares y algas multicelulares. Las algas multicelulares que pueden seleccionarse para su uso en esta invencion incluyen, pero no se limitan a algas marinas, tales como Ulva latissima (lechuga de mar), Ascophyllum nodosum, Codium fragile, Fucus vesiculosus, Eucheuma denticulatum, Gracilaria gracilis, Hydrodictyon reticulatum, Laminaria japonica, Undaria pinntifida, Saccharina japonica, Porphyra yezoensis, y Porphyra tenera. Las algas adecuadas tambien pueden seleccionarse de las siguientes divisiones de algas: algas verdes (Chlorophyta), algas rojas (Rhodophyta), algas marrones (Phaeophyta), diatomeas (Bacillariophyta), y algas verdeazuladas (Oxyphotobacteria que incluye Cyanophyta y Prochlorophyta). Los ordenes adecuados de algas verdes incluyen Ulvales, Ulotrichales, Volvocales, Chlorellales, Schizogoniales, Oedogoniales, Zygnematales, Cladophorales, Siphonales, y Dasycladales. Los generos adecuados de Rhodophyta son Porphyra, Chondrus, Cyanidioschyzon, Porphyridium, Gracilaria, Kappaphycus, Gelidium y Agardhiella. Los generos adecuados de Phaeophyta son Laminaria, Undaria, Macrocystis, Sargassum y Dictyosiphon. Los generos adecuados de Cyanophyta (tambien conocidas como cianobacterias) incluyen, pero no se limitan a Phoridium, Synechocystis, Syncechococcus, Oscillatoria, y Anabaena. Los generos adecuados de Prochlorophyta (tambien conocidas como oxiclorobacterias) incluyen, pero no se limitan a Prochloron, Prochlorothrix, and Prochlorococcus. Los generos adecuados de Bacillariophyta son Cyclotella, Cylindrotheca, Navicula, Thalassiosira, y Phaeodactylum. Las especies preferidas de algas para su uso en la presente invencion incluyen Chlamydomonas reinhardtii, Platymonas subcordiformis, Chlorella fusca, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, Chlorella ellipsoidea, Chlorella spp., Dunaliella salina, Dunaliella viridis, Dunaliella bardowil, Haematococcus pluvialis; Parachlorella kessleri, Betaphycus gelatinum, Chondrus crispus, Cyanidioschyzon merolae, Cyanidium caldarium, Galdieria sulphuraria, Gelidiella acerosa, Gracilaria changii, Kappaphycus alvarezii, Porphyra miniata,

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Ostreococcus tauri, Porphyra yezoensis, Porphyridium sp., Palmaria palmata, Gracilaria spp., Isochrysis galbana, Kappaphycus spp., Laminaria japonica, Laminaria spp., Monostroma spp., Nannochloropsis oculata, Porphyra spp., Porphyridium spp., Undaria pinnatifida, Ulva lactuca, Ulva spp., Undaria spp., Phaeodactylum Tricornutum, Navicula saprophila, Crypthecodinium cohnii, Cylindrotheca fusiformis, Cyclotella cryptica, Euglena gracilis, Amphidinium sp., Symbiodinium microadriaticum, Macrocystis pyrifera, Ankistrodesmus braunii, y Scenedesmus obliquus.

Las especies preferidas de algas verdeazuladas (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias) para su uso en la presente invencion incluyen Thermosynechococcus elongatus BP-1, Nostoc sp. PCC 7120, Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. cepa PCC 7942, Syncechococcus sp. cepa PCC 7002, Syncechocystis sp. cepa PCC 6803, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SS120, Spirulina platensis (Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscule, Anabaena sp., Synechocyitis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102, Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. cepa PCC 7943, Synechocyitis PCC 6714 mutante deficiente en ficocianina PD-1, Cyanothece cepa 51142, Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Lyngbya majuscula, Symploca muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Prochlorococcus marinus, Prochlorococcus SS120, Synechococcus WH8102, Lyngbya majuscula, Symploca muscorum, Synechococcus bigranulatus, cryophilic Oscillatoria sp., Phormidium sp., Nostoc sp.-1, Calothrix parietina, thermophilic Synechococcus bigranulatus, Synechococcus lividus, thermophilic Mastigocladus laminosus, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp. cepa MA4, Synechococcus sp. cepa MA19, y Thermosynechococcus elongatus.

La seleccion adecuada de organismos fotosinteticos hospedantes segun sus trasfondos geneticos y ciertas caractensticas especiales tambien resulta beneficiosa. Por ejemplo, un alga de diseno que produce butanol de modo fotosintetico creada a partir de algas criofilas (psicrofilas) que puede crecer sobre la nieve y el hielo y/o a partir de cepas hospedantes tolerantes al fno, tal como Chlamydomonas cepa tolerante al fno CCMG1619, que se ha caracterizado como capaz de realizar la disociacion fotosintetica del agua a una temperatura tan fna como de 4 °C (Lee, Blankinship y Greenbaum (1995), “Temperature effect on production of hydrogen and oxygen by Chlamydomonas cold strain CCMP1619 and wild type 137c,” Applied Biochemistry and Biotechnology, 51/52:379- 386), permite la produccion fotobiologica de butanol incluso en las estaciones fnas o en regiones fnas, tales como Canada. Por otra parte, un alga de diseno creada a partir de un organismo fotosintetico termofilo/termotolerante, tal como las algas termofilas Cyanidium caldarium y Galdieria sulphuraria y/o cianobacterias termofilas (algas verdeazuladas), tales como Thermosynechococcus elongatus BP-1 y Synechococcus bigranulatus, puede permitir que la practica de esta invencion se extienda sin problemas hacia las estaciones calidas o en areas calidas, tales como Mexico y la region sudoeste de EEUU, que incluye Nevada, California, Arizona, Nuevo Mexico y Texas, en donde la climatologfa a menudo puede ser calurosa. Ademas, un alga de diseno que produce butanol de modo fotosintetico creada a partir de un alga marina, tal como Platymonas subcordiformis, permite practicar esta invencion con agua de mar, mientras que un alga de diseno creada a partir de un alga de agua dulce, tal como Chlamydomonas reinhardtii, puede emplear agua dulce. Otras caractensticas opcionales de un alga de diseno que produce butanol de modo fotosintetico incluyen los beneficios de un menor tamano del complejo antena de la clorofila, que ha demostrado proporcionar una mayor productividad fotosintetica (Lee, Mets, y Greenbaum (2002), “Improvement of photosynthetic efficiency at high light intensity through reduction of chlorophyll antenna size,” Applied Biochemistry and Biotechnology, 98-100: 37-48) y una tolerancia al butanol que permite una produccion fotosintetica de butanol mas robusta y eficaz a partir de CO2 y H2O. Mediante el uso de un mutante deficiente en ficocianina de Synechocystis PCC 6714, se ha demostrado experimentalmente que la fotoinhibicion tambien puede reducirse reduciendo el contenido en pigmentos recolectores de luz (Nakajima, Tsuzuki, y Ueda (1999), “Reduced photoinhibition of a phycocyanin-deficient mutant of Synechocystis PCC 6714”, Journal of Applied Phycology, 10: 447-452). Estas caractensticas opcionales pueden incorporarse en un alga de diseno, por ejemplo, mediante el uso de un mutante tolerante al butanol y/o deficiente en el complejo antena de la clorofila (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii cepa DS521) como organismo hospedante, para la transformacion de genes con los genes de la via de produccion de butanol de diseno. Por tanto, en una de las diversas realizaciones, se selecciona un alga hospedante del grupo que consiste en algas verdes, algas rojas, algas marrones, algas verdeazuladas (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y proclorofitos), diatomeas, algas del medio marino, algas de agua dulce, algas unicelulares, algas multicelulares, algas marinas, cepas de algas tolerantes al fno, cepas de algas tolerantes al calor, mutantes deficientes en el pigmento del complejo antena recolector de luz, cepas de algas tolerantes al butanol, y sus combinaciones.

Creacion de una via de produccion de butanol de diseno en un hospedante Seleccion de las enzimas de diseno apropiadas

Una de las caractensticas clave de la presente invencion es la creacion de una via de produccion de butanol de diseno para domesticar y trabajar con los mecanismos fotosinteticos naturales para lograr la smtesis deseable de butanol directamente a partir de CO2 y H2O. Los mecanismos fotosinteticos naturales incluyen (1) el proceso de disociacion fotosintetica del agua y el transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones a traves de la membrana tilacoide, que produce el poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP), y (2) el ciclo de Calvin, que reduce el CO2 mediante el consumo del poder reductor (NADPH) y la energfa (ATP).

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Segun la presente invencion, se emplea una serie de enzimas para crear una via de produccion de butanol de diseno que parte de un producto intermedio del ciclo de Calvin y convierte el producto intermedio en butanol, tal como se ilustra en la figura 1. Una “enzima de la via de produccion de butanol de diseno” se define en la presente como una enzima que actua como catalizador para al menos una de las etapas en una via de produccion de butanol de diseno. Segun la presente invencion, puede utilizarse una serie de productos intermedios del ciclo de Calvin para crear una o mas vfas de produccion de butanol de diseno; y las enzimas necesarias para una via de produccion de butanol de diseno se seleccionan dependiendo del producto intermedio del ciclo de Calvin del cual se bifurca la via de produccion de butanol de diseno desde el ciclo de Calvin.

En un ejemplo, se crea una via de diseno que parte del gliceraldehndo-3-fosfato y lo convierte en butanol empleando, por ejemplo, un conjunto de enzimas que consiste, tal como como se muestra con las marcas numericas 01-12 en la figura 1, en gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa 01, fosfoglicerato quinasa 02, fosfoglicerato mutasa 03, enolasa 04, piruvato quinasa 05, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa 06, tiolasa 07, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08, crotonasa 09, butiril-CoA deshidrogenasa 10, butiraldehndo deshidrogenasa 11, y butanol deshidrogenasa 12. En esta via de diseno que se bifurca desde el gliceraldehndo-3-fosfato, para la conversion de dos moleculas de gliceraldehndo-3-fosfato en butanol se generan dos moleculas de NADH a partir de NAD+ en la etapa desde el gliceraldehndo-3-fosfato hasta el 1,3-difosfoglicerato catalizada por la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa 01; mientras, dos moleculas de NADH son convertidas en NAD+: una en la etapa catalizada por la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08 para reducir la acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA, y la otra en la etapa catalizada por la butiril-CoA deshidrogenasa 10 para reducir la crotonil-CoA a butiril-CoA. Por consiguiente, en esta via de diseno que se bifurca desde el gliceraldehido-3-fosfato (01-12), el numero de moleculas de NADH consumidas se equilibra con el numero de moleculas de NADH generadas. Ademas, tanto la etapa catalizada por la butiraldehndo deshidrogenasa 11 (para reducir la butiril-CoA a butiraldehndo) como la etapa terminal catalizada por la butanol deshidrogenasa 12 (para reducir el butiraldehndo a butanol) pueden utilizar NADPH, que puede ser regenerado por la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones. Por tanto, esta via de produccion de butanol de diseno que se bifurca desde el gliceraldehido- 3-fosfato puede funcionar de modo continuo.

En otro ejemplo, se crea una via de diseno que parte del producto intermedio 3-fosfoglicerato y lo convierte en butanol empleando, por ejemplo, un conjunto de enzimas que consiste (tal como como se muestra con las marcas numericas 03-12 en la figura 1) en fosfoglicerato mutasa 03, enolasa 04, piruvato quinasa 05, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa 06, tiolasa 07, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08, crotonasa 09, butiril-CoA deshidrogenasa 10, butiraldehndo deshidrogenasa 11, y butanol deshidrogenasa 12. Merece la pena advertir que las ultimas diez enzimas (03-12) de la via de produccion de butanol de diseno que se bifurca desde el gliceraldehido-3-fosfato (0112) son identicas a las utilizadas en la via de diseno que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12). En otras palabras, las enzimas de diseno (01-12) de la via que se bifurca desde el gliceraldehido-3-fosfato permiten la produccion de butanol desde el punto del 3-fosfoglicerato y desde el punto del gliceraldehndo-3-fosfato del ciclo de Calvin. Sin embargo, estas dos vfas tienen caractensticas diferentes. A diferencia de la via de produccion de butanol que se bifurca del gliceraldehndo-3-fosfato, la via que se bifurca del 3-fosfoglicerato, que esta compuesta por las actividades de tan solo diez enzimas (03-12), no puede generar en sf misma el NADH requerido para su uso en dos lugares: uno en la etapa catalizada por la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08 para reducir la acetoacetil-CoA a 3- hidroxibutiril-CoA, y el otro en la etapa catalizada por la butiril-CoA deshidrogenasa 10 para reducir la crotonil-CoA a butiril-CoA. Es decir, si (o cuando) se emplea una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y/o una butiril-CoA deshidrogenasa que solo pueden emplear estrictamente NADH, pero no NADPH, esto requiere un suministro de NADH para que la via que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12) pueda funcionar. Por consiguiente, para que la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato pueda funcionar, es importante utilizar una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08 y una butiril-CoA deshidrogenasa 10 que puedan emplear NADPH, que puede ser suministrado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido. Por tanto, una practica preferida es utilizar una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y una butiril-CoA deshidrogenasa que puedan emplear NADPH, o ambos NADPH y NADH (es decir, NAD(P)H) para esta via de produccion de butanol de diseno que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12 en la figura 1). Como alternativa, cuando se emplea una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa y una butiril-CoA deshidrogenasa que solo pueden emplear NADH, en este caso es preferible emplear otra realizacion que pueda conferir un mecanismo de conversion de NADPH/NADH (para suministrar el NADH convirtiendo NADPH en NADH, veanse mas detalles a continuacion en el texto) en el organismo de diseno para facilitar la produccion fotosintetica de butanol a traves de la via que se bifurca del 3-fosfoglicerato de diseno.

En otro ejemplo, se crea una via de diseno que parte de la fructosa-1,6-difosfato y la convierte en butanol empleando (tal como como se muestra con las marcas numericas 20-33 en la figura 1), un conjunto de enzimas que consiste en aldolasa 20, triosa fosfato isomerasa 21, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa 22, fosfoglicerato quinasa 23, fosfoglicerato mutasa 24, enolasa 25, piruvato quinasa 26, piruvato-NADP+ oxidorreductasa (o piruvato- ferredoxina oxidorreductasa) 27, tiolasa 28, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 29, crotonasa 30, butiril-CoA deshidrogenasa 31, butiraldehndo deshidrogenasa 32, y butanol deshidrogenasa 33, siendo la aldolasa 20 y la triosa fosfato isomerasa 21 las unicas dos enzimas adicionales con relacion a la via de diseno que se bifurca desde el gliceraldehndo-3-fosfato. El uso de una piruvato-NADP+ oxidorreductasa 27 (en lugar de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa) para catalizar la conversion de una molecula de piruvato en acetil-CoA permite la produccion de un NADPH, que puede utilizarse en alguna otra etapa de la via de produccion de butanol. La adicion de otra enzima

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mas al organismo de diseno, la fosfofructosa quinasa 19, permite la creacion otra via de diseno que se bifurca desde el punto de la fructosa-6-fosfato del ciclo de Calvin para la produccion de butanol. Al igual que la via de produccion de butanol que se bifurca del gliceraldetndo-3-fosfato, tanto la via que se bifurca de la fructosa-1,6-difosfato (20-33) como la via que se bifurca de la fructosa-6-fosfato (19-33) pueden, en sf mismas, generar NADH para su uso en la via en la etapa catalizada por la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 29 para reducir la acetoacetil-CoA a 3- hidroxibutiril-CoA, y en la etapa catalizada por la butiril-CoA deshidrogenasa 31 para reducir la crotonil-CoA a butiril- CoA. En cada una de estas vfas de produccion de butanol de diseno, el numero de moleculas de NADH consumidas se equilibra con el numero de moleculas de NADH generadas; y tanto la butiraldelddo deshidrogenasa 32 (que cataliza la etapa que reduce la butiril-CoA a butiraldelddo) como la butanol deshidrogenasa 33 (que cataliza la etapa terminal para reducir el butiraldelddo a butanol) pueden utilizar NADPH, que puede ser regenerado por la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a un gradiente de protones. Por tanto, estas vfas de produccion de butanol de diseno pueden funcionar de modo continuo.

La tabla 1 lista ejemplos de las enzimas, que incluyen las identificadas anteriormente, para la construccion de las vfas de produccion de butanol de diseno. A lo largo de esta memoria descriptiva, cuando se menciona una enzima, tal como, por ejemplo, cualquiera de las enzimas listadas en la tabla 1, se incluyen sus isozimas, analogos funcionales y enzimas modificadas de diseno, y sus combinaciones. Estas enzimas pueden seleccionarse para su uso para la construccion de las vfas de produccion de butanol de diseno (tales como las ilustradas en la figura 1). Las “isozimas o analogos funcionales” se refieren a ciertas enzimas que tienen la misma funcion catalftica pero que pueden o no tener exactamente las mismas estructuras de protemas. La caractenstica mas fundamental de una enzima es su sitio activo, que cataliza la reaccion enzimatica. Por tanto, ciertos fragmentos o subunidades de la protema de la enzima que contienen dicho sitio catalftico activo tambien pueden seleccionarse para su uso en esta invencion. Por diversas razones, algunas de las enzimas naturales contienen no solo la estructura catalftica fundamental, sino tambien otros componentes estructurales que puede o no resultar deseables para una aplicacion concreta. Empleando tecnicas de diseno molecular asistido por ordenador, es posible seleccionar la estructura o estructuras cataltticas fundamentales para su uso para la construccion de una construccion de ADN de diseno que codifica una enzima de diseno deseada. Por tanto, en una de las diversas realizaciones, se crea un gen de una enzima de diseno mediante smtesis artificial de una construccion de ADN segun un diseno de secuencias moleculares asistido por ordenador. Empleando la estrategia de la biologfa sintetica asistida por ordenador, cualquier secuencia de ADN (y, por tanto, la estructura de su protema) de una enzima de diseno puede modificarse selectivamente para lograr resultados mas deseables por medio del diseno. Por tanto, las expresiones “secuencias modificadas de diseno” y “enzimas modificadas de diseno” se definen en la presente como secuencias de ADN y las protemas de las enzimas que se modifican por medio del diseno molecular asistido por ordenador. Por ejemplo, cuando se disena una construccion de ADN para una enzima de diseno dirigida al cloroplasto a partir de la secuencia de una enzima mitocondrial, una practica preferida consiste en modificar algunas de las estructuras de las protemas, por ejemplo, cortando selectivamente cierto componente o componentes estructurales, tal como la secuencia de su peptido de transito mitocondrial que no es adecuada para la aplicacion concreta y/o anadiendo ciertas estructuras de peptidos, tales como una secuencia de peptido de transito del cloroplasto exogena (por ejemplo, un peptido de transito de la subunidad pequena de rubisco de 135 pb (RbcS2)), que son necesarias para conferir la capacidad en la insercion dirigida al cloroplasto de la protema de diseno. Por tanto, una de las diversas realizaciones emplea de modo flexible las enzimas, sus isozimas, analogos funcionales, enzimas modificadas de diseno y/o sus combinaciones en la construccion de la via o vfas de produccion de butanol de diseno.

Tal como se muestra en la tabla 1, muchos genes de las enzimas identificadas anteriormente se han clonado y/o secuenciado a partir de diversos organismos. Pueden utilizarse datos de secuencias de ADN genomico y/o ARNm para disenar y sintetizar las construcciones de ADN de diseno para la transformacion de un alga, oxifotobacteria, planta, tejido o celulas vegetales hospedantes para crear un organismo de diseno para la produccion fotobiologica de butanol (figura 1). Sin embargo, debido a las posibles variaciones que, a menudo, estan asociadas con diversos organismos fuente y compartimentos celulares con respecto a un organismo hospedante espedfico y el entorno de sus cloroplastos/tilacoide, en los que la via o vfas de produccion de butanol se han de diseno para que trabajen con el ciclo de Calvin, a menudo son necesarios ciertos trabajos de ingeniena molecular en el diseno de la construccion de ADN, que incluyen la optimizacion de la utilizacion de codones y la modificacion de secuencias, para que una construccion de ADN de diseno (figura 2) funcione bien. Por ejemplo, en la creacion de un alga eucariota de diseno que produce butanol, si las secuencias fuente proceden de enzimas citosolicas (secuencias), puede anadirse una secuencia funcional de transporte dirigido al cloroplasto para proporcionar la capacidad para que una enzima codificada por un gen poco clara de diseno se inserte en el cloroplasto de un hospedante para conferir su funcion para una via de produccion de butanol de diseno. Ademas, para proporcionar una conmutacion para una via de produccion de butanol de diseno, tambien es importante incluir una secuencia de un promotor inducible funcional, tal como el promotor de un gen de hidrogenasa (Hyd1) o nitrato reductasa (Nia1), o el gen de nitrito reductasa (nirA) en ciertas construcciones de ADN de diseno, tal como se ilustra en la figura 2A, para controlar la expresion del gen o genes de diseno. Ademas, tal como se menciono anteriormente, ciertos derivados funcionales o fragmentos de estas enzimas (secuencias), secuencias de peptidos de transito que se dirigen al cloroplasto, y secuencias de promotores inducibles tambien pueden seleccionarse para su uso completo, en parte o en combinaciones entre sf, para crear organismos de diseno segun diversas realizaciones de esta invencion. La tecnica para crear y emplear los organismos de diseno se describe mas a fondo a continuacion.

La tabla 1 lista ejemplos de enzimas para la construccion de las v^as de produccion de butanol de diseno.

Enzima: Fuente (organismo) GenBank n.° de registro, ID JGI de la protema, o cita

Butanol deshidrogenasa: Clostridium saccharoperbutylacetonicum; Propionibacterium freudenreichii; Trichomonas vaginalis; Aeromonas hydrophila; Clostridium beijerinckii; Clostridium acetobutylicum GenBank: AB257439; AJ508920; AF112135; AF388671; AF157307; M96946, M96945

Butiraldehndo deshidrogenasa: Clostridium saccharoperbutylacetonicum GenBank: AY251646

Butiril-CoA deshidrogenasa: Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; bacteria productora de butirato L2-50; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum GenBank: AF494018; AB190764; DQ987697; Z92974

Crotonasa: Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; bacteria productora de butirato L2-50; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum GenBank: AF494018; AB190764; DQ987697; Z92974

3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa: Clostridium beijerinckii; Butyrivibrio fibrisolvens; Ajellomyces capsulatus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus clavatus; Neosartorya fischeri; bacteria productora de butirato L2- 50; Arabidopsis thali thermosaccharolyticumana; Thermoanaerobacterium GenBank: AF494018; AB190764; XM 001537366; XM 741533; XM 001274776; XM 001262361; DQ987697; BT001208; Z92974

Tiolasa: Butyrivibrio fibrisolvens; bacteria productora de butirato L2-50; Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum GenBank: AB190764; DQ987697; Z92974

Gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa: citosol de Mesostigma viride; citosol de Triticum aestivum; cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii; Botryotinia fuckeliana; Saccharomyces cerevisiae; Zymomonas mobilis; Karenia brevis; Ajellomyces capsulatus; Pichia stipitis; Pichia guilliermondii; Kluyveromyces marxianus; Triticum aestivum; Arabidopsis thaliana; Zea mays citosolica GenBank: DQ873404; EF592180; L27668; XM 001549497; J01324; M18802; EU078558; XM 001539393; XM 001386423; XM 001386568; XM 001485596; DQ681075; EF592180; NM 101214; U45857, ZMU45856, U45855

Fosfoglicerato quinasa: cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii; Plasmodium vivax; Babesia bovis; Botryotinia fuckeliana; Monocercomonoides sp.; Lodderomyces elongisporus; Pichia guilliermondii; Arabidopsis thaliana; Helianthus annuus; Oryza sativa; Dictyostelium discoideum; Euglena gracilis; Chondrus crispus; Phaeodactylum tricornutum; Solanum tuberosum GenBank: U14912, AF244144; XM 001614707; XM 001610679; XM 001548271; DQ665858; XM 001523843; XM 001484377; NM 179576; DQ835564; EF122488; AF316577; AY647236; AY029776; AF108452; AF073473

Fosfoglicerato mutasa: citoplasma de Chlamydomonas reinhardtii; Aspergillus fumigatus; JGI Chlre2 protema ID 161689, GenBank: AF268078; XM 747847;

(fosfogliceromutasa): Coccidioides immitis; Leishmania braziliensis; Ajellomyces capsulatus; Monocercomonoides sp.; Aspergillus clavatus; Arabidopsis thaliana; Zea mays XM 749597; XM 001248115; XM 001569263; XM 001539892; DQ665859; XM 001270940; NM_117020; M80912

Enolasa: citoplasma de Chlamydomonas reinhardtii; Arabidopsis thaliana; Leishmania mexicana; Lodderomyces elongisporus; Babesia bovis; Sclerotinia sclerotiorum; Pichia guilliermondii; Spirotrichonympha leidyi; Oryza sativa; Trimastix pyriformis; Leuconostoc mesenteroides; Davidiella tassiana; Aspergillus oryzae; Schizosaccharomyces pombe; Brassica napus; Zea mays GenBank: X66412, P31683; AK222035; DQ221745; XM 001528071; XM 001611873; XM 001594215; XM 001483612; AB221057; EF122486, U09450; DQ845796; AB088633; U82438; D64113; U13799; AY307449; U17973

Piruvato quinasa: citoplasma de Chlamydomonas reinhardtii; Arabidopsis thaliana; Saccharomyces cerevisiae; Babesia bovis; Sclerotinia sclerotiorum; Trichomonas vaginalis; Pichia guilliermondii; Pichia stipitis; Lodderomyces elongisporus; Coccidioides immitis; Trimastix pyriformis; Glycine max (soja) JGI Chlre3 protema ID 138105; GenBank: AK229638; AY949876, AY949890, AY949888; XM 001612087; XM 001594710; XM 001329865; XM 001487289; XM 001384591; XM 001528210; XM_001240868; DQ845797; L08632

Fosfofructosa quinasa: Chlamydomonas reinhardtii; Arabidopsis thaliana; Ajellomyces capsulatus; Yarrowia lipolytica; Pichia stipitis; Dictyostelium discoideum; Tetrahymena thermophila; Trypanosoma brucei; Plasmodium falciparum; Spinacia oleracea JGI Chlre2 protema ID 159495; GenBank: NM 001037043, NM 179694, NM 119066, NM 125551; XM 001537193; AY142710; XM 001382359, XM_001383014; XM_639070; XM 001017610; XM 838827; XM_001347929; DQ437575

Fructosa-difosfato aldolasa: cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii; citoplasma de Fragaria * ananassa; Homo sapiens; Babesia bovis; Trichomonas vaginalis; Pichia stipitis; Arabidopsis thaliana GenBank: X69969; AF308587; NM 005165; XM 001609195; XM 001312327, XM 001312338; XM 001387466; NM 120057, NM_001036644

Triosa fosfato isomerasa: Arabidopsis thaliana; Chlamydomonas reinhardtii; Sclerotinia sclerotiorum; Chlorella pyrenoidosa; Pichia guilliermondii; Euglena intermedia; Euglena longa; Spinacia oleracea; Solanum chacoense; Hordeum vulgare; Oryza sativa GenBank: NM 127687, AF247559; AY742323; XM 001587391; AB240149; XM 001485684; DQ459379; AY742325; L36387; AY438596; U83414; EF575877

Glucosa-1-fosfato adenililtransferasa: Arabidopsis thaliana; Zea mays; Chlamydia trachomatis; Solanum tuberosum (patata); Shigella flexneri; Lycopersicon esculentum GenBank: NM 127730, NM 124205, NM 121927, AY059862; EF694839, EF694838; AF087165; P55242; NP 709206; T07674

Almidon sintasa: Chlamydomonas reinhardtii; Phaseolus vulgaris; Oryza sativa; Arabidopsis thaliana; Colocasia esculenta; Amaranthus cruentus; Parachlorella kessleri; Triticum aestivum; Sorghum bicolor; Astragalus membranaceus; Perilla frutescens; Zea mays; Ipomoea GenBank: AF026422, AF026421, DQ019314, AF433156; AB293998; D16202, AB115917, AY299404; AF121673, AK226881; NM 101044; AY225862, AY142712; DQ178026; AB232549; Y16340; AF168786; AF097922; AF210699; AF019297;

: batatas AF068834

Alfa-amilasa: celulas de alerurona de Hordeum vulgare; Trichomonas vaginalis; Phanerochaete chrysosporium; Chlamydomonas reinhardtii; Arabidopsis thaliana; gen de amilasa termoestable de Dictyoglomus thermophilum GenBank: J04202; XM 001319100; EF143986; AY324649; NM 129551; X07896

Beta-amilasa: Arabidopsis thaliana; Hordeum vulgare; Musa acuminata GenBank: NM 113297: D21349; DQ166026

Almidon fosforilasa: ra^z de cultivares hforidos de cftricos; cloroplasto de Solanum tuberosum; Arabidopsis thaliana; Triticum aestivum; Ipomoea batatas Genbank: AY098895; P53535; NM 113857, NM 114564; AF275551; M64362

Fosfoglucomutasa: plastido de Oryza sativa; Ajellomyces capsulatus; Pichia stipitis; Lodderomyces elongisporus; Aspergillus fumigatus; Arabidopsis thaliana; Populus tomentosa; Oryza sativa; Zea mays GenBank: AC105932, AF455812; XM 001536436; XM 001383281; XM 001527445; XM 749345; NM 124561, NM 180508, AY128901; AY479974; AF455812; U89342, U89341

Glucosa fosfato (glucosa-6-fosfato) isomerasa: Chlamydomonas reinhardtii; Saccharomyces cerevisiae; Pichia stipitis; Ajellomyces capsulatus; citosol de Spinacia oleracea; citoplasma de Oryza sativa; Arabidopsis thaliana; Zea mays JGI Chlre3 protema ID 135202; GenBank: M21696; XM 001385873; XM 001537043; T09154; P42862; NM_123638, NM_118595; U17225

Hexoquinasa (glucoquinasa): Ajellomyces capsulatus; Pichia stipitis; Pichia angusta; Thermosynechococcus elongates; Babesia bovis; Solanum chacoense; Oryza sativa; Arabidopsis thaliana GenBank: XM 001541513; XM 001386652, AY278027; XM 001386035; NC 004113; XM 001608698; DQ177440; DQ116383; NM_112895

NADP(H) fosfatasa: Methanococcus jannaschii The Journal Of Biological Chemistry, 280, (47):39200-39207 (2005)

NAD quinasa: Babesia bovis; Trichomonas vaginalis GenBank: XM 001609395; XM_001324239

Piruvato-NADP+ oxidorreductasa: Peranema trichophorum; Euglena gracilis GenBank: EF114757; AB021127, AJ278425

Piruvato-ferredoxina oxidorreductasa: Mastigamoeba balamuthi; Desulfovibrio africanus; Entamoeba histolytica; Trichomonas vaginalis; Cryptosporidium parvum; Cryptosporidium baileyi; Giardia lamblia; Entamoeba histolytica; Hydrogenobacter thermophilus; Clostridium pasteurianum GenBank: AY101767; Y09702; U30149; XM 001582310, XM 001313670, XM 001321286, XM 001307087, XM 001311860, XM 001314776, XM 001307250; EF030517; EF030516; XM_764947; XM 651927; AB042412; Y17727

Transporte dirigido de enzimas a la region estromatica de los cloroplastos

Se sabe que algunas de las enzimas de diseno analizadas anteriormente, tal como piruvato-ferredoxina oxidorreductasa, tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldetndo 5 deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa, actuan en ciertas bacterias especiales, tales como Clostridium; pero, en general, los cloroplastos de plantas de tipo salvaje no poseen estas enzimas para que funcionen con el ciclo de Calvin. Por tanto, en una de las diversas realizaciones para crear un organismo eucariota de diseno que produce butanol, los acidos nucleicos de diseno que codifican estas enzimas se expresan en el cloroplasto o cloroplastos de una celula hospedante. Esto puede lograrse mediante el transporte de un gen o genes de la via de produccion de 10 butanol de diseno hacia el genoma del cloroplasto de la celula hospedante eucariota, generalmente empleando una

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pistola de genes. Hasta cierto punto, la genetica molecular de los cloroplastos es similar a la de las cianobacterias. Despues de ser introducida en el cloroplasto, una construccion de ADN de diseno que contiene un par de sitios de recombinacion apropiados, tal como se ilustra en la figura 2F, puede incorporarse en el genoma del cloroplasto a traves de un proceso natural de recombinacion doble de ADN homologo.

En otra realizacion, los acidos nucleicos que codifican estas enzimas se modifican geneticamente de modo que las enzimas expresadas se insertan en los cloroplastos para que funcionen con el ciclo de Calvin que se desarrolla allu Dependiendo del trasfondo genetico de un organismo hospedante concreto, algunas de las enzimas de diseno analizadas anteriormente, tal como la fosfoglicerato mutasa y la enolasa, pueden existir a ciertos niveles de fondo en su forma nativa en un cloroplasto de tipo salvaje. Sin embargo, por diversas razones, que a menudo incluyen la incapacidad de controlarlas, algunas de las enzimas de fondo del cloroplasto pueden o no ser suficientes para actuar como una parte significativa de la via o vfas de produccion de butanol de diseno. Ademas, resulta que una serie de promotores inducibles utiles actuan en el genoma nuclear. Por ejemplo, tanto el promotor de la hidrogenasa (Hyd1) como el promotor de la nitrato reductasa (Nia1), que pueden utilizarse para controlar la expresion de las vfas de produccion de butanol de diseno, se localizan en el genoma nuclear de Chlamydomonas reinhardtii, cuyo genoma ha sido recientemente secuenciado. Por tanto, en una de las diversas realizaciones, se prefiere utilizar genes de diseno que pueden ser codificados por el genoma nuclear, para conferir una via de produccion de butanol conmutable. Por consiguiente, tambien es necesario que los acidos nucleicos que codifican estas enzimas se modifiquen geneticamente con una modificacion de secuencia apropiada, de modo que las enzimas se expresen de modo controlable y se inserten en los cloroplastos para crear una via de produccion de butanol de diseno.

Segun una de las diversas realizaciones, es mejor expresar las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno solo en los cloroplastos (en la region estromatica), exactamente donde la accion de las enzimas es necesaria para permitir la produccion fotosintetica de butanol. Si se expresan sin un mecanismo de insercion dirigido a los cloroplastos, las enzimas simplemente se quedanan en el citosol y no senan capaces de interaccionar directamente con el ciclo de Calvin para la produccion de butanol. Por tanto, ademas de las caractensticas distintivas obvias en los disenos de vfas y las estrategias asociadas, otra distincion significativa es que una de las diversas realizaciones emplea, de modo innovador, un mecanismo dirigido a cloroplastos para la insercion genetica de muchas enzimas de la via de produccion de butanol de diseno en el cloroplasto para que interaccionen directamente con el ciclo de Calvin para la produccion fotobiologica de butanol.

Empleando un mecanismo dirigido al estroma del cloroplasto, las celulas no solo pueden producir butanol, sino que tambien pueden crecer y regenerarse cuando se devuelven a ciertas condiciones bajo las cuales la via de diseno esta inactivada, tales como bajo condiciones aerobias cuando se emplean genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de la hidrogenasa. Las algas, plantas o celulas vegetales de diseno que contienen mitocondrias normales debenan ser capaces de emplear el poder reductor (NADH) de reservas organicas y/o de algun sustrato organico exogeno, tal como acetato o azucar, para suministrar energfa a las celulas inmediatamente despues de volver a las condiciones aerobias. Por consiguiente, cuando las algas, plantas o celulas vegetales de diseno vuelven a las condiciones aerobias despues de su uso bajo condiciones anaerobias para la produccion fotosintetica de butanol, las celulas dejaran de producir las enzimas de la via de produccion de butanol y comenzaran a restablecer la capacidad fotoautotrofa normal sintetizando nuevos cloroplastos funcionales. Por tanto, es posible emplear estos organismos vegetales/algas de diseno modificadas geneticamente para ciclos repetidos de crecimiento fotoautotrofo bajo condiciones aerobias normales y la produccion eficaz de butanol directamente a partir de CO2 y H2O bajo ciertas condiciones de produccion de butanol de diseno espedficas, tales como bajo condiciones anaerobias y/o en presencia de nitrato cuando se emplea una via de produccion de butanol controlada por un promotor de Nia1.

La insercion dirigida de enzimas de la via de produccion de butanol de diseno puede lograrse mediante el uso de una secuencia de ADN que codifica un peptido “senal” estromatico. Un peptido senal (de transito) de una protema estromatica dirige el transporte y la insercion de una protema recien sintetizada en el estroma. Segun una de las diversas realizaciones, una secuencia de ADN de transporte dirigido espedfica se coloca preferiblemente entre el promotor y la secuencia de una enzima de la via de produccion de butanol de diseno, tal como se muestra en una construccion de ADN de diseno (figura 2A). Esta secuencia de transporte dirigido codifica un peptido senal (de transito) que se sintetiza como parte de la apoprotema de una enzima en el citosol. El peptido de transito grna la insercion de una apoprotema de una enzima de la via de produccion de butanol de diseno desde el citosol hacia el cloroplasto. Despues de que la apoprotema se inserte en el cloroplasto, el peptido de transito se escinde de la apoprotema, que entonces se convierte en una enzima activa.

Son adecuadas una serie de secuencias de peptidos de transito para su uso en la insercion dirigida de las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno en el cloroplasto, que incluyen, pero no se limitan a las secuencias de peptidos de transito de: las apoprotemas de hidrogenasa (tales como HydAl (Hyd1) y HydA2, GenBank n.° de registro AJ308413, AF289201, AY090770), la apoprotema de ferredoxina (Frx1, n.os de registro L10349, P07839), la apoprotema m de tiorredoxina (Trx2, X62335), la apoprotema de glutamina sintasa (Gs2, Q42689), las apoprotemas de LhcII (AB051210, AB051208, AB051205), la apoprotema de PSII-T (PsbT), la apoprotema de PSII-S (PsbS), la apoprotema de PSII-W (PsbW), la apoprotema de la subunidad y de CF0CF1 (AtpC), la apoprotema de la subunidad 8 de CF0CF1 (AtpD, U41442), la apoprotema de la subunidad II de CFoCFi (AtpG), las apoprotemas del fotosistema I (PSI) (tales como de los genes PsaD, PsaE, PsaF, PsaG, PsaH, y PsaK), las apoprotemas de SSU de rubisco (tales

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como RbcS2, X04472). A lo largo de esta memoria descriptiva, cuando se menciona una secuencia de peptido de transito, tal como, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de peptidos de transito descritas anteriormente, se incluyen sus analogos funcionales, secuencias de diseno modificadas y sus combinaciones. Un “analogo funcional” o “secuencia de diseno modificada” en este contexto se refiere a una secuencia de peptido derivada o modificada (por ejemplo, mediante sustitucion conservadora, delecion o adicion moderada de aminoacidos, o modificacion de las cadenas laterales de aminoacidos) basada en una secuencia nativa del peptido de transito, tales como las identificadas anteriormente, que tiene la misma funcion que la secuencia nativa del peptido de transito, es decir, realizar la insercion dirigida de una enzima deseada.

En ciertas realizaciones espedficas, se emplean las siguientes secuencias de peptidos de transito para guiar la insercion de las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno hacia la region estromatica del cloroplasto: el peptido de transito de Hyd1 (que tiene la secuencia de aminoacidos: msalylkpca aysirgsscr arqvaprapl aastvrvala tleaparrlg nvacaa (SEQ ID NO: 54)), los peptidos de transito de RbcS2 (que tienen la secuencia de aminoacidos: maaviakssv saavarpars svrpmaalkp avkaapvaap aqanq (SEQ ID NO: 55)), el peptido de transito de ferredoxina (que tiene la secuencia de aminoacidos: mamamrs (SEQ ID NO: 56)), el peptido de transito de la subunidad 8 de CF0CF1 (que tiene la secuencia de aminoacidos: mlaaksiagp rafkasavra apkagrrtvv vma (SEQ ID NO: 57)), sus analogos, derivados funcionales, secuencias de diseno y sus combinaciones.

Uso de una conmutacion genetica para controlar la expresion de una v^a de produccion de butanol de diseno

Otra caractenstica clave de la invencion es la aplicacion de un conmutador genetico para controlar la expresion de una via o vfas de produccion de butanol de diseno, tal como se ilustra en la figura 1. La conmutabilidad se logra empleando un promotor externamente inducible, de modo que los transgenes de diseno son expresados de modo inducible bajo ciertas condiciones espedficas. Preferiblemente, el promotor empleado para controlar la expresion de los genes de diseno en un hospedante se origina del propio hospedante o de un organismo muy proximo. Las actividades y la inducibilidad de un promotor en una celula hospedante pueden ensayarse colocando el promotor delante de un gen indicador, introduciendo esta construccion de indicador en el tejido o en celulas del hospedante mediante cualquier tecnica de transporte de ADN conocida, y evaluar la expresion del gen indicador.

En una realizacion preferida, el promotor inducible empleado para controlar la expresion de los genes de diseno es un promotor que es inducible por anaerobiosis, es decir, es activo bajo condiciones anaerobias, pero inactivo bajo condiciones aerobias. Un alga/organismo vegetal de diseno puede realizar la fotosmtesis autotrofa empleado CO2 como fuente de carbono bajo condiciones aerobias, y cuando el cultivo del organismo de diseno se cultiva y esta listo para la produccion fotosintetica de butanol se aplicaran las condiciones anaerobias para activar el promotor y los genes de diseno que codifican una via o vfas de produccion de butanol de diseno.

Una serie de promotores que se activan bajo condiciones anaerobias son adecuados para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, pueden emplearse los promotores de los genes de la hidrogenasa (HydAI (Hyd1) y HydA2, GenBank n.° de registro: AJ3084l3, AF289201, AY090770) de Chlamydomonas reinhardtii, que son activos bajo condiciones anaerobias, pero inactivos bajo condiciones aerobias, como conmutador genetico eficaz para controlar la expresion de los genes de diseno en un alga hospedante, tal como Chlamydomonas reinhardtii. De hecho, las celulas de Chlamydomonas contienen varios genes nucleares que son inducidos de modo coordinado bajo condiciones anaerobias. Estos incluyen el propio gen estructural de la hidrogenasa (Hyd1), el gen Cyc6 que codifica la apoprotema del citocromo Ca, y el gen Cpx1 que codifica la coprogeno oxidasa. Las regiones reguladoras para estos dos ultimos genes han sido bien caracterizadas, y una region de aproximadamente 100 pb ha demostrado ser suficiente para conferir la regulacion por anaerobiosis en construcciones de genes sinteticas (Quinn, Barraco, Ericksson y Merchant (2000), “Coordinate copper- and oxygen-responsive Cyc6 and Cpx1 expression in Chlamydomonas is mediated by the same element”, J. Biol. Chem., 275:6080-6089). Aunque los anteriores promotores de algas inducibles pueden resultar adecuados para su uso en otros hospedantes vegetales, en especial en plantas muy proximas a las algas, pueden obtenerse promotores de los genes homologos de estas otras plantas, que incluyen plantas superiores, y emplearse para controlar la expresion de los genes de diseno en estas plantas.

En otra realizacion, el promotor inducible empleado en la presente invencion es un promotor de la nitrato reductasa de algas (Nia1), que es inducible por el crecimiento en un medio que contienen nitrato y resulta reprimido en un medio deficiente en nitrato, pero que contiene amonio (Loppes y Radoux (2002), “Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii,” Mol. Genet. Genomics, 268:42-48). Por tanto, puede seleccionarse el promotor de Nia1 (n.° de registro de gen AF203033) para su uso para controlar la expresion de los genes de diseno en un alga segun los niveles de concentracion de nitrato y amonio en un medio de cultivo. Otros promotores inducibles que tambien pueden seleccionarse para su uso en la presente invencion incluyen, por ejemplo, el promotor de la protema de choque termico HSP70A (n.° de registro: DQ059999, AY456093, M98823; Schroda, Blocker, Beek (2000), The HSP70A promoter as a tool for the improved expression of transgenes in Chlamydomonas, Plant Journal, 21:121-131), el promotor del gen CabII-1 (n.° de registro m24072), el promotor del gen Ca1 (n.° de registro P20507), y el promotor del gen Ca2 (n.° de registro P24258).

En el caso de las algas verdeazuladas (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias), tambien existen una serie de promotores inducibles que pueden seleccionarse para su uso en la presente invencion. Por ejemplo, pueden emplearse los promotores de los genes hox de hidrogenasa bidireccionales de respuesta anaerobia

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de Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019), Prochlorothrix hollandica (GenBank: U88400; promotor del operon hoxUYH), Synechocystis sp. cepa PCC 6803 (CyanoBase: sll1220 y sll1223), Synechococcus elongatus PCC 6301 (CyanoBase: syc1235_c), Arthrospira platensis (GenBank: ABC26906), Cyanothece sp. CCY0110 (GenBank: ZP_ 01727419) y Synechococcus sp. PCC 7002 (GenBank: AAN03566), que son activos bajo condiciones anaerobias, pero inactivos bajo condiciones aerobias (Sjoholm, Oliveira, y Lindblad (2007), “Transcription and regulation of the bidirectional hydrogenase in the Cyanobacterium Nostoc sp. strain PCC 7120,” Applied and Environmental Microbiology, 73(17): 5435-5446), como conmutador genetico eficaz para controlar la expresion de los genes de diseno en un hospedante de oxifotobacteria, tal como Nostoc sp. PCC 7120, Synechocystis sp. cepa PCC 6803, Synechococcus elongatus PCC 6301, Cyanothece sp. CCY0110, Arthrospira platensis, o Synechococcus sp. PCC 7002.

En otra realizacion, para crear organismos de diseno para la produccion de butanol conmutable, tales como oxifotobacterias de diseno conmutables, el promotor inducible seleccionado para su uso es un promotor de la nitrato reductasa (nirA), que es inducible por el crecimiento en un medio que contienen nitrato y resulta reprimido en un medio deficiente en nitrato, pero que contiene amonio (Qi, Hao, Ng, Slater, Baszis, Weiss, y Valentin (2005), “Application of the Synechococcus nirA promoter to establish an inducible expression system for engineering the Synechocystis tocopherol pathway,” Applied and Environmental Microbiology, 71(10):5678-5684; Maeda, Kawaguchi, Ohe, y Omata (1998) “cis-Acting sequences required for NtcB-dependent, nitrite-responsive positive regulation of the nitrate assimilation operon in the Cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942,” Journal of Bacteriology, 180(16):4080-4088). Por tanto, pueden seleccionarse secuencias del promotor nirA para su uso para controlar la expresion de los genes de diseno en una serie de oxifotobacterias segun los niveles de concentracion de nitrato y amonio en un medio de cultivo. Las secuencias del promotor nirA que pueden seleccionarse y modificarse para su uso incluyen, pero no se limitan a los promotores nirA de las siguientes oxifotobacterias: Synechococcus elongatus PCC 6301 (GenBank: AP008231, region 355890-255950), Synechococcus sp. (GenBank: X67680.1, D16303.1, D12723.1, y D00677), Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank: NP-442378, BA000022, AB001339, D63999- D64006, D90899-D90917), Anabaena sp. (GenBank: X99708.1), Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019.2 y AJ319648), Plectonema boryanum (GenBank: D31732.1), Synechococcus elongatus PCC 7942 (GenBank: P39661, CP000100.1), Thermosynechococcus elongatus BP-1 (GenBank: BAC08901, NP—682139), Phormidium laminosum (GenBank: CAA79655, Q51879), Mastigocladus laminosus (GenBank: ABD49353, ABD49351, ABD49349, ABD49347), Anabaena variabilis AtCC 29413 (GenBank: YP—325032), Prochlorococcus marinus cepa. MIT 9303 (GenBank: YP—001018981), Synechococcus sp. WH 8103 (GenBank: AAC17122), Synechococcus sp. WH 7805 (GenBank: ZP-01124915), y Cyanothece sp. CCY0110 (GenBank: ZP-01727861).

En otra realizacion, un promotor inducible seleccionado para su uso es el promotor groE del gen de chaperona de respuesta a la luz y al calor, que puede ser inducido por el calor y/o la luz [Kojima y Nakamoto (2007), “A novel light- and heat-responsive regulation of the groE transcription in the absence of HrcA or CIRCE in cyanobacteria,” FEBS Letters, 581:1871-1880). Estan disponibles una serie de promotores groE, tales como los promotores groES y groEL (chaperonas) para su uso como promotor inducible para controlar la expresion de las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno. Las secuencias del promotor groE que pueden seleccionarse y modificarse para su uso en una de las diversas realizaciones incluyen, pero no se limitan a los promotores groES y/o groEL de las siguientes oxifotobacterias: Synechocystis sp. (GenBank: D12677.1), Synechocystis sp. PCC 6803 (GenBank: BA000022.2), Synechococcus elongatus pCc 6301 (GenBank: AP008231.1), Synechococcus sp (GenBank: M58751.1), Synechococcus elongatus PCC 7942 (GenBank: CP000100.1), Nostoc sp. PCC 7120 (GenBank: BA000019.2), Anabaena variabilis ATCC 29413 (GenBank: CP000117.1), Anabaena sp. L-31 (GenBank: AF324500); Thermosynechococcus elongatus BP-1 (CyanoBase: tll0185, tll0186), Synechococcus vulcanus (GenBank: D78139), Oscillatoria sp. NKBG091600 (GenBank: AF054630), Prochlorococcus marinus MIT9313 (GenBank: BX572099), Prochlorococcus marinus cepa MIT 9303 (GenBank: CP000554), Prochlorococcus marinus cepa. MIT 9211 (GenBank: ZP—01006613), Synechococcus sp. WH8102 (GenBank: BX569690), Synechococcus sp. cC9605 (GenBank: CP000110), Prochlorococcus marinus subsp. marinus cepa CCMP1375 (GenBank: AE017126), y Prochlorococcus marinus MED4 (GenBank: BX548174).

Otros promotores inducibles que tambien pueden seleccionarse para su uso en la presente invencion incluyen por ejemplo, el promotor smt inducible por metales (cinc) de Synechococcus PCC 7942 (Erbe, Adams, Taylor y Hall (1996), “Cyanobacteria carrying an smt-lux transcriptional fusion as biosensors for the detection of heavy metal cations,” Journal of Industrial Microbiology, 17:80-83); el promotor idiA de respuesta al hierro de Synechococcus elongatus PCC 7942 (Michel, Pistorius, y Golden (2001), “Unusual regulatory elements for iron deficiency induction of the idiA gene of Synechococcus elongatus PCC 7942”, Journal of Bacteriology, 183(17):5015-5024); el promotor crhR de cianobacterias de respuesta a redox (Patterson-Fortin, Colvin y Owttrim (2006), “A LexA-related protein regulates redox-sensitive expression of the cyanobacterial RNA helicase, crhR", Nucleic Acids Research, 34(12):3446-3454); el promotor hsp16.6 del gen de respuesta al choque termico de Synechocystis sp. PCC 6803 (Fang y Barnum (2004), “Expression of the heat shock gene hsp16.6 and promoter analysis in the Cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803,” Current Microbiology, 49:192-198); el promotor de la protema del choque termico pequena (Hsp), tal como como el promotor hspA del gen de Synechococcus vulcanus (Nakamoto, Suzuki, y Roy (2000), “Constitutive expression of a small heat-shock protein confers cellular thermotolerance and thermal protection to the photosynthetic apparatus in cyanobacteria,” FEBS Letters, 483:169-174); los promotores de respuesta a CO2 de genes de anhidrasa carbonica de oxifotobacterias (GenBank: EAZ90903, eAz90685, ZP—01624337, EAW33650,

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ABB17341, AAT41924, CAO89711, ZP-00111671, YP-400464, AAC44830; y CyanoBase: all2929, PMT1568 slr0051, slr1347, and syc0167_c); los promotores del gen de la nitrato reductasa (narB) (tales como GenBank n.os de registro: BAC08907, NP-682145, AAO25121; ABI46326, YP-732075, BAB72570, NP-484656); los promotores de respuesta a luz verde/roja, tales como el promotor cpcB2A2 regulado por la luz de Fremyella diplosiphon (Casey y Grossman (1994), “In vivo and in vitro characterization of the light-regulated cpcB2A2 promoter of Fremyella diplosiphont”, Journal of Bacteriology, 176(20):6362-6374); y los promotores de respuesta a la luz UV de cianobacterias) de los genes lexA, recA y ruvB (Domain, Houot, Chauvat, y Cassier-Chauvat (2004), “Function and regulation of the cyanobacterial genes lexA, recA and ruvB: LexA is critical to the survival of cells facing inorganic carbon starvation,” Molecular Microbiology, 53(1):65-80).

Ademas, en una de las diversas realizaciones, tambien pueden seleccionarse ciertos promotores “semiinducibles” o constitutivos para su uso en combinacion con un promotor o promotores inducibles para la construccion de una via o vfas de produccion de butanol de diseno. Por ejemplo, tambien pueden seleccionarse los promotores del operon de rubisco oxifotobacteriana, tales como los genes rbcL (GenBank: X65960, ZP—01728542, Q3M674, BAF48766, NP_ 895035, 0907262A; CyanoBase: PMT1205, PMM0550, Pro0551, tll1506, SYNW1718, glr2156, alr1524, slr0009), que presentan cierta dependencia de la luz pero que pueden considerarse casi como promotores constitutivos, para su uso en combinacion con un promotor o promotores inducibles, tales como los promotores nirA, hox, y/o groE, para la construccion de una via o vfas de produccion de butanol de diseno.

A lo largo de esta memoria descriptiva, cuando se menciona un promotor inducible, tal como, por ejemplo, cualquiera de los promotores inducibles descritos anteriormente, se incluyen sus analogos, derivados funcionales, secuencias de diseno y sus combinaciones. Un ““analogo funcional” o “secuencia de diseno modificada” en este contexto se refiere a una secuencia de promotor derivada o modificada (por ejemplo, mediante sustitucion, delecion o adicion moderada o modificacion de nucleotidos) basada en una secuencia nativa de un promotor, tales como los identificados anteriormente, que conserva la funcion de la secuencia nativa del promotor.

Construcciones de ADN y transformacion en organismos hospedantes

Se generan construcciones de ADN para introducir genes de la via de produccion de butanol de diseno en un alga, planta, tejido o celulas vegetales hospedantes. Es decir, una secuencia de nucleotidos que codifica una enzima de la via de produccion de butanol de diseno se coloca en un vector, en enlace operable con un promotor, preferiblemente un promotor inducible, y en enlace operable con una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de peptido de transito que se dirige al cloroplasto apropiada. En una realizacion preferida, se preparan construcciones de acidos nucleicos para que contengan los elementos colocados en la siguiente orientacion 5' (cadena arriba) a 3' (cadena abajo): un promotor externamente inducible, una secuencia de transporte dirigido de transito, y un acido nucleico que codifica una enzima de la via de produccion de butanol de diseno, y preferiblemente una secuencia de fin de la transcripcion apropiada. Pueden colocarse uno o mas genes de diseno (construcciones de ADN) en un vector genetico. Se muestra un ejemplo de dicha construccion en la figura 2A. Tal como se muestra en la realizacion ilustrada en la figura 2A, un transgen de la via de produccion de butanol de diseno es una construccion de acido nucleico que comprende: a) un cebador directo de PCR; b) un promotor externamente inducible; c) una secuencia de transporte dirigido de transito; d) una secuencia que codifica una enzima de la via de produccion de butanol de diseno con una secuencia de fin de la transcripcion apropiada; y e) un cebador inverso de PCR.

Segun diversas realizaciones, cualquiera de los componentes a) hasta e) de esta construccion de ADN se ajustan para que se adapten a ciertas condiciones espedficas. En la practica, cualquiera de los componentes a) hasta e) de esta construccion de ADN se aplican totalmente o en parte y/o en cualquier combinacion ajustada para lograr resultados mas deseables. Por ejemplo, cuando se emplea un promotor de hidrogenasa de alga como promotor inducible en la construccion de ADN de la via de produccion de butanol de diseno, un alga de diseno transgenica que contenga esta construccion de ADN podra realizar la fotosmtesis autotrofa empleando el CO2 del aire ambiental como fuente de carbono y crecera con normalidad bajo condiciones aerobias, tal como en un estanque abierto. Cuando se cultiva el cultivo de algas y este preparado para la produccion de butanol, el transgen o transgenes de diseno pueden ser expresados mediante induccion bajo condiciones anaerobias, debido al uso del promotor de hidrogenasa. La expresion del gen o genes de diseno provoca que un conjunto de enzimas de la via de produccion de butanol de diseno actuen con el ciclo de Calvin para la produccion fotobiologica de butanol (figura 1).

Los dos cebadores de PCR son un cebador directo de PCR (cebador FD [“forward”] de PCR) localizado al comienzo (el extremo 5') de la construccion de ADN, y un cebador inverso de PCR (cebador Re [“reverse”] de PCR) localizado en el otro extremo (el extremo 3'), tal como se muestra en la figura 2A. Esta pareja de cebadores de PCR se disena para proporcionar cierta comodidad cuando sea necesaria para una amplificacion por PCR relativamente facil de la construccion de ADN de diseno, que es util no solo durante y despues de sintetizar la construccion de ADN de diseno en preparacion para la transformacion genica, sino tambien despues de transportar la construccion de ADN de diseno hasta el genoma de un alga hospedante para la verificacion del gen de diseno en los transformantes. Por ejemplo, despues de lograr la transformacion del gen de diseno en una celula hospedante de Chlamydomonas reinhardtii-arg7 empleando las tecnicas de electroporacion y seleccion de complementacion de arginino succinato liasa (arg7), los transformantes resultantes despues pueden analizarse mediante un ensayo de ADN con PCR de su ADN nuclear empleando esta pareja de cebadores de PCR para verificar si el gen completo de la via de produccion de butanol de diseno (la construccion de ADN) se ha incorporado con exito en el genoma de un transformante

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concreto. Cuando el ensayo por PCR del ADN nuclear de un transformante puede generar un producto de PCR que se aparea con la secuencia y el tamano del ADN previsto segun la construccion de ADN de diseno, se verifica la incorporacion correcta del gen o genes de diseno en el genoma del transformante.

Por tanto, las diversas realizaciones tambien indican que el metodo asociado crea, de modo eficaz, las algas, plantas o celulas vegetales transgenicas de diseno para la produccion fotobiologica de butanol. Este metodo, en una de las realizaciones, incluye la siguientes etapas: a) seleccionar un alga, planta, tejido vegetal o celula vegetal hospedante apropiado con respecto a su trasfondo genetico y ciertas caractensticas especiales con relacion a la produccion de butanol; b) introducir las construcciones de acidos nucleicos de los genes de diseno en el genoma de dicha alga, planta, tejido vegetal o celula vegetal hospedante; c) verificar la incorporacion de los genes de diseno en el alga, planta, tejido vegetal o celula vegetal transformado con ensayos de ADN con PCR empleando dichos cebadores de PCR de la construccion de ADN de diseno; d) medir y verificar las caractensticas del organismo de diseno, tales como la expresion inducible de los genes de la via del butanol de diseno para la produccion fotosintetica de butanol a partir de dioxido de carbono y agua por medio de ensayos de ARNm, protemas y caractensticas de produccion de butanol segun las caractensticas de diseno espedficas de la construccion o construcciones de ADN (figura 2A).

La anterior realizacion del metodo para crear el organismo transgenico de diseno para la produccion fotobiologica de butanol tambien puede aplicarse repetidas veces para una pluralidad de ciclos operativos para lograr los resultados mas deseables. En diversas realizaciones, cualquiera de las etapas a) hasta d) de este metodo descrito anteriormente se ajustan para que se adapten a ciertas condiciones espedficas. En diversas realizaciones, cualquiera de las etapas a) hasta d) de este metodo se aplican totalmente o en parte y/o en cualquier combinacion ajustada.

Los ejemplos de genes de la via de produccion de butanol de diseno (construcciones de ADN) se muestran en las listas de secuencias. SEQ ID NO:1 presenta una construccion de ADN detallada de un gen de butanol deshidrogenasa de diseno (1809 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa Nia1 de 262 pb (21-282), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (283-417), una secuencia codificadora de enzima (418-1566) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la butanol deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AB257439), un terminador de RbcS2 de 223 pb (15671789), y un cebador RE de PCR (1790-1809). El promotor de Nia1 de 262 pb (secuencia de ADN 21-282) se emplea como ejemplo de un promotor inducible para controlar la expresion de un gen de butanol deshidrogenasa de la via de produccion de butanol de diseno (secuencia de ADN 418-1566). El peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (secuencia de ADN 283-417) se emplea como ejemplo para guiar la insercion de la enzima de diseno (secuencia de ADN 418-1566) hacia el cloroplasto del organismo hospedante. El terminador de RbcS2 (secuencia de ADN 15671789) se emplea para que la transcripcion y la traduccion del gen de diseno se termine de modo adecuado para producir la apoprotema de diseno (peptido de transito de RbcS2-butanol deshidrogenasa) segun se desea. Debido a que el promotor de Nia1 es un ADN nuclear que solo puede controlar la expresion de genes nucleares, el gen de la via de produccion de butanol sintetica en este ejemplo se disena segun la utilizacion de codones del genoma nuclear de Chlamydomonas. Por tanto, en este caso, el gen de la enzima de diseno se transcribe en el nucleo. Su ARNm es translocado de modo natural hacia el citosol, en donde el ARNm es traducido en una apoprotema que consiste en el peptido de transito de RbcS2 (que se corresponde con la secuencia de ADN 283-417) y su C-terminal esta unido al N-terminal de la protema de la butanol deshidrogenasa (que se corresponde con la secuencia de 418-1566). El peptido de transito de la apoprotema grna su transporte a traves de las membranas del cloroplasto y hacia el area del estroma, en donde el peptido de transito se escinde de la apoprotema. Entonces la butanol deshidrogenasa resultante reanuda su funcion como enzima para la via de produccion de butanol de diseno en el cloroplasto. Los dos cebadores de PCR (secuencias 1-20 y 1790-1809) se seleccionan y se modifican a partir de la secuencia del gen de la actina humano y pueden aparearse entre sf. El empleo de BLAST con las secuencias frente a Chlamydomonas no encontro secuencias homologas en GenBank. Por tanto, pueden utilizarse como cebadores de PCR apropiados en ensayos de ADN con PCR para la verificacion del gen de diseno en las algas transformadas.

SEQ ID NO:2 presenta el ejemplo 2 para una construccion de ADN de butiraldelddo deshidrogenasa de diseno (2067 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa Nia1 de 262 pb (21-282), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (283-417), una secuencia que codifica la butiraldetudo deshidrogenasa (418-1824) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la butiraldehfdo deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1825-2047), y un cebador RE de PCR (2048-2067). Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 1, SEQ ID NO:1, excepto que se emplea una secuencia que codifica la butiraldetudo deshidrogenasa (418-1824) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la butiraldehfdo deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646).

SEQ ID NO:3 presenta el ejemplo 3 para una construccion de butiril-CoA deshidrogenasa de diseno (1815 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 262 pb (21-282), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (283-291), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (292-426), una secuencia que codifica la butiril- CoA deshidrogenasa (427-1563) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (AF494018), un sitio XbaI de 9 pb (1564-1572), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1573-1795), y un cebador RE de PCR (1796-1815) en el extremo 3'. Esta construccion de ADN es similar a la del ejemplo 1, SEQ ID NO:1, excepto que se empleo una secuencia que codifica la butiril-CoA deshidrogenasa

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(427-1563) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (AF494018) y que se anaden los sitios de restriccion Xho I Ndel y Xbal para hacer que componentes clave, tales como la secuencia de transporte dirigido (292-426) y la secuencia de la enzima de diseno (427-1563) formen una unidad modular que puede ser reemplazada de modo flexible cuando sea necesario para ahorrar costes de smtesis genica y potenciar la productividad del trabajo. Notese que no es necesario que la enzima sean la butiril- CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii; tambien pueden seleccionarse para su uso una serie de enzimas butiril-CoA deshidrogenasas (tales como las listadas en la tabla 1), incluyendo sus isozimas, enzimas modificadas de diseno, y analogos funcionales procedentes de otras fuentes, tales como Butyrivibrio fibrisolvens, bacteria productora de butirato L2-50, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.

SEQ ID NO:4 presenta el ejemplo 4 para una construccion de ADN de crotonasa de diseno (1482 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 262 pb (21-282), un sitio xho I Ndel de 9 pb (283-291), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (292-426), una secuencia que codifica la crotonasa (4271209) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una crotonasa de Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018), una secuencia que codifica el marcador Lumio de 21 pb (1210-1230), un sitio Xbal de 9 pb (1231-1239) que contiene un codon de fin, un terminador de RbcS2 de 223 pb (1240-1462), y un cebador RE de PCR (14631482) en el extremo 3'. Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 3, SEQ ID NO:3, excepto que se emplea una secuencia que codifica la crotonasa (427-1209) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una crotonasa de Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018) y que se anade una secuencia que codifica un marcador Lumio de 21 pb (1210-1230) en el extremo C-terminal de la secuencia de enolasa. La secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1210-1230) se emplea en este caso para codificar una secuencia del peptido Lumio Gly-Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO:58), que puede convertirse en fluorescente cuando se trata con un reactivo Lumio que esta disponible en el mercado en Invitrogen [
https://catalog.invitrogen.com]. La tecnologfa de marcaje molecular con Lumio se basa en un derivado biarsenico acoplado a EDT (1,2-etanditiol) (el reactivo Lumio) de la fluorescema que se une a una secuencia de tetracistema modificada (Keppetipola, Coffman, et al. (2003), Rapid detection of in vitro expressed proteins using Lumio™ technology, Gene Expression, 25.3:7-11). La secuencia de tetracistema consiste en Cys- Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys (SEQ ID nO:59), en la que Xaa es cualquier aminoacido que no sea cistema, tal como Pro o Gly en este ejemplo. El reactivo Lumio unido a EDT permite la rotacion libre de los atomos de arsenico que extingue la fluorescencia de la fluorescema. La formacion de enlaces covalentes entre los tioles de los grupos arsenico de Lumio y las tetracistemas evita la rotacion libre de los atomos de arsenico que libera la fluorescencia de la fluorescema (Griffin, Adams, y Tsien (1998), “Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells”, Science, 281:269-272). Esto tambien permite la visualizacion de las protemas marcadas con tetracistema mediante la formacion de imagenes moleculares fluorescentes. Por tanto, el uso del marcador Lumio de esta manera permite controlar y/o seguir el rastro de la crotonasa de diseno cuando se expresa para verifica si la enzima de la via de produccion de butanol de diseno en efecto se transporta hacia el cloroplasto de un organismo hospedante, tal como se ha de diseno. El marcador Lumio (un peptido corto de 7 aminoacidos) que esta unido al extremo C-terminal de la protema de crotonasa en este ejemplo debe tener un efecto mmimo sobre la funcion de la enzima de diseno, pero debe permitir que la molecula de la enzima de diseno se visualice cuando se trate con el reactivo Lumio. El uso del marcador Lumio es totalmente opcional. Si el marcador Lumio afecta de alguna manera a la funcion de la enzima de diseno, este marcador puede ser delecionado en el diseno de la secuencia de ADN.

SEQ ID NO:5 presenta el ejemplo 5 para una construccion de ADN de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de diseno (1367 pb) que incluye un cebador fD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 84 pb (21-104), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (105-113), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (114-248), una secuencia que codifica la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (249-1094) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1095-1115), un sitio XbaI de 9 pb (1116-1124), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1125-1347), y un cebador RE de PCR (1348-1367). Esta construccion de AdN es similar al ejemplo 4, SEQ ID NO:4, excepto que se emplea un promotor de nitrato reductasa de 84 pb (21-104) y una secuencia que codifica la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (249-1094) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (Genbank: AF494018). El promotor de nitrato reductasa de 84 pb se crea de modo artificial uniendo dos regiones de secuencia parcialmente homologa (-231 a -201 y -77 a -25 con respecto al sitio de inicio de la transcripcion) del promotor de Nia1 nativo de Chlamydomonas reinhardtii. Estudios experimentales han demostrado que la secuencia de 84 pb es mas activa que el promotor de Nia1 nativo (Loppes y Radoux (2002), “Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii,” Mol. Genet. Genomics, 268:42-48). Por tanto, este tambien es un ejemplo en el que pueden seleccionarse secuencias sinteticas funcionales, analogos, derivados funcionales y/o secuencias modificadas de diseno, tales como la secuencia sintetica de 84 pb, para su uso segun diversas realizaciones en esta invencion.

SEQ ID NO:6 presenta el ejemplo 6 para una construccion de ADN de tiolasa de diseno (1721 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 84 pb (21-104), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (105-113), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (114-248), una secuencia que codifica la tiolasa (248-1448) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una tiolasa de Butyrivibrio fibrisolvens (AB190764), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1449-1469), un sitio XbaI de 9 pb (1470-1478), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1479-1701), y un cebador RE de PCR (1702-1721). Esta construccion de ADN tambien es similar al ejemplo

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4, SEQ ID NO:4, excepto que se emplea una secuencia que codifica la tiolasa (249-1448) y un promotor de Nia1 sintetico de 84 pb (21-104). Este es otro ejemplo en el que tambien pueden seleccionarse secuencias sinteticas funcionales para su uso en las construcciones de ADN de diseno.

SEQ ID NO:7 presenta el ejemplo 7 para una construccion de ADN de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de diseno (4211 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 84 pb x 2 (21-188), un sitio Xho I Ndel de 9 pb (189-197), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (198-332), una secuencia que codifica la piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (333-3938) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY101767), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (3939-3959), un sitio Xbal de 9 pb (3960-3968), un terminador de RbcS2 de 223 pb (3969-4191), y un cebador RE de PCR (4192-4211). Esta construccion de ADN tambien es similar al ejemplo 4, sEq ID NO:4, excepto que se emplea un promotor de Nia1 de 84 pb x 2 y una secuencia que codifica la piruvato- ferredoxina oxidorreductasa (333-3938) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una piruvato- ferredoxina oxidorreductasa de Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY101767). El promotor de Nia1 de 84 pb x 2 se construye como una duplicacion en tandem de la secuencia del promotor de Nia1 sintetico de 84 pb presentado en la anterior SEQ ID NO:6. Los ensayos experimentales han demostrado que el promotor de Nia1 de 84 pb x 2 sintetico es aun mas potente que la secuencia de 84 pb, que es mas activa que el promotor de Nia1 nativo (Loppes y Radoux (2002), “Two short regions of the promoter are essential for activation and repression of the nitrate reductase gene in Chlamydomonas reinhardtii," Mol. Genet. Genomics, 268:42-48). El uso de este tipo de secuencias de promotores inducibles con diversas potencias de promotor tambien ayuda a ajustar los niveles de expresion de las enzimas de diseno para la via o vfas de produccion de butanol de diseno.

SEQ ID NO:8 presenta el ejemplo 8 para una construccion de ADN de piruvato quinasa de diseno (2021 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 84 pb (21-104), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (105-113), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (114-248), una secuencia que codifica la piruvato quinasa (249-1748) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una piruvato quinasa de Saccharomyces cerevisiae (GenBank: AY949876), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1749-1769), un sitio XbaI de 9 pb (1770-1778), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1779-2001), y un cebador RE de PCR (20022021). Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 6, SEQ ID NO:6, excepto que se emplea una secuencia que codifica la piruvato quinasa (249-1748).

SEQ ID NO:9 presenta el ejemplo 9 para un gen de enolasa de diseno (1815 pb) que consiste en un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 262 pb (21-282), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (283-291), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (292-426), una secuencia que codifica la enolasa (427-1542) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una enolasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (Genbank: X66412, P31683), una secuencia que codifica el marcador Lumio de 21 pb (1507-1527), un sitio XbaI de 9 pb (1543-1551) que contiene un codon de fin, un terminador de RbcS2 de 223 pb (1552-1795), y un cebador RE de PCR (1796-1815) en el extremo 3'. Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 3, SEQ ID NO:3, excepto que se emplea una secuencia que codifica la enolasa (427-1542) seleccionada y modificada a partir de las secuencias de una enolasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii.

SEQ ID NO:10 presenta el ejemplo 10 para una construccion de ADN de fosfoglicerato mutasa de diseno (2349 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 262 pb (21-282), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (283-291), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (292-426), una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (427-2097) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre2 ID de la protema 161689, Genbank: AF268078), un sitio XbaI de 9 pb (2098-2106), un terminador de RbcS2 de 223 pb (2107-2329), y un cebador RE de PCR (2330-2349) en el extremo 3'. Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 3, SEQ ID NO:3, excepto que se emplea una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (427-2097) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa citosolica Chlamydomonas reinhardtii.

SEQ ID NO:11 presenta el ejemplo 11 para una construccion de ADN de fosfoglicerato quinasa de diseno (1908 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa Nia1 de 262 pb (21-282), una secuencia que codifica la fosfoglicerato quinasa (283-1665) seleccionada de una secuencia de fosfoglicerato quinasa del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii que incluye su peptido senal del cloroplasto y la secuencia de la enzima madura (GenBank: U14912), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1666-1888), y un cebador RE de PCR (1889-1908). Esta construccion de ADN es similar al ejemplo 1, SEQ ID NO:1, excepto que se emplea una secuencia que codifica la fosfoglicerato quinasa (283-1665) seleccionada de una secuencia de fosfoglicerato quinasa del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii que incluye su peptido senal del cloroplasto y la secuencia de la enzima madura. Por tanto, este tambien es un ejemplo en el que tambien puede utilizarse la secuencia de una enzima de cloroplasto codificada en el nucleo, tal como la fosfoglicerato quinasa del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardtii, en el diseno y la construccion de un gen de la via de produccion de butanol de diseno y, cuando resulte apropiado, con un promotor inducible apropiado, tal como el promotor de Nia1 (secuencia de ADN 21-282).

SEQ ID NO:12 presenta el ejemplo 12 para un gen de gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa de diseno (1677 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa Nia1 de 262 pb (21-282), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (283-417), una secuencia codificadora de enzima (418-1434) seleccionada y

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modificada a partir de una secuencia (ARNm) de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa citosolica de Mesostigma viride (GenBank n.° de registro DQ873404), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1435-1657), y un cebador RE de PCR (1658-1677). Esta construccion de AdN es similar al ejemplo 1, SEQ ID NO:1, excepto que se emplea una secuencia codificadora de enzima (418-1434) seleccionada y modificada a partir de una secuencia (ARNm) de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa citosolica de Mesostigma viride (GenBank n.° de registro DQ873404).

SEQ ID NO:13 presenta el ejemplo 13 para una construccion de ADN de fosfoglicerato mutasa unida al promotor de HydA1 de diseno (2351 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (438-2108) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre2 ID de protema 161689, Genbank: AF268078), un terminador de RbcS2 de 223 pb (2109-2331), y un cebador RE de PCR (2332-2351). Esta construccion de ADN de diseno es bastante similar al ejemplo 1, SEQ ID NO:1, excepto que se emplea un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302) y una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (438-2108) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii. Se ha demostrado que el promotor de HydA1 de 282 pb (21-302) es activo por medio de ensayos experimentales en el laboratorio del inventor. El uso del promotor de HydA1 (21302) permite la activacion de la expresion de la enzima de diseno empleando condiciones de cultivo anaerobias.

Con el mismo principio de emplear un promotor anaerobio inducible y una secuencia de transporte dirigido al cloroplasto que la que se muestra en SeQ ID NO:13 (ejemplo 13), SEQ ID NO:14-23 muestran los ejemplos 14-23 de genes de diseno. Brevemente, SEQ ID NO:14 presenta el ejemplo 14 para una construccion de aDn de enolasa de diseno (1796 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la enolasa (438-1553) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una enolasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (Genbank: X66412, P31683), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1554-1776), y un cebador RE de PCR (17771796).

SEQ ID NO:15 presenta el ejemplo 15 para una construccion de ADN de piruvato quinasa controlada por el promotor de HydA1 de diseno que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la piruvato quinasa (4381589) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una piruvato quinasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (JGI Chlre3 ID de protema 138105), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1590-1812), y un cebador RE de PCR (1813-1832).

SEQ ID NO:16 presenta el ejemplo 16 para una construccion de ADN de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de diseno (4376 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (438-4133) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de Desulfovibrio africanus (GenBank n.° de registro Y09702), un terminador de RbcS2 de 223 pb (4134-4356), y un cebador RE de PCR (4357-4376).

SEQ ID NO:17 presenta el ejemplo 17 para una construccion de ADN de piruvato-NADP+ oxidorreductasa unida al promotor de HydA1 de diseno (6092 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la piruvato-NADP+ oxidorreductasa (438-5849) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una piruvato- NADP+ oxidorreductasa de Euglena gracilis (GenBank n.° de registro AB021127), un terminador de RbcS2 de 223 pb (5850-6072), y un cebador RE de PCR (6073-6092).

SEQ ID NO:18 presenta el ejemplo 18 para una construccion de ADN de tiolasa unida al promotor de HydA1 de diseno (1856 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la tiolasa (438-1613) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una tiolasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1614-1836), y un cebador RE de PCR (1837-1856).

SEQ ID NO:19 presenta el ejemplo 19 para una construccion de ADN de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa unida al promotor de HydA1 de diseno (1550 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la 3- hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (438-1307) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una 3- hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1308-1530), y un cebador RE de PCR (1531-1550).

SEQ ID NO:20 presenta el ejemplo 20 para una construccion de ADN de crotonasa unida al promotor de HydA1 de diseno (1457 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la crotonasa (438-1214) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una crotonasa de Thermoanaerobacterium

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thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1215-1437), y un cebador RE de PCR (1438-1457).

SEQ ID NO:21 presenta el ejemplo 21 para una construccion de ADN de butiril-CoA deshidrogenasa unida al promotor de HydA1 de diseno (1817 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la butiril-CoA deshidrogenasa (438-1574) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butiril-CoA deshidrogenasa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (GenBank Z92974), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1575-1797), y un cebador RE de PCR (1798-1817).

SEQ ID NO: 22 presenta el ejemplo 22 para una construccion de ADN de butiraldehndo deshidrogenasa unida al promotor de HydA1 de diseno (2084 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la butiraldehndo deshidrogenasa (438-1841) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butiraldehndo deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (GenBank AY251646), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1842-2064), y un cebador RE de PCR (2065-2084).

SEQ ID NO: 23 presenta el ejemplo 23 para una construccion de ADN de butanol deshidrogenasa unida al promotor de HydA1 de diseno (1733 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (303-437), una secuencia que codifica la butanol deshidrogenasa (438-1490) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butanol deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (GenBank AF157307), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1491-1713), y un cebador RE de PCR (1714-1733).

Con el mismo principio de emplear un promotor sintetico de Nia1 de 84 pb x 2 y un mecanismo de transporte dirigido al cloroplasto segun se menciono previamente, SEQ ID NO:24-26 muestran mas ejemplos de construcciones de ADN de enzimas de diseno. Brevemente, SEQ ID NO:24 presenta el ejemplo 24 para una construccion de ADN de fructosa-difosfato aldolasa de diseno que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188), una secuencia que codifica la fructosa-difosfato aldolasa (189-1313) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una fructosa-difosfato aldolasa de cloroplasto de C. reinhardtii (GenBank: X69969), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1314-1536), y un cebador RE de PCR (1537-1556).

SEQ ID NO: 25 presenta el ejemplo 24 para una construccion de ADN de triosa-fosfato isomerasa de diseno que incluye un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188), una secuencia que codifica la triosa-fosfato isomerasa (189-1136) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la triosa-fosfato isomerasa de cloroplasto de Arabidopsis thaliana (GenBank: AF247559), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1137-1359), y un cebador RE de PCR (13601379).

SEQ ID NO: 26 presenta el ejemplo 26 para una construccion de ADN de fosfofructosa quinasa de diseno que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188),un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (189-323), una secuencia que codifica la fosfofructosa quinasa (324-1913) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una 6-fosfofructoquinasa de Arabidopsis thaliana (GenBank: NM—001037043), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1914-2136), y un cebador RE de PCR (2137-2156).

Las construcciones de acidos nucleicos, tales como las presentadas en los anteriores ejemplos, pueden incluir otras secuencias apropiadas, tales como un gen marcador de seleccion y una secuencia de marcador biomolecular opcional (tal como el marcador Lumio descrito en el ejemplo 4, SEQ ID NO:4). Los marcadores seleccionables que pueden seleccionarse para su uso en las construcciones incluyen marcadores que confieren resistencia a la kanamicina, la higromicina, la espectinomicina, la estreptomicina, la sulfonilurea, la gentamicina, el cloranfenicol, entre otros, todos los cuales han sido clonados y estan disponibles para los expertos en la tecnica. Como alternativa, el marcador seleccionable es un gen marcador de nutricion que puede complementar una deficiencia en el organismo hospedante. Por ejemplo, puede utilizarse el gen que codifica la argininosuccinato liasa (arg7) como gen marcador de seleccion en la construccion de diseno, que permite la identificacion de los transformantes cuando se emplean celulas de Chlamydomonas reinhardtii arg7- (menos) como celulas hospedantes.

Las construcciones de acidos nucleicos que portan genes de diseno pueden introducirse en un alga, alga verdeazulada, planta, tejidos o celulas vegetales hospedantes empleando las tecnicas de transformacion de genes disponibles, tales como electroporacion, captacion inducida por PEG, y transporte balfstico de ADN, y transformacion mediada por Agrobacterium. Con el objetivo de transportar una construccion de diseno a celulas de algas, pueden seleccionarse las tecnicas de electroporacion, esferas de vidrio y pistola de genes biolfstica para su uso como metodos preferidos; y se prefiere un alga con celulas individuales o una estructura de talo sencilla para su uso en la transformacion. Los transformantes pueden ser identificados y ensayados basandose en tecnicas habituales.

Los diversos genes de diseno pueden introducirse en celulas hospedantes de modo secuencial de una manera discontinua, o de modo simultaneo empleando una construccion o en una transformacion. Por ejemplo, las diez construcciones de ADN mostradas en sEq ID NO:13-16 (o 17) y 18-23 para la via de produccion de butanol de diez

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enzimas que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato pueden introducirse en un vector genetico, tal como p389-Arg7 con un unico marcador de seleccion (Arg7). Por tanto, mediante el uso de un plasmido de esta manera es posible transportar las diez construcciones de ADN (genes de diseno) a un hospedante de Chlamydomonas reinhardtii-arg7 que requiera arginina (CC-48) en una sola transformacion para la expresion de la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12 en la figura 1). Cuando sea necesario, un transformante que contenga las diez construcciones de ADN puede transformarse aun mas para introducir mas genes de diseno en su ADN genomico con otro marcador de seleccion, tal como estreptomicina. Mediante el uso de combinaciones de diversas construcciones de ADN de enzimas de diseno, tales como las presentadas en SEQ ID NO:1-26 en la transformacion genetica con un organismo hospedante apropiado, pueden construirse diversas vfas de produccion de butanol, tales como las ilustradas en la figura 1. Por ejemplo, las construcciones de ADN de diseno de SEQ ID NO:1-12 pueden seleccionarse para la construccion de una via de produccion de butanol que se bifurca desde el gliceraldetndo-3- fosfato (01-12 en la figura 1); las construcciones de ADN de diseno de SEQ ID NO:1-12, 24 y 25 pueden seleccionarse para la construccion de una via de produccion de butanol que se bifurca desde la fructosa-1,6- difosfato (20-33); y las construcciones de ADN de diseno de SEQ ID NO: 1-12 y 24-26 pueden seleccionarse para la construccion de una via de produccion de butanol que se bifurca desde la fructosa-6-fosfato (19-33).

Otras modificaciones del hospedante para potenciar la produccion fotosintetica de butanol

Un mecanismo de conversion de NADPH/NADH

Segun la via o vfas de produccion fotosintetica de butanol, para producir una molecula de butanol a partir de 4CO2 y 5H2O es probable que se necesiten 14 ATP y 12 NADPH, siendo ambos generados por la disociacion fotosintetica del agua y la fotofosforilacion a traves de la membrana tilacoide. Para que la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12 en la figura 1) pueda funcionar, una practica preferida es emplear una o mas enzimas de la via de produccion de butanol que puedan utilizar NADPH que es generado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido. La butanol deshidrogenasa (GenBank n.° de registro: AB257439) y la butiraldetudo deshidrogenasa de (GenBank: AY251646) Clostridium saccharoperbutylacetonicum son ejemplos de una enzima de la via de produccion de butanol que es capaz de aceptar NADP(H) o NAD(H). Esta enzima de la via de produccion de butanol que puede emplear ambos NADPH y NADH (es decir, NAD(P)H) tambien puede seleccionarse para su uso en esta via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato y tambien en cualquier otra de las vfas de produccion de butanol de diseno (figura 1). La butiril-CoA deshidrogenasa (GenBank n.° de registro: AF494018) y la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (GenBank: AF494018) de Clostridium beijerinckii son ejemplos de una enzima de la via de produccion de butanol que solo puede aceptar NAD(H). Cuando se emplea una enzima de la via de produccion de butanol que solo utiliza NADH, puede ser necesario un mecanismo de conversion de NADPH/NADh para que esta via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato funcione correctamente. Sin embargo, dependiendo del trasfondo genetico de un organismo hospedante, puede existir un mecanismo de conversion entre NADPH y NADH en el hospedante, de modo que tanto NADPH como NADH puedan ser utilizados de modo intercambiable en el organismo. Ademas, se sabe que el NADPH puede convertirse en NADH por medio de una actividad NADPH-fosfatasa (Pattanayak y Chatterjee (1998)m “Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate phosphatase facilitates dark reduction of nitrate: regulation by nitrate and ammonia,” Biologia Plantarium, 41(1):75-84) y que el NAD puede convertirse en NADP por medio de una actividad NAD quinasa (Muto, Miyachi, Usuda, Edwards y Bassham (1981), “Light-induced conversion of nicotinamide adenine dinucleotide to nicotinamide adenine dinucleotide phosphate in higher plant leaves,” Plant Physiology, 68(2):324-328; Matsumura-Kadota, Muto, Miyachi (1982), “Light-induced conversion of NAD+ to NADP+ in Chlorella cells,” Biochimica Biophysica Acta, 679(2):300-300). Por tanto, cuando se desee una conversion de NADPH/NADH potenciada, el hospedante puede ser geneticamente modificado para potenciar las actividades NADPH fosfatasa y NAD quinasa. Asf, en una de las diversas realizaciones, la planta de diseno, el alga o la celula vegetal de diseno contiene ademas transgenes adicionales de diseno (figura 2B) para que expresen, de modo inducible, una o mas enzimas para facilitar la interconversion de NADPH/NADH, tal como la NADPH fosfatasa y la NAD quinasa (GenBank: XM—001609395, XM—001324239), en la region estromatica del cloroplasto del alga.

Otra realizacion que puede proporcionar un mecanismo de conversion de NADPH/NADH es a traves de la seleccion adecuada de un punto de bifurcacion apropiado en el ciclo de Calvin del cual se bifurque una via de produccion de butanol de diseno. Para conferir este mecanismo de conversion de NADPH/NADH por medio del diseno de una via segun esta realizacion, una practica preferida consiste en bifurcar una via de produccion de butanol de diseno en el punto o despues del punto de la gliceraldetndo-3-fosfato del ciclo de Calvin, tal como se muestra en la figura 1. En estas vfas de diseno, la conversion de NADPH/NADH se logra fundamentalmente por medio de un mecanismo de dos etapas: 1) el uso de la etapa con la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa del ciclo de Calvin, que emplea NADPH para reducir el 1,3-difosfoglicerato a gliceraldetndo-3-fosfato; y 2) el uso de la etapa con la gliceraldetndo-3- fosfato deshidrogenasa 01 dependiente de NAD+ de la via de diseno, que produce NADH cuando oxida el gliceraldetndo-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato. El resultado neto de las dos etapas descritas anteriormente es la conversion de NADPH en NADH, que puede suministrar el poder reductor necesario en forma de NADH para la via o vfas de produccion de butanol de diseno. Para la etapa 1), normalmente resulta suficiente el uso de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADPH del ciclo de Calvin en el organismo hospedante. Por consiguiente, la introduccion de una gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa 01 dependiente de NAD+ de diseno para que trabaje con la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADPH del ciclo de Calvin puede conferir la funcion de un mecanismo de conversion de NADPH/NADH, que es necesario para que la via de

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produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12 en la figura 1) funcione correctamente. Por esta razon, la construccion de ADN de gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+ (ejemplo 12, SEQ ID NO:12) se emplea tambien como un gen de diseno de conversion de NADPH/NADH (figura 2B) para apoyar a la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12 en la figura 1) en una de las diversas realizaciones. Esto tambien explica por que es importante emplear una gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa 01 dependiente de NAD+ para conferir este mecanismo de conversion de NADPH/NADH de dos etapas para la via o vfas de produccion de butanol de diseno. Por tanto, en una de las diversas realizaciones, tambien es una practica preferida emplear una gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD+, sus isozimas, derivados funcionales, analogos, enzimas modificadas de diseno y/o sus combinaciones en la via o vfas de produccion de butanol de diseno, tal como se ilustra en la figura 1.

Tecnicas de ARNi para domesticar aun mas el mecanismo de regulacion de la fotos^ntesis

En otra realizacion de la presente invencion, la planta o celula hospedante se modifica aun mas para domesticar el ciclo de Calvin de modo que el hospedante pueda producir directamente butanol como combustible lfquido, en lugar de sintetizar almidon (glucogeno en el caso de las oxifotobacterias), celulosas y lignocelulosas que a menudo no son eficaces y resultan duras para que la industria de la biorrefinena las use. Segun una de las diversas realizaciones, la inactivacion de la actividad de smtesis de almidon se logra reprimiendo la expresion de cualquiera de las enzimas clave, tales como la almidon sintasa (glucogeno sintasa en el caso de las oxifotobacterias) 13, glucosa-1-fosfato (G- 1-P) adenililtransferasa 14, fosfoglucomutasa 15, y hexosa-fosfato isomerasa 16 de la via de smtesis de almidon que conecta con el ciclo de Calvin (figura 1).

La introduccion de un factor geneticamente transmisible que puede inhibir la actividad de smtesis de almidon que compite con la via o vfas de produccion de butanol de diseno por los productos del ciclo de Calvin puede potenciar aun mas la produccion fotosintetica de butanol. En una realizacion espedfica, un inhibidor que es geneticamente codificado (figura 2C) para la via de smtesis de almidon competitiva es una molecula de ARN de interferencia (ARNi), que inhibe espedficamente la smtesis de una enzima de la via de smtesis del almidon, por ejemplo, almidon sintasa 16, glucosa-1-fosfato (G-1-P) adenililtransferasa 15, fosfoglucomutasa 14 y/o hexosa-fosfato isomerasa 13, tal como se muestra con las marcas numericas 13-16 en la figura 1. Las secuencias de ADN que codifican el ARNi de la almidon sintasa, el ARNi de la glucosa-1-fosfato (G-1-P) adenililtransferasa, el ARNi de una fosfoglucomutasa y/o el ARNi de una G-P-isomerasa, respectivamente, pueden disenarse y sintetizarse basandose en tecnicas de ARN de interferencia conocidas por los expertos en la tecnica (Liszewski (1 de junio, 2003), Progress in RNA interference, Genetic Engineering News, vol. 23, n.° 11, pp. 1-59). En terminos generales, una molecula de ARN de interferencia (ARNi) es antisentido, pero complementaria con un ARNm normal de una protema (gen) concreta, de modo que dicha molecula de ARNi puede unirse espedficamente con el ARNm normal del gen concreto, inhibiendo (bloqueando) con ello la traduccion del ARNm espedfico de gen en la protema (Fire, Xu, Montgomery, Kostas, Driver, Mello (1998), “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”, Nature, 391(6669):806-811; Dykxhoorn, Novina, Sharp (2003), “Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression”, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4(6):457-467).

Los ejemplos de construcciones de ADN del ARNi de la smtesis de almidon de diseno (figura 2C) se muestran en SEQ ID NO:27 y 28 listadas. Brevemente, SEQ ID NO: 27 presenta el ejemplo 27 para una construccion de ADN del ARNi de la almidon sintasa controlada por el promotor de Nia1 de diseno (860 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de Nia1 de 262 pb (21-282), una secuencia de ARNi de la almidon sintasa (283617) que consiste en un codon de inicio atg y una secuencia de complemento inverso de dos fragmentos de secuencia exclusivos de una secuencia de ARNm de la almidon sintasa de Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: AF026422), un terminador de RbcS2 de 223 pb (618-850), y un cebador RE de PCR (851-860). Debido al uso de un promotor de Nia1 (21-282), este gen del ARNi de la smtesis de almidon de diseno se disena par ser expresado solo cuando sea necesario potenciar la produccion fotobiologica de butanol en presencia de su inductor especifico, el nitrato (NO3-), que puede anadirse al medio de cultivo como fertilizante para la induccion de los organismos de diseno. La secuencia de ARNi de la almidon sintasa (283-617) se disena para que se una con el ARNm normal del gen de la almidon sintasa, y asf bloquea su traduccion en una almidon sintasa funcional. La inhibicion de la actividad almidon/glucogeno sintasa en 16 de esta manera se realiza para canalizar mas productos fotosinteticos del ciclo de Calvin hacia la via o vfas de produccion de butanol que se bifurcan del ciclo de Calvin, tal como la via de produccion de butanol que se bifurca desde el gliceraldehndo-3-fosfato 01-12, segun se ilustra en la figura 1.

SEQ ID NO:28 presenta el ejemplo 28 para una construccion de ADN del ARNi de la almidon sintasa controlada por el promotor de HydA1 (1328 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de HydA1 de 282 pb (21-302), una secuencia de ARNi de la almidon sintasa de diseno (303-1085), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1086-1308), y un cebador RE de PCR (1309-1328). La secuencia de ARNi de la almidon sintasa de diseno (303-1085) comprende: un fragmento sentido de 300 pb (303-602) seleccionado de las primeras 300 pb de la secuencia codificadora exclusiva de una secuencia de ARNm de la almidon sintasa de Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: AF026422), un bucle similar a un intron de diseno de 183 pb (603-785), y una secuencia antisentido de 300 pb (786-1085) complementaria con las primeras 300 pb de la secuencia codificadora de una secuencia de ARNm de la almidon sintasa de Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: AF026422). Esta secuencia de ARNi de la almidon sintasa de diseno (303-1085) se disena para que inhiba la smtesis de la almidon sintasa por medio de los siguientes dos mecanismos. En primer lugar, la secuencia de ARNi complementaria antisentido de 300 pb (que se

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corresponde con la secuencia de ADN 786-1085) se une con el ARNm normal del gen de la almidon sintasa, bloqueando as^ su traduccion en una almidon sintasa funcional. En segundo lugar, la secuencia de ARNi complementaria antisentido de 300 pb (que se corresponde con la secuencia de ADN 786-1085) tambien puede unirse con el homologo sentido de 300 pb (que se corresponde con la secuencia de ADN 303-602) en la misma molecula de ARNi de diseno, formando una estructura de ARN bicatenario similar a una horquilla con la secuencia similar a un intron de diseno de 183 pb (603-785) como un bucle. Estudios experimentales han demostrado que este tipo de ARN bicatenario similar a una horquilla tambien puede activar el silenciamiento postranscripcional de genes (Fuhrmann, Stahlberg, Govorunova, Rank y Hegemann (2001), Journal of Cell Science, 114:3857-3863). Debido al uso de un promotor de HydA1 (21-302), este gen del ARNi de la smtesis de almidon de diseno se disena par ser expresado solo bajo condiciones anaerobias cuando sea necesario para potenciar la produccion fotobiologica de butanol mediante la canalizacion de mas productos fotosinteticos del ciclo de Calvin hacia la via o vfas de produccion de butanol, tales como 01-12, 03-12, y/o 20-33, segun se ilustra en la figura 1.

Genes de la glicolisis y la degradacion del almidon de diseno

En otra realizacion de la presente invencion, la produccion fotobiologica de butanol se potencia mediante la incorporacion de un conjunto adicional de genes de diseno (figura 2D) que pueden facilitar la degradacion y glicolisis del almidon/glucogeno en combinacion con el gen o genes de produccion de butanol de diseno (figura 2a). Estos genes de diseno adicionales para la degradacion del almidon incluyen, por ejemplo, genes que codifican, para 17: la amilasa, la almidon fosforilasa, la hexoquinasa, la fosfoglucomutasa y, para 18: la glucosa fosfato isomerasa (G-P- isomerasa), tal como se ilustra en la figura 1. Los genes de la glicolisis de diseno codifican enzimas de la glicolisis dirigidas al cloroplasto: glucosa fosfato isomerasa 18, fosfofructosa quinasa 19, aldolasa 20, triosa fosfato isomerasa 21, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa 22, fosfoglicerato quinasa 23, fosfoglicerato mutasa 24, enolasa 25, y piruvato quinasa 26. Los genes de la glicolisis y degradacion del almidon de diseno, en combinacion con cualquiera de las vfas de produccion de butanol mostradas en la figura 1, pueden formar otras vfas partir del almidon/glucogeno hasta el butanol (17-33). Por consiguiente, la coexpresion de los genes de la glicolisis y la degradacion del almidon de diseno con los genes de la via de produccion de butanol puede potenciar tambien la produccion fotobiologica de butanol. Por tanto, esta realizacion representa otra estrategia para domesticar el ciclo de Calvin para una produccion fotobiologica potenciada de butanol. En este caso, algunos de los productos del ciclo de Calvin fluyen a traves de la via de smtesis de almidon (13-16), seguida de la via del almidon/glucogeno hasta el butanol (17-33), tal como se muestra en la figura 1. En este caso, el almidon/glucogeno actua como deposito de almacenamiento transitorio de los productos del ciclo de Calvin antes de que puedan convertirse en butanol. Este mecanismo es bastante util para maximizar el rendimiento de produccion de butanol en ciertos casos. Por ejemplo, con una alta intensidad de luz solar, tal como alrededor del mediodfa, la tasa de fijacion fotosintetica del CO2 del ciclo de Calvin puede ser tan alta que exceda la maxima tasa de capacidad de una via o vfas de produccion de butanol; el uso de los mecanismos de smtesis de almidon permite el almacenamiento temporal del exceso de productos fotosinteticos para ser utilizados mas tarde tambien para la produccion de butanol.

La figura 1 tambien ilustra el uso de una via del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno con enzimas de diseno (marcadas como 17 a 33) en combinacion con una via o vfas de produccion de butanol de diseno que se bifurcan del ciclo de Calvin, tal como la via de produccion de butanol que se bifurca desde el gliceraldehndo-3-fosfato 01-12, para una produccion fotobiologica potenciada de butanol. Similar a los beneficios de emplear las vfas de produccion de butanol de diseno que se bifurcan del ciclo de Calvin, el uso de la via del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno (17-33) tambien puede ayudar a convertir los productos fotosinteticos en butanol antes de que los azucares se conviertan en otras biomoleculas complejas, tales como biomasas lignocelulosicas, que no pueden ser empleadas con facilidad por las industrias de la biorrefinena. Por tanto, el uso apropiado de la via o vfas de produccion de butanol de diseno que se bifurcan del ciclo de Calvin (tales como 01-12, 03-12, y/o 20-33) y/o la via del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno (17-33), puede representar una tecnologfa revolucionaria que, entre otras cuestiones, puede sortear de modo eficaz los problemas de cuello de botella de la actual tecnologfa de biomasa, que incluyen el problema de la “recalcitrancia lignocelulosica”.

Otra caractenstica es que la actividad de la via de produccion de butanol de diseno que se bifurca del ciclo de Calvin (tal como 01-12, 03-12, y/o 20-33) puede aparecer predominantemente durante los dfas en que haya luz, porque emplea un producto intermedio del ciclo de Calvin que requiere un suministro de poder reductor (NADPH) y energfa (ATP) generado por la disociacion fotosintetica del agua y el proceso de transporte de electrones acoplado a la translocacion de protones activado por la luz a traves del sistema de las membranas tilacoides. La via del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno (17-33) que puede utilizar el superavit de azucar que ha sido almacenado como almidon/glucogeno durante la fotosmtesis, puede funcionar no solo durante el dfa, sino tambien por la noche. Por consiguiente, el uso de una via de produccion de butanol de diseno que se bifurca del ciclo de Calvin (tales como 01-12, 03-12, y/o 20-33) junto con una via o vfas del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno (17-33), tal como se ilustra en la figura 1, permite la produccion de butanol durante el dfa y la noche.

Debido a que la expresion de la via o vfas del almidon/glucogeno hasta el butanol de diseno y la via o vfas de produccion de butanol de diseno que se bifurcan del ciclo de Calvin estan controladas por el uso de un promotor inducible, tal como un promotor de hidrogenasa anaerobio, este tipo de organismos de diseno tambien son capaces de crecer de modo fotoautotrofo bajo condiciones aerobias (normales). Cuando los organismos fotosinteticos de diseno se cultivan y estan listos para la produccion fotobiologica de butanol, las celulas entonces se colocan bajo

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condiciones inductoras espedficas, tales como bajo condiciones anaerobias [o el uso de un desplazamiento de fertilizante desde amonio a nitrato, si se emplea la via o vfas de produccion de butanol controladas por el promotor Nia1/nirA de diseno] para la produccion potenciada de butanol, tal como se muestra en las figuras 1 y 3.

Se muestran ejemplos de genes de degradacion del almidon (glucogeno) en las SEQ ID NO:29-33 listadas. Brevemente, sEq ID NO:29 presenta el ejemplo 29 para una construccion de ADN de amilasa de diseno (1889 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188), un sitio Xho I Ndel de 9 pb (189-197), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (198-332), una secuencia que codifica la amilasa (333-1616) seleccionada y modificada a partir de una alfa-amilasa de la cebada (GenBank: J04202A my46 expresion ensayada en celulas de aleurona), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1617-1637), un sitio Xbal de 9 pb (1638-1646), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1647-1869), y un cebador RE de PCR (1870-1889).

SEQ ID NO:30 presenta el ejemplo 30 para una construccion de ADN de almidon fosforilasa de diseno (3089 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188),un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (189-323), una secuencia que codifica la almidon fosforilasa (324-2846) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de almidon fosforilasa de rafces de dtricos (GenBank: AY098895, expresion ensayada en rafces de dtricos), un terminador de RbcS2 de 223 pb (2847-3069), y un cebador RE de PCR (30703089).

SEQ ID NO:31 presenta el ejemplo 31 para una construccion de ADN de hexosa quinasa de diseno (1949 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188),un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (189-323), una secuencia que codifica la hexosa quinasa (324-1706) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de ARNm de hexoquinasa de Ajellomyces capsulatus (Genbank: XM—001541513), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1707-1929), y un cebador Re de PCR (1930-1949).

SEQ ID NO:32 presenta el ejemplo 32 para una construccion de ADN de fosfoglucomutasa de diseno (2249 pb) que incluye un cebador FD de pCr (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188),un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (189-323), una secuencia que codifica la fosfoglucomutasa (324-2006) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de fosfomutasa de Pichia stipitis (GenBank: XM—001383281), un terminador de RbcS2 de 223 pb (2007-2229), y un cebador RE de PCR (2230-2249).

SEQ ID NO:33 presenta el ejemplo 33 para una construccion de ADN de glucosa-fosfato isomerasa de diseno (2231 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de NR de 84 pb x 2 (21-188), un peptido de transito de RbcS2 de 135 pb (189-323), una secuencia que codifica la glucosa-fosfato isomerasa (324-1988) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de glucosa-fosfato isomerasa de S. cerevisiae (GenBank: M21696), un terminador de RbcS2 de 223 pb (1989-2211), y un cebador RE de PCR (2212-2231).

Los genes de la degradacion del almidon de diseno, tales como los que aparecen en SEQ ID NO:29-33, pueden seleccionarse para su uso en combinacion con cualquiera de los genes de la via de produccion de butanol de diseno para la construccion de diversas vfas de produccion de butanol de la degradacion del almidon de diseno, tales como las vfas mostradas en figura 1. Por ejemplo, los genes de diseno que aparecen en SEQ ID NO:1-12, 24-26, y 29-33 pueden seleccionarse para la construccion de una via de produccion de butanol desde el almidon controlada por el promotor de Nia1 que incluye las siguientes enzimas de diseno: amilasa, almidon fosforilasa, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa-fosfato isomerasa, fosfofructosa quinasa, fructosa difosfato aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato-NADP+ oxidorreductasa (o piruvato-ferredoxina oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehndo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa. Esta via del almidon/glucogeno hasta el butanol 17-33 puede emplearse por sf sola y/o en combinaciones con otra via o vfas de produccion de butanol, tales como la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3- fosfoglicerato 03-12, segun se ilustra en la figura 1.

Distribucion de las v^as de produccion de butanol de diseno entre el cloroplasto y el citoplasma

En otra realizacion de la presente invencion, la productividad fotobiologica del butanol se potencia mediante una distribucion seleccionada de la via o vfas de produccion de butanol de diseno entre el cloroplasto y el citoplasma en una celula vegetal eucariota. Es decir, no todas las vfas de produccion de butanol de diseno (figura 1) deben funcionar en el cloroplasto; cuando sea necesario, parte de las vfas de produccion de butanol de diseno pueden funcionar tambien en el citoplasma. Por ejemplo, en una de las diversas realizaciones, una parte significativa de la actividad de la via del almidon hasta el butanol de diseno, desde la dihidroxiacetona fosfato hasta el butanol (21-33), se disena para que se produzca en el citoplasma, mientras que las etapas desde el almidon hasta la dihidroxiacetona fosfato (17-20) se producen en el cloroplasto. En este ejemplo, el enlace entre las partes en el cloroplasto y en el citoplasma de la via de diseno se logra mediante el uso de un translocador de triosa fosfato- fosfato, que facilita la translocacion de la dihidroxiacetona a traves de la membrana del cloroplasto. Mediante el uso del translocador de triosa fosfato-fosfato, tambien se permite el funcionamiento de la via de produccion de butanol de diseno que se bifurca desde el gliceraldehido-3-fosfato no solo en el cloroplasto, sino tambien en el citoplasma. La parte del citoplasma de la via de produccion de butanol de diseno pueden construirse mediante el uso de genes de la via de produccion de butanol de diseno (construcciones de ADN de la figura 2A), omitiendose su secuencia de

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transporte dirigido al cloroplasto, tal como se muestra en la 2E.

Oxifotobacterias de diseno con v^as de produccion de butanol de diseno en el citoplasma

En organismos fotosinteticos procariotas, tales como algas verdeazuladas (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias), que generalmente contienen membranas tilacoides fotosinteticas pero no una estructura de cloroplasto, el ciclo de Calvin se localiza en el citoplasma. En este caso especial, la via o vfas de produccion de butanol de diseno completas (figura 1) que incluyen, pero no se limitan a la via de produccion de butanol que se bifurca desde la gliceraldehndo-3-fosfato (01-12), la via de produccion de butanol que se bifurca desde el 3-fosfoglicerato (03-12), la via que se bifurca desde la fructosa-1,6-difosfato (20-33), la via que se bifurca desde la fructosa-6-fosfato (19-33), y las vfas desde el almidon (o glucogeno) hasta el butanol (17-33) se ajustan en su diseno para que funcionen con el ciclo de Calvin en el citoplasma de un alga verdeazulada. La construccion de las vfas de produccion de butanol de diseno del citoplasma puede lograrse mediante el uso de genes de la via de produccion de butanol de diseno (construcciones de ADN de la figura 2A), omitiendose su secuencia de transporte dirigido al cloroplasto. Cuando la secuencia de transporte dirigido al cloroplasto se omite en la construccion o construcciones de ADN de diseno, tal como se ilustra en la figura 2E, el gen o genes de diseno se transcriben y se traducen en las enzimas de diseno en el citoplasma, en donde se introducen en la via o vfas de produccion de butanol de diseno. El gen o genes de diseno pueden incorporarse en el ADN cromosomico y/o plasirndico en un alga verdeazulada hospedante (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias) empleando las tecnicas de la transformacion de genes conocidas por los expertos en la tecnica. Una practica preferida consiste en integrar los genes de diseno a traves de una transformacion integradora en el aDn cromosomico, que habitualmente proporciona mejor estabilidad genetica a los genes de diseno. En las oxifotobacterias, tales como cianobacterias y oxiclorobacterias, la transformacion integradora puede lograrse a traves de un proceso de recombinacion doble de ADN homologo en el ADN cromosomico del hospedante, empleando una construccion de ADN segun se ilustra en la figura 2F, que generalmente consiste, desde 5' cadena arriba hasta 3' cadena abajo, en: un sitio de recombinacion 1, un gen o genes de la via de produccion de butanol de diseno, y un sitio de recombinacion 2. Este tipo de construcciones de ADN (figura 2F) pueden introducirse en las oxifotobacterias (algas verdeazuladas) con una serie de tecnicas de transformacion genetica disponibles, que incluyen electroporacion, transformacion natural y/o conjugacion. Los organismos transgenicos de diseno creados a partir de algas verdeazuladas tambien se denominan algas verdeazuladas de diseno (oxifotobacterias de diseno, que incluyen cianobacterias de diseno y oxiclorobacterias de diseno).

Se muestran ejemplos de genes de la via de produccion de butanol de oxifotobacterias de diseno en las SEQ ID NO:34-45 listadas. Brevemente, SEQ ID NO:34 presenta el ejemplo 34 para una construccion de ADN de butanol deshidrogenasa de oxifotobacterias de diseno (1709 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrito reductasa (nirA) de 400 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-420), una secuencia codificadora de enzima (421-1569) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la butanol deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AB257439), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1570-1689), y un cebador RE de PCR (1690-1709) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:35 presenta el ejemplo 35 para una construccion de ADN de butiraldehndo deshidrogenasa de oxifotobacterias de diseno (1967 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrito reductasa (nirA) de 400 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-420), una secuencia codificadora de enzima (421-1827) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la butiraldehndo deshidrogenasa de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (AY251646), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1828-1947), y un cebador RE de PCR (1948-1967) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:36 presenta el ejemplo 36 para una construccion de ADN de butiril-CoA deshidrogenasa de oxifotobacterias de diseno (1602 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia que codifica la butiril-CoA deshidrogenasa (326-1422) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una butiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (AF494018), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1423-1582), y un cebador RE de PcR (1583-1602) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:37 presenta el ejemplo 37 para una construccion de ADN de crotonasa de oxifotobacterias de diseno (1248 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nitrato reductasa de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia que codifica la crotonasa (326-1108) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una crotonasa de Clostridium beijerinckii (GenBank: AF494018), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1109-1228), y un cebador RE de PCR (1229-1248).

SEQ ID NO:38 presenta el ejemplo 38 para una construccion de ADN de 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de oxifotobacterias de diseno (1311 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 305 pb procedente de (21-325), una secuencia que codifica la 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (326-1171) seleccionada/modificada a partir de la secuencia de una 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa de Clostridium beijerinckii (GenBank: AF494018), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1172-1291), y un cebador RE de PCR (1292-1311).

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SEQ ID NO:39 presenta el ejemplo 39 para una construccion de ADN de tiolasa de oxifotobacterias de diseno (1665 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia que codifica la tiolasa (326-1525) seleccionada/modificada a partir de una secuencia de tiolasa de Butyrivibrio fibrisolvens (AB190764), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1526-1645), y un cebador Re de PCR (1646-1665).

SEQ ID NO:40 presenta el ejemplo 40 para una construccion de ADN de piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de oxifotobacterias de diseno (4071 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia que codifica la piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (326-3931) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una piruvato-ferredoxina oxidorreductasa de Mastigamoeba balamuthi (GenBank: AY101767), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (3932-4051), y un cebador RE de PCR (4052-4071).

SEQ ID NO:41 presenta el ejemplo 41 para una construccion de ADN de piruvato quinasa de oxifotobacterias de diseno (1806 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia que codifica la piruvato quinasa (326-1666) seleccionada/modificada a partir de una piruvato quinasa de Thermoproteus tenax (GenBank: AF065890), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1667-1786), y un cebador RE de PCR (1787-1806) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:42 presenta el ejemplo 42 para una construccion de ADN de enolasa de oxifotobacterias de diseno (1696 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 231 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), una secuencia que codifica la enolasa (252-1556) seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una enolasa citosolica de Chlamydomonas reinhardtii (GenBank: X66412, P31683), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (15571676), y un cebador RE de PCR (1677-1696) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:43 presenta el ejemplo 43 para una construccion de ADN de fosfoglicerato mutasa de oxifotobacterias de diseno (2029 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 231 pb de

Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (252-1889)

seleccionada/modificada a partir de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa de Pelotomaculum thermopropionicum SI (GenBank: YP—001213270), un terminador de rbcS de 120 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1890-2009), y un cebador RE de PCR (2010-2029) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:44 presenta el ejemplo 44 para una construccion de ADN de fosfoglicerato quinasa de oxifotobacterias de diseno (1687 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 231 pb de

Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-251), una secuencia que codifica la fosfoglicerato quinasa (252-1433)

seleccionada a partir de una fosfoglicerato quinasa de Pelotomaculum thermopropionicum SI (BAF60903), un terminador de rbcS de 234 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (1434-1667), y un cebador RE de PCR (1668-1687).

SEQ ID NO:45 presenta el ejemplo 45 para una construccion de ADN de gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa de oxifotobacterias de diseno (1514 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de 305 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (21-325), una secuencia codificadora de enzima (326-1260) seleccionada y modificada a partir de una gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD de Blastochloris viridis (CAC80993), un terminador de rbcS de 234 pb de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (12611494), y un cebador RE de PCR (1495-1514).

Los genes de oxifotobacterias de diseno, tales como los que aparecen en SEQ ID NO:34-45, pueden seleccionarse para su uso completos, en parte y/o en combinacion con diversos otros genes de la via de produccion de butanol de diseno para la construccion de diversas otras vfas de produccion de butanol en oxifotobacterias de diseno, tales como las vfas mostradas en figura 1. Por ejemplo, los genes de diseno que aparecen en SEQ ID NO:34-45 pueden seleccionarse para la construccion de una via de produccion de butanol se bifurca desde el la gliceraldetndo-3- fosfatasa controlada por el promotor de nirA de oxifotobacterias (01-12) que comprende las siguientes enzimas de diseno: gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD 01, fosfoglicerato quinasa 02, fosfoglicerato mutasa 03, enolasa 04, piruvato quinasa 05, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (o piruvato-NADP+ oxidorreductasa) 06, tiolasa 07, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa 08, crotonasa 09, butiril-CoA deshidrogenasa 10, butiraldetndo deshidrogenasa 11, y butanol deshidrogenasa 12. El uso de estos genes de la via de produccion de butanol de oxifotobacterias de diseno (SEQ ID NO:34-45) en una cianobacteria termofila y/o termotolerante puede representar una oxifotobacteria productora de butanol termofila y/o termotolerante. Por ejemplo, el uso de estos genes de diseno (SEQ ID NO:34-45) en una cianobacteria termofila/termotolerante, tal como Thermosynechococcus elongatus BP-1, puede representar una cianobacteria productora de butanol termofila/termotolerante de diseno, tal como Thermosynechococcus productora de butanol de diseno.

Otras modificaciones del hospedante para ayudar a asegurar la bioseguridad

La presente tambien proporciona metodos de produccion fotosintetica de biocombustible con proteccion de

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bioseguridad basados en plantas transgenicas o celulas vegetales de diseno que se controlan por medio de la division celular (tales como algas y oxifotobacterias). El organismo fotosintetico de diseno controlable por medio de la division celular (figura 3) se crea mediante el uso de un gen o genes de control de la bioseguridad de diseno (figura 2G) junto con el gen o genes de la via de produccion de butanol de diseno (figuras 2A-2F), de modo que su division celular y la funcion de apareamiento pueden detenerse de modo controlable para proporcionar mejores caractensticas de bioseguridad.

En una de las diversas realizaciones, una caractenstica fundamental es que el organismo controlable por medio de la division celular de diseno (tal como un alga, una celula vegetal o una oxifotobacteria) contiene dos funciones clave (figura 3A): un mecanismo o mecanismos de bioseguridad de diseno y una via o vfas de produccion de biocombustible de diseno. Tal como se muestra en la figura 3B, la caractenstica o caractensticas de bioseguridad de diseno son conferidas por una serie de mecanismos que incluyen: (1) la insercion inducible de canales de protones de diseno en la membrana citoplasmica para inutilizar permanentemente cualquier capacidad de division celular y de apareamiento, (2) la aplicacion selectiva de una protema reguladora del ciclo de division celular de diseno o ARN de interferencia (ARNi) para inhibir permanentemente el ciclo de division celular y preferiblemente mantener la celula en la fase Gi o el estado Go, y (3) el uso innovador de un organismo fotosintetico hospedante que requiere una alta cantidad de CO2 para la expresion de la via o vfas de produccion de biocombustible de diseno. Los ejemplos de la via o vfas de produccion de biocombustibles de diseno incluyen la via o vfas de produccion de butanol de diseno, que actuan con el ciclo de Calvin para sintetizar un biocombustible, tal como butanol, directamente a partir de dioxido de carbono (CO2) y agua (H2O). La tecnologfa de control de la division celular de diseno puede ayudar a asegurar la bioseguridad cuando se emplean los organismos de diseno para la produccion fotosintetica de biocombustibles. Por consiguiente, esta realizacion proporciona, entre otras cuestiones, metodos con proteccion de bioseguridad para producir biocombustibles basados en un alga, cianobacteria, oxiclorobacteria, planta o celula vegetal productora de biocombustible de diseno controlable por medio de la division celular.

En una de las diversas realizaciones, se crea una celula vegetal o alga eucariota que produce butanol de diseno controlable por medio de la division celular mediante la introduccion de un gen del canal de protones de diseno (figura 2H) en un alga o celula vegetal hospedante (figura 3B). SEQ ID NO: 46 presenta el ejemplo 46 para una construccion de ADN detallada de un gen del canal de protones controlada por el promotor Nial de diseno (609 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de Nial de 262 pb (21-282), una secuencia que codifica el canal de protones de melitina (283-366), un terminador de RbcS2 de 223 pb (367-589), y un cebador RE de PCR (590-609).

La expresion del gen del canal de protones de diseno (figura 2H) es controlada por un promotor inducible, tal como el promotor de la nitrato reductasa (Nial), que tambien puede utilizarse para controlar la expresion de un gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno. Por tanto, antes de inducir la expresion del gen o genes de diseno, el organismo de diseno puede crecer de modo fotoautotrofo empleando CO2 como fuente de carbono y H2O como fuente de electrones, igual que el organismo de tipo salvaje. Cuando el cultivo del organismo de diseno se cultiva y esta listo para la produccion fotobiologica de biocombustible, el cultivo celular se coloca bajo condiciones inductoras espedficas (tales como la adicion de nitrato en el medio de cultivo, si se emplea el promotor de la nitrato reductasa (Nial) como promotor inducible) para inducir la expresion del gen del canal de protones de diseno y del gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno. La expresion del gen del canal de protones se disena para que se produzca a traves de su transcripcion en el nucleo y su traduccion en el citosol. Debido al diseno molecular espedfico, los canales de protones expresados se insertan automaticamente en la membrana citoplasmica, pero dejan intacta a la membrana tilacoide fotosintetica. La insercion de los canales de protones de diseno en la membrana citoplasmica colapsa el gradiente de protones a traves de la membrana citoplasmica, de modo que la division celular y la funcion de apareamiento quedan permanentemente inutilizadas. Sin embargo, la membrana tilacoide fotosintetica dentro del cloroplasto se mantiene intacta (funcional), de modo que las enzimas de la via de produccion de biocombustible de diseno expresadas en la region estromatica pueden trabajar con el ciclo de Calvin para la produccion fotobiologica de biocombustibles a partir de CO2 y H2O. Es decir, cuando el gen del canal de protones de diseno y el gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno se activan, el organismo de diseno se convierte en una celula que no puede reproducirse para la produccion fotosintetica dedicada de biocombustibles. Debido a que la division celular y la funcion de apareamiento estan permanentemente inutilizadas (muertas) en esta etapa, el cultivo de organismos de diseno ya no es una materia viva, excepto por su funcion catalftica para la conversion fotoqmmica de CO2 y H2O en un biocombustible. Ya no es capaz de aparearse ni de intercambiar material genetico con ninguna otra celula, aunque se pusiera en contacto de alguna forma con una celula de tipo salvaje, tal como sena el caso de una liberacion accidental hacia el entorno.

Segun una de las diversas realizaciones, el promotor de la nitrato reductasa (Nial) o el promotor de la nitrito reductasa (nirA) son promotores inducibles preferidos para su uso para controlar la expresion de los genes de diseno. En presencia de amonio (pero no de nitrato) en el medio de cultivo, por ejemplo, un organismo de diseno con un gen del canal de protones de diseno controlado por el promotor de Nial y un gen o genes de la via de produccion de biocombustible puede crecer de modo fotoautotrofo empleando CO2 como fuente de carbono y H2O como fuente de electrones, igual que el organismo de tipo salvaje. Cuando el cultivo del organismo de diseno se cultiva y esta listo para la produccion fotobiologica de biocombustible, la expresion del gen del canal de protones de diseno y el gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno puede ser inducida entonces mediante la adicion de algun fertilizante de nitrato al medio de cultivo. El nitrato esta muy presente en suelos y en casi toda el agua

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superficial del planeta. Por tanto, aunque un organismo de diseno controlado por el promotor de Nia1 se liberase accidentalmente hacia el entorno natural, pronto morina puesto que el entorno activana la expresion del gen del canal de protones de diseno controlado por el promotor de Nia1, que inserta canales de protones en la membrana citoplasmica y, con ello, mata a la celula. Es decir, un organismo fotosintetico de diseno con un gen del canal de protones controlado por el promotor de Nia1 esta programado para morir en cuanto detecta nitrato en el entorno. Esta caractenstica de los organismos de diseno controlables por la division celular con un gen del canal de protones controlado por el promotor de Nia1 proporciona una caractenstica de bioseguridad anadida.

La tecnica de la construccion de genes de canales de protones (figura 2H) con una secuencia de transporte dirigido a la membrana tilacoide ha sido descrita recientemente [James W. Lee (2007), Designer proton-channel transgenic algae for photobiological hydrogen production, publicacion internacional PCT n.°: WO 2007/134340 A2]. En la presente invencion para crear un organismo de diseno controlable por medio de la division celular, la secuencia de transporte dirigido a la membrana tilacoide debe omitirse en el diseno del gen del canal de protones. Por ejemplo, los componentes fundamentales de un gen del canal de protones de diseno controlado por el promotor de Nia1 pueden ser simplemente un promotor de Nia1 unido a una secuencia que codifica un canal de protones (sin ninguna secuencia de transporte dirigido a la membrana tilacoide), de modo que el canal de protones se insertara en la membrana citoplasmica, pero no en la membrana tilacoide fotosintetica.

Segun una de las diversas realizaciones, una practica preferida es emplear el mismo promotor inducible, tal como el promotor de Nia1, para controlar la expresion del gen del canal de protones de diseno y los genes de la via de produccion de biocombustible de diseno. De esta forma, la via o vfas de produccion de biocombustible de diseno pueden ser expresadas de modo inducible simultaneamente con la expresion del gen del canal de protones de diseno que detiene ciertas funciones celulares, que incluyen la division celular y el apareamiento.

En una de las diversas realizaciones, un promotor inducible que puede emplearse en esta realizacion de bioseguridad de diseno se selecciona del grupo que consiste en promotores de hidrogenasa [HydAI (Hyd1) y HydA2, n.° de registro: AJ308413, AF289201, AY090770], el promotor del gen Cyc6, el promotor del gen Cpx1, el promotor de la protema de choque termico HSP70A, el promotor del gen CablI-1 (n.° de registro M24072), el promotor del gen Ca1 (n.° de registro P20507), el promotor del gen Ca2 (n.° de registro P24258), el promotor de la nitrato reductasa (Nia1), los promotores del gen de la nitrito reductasa (nirA), los promotores hox del gen de hidrogenasa bidireccional, los promotores groE que responden a la luz y al calor, los promotores rbcL del operon de rubisco, el promotor smt inducible por metales (cinc), el promotor idiA que responde al hierro, el promotor crhR que responde a redox, el promotor hsp16.6 del gen de choque termico, el promotor de la protema del choque termico pequena (Hsp), los promotores del gen de anhidrasa carbonica que responden a CO2, el promotor cpcB2A2 que responde a la luz verde/roja, los promotores lexA, recA y ruvB que responden a la luz UV, los promotores del gen de la nitrato reductasa (narB), y sus combinaciones.

En otra realizacion, se crea un organismo fotosintetico controlable por medio de la division celular mediante el uso de un mutante deficiente en anhidrasa carbonica o un mutante que requiere una alta cantidad de CO2 como organismo hospedante, para crear el organismo de produccion de biocombustible de diseno. Los mutantes que requieren una alta cantidad de CO2 que pueden seleccionarse para su uso en esta invencion incluyen, pero no se limitan a: Chlamydomonas reinhardtii mutante deficiente en anhidrasa carbonica 12-1C (CC-1219 cal mt-), Chlamydomonas reinhardtii mutante cia3 (Plant Physiology, 2003, 132:2267-2275), el mutante que requiere una alta cantidad de CO2 M3 de Synechococcus sp. cepa PCC 7942, o las celulas deficientes en carboxisomas de Synechocystis sp. PCC 6803 (Plant biol. (Stuttg.), 2005, 7:342-347) que carece del mecanismo de concentracion de CO2 y puede crecer de modo fotoautotrofo solo bajo un nivel elevado de concentracion de CO2, tal como CO2 al 0,23%.

Bajo un nivel de concentracion atmosferica de CO2 (380 ppm), los mutantes deficientes en anhidrasa carbonica o que necesitan una alta cantidad de CO2 habitualmente no pueden sobrevivir. Por tanto, en este caso, el concepto clave es que un organismo de produccion de biocombustible de diseno que requiere una alta cantidad de CO2 que carezca del mecanismo de concentracion de CO2 se cultivara y empleara para la produccion fotobiologica de biocombustibles siempre bajo un nivel elevado de concentracion de CO2 (CO2 al 0,2-5%) en un biorreactor sellado con alimentacion de CO2. Este organismo transgenico de diseno no puede sobrevivir cuando se expone a un nivel de concentracion atmosferico de CO2 (380 ppm = CO2 al 0,038%) porque su mecanismo de concentracion de CO2 (CCM) para la fijacion fotosintetica eficaz del CO2 esta deteriorado debido a la mutacion. Aunque dicho organismo de diseno se liberase accidentalmente al entorno natural, sus celulas pronto no seran capaces de dividirse o de aparearse, y moriran con rapidez por privacion de carbono, puesto que no pueden realizar con eficacia la fijacion fotosintetica del CO2 a la concentracion atmosferica de CO2 (380 ppm). Por tanto, el uso de dicho mutante que requiere una alta cantidad de CO2 como organismo hospedante para la transformacion genica de un gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno representa otra forma de crear los organismos de diseno controlables por la division celular previstos para la produccion fotobiologica con proteccion de bioseguridad de biocombustibles a partir de CO2 y H2O. En este caso, no se requiere un gen del canal de protones de diseno.

En otra realizacion, se crea un organismo de diseno controlable por medio de la division celular (figura 3B) mediante el uso de un gen regulador del ciclo de la division celular de diseno como gen de control de la bioseguridad (figura 2G) que pueden controlar la expresion de genes del ciclo de division de la celula (cdc) en el organismo hospedante,

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de modo que pueden desactivar, de modo inducible, sus funciones reproductivas, tales como inactivar permanentemente la division celular y la capacidad de apareamiento tras una induccion espedfica del gen de diseno.

Desde el punto de vista biologico, es la expresion de los genes cdc naturales lo que controla el crecimiento celular y el ciclo de division de la celula en cianobacterias, algas y celulas de plantas superiores. La funcion mas basica del ciclo celular es duplicar, de modo preciso, la enorme cantidad de ADN en los cromosomas durante la fase S (S de smtesis) y despues segregar con precision las copias en dos celulas hijas geneticamente identicas durante la fase M (M de mitosis). La mitosis comienza generalmente con la condensacion de los cromosomas: las hebras de ADN duplicadas, compactadas en cromosomas alargados, se condensan en cromosomas mucho mas compactos necesarios para su segregacion. El envuelta nuclear se degrada, y los cromosomas replicados (cada uno consiste en un par de cromatidas hermanas) se unen a los microtubulos del huso mitotico. A medida que avanza la mitosis, la celula se detiene brevemente en un estado denominado metafase, en el que los cromosomas se alinean en el ecuador del huso mitotico, listos para la segregacion. La segregacion repentina de las cromatidas hermanas marca el comienzo de la anafase, durante la cual los cromosomas se mueven hacia polos opuestos del huso, en donde se descondensan y vuelven a formar nucleos intactos. La celula despues se divide en dos mediante dos divisiones citoplasmicas (citoquinesis) y entonces se completa la division de la celula. Notese que la mayona de las celulas requieren mucho mas tiempo para crecer y duplicar su masa de protemas y organulos que el que requieren para replicar su ADN (la fase S) y dividirse (la fase M). Por tanto, existen dos fases vadas: una fase a Gi entre la fase M y la fase S, y una fase g2 entre la fase S y la mitosis. Como resultado, el ciclo de las celulas eucariotas tradicionalmente se divide en cuatro fases secuenciales: Gi, S, G2, y M. Desde el punto de vista fisiologico, las dos fases vadas tambien proporcionan tiempo a la celula para que controle el entorno interno y externo para asegurarse de que las condiciones son adecuadas y la preparacion se ha completado antes de que la celula se comprometa al considerable trastorno que supone la fase S y la mitosis. La fase Gi es especialmente importante en este aspecto. Su longitud puede variar en gran medida dependiendo de las condiciones externas y de las senales extracelulares procedentes de otras celulas. Si las condiciones extracelulares son desfavorables, por ejemplo, las celulas retrasan el avance a traves de Gi e incluso pueden entrar en un estado de reposo especializado denominado Go (G cero), en el que permanecen durante dfas, semanas o incluso anos antes de reanudar la proliferacion. En efecto, muchas celulas permanecen permanentemente en el estado Go hasta que mueren.

En una de las diversas realizaciones, un gen o genes de diseno que codifican una protema reguladora de cdc de diseno o un ARNi de cdc espedfico se emplean para inhibir, de modo inducible, la expresion de cierto gen o genes cdc para detener la division de la celula e inutilizar la capacidad de reproduccion cuando el gen o genes de diseno son activados por una condicion inductora espedfica. Cuando el cultivo de diseno controlable por medio de la division celular se cultiva y esta listo para la produccion fotosintetica de biocombustible, por ejemplo, una practica preferida consiste en inducir la expresion de un gen o genes de ARNi de cdc de diseno espedficos, junto con la induccion de un gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno, de modo que las celulas se detengan permanentemente en la fase Gi o en el estado Go. De esta forma, las celulas del organismo de diseno cultivadas se convierten en catalizadores perfectos para la produccion fotosintetica de biocombustibles a partir de CO2 y H2O, mientras que sus funciones de division celular y apareamiento se inactivan permanentemente en la fase Gi o el estado Go para ayudar a asegurar la bioseguridad.

El uso de las realizaciones de bioseguridad con diversos genes de produccion de biocombustible de diseno listados en SEQ ID:i-45 puede crear diversos productores de biocombustible fotobiologico con proteccion de bioseguridad (figuras 3A, 3B, y 3C). Notese que SEQ ID NO:46 y i-i2 (ejemplos i-i2) representan un ejemplo de un organismo eucariota de diseno controlable por medio de la division celular, tal como un alga de diseno controlable por medio de la division celular (por ejemplo, Chlamydomonas) que contiene un gen del canal de protones controlado por el promotor de Niai de diseno (SEQ ID nO:46) y un conjunto de genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de Niai de diseno (SEQ ID NO:i-i2). Debido a que el gen del canal de protones de diseno y el gen o genes de la via de produccion de biocombustible de diseno estan todos controlados por las mismas secuencias del promotor de Niai, pueden expresarse simultaneamente tras la induccion por medio de la adicion de un fertilizante de nitrato en el medio de cultivo, para proporcionar la capacidad productora de biocombustible fotosintetico con proteccion de bioseguridad, tal como se ilustra en la figura 3B. El uso de los genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de Niai de diseno (SEQ ID NO:i-i2) en un organismo fotosintetico que requiere una alta cantidad de CO2, tal como Chlamydomonas reinhardtii mutante deficiente en anhidrasa carbonica i2-iC (CC-i2i9 cal mt-) o el mutante cia3 de Chlamydomonas reinhardtii, representa otro ejemplo de creacion de un organismo fotosintetico controlable por medio de la division celular de diseno para ayudar a asegurar la bioseguridad.

La caractenstica de bioseguridad de diseno puede ser util para la produccion de otros biocombustibles, tales como bioaceites, biohidrogeno, etanol y tambien los productos intermedios. Por ejemplo, esta realizacion de bioseguridad en combinacion con un conjunto de genes de la via de produccion de etanol de diseno, tales como los que aparecen en SEQ ID NO:47-53, puede representar un productor de etanol controlable por medio de la division celular (figura 3C). Brevemente, SEQ ID NO:47 presenta el ejemplo 47 para una construccion de ADN detallada (i360 pares de bases (pb)) un gen de la gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD de diseno controlado por el promotor de nirA que incluye: un cebador FD de PCR (secuencia i-20), un promotor de nirA de 88 pb (2i-i08) seleccionado de la secuencia del promotor del gen de la nitrito reductasa de Synechococcus sp. cepa PCC 7942

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(cianobacteria de agua dulce), una secuencia codificadora de enzima (109-1032) seleccionada y modificada a partir de una secuencia de la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD citosolica de Cyanidium caldarium (GenBank n.° de registro: CAC85917), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1033-1340), y un cebador RE de PCR (1341-1360) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:48 presenta el ejemplo 48 para una construccion de ADN de fosfoglicerato quinasa controlada por el promotor de nirA de diseno (1621 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), una secuencia que codifica la fosfoglicerato quinasa (109-1293) seleccionada de una secuencia de la fosfoglicerato quinasa de Geobacillus kaustophilus HTA426 (GenBank: BAD77342), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1294-1601), y un cebador RE de PCR (1602-1621).

SEQ ID NO:49 presenta el ejemplo 49 para una construccion de ADN de fosfoglicerato mutasa controlada por el promotor de nirA de diseno (1990 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), un sitio Xho I Ndel de 9 pb (109-117), una secuencia que codifica la fosfoglicerato mutasa (118-1653) seleccionada de las secuencias de una fosfoglicerato mutasa de Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903 (GenBank: ABP67536), un sitio Xbal de 9 pb (1654-1662), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1663-1970), y un cebador RE de PCR (1971-1990).

SEQ ID NO:50 presenta el ejemplo 50 para una construccion de ADN de enolasa controlada por el promotor de nirA de diseno (1765 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (109-117), una secuencia que codifica la enolasa (118-1407) seleccionada de la secuencia de una enolasa de Cyanothece sp. CCY0110 (GenBank: ZP—01727912), una secuencia que codifica el marcador Lumio de 21 pb (1408-1428), un sitio XbaI de 9 pb (1429-1437) que contiene un codon de fin, un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1438-1745), y un cebador RE de PCR (1746-1765) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:51 presenta el ejemplo 51 para una construccion de ADN de piruvato quinasa controlada por el promotor de nirA de diseno (1888 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), un sitio xho I NdeI de 9 pb (109-117), una secuencia que codifica la piruvato quinasa (118-1530) seleccionada de una secuencia de la piruvato quinasa de Selenomonas ruminantium (GenBank: AB037182), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1531-1551), un sitio XbaI de 9 pb (1552-1560), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa pCc 7942 (15611868), y un cebador RE de PCR (1869-1888).

SEQ ID NO:52 presenta el ejemplo 52 para una construccion de ADN de piruvato descarboxilasa controlada por el promotor de nirA de diseno (2188 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 1-20), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), un sitio Xho I NdeI de 9 pb (109-117), una secuencia que codifica la piruvato descarboxilasa (118-1830) seleccionada de las secuencias de una piruvato descarboxilasa de Pichia stipitis (GenBank: XM—001387668), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (18311851), un sitio XbaI de 9 pb (1852-1860), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1861-2168), y un cebador rE de PCR (2169-2188) en el extremo 3'.

SEQ ID NO:53 presenta el ejemplo 53 para una construccion de ADN de alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD(P)H controlada por el promotor de nirA de diseno (1510 pb) que incluye un cebador FD de PCR (secuencia 120), un promotor de nirA de la nitrito reductasa de 88 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (21-108), una secuencia que codifica la alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD(P)H (109-1161) seleccionada/modificada (se retira la secuencia de su peptido senal mitocondrial) de una secuencia del gen de la alcohol deshidrogenasa de Kluyveromyces lactis (ADH3) (GenBank: X62766), una secuencia del marcador Lumio de 21 pb (1162-1182), un terminador de rbcS de 308 pb de Synechococcus sp. cepa PCC 7942 (1183-1490), y un cebador RE de PCR (14911510) en el extremo 3'.

Notese que las SEQ ID NO:47-53 (ejemplos de construcciones de ADN 47-53) representan un conjunto de genes de la via de produccion de etanol controlados por el promotor de nirA de diseno que pueden emplearse en oxifotobacterias, tales como Synechococcus sp. cepa PCC 7942. El uso de este conjunto de genes de la via de produccion de etanol de diseno en una cianobacteria que requiere una alta cantidad de CO2, tal como Synechococcus sp. cepa PCC 7942 mutante M3, representa otro ejemplo de una cianobacteria de diseno controlable por medio de la division celular para la produccion fotosintetica con proteccion de bioseguridad de biocombustibles a partir de CO2 y H2O.

Uso de organismos productores de butanol de diseno con procesos de recoleccion de butanol en fotobiorreactores

Las diversas realizaciones indican ademas como pueden emplearse los organismos de diseno, que incluyen organismos controlables por medio de la division celular de diseno (figura 3) con un fotobiorreactor y un proceso de separacion y recoleccion de butanol para la produccion fotosintetica de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) y O2 directamente a partir de CO2 y H2O empleando la luz solar. Existen una serie de realizaciones sobre como los

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organismos de diseno pueden utilizarse para la produccion fotobiologica de butanol. Una de las realizaciones preferidas consiste en emplear los organismos de diseno para la produccion fotosintetica de butanol directa a partir de CO2 y H2O con un reactor fotobiologico y un sistema de recoleccion de butanol (filtracion y destilacion/evaporacion), que incluye un proceso operativo espedfico descrito como una serie de las siguientes etapas: a) cultivar de modo fotoautotrofo un organismo transgenico de diseno en un medio de cultivo mmimo empleando el CO2 del aire como fuente de carbono, bajo condiciones aerobias (normales) antes de inducir la expresion de los genes de la via de produccion de butanol de diseno; b) cuando el cultivo del organismo de diseno se cultiva y esta listo para la produccion de butanol, sellar o colocar el cultivo en una condicion espedfica, tal como una condicion anaerobia, que puede ser generada mediante la eliminacion del O2 del reactor fotobiologico, para inducir la expresion de los genes de produccion de butanol de diseno; c) cuando las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno se expresan, suministrar energfa de luz visible, tal como luz solar, para que las celulas que expresan los genes de diseno funcionen como catalizadores para la produccion fotosintetica de butanol a partir de CO2 y H2O; d) recolectar el producto de butanol mediante cualquier metodo conocido por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se puede recolectar el producto de butanol del reactor fotobiologico mediante una combinacion de tecnicas de recoleccion de butanol con filtracion con membrana y destilacion/evaporacion y recoger de modo flexible el producto gaseoso de O2 del reactor.

El anterior proceso para emplear los organismos de diseno para la produccion fotosintetica de CH3CH2CH2CH2OH y O2 a partir de CO2 y H2O con un reactor biologico y la recoleccion del butanol y el sistema de recoleccion y separacion del producto gaseoso pueden repetirse para una pluralidad de ciclos operativos para lograr unos resultados mas deseables. Cualquiera de las etapas a) hasta d) de este proceso descrito anteriormente tambien puede ajustarse segun la invencion para adaptarse a ciertas condiciones espedficas. En la practica, cualquiera de las etapas a) hasta d) del proceso puede aplicarse totalmente o en parte y/o en cualquier combinacion ajustada tambien para la produccion fotobiologica de butanol potenciada segun esta invencion.

Las fuentes de CO2 que pueden emplearse en este proceso incluyen, pero no se limitan a CO2 industrial, (bi)carbonatos, y CO2 atmosferico. Por ejemplo, puede introducirse CO2 de los gases de combustion procedentes de instalaciones industriales alimentadas con combustibles fosiles y/o alimentadas con biomasa, a traves de una tubena hacia un reactor fotobiologico en este proceso. Las instalaciones industriales que pueden generar suministros de CO2 para un proceso de produccion fotosintetica de butanol de diseno incluyen, pero no se limitan a plantas de energfa alimentadas con carbon, industrias del hierro y del acero, plantas de fabricacion de cemento, instalaciones de refinenas de petroleo, fabricas de produccion de fertilizantes qmmicos, instalaciones de destilacion/separacion de biocombustibles (o productos intermedios) alimentadas con biomasa y/o alimentadas con combustibles fosiles, procesos de pirolisis de biomasa, conductos de humo, biorreactores de fermentacion, instalaciones de refinenas de biocombustibles y sus combinaciones.

Como alternativa, el proceso de produccion fotobiologica de butanol de diseno tambien puede emplear el CO2 del entorno y tambien de la atmosfera. La tecnologfa de produccion fotobiologica de butanol con organismos de diseno puede emplear CO2 gaseoso, CO2 disuelto, bicarbonato, y carbonatos.

Esta realizacion se ilustra con mas detalle en la presente empleando algas de diseno como ejemplo. Tal como se describio anteriormente, las algas de diseno de la presente invencion, tales como las que contienen un conjunto de genes de la via de produccion de butanol de diseno controlados por el promotor de HydAI de diseno (por ejemplo, las construcciones de ADN de SEQ ID NO:13-16 (o 17) y 18-23), pueden crecer con normalidad bajo condiciones aerobias mediante fotosmtesis autotrofa empleando el CO2 del aire de una manera similar al de las algas de tipo salvaje. Las algas de diseno tambien pueden crecer de modo fotoheterotrofo empleando un sustrato organico.

En una realizacion preferida, un alga de diseno se cultiva de modo fotoautotrofo empleado el CO2 del aire como fuente de carbono bajo condiciones aerobias en un medio irunimo que contiene los nutrientes minerales (inorganicos) esenciales. No es necesario ningun sustrato organico, tal como acetato, para cultivar un alga de diseno bajo condiciones normales antes de que se expresen los genes de la via de produccion fotosintetica de butanol de diseno. La mayona de las algas pueden crecer con rapidez en el agua a traves de la fotosmtesis autotrofa empleando el CO2 del aire, con la condicion de que existan suficientes nutrientes minerales. Los elementos nutrientes que se requieren normalmente para el crecimiento de las algas son: N, P, y K a concentraciones de aproximadamente 1-10 mM, y Mg, Ca, S, y Cl a concentraciones de aproximadamente 0,5 a 1,0 mM, mas algunos oligoelementos como Mn, Fe, Cu, Zn, B, Co, Mo, entre otros, a unos niveles de concentracion de |jM. Todos los nutrientes minerales pueden suministrarse en un medio mmimo acuoso que puede prepararse con recetas bien establecidas de medios de cultivo de algas empleando agua (agua dulce para las algas de agua dulce de diseno, y agua de mar para las algas marinas de diseno tolerantes a la sal) y una cantidad relativamente pequena de fertilizantes baratos y sales minerales, tales como bicarbonato de amonio (NH4HCO3) (o nitrato de amonio, urea, cloruro de amonio), fosfatos de potasio (K2HPO4 y KH2PO4), sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O), cloruro de calcio (CaCh), sulfato de cinc heptahidratado (ZnSO4.7H2O), sulfato de hierro(II) heptahidratado (FeSO4.7H2O), y acido borico (H3BO3), entre otros. Es decir, grandes cantidades de celulas de algas de diseno pueden cultivarse de modo barato en un periodo corto de tiempo porque, bajo condiciones aerobias, tales como en un estanque abierto, las algas de diseno pueden crecer de modo fotoautotrofo por sf mismas empleando el CO2 del aire con tanta rapidez como sus cepas de origen de tipo salvaje. Esto constituye una caractenstica significativa (beneficio) de la invencion que puede proporcionar una solucion barata a la generacion de biocatalizadores

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fotoactivos (las algas productoras de butanol fotosinteticas de diseno) para la produccion de energfa solar renovable.

Cuando el cultivo de algas se cultiva y esta listo para la produccion de butanol, el cultivo de algas cultivados se sella o se coloca bajo ciertas condiciones espedficas, tales como condiciones anaerobias, que pueden ser generadas mediante la eliminacion del O2 del reactor fotobiologico sellado, para inducir la expresion de los genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de HydAI de diseno. Cuando se expresan las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno, se suministra energfa de luz visible, tal como luz solar, para que las celulas de las algas que expresan los genes de diseno puedan actuar como catalizadores para la produccion fotosintetica de butanol a partir de CO2 y H2O. Cuando se expresan los genes de diseno, las celulas de algas se convierten fundamentalmente en “maquinas verdes” eficaces y robustas que son perfectas para la produccion fotosintetica de butanol (CH3CH2CH2CH2OH) y O2 a partir de CO2 y H2O. El producto de butanol del reactor fotobiologico de las algas puede recolectarse mediante una combinacion de tecnicas de recoleccion de butanol con filtracion con membrana y destilacion/evaporacion, que incluyen, pero no se limitan a una extraccion de lfquido/lfquido, destilacion de gases, evaporacion con membrana, pervaporacion y tecnicas de adsorcion (Durre, P., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol., 49: 639-648; Qureshi, Hughes, Maddox, y Cotta, 2005, Bioprocess Biosyst. Eng., 27:215-222).

La produccion fotosintetica de CH3CH2CH2CH2OH y O2 directamente a partir de CO2 y H2O segun la presente invencion, en principio, puede tener un alto rendimiento cuantico. En teona, solo se necesitan 48 fotones para producir un CH3CH2CH2CH2OH y 6O2 a partir de agua y dioxido de carbono mediante este mecanismo. La maxima eficiencia energetica teorica desde la luz solar al butanol mediante el proceso de la produccion fotosintetica de butanol directa a partir del CO2 y H2O es de aproximadamente 10%, que es la mas alta posible entre todas las estrategias biologicas. Por consiguiente, esta estrategia presenta un gran potencial cuando se aplica de modo adecuado con un reactor para algas y un proceso de recoleccion de butanol y oxfgeno.

El anterior proceso para utilizar las algas de diseno para la produccion fotosintetica de CH3CH2CH2CH2OH y O2 a partir de CO2 y H2O con un reactor para algas y un sistema de recoleccion del butanol y separacion y recoleccion del producto gaseoso puede repetirse durante una pluralidad de ciclos operativos para lograr resultados mas deseables.

Otra caractenstica es que el organismo de produccion de butanol conmutable de diseno proporciona la capacidad de realizar ciclos repetidos de crecimiento en cultivo fotoautotrofo bajo condiciones aerobias normales de una manera similar a la del tipo salvaje y de lograr una produccion fotobiologica eficaz de butanol (figuras 1 y 3) cuando la via de produccion de butanol de diseno se activa por medio de un promotor inducible (tal como un promotor de hidrogenasa) en ciertas condiciones inductoras espedficas (tales como bajo condiciones anaerobias) en un biorreactor. Por ejemplo, las algas de diseno conmutables que portan los genes de produccion de butanol controlados por un promotor de hidrogenasa de diseno contienen mitocondrias normales, que emplean el poder reductor (NADH) de reservas organicas (y/o de sustratos exogenos, tales como acetato) para dar energfa a la celula inmediatamente despues de su vuelta a las condiciones aerobias. Por tanto, cuando la celula del alga vuelve a las condiciones aerobias despues de su uso bajo condiciones anaerobias para la produccion de butanol, la celula dejara de producir las enzimas de la via de produccion de butanol y comenzara a restablecer su capacidad fotoautotrofa normal sintetizando cloroplastos funcionales normales. Por consiguiente, es posible emplear este tipo de organismo transformado geneticamente para ciclos repetidos de crecimiento en cultivo fotoautotrofo bajo condiciones aerobias normales y la produccion eficaz de butanol bajo condiciones anaerobias en un reactor anaerobio. Es decir, esta tecnologfa de produccion fotobiologica de butanol puede funcionar durante una pluralidad de ciclos operativos mediante el rejuvenecimiento del cultivo usado bajo condiciones aerobias y empleando, de modo reciclable, el cultivo de algas rejuvenecido bajo condiciones productoras de butanol para lograr resultados mas deseables. Opcionalmente, esta tecnologfa de produccion fotobiologica de butanol se hace funcionar de modo continuo haciendo circular el cultivo de algas rejuvenecido desde un reactor aerobio hacia el reactor anaerobio, y al mismo tiempo se hace circular el cultivo de algas usado desde el reactor anaerobio (despues de su uso para la produccion de butanol) hacia el reactor aerobio para el rejuvenecimiento por medio de la smtesis de cloroplastos funcionales normales a traves de la fijacion fotosintetica del CO2 y el crecimiento fotoautotrofo.

Algunos de los organismos de diseno pueden crecer de modo fotoautotrofo incluso con la via o vfas de produccion de butanol activadas. La rapidez con que puede crecer un organismo de diseno bajo condiciones de produccion de butanol puede depender de su trasfondo genetico y de la cantidad de productos del ciclo de Calvin que siguen estando disponibles para el crecimiento celular despues de su uso por la via o via de produccion de butanol de diseno. Los organismos de diseno que, bajo las condiciones de produccion de butanol, pueden mantener las funciones celulares esenciales con una tasa de crecimiento apropiada tambien pueden emplearse para la produccion fotobiologica continua de CH3CH2CH2CH2OH y O2 a partir de CO2 y H2O con un biorreactor y un proceso de recoleccion del butanol.

Existen otras formas en las que los organismos de diseno conmutables, que incluyen los organismos de diseno controlables por medio de la division celular (figura 3), pueden utilizarse para la produccion fotobiologica con proteccion de bioseguridad de biocombustibles. Con el uso de las caractensticas de bioseguridad de diseno descritas previamente, por ejemplo, no es necesario que el cultivo de algas de diseno usado de un reactor de produccion fotobiologica de butanol tenga que recircularse hacia el reactor de crecimiento del cultivo. Por el contrario, el cultivo de algas usado se extrae para ser empleado como fertilizante o materia prima de biomasa para otros procesamientos, puesto que el crecimiento fotoautotrofo del alga de diseno conmutable en el reactor de

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crecimiento del cultivo es capaz de suministrar celulas de algas de modo continuo al reactor de produccion fotobiologica de butanol para la produccion de biocombustible. Esta realizacion es especialmente util cuando se emplean algunos de los organismos de diseno que pueden crecer de modo fotoautotrofo solo antes, y no despues, de que se active la via o vfas de produccion de butanol. Por ejemplo, si se mantiene un cultivo de crecimiento continuo de un alga de diseno (que puede crecer de modo fotoautotrofo solo antes de que se active la via o vfas de produccion de butanol) en un reactor de crecimiento del cultivo, esto puede proporcionar un suministro continuo de celulas de algas cultivadas para su uso en un reactor de produccion fotobiologica de butanol. Esta estrategia tambien posibilita el uso de los organismos de diseno que solo pueden crecer antes de que active la via o vfas de produccion de butanol para la produccion fotobiologica de butanol.

Debido a diversas razones, algunos de los organismos de produccion de butanol de diseno solo pueden crecer de modo fotoheterotrofo o fotomixotrofico, pero no de modo fotoautotrofo. El uso de un reactor de crecimiento del cultivo tambien puede cultivar este tipo de organismos de produccion de butanol de diseno de modo fotoheterotrofo o fotomixotrofico empleando sustratos organicos que incluyen, pero no se limitan a sacarosa, glucosa, acetato, etanol, metanol, propanol, butanol, acetona, almidon, hemicelulosa, celulosa, lfpidos, protemas, acidos organicos, materiales de biomasa y sus combinaciones. El cultivo cultivado de este modo tambien puede suministrarse a un reactor de produccion fotobiologica de butanol para la induccion de las vfas de diseno para la produccion de butanol. Esta realizacion modificada del crecimiento del cultivo tambien permite emplear los organismos de diseno que solo pueden crecer de modo fotoheterotrofo o fotomixotrofico para la produccion fotobiologica de butanol.

Para ciertos organismos de diseno espedficos que portan genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de la nitrato reductasa (Nia1), el anterior proceso fotobiologico en un reactor puede ajustarse aun mas para lograr resultados mas beneficiosos. Por ejemplo, el alga de diseno que contiene los genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de Nia1 (o nirA), tales como los que se muestran en los ejemplos de secuencias de ADN de diseno 1-12 (SEQ ID NO:1-12) y una oxifotobacteria de diseno que porta los genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de nirA que aparecen en SEQ ID NO:34-45, pueden crecer con normalidad en un medio de cultivo con amonio (pero no con nitrato) mediante la fotosmtesis autotrofa empleando el CO2 del aire de una manera similar a la de las algas de tipo salvaje. Esto es debido a que la expresion de los genes de la via de produccion de butanol en el organismo de diseno se activa solo en presencia de nitrato, segun se desee, debido al uso de un promotor de la nitrato reductasa (Nia1) o un promotor de la nitrito reductasa (nirA) para controlar la expresion de la via o vfas de diseno. Una caractenstica significativa de los organismos de diseno con genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de nirA o Nia1 es que la expresion de las vfas de produccion de butanol de diseno puede ser inducida manipulando los niveles de concentracion de nitrato (NO3-) con relacion a los del amonio (NH/) en el medio de cultivo sin la necesidad de emplear condiciones anaerobias. Es decir, la expresion de la via o vfas de produccion de butanol de diseno puede ser inducida bajo condiciones aerobias y anaerobias. Esto permite que el proceso de produccion fotobiologica de butanol de diseno tambien pueda funcionar bajo condiciones aerobias empleando el CO2 atmosferico. De modo similar, este tipo de organismos de diseno con genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de Nia1 tambien pueden crecer de modo fotoautotrofo en condiciones aerobias y anaerobias. Por tanto, como otra realizacion, el proceso operativo para utilizar un organismo de diseno con genes de la via de produccion de butanol controlados por el promotor de la nitrato reductasa (Nia1) se ajusta a lo siguiente: a) cultivar de modo fotoautotrofo un organismo transgenico de diseno en un medio de cultivo mmimo en presencia de amonio (NH/), pero no de nitrato (NO3-) antes de inducir la expresion de los genes de la via de produccion de butanol de diseno; b) cuando el cultivo del organismo de diseno se cultiva y esta listo para la produccion de butanol, anadir un fertilizante de nitrato (NO3-) al medio de cultivo para aumentar la concentracion de nitrato (NO3-) con relacion a la del amonio (NH/) para inducir la expresion de los genes de produccion de butanol de diseno; c) cuando las enzimas de la via de produccion de butanol de diseno se expresan, suministrar energfa de luz visible, tal como luz solar, para que las celulas que expresan los genes de diseno funcionen como catalizadores para la produccion fotosintetica de butanol a partir de CO2 y H2O; d) recolectar el producto de butanol del reactor fotobiologico mediante una combinacion de filtracion con membrana y tecnicas de recoleccion de butanol.

Ademas de la produccion de butanol, tambien es posible emplear un organismo de diseno o parte de su via o vfas de produccion de butanol de diseno para producir ciertos productos intermedios que incluyen: butiraldehndo, butiril- CoA, crotonil-CoA, 3-hidroxibutiril-CoA, acetoacetil-CoA, acetil-CoA, piruvato, fosfoenolpiruvato, 2-fosfoglicerato, 1,3- difosfoglicerato, gliceraldehndo-3-fosfato, dihidroxiacetona fosfato, fructosa-1,6-difosfato, fructosa-6-fosfato, glucosa- 6-fosfato, glucosa, y glucosa-1-fosfato. Por tanto, otra realizacion comprende una etapa adicional de recolectar los productos intermedios que tambien pueden ser producidos por un organismo transgenico de diseno inducido. La produccion de un producto intermedio puede potenciarse selectivamente inactivando la actividad de una enzima de diseno que cataliza su consumo en las vfas de diseno. La produccion de dicho producto intermedio tambien puede potenciarse empleando un organismo de diseno con una o varias de las enzimas de diseno omitidas de las vfas de produccion de butanol de diseno. Por ejemplo, puede utilizarse un organismo de diseno en el que se ha omitido la butanol deshidrogenasa o la butiraldehndo deshidrogenasa de la via o vfas de diseno de la figura 1 para producir butiraldehndo o butiril-CoA, respectivamente.

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REIVINDICACIONES

1. - Un metodo para la produccion fotosintetica de butanol que comprende cultivar un alga transgenica de diseno en un medio lfquido, en el que el alga esta geneticamente modificada para que exprese un conjunto de enzimas que actuan sobre un producto intermedio del ciclo de Calvin y convierten el producto intermedio en butanol;

en el que dicho conjunto de enzimas consiste en fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato- ferredoxina oxidorreductasa (o piruvato-NADP+ oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehndo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa;

en el que dichas butiraldehfdo deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa pueden utilizar el NADPH, que es suministrado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido;

en el que los nucleotidos que codifican dicho conjunto de enzimas se modifican geneticamente de modo que las enzimas expresadas se inserten en los cloroplastos del organismo fotosintetico hospedante, dirigidas por un peptido senal estromatico; y

recuperar el butanol a partir de dicho medio lfquido.
2. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha alga se selecciona del grupo que consiste en algas verdes, algas rojas, algas marrones, algas verdeazuladas (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias), diatomeas, algas del medio marino, algas de agua dulce, cepas de algas tolerantes al frio, cepas de algas tolerantes al calor, mutantes deficientes en el pigmento del complejo antena recolector de luz, cepas de algas tolerantes al butanol, y sus combinaciones.
3. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que dicha alga es Chlamydomonas reinhardtii.
4. - El metodo de la reivindicacion 2, en el que dicha alga verdeazulada (oxifotobacterias, que incluyen cianobacterias y oxiclorobacterias) se selecciona del grupo que consiste en Thermosynechococcus elongatus BP-1, Nostoc sp. PCC 7120, Synechococcus elongatus PCC 6301, Syncechococcus sp. cepa PCC 7942, Syncechococcus sp. cepa PCC 7002, Syncechocystis sp. cepa PCC 6803, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus NATL1A, Prochlorococcus SS120, Spirulina platensis (Arthrospira platensis), Spirulina pacifica, Lyngbya majuscule, Anabaena sp., Synechocystis sp., Synechococcus elongates, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Synechococcus WH7803, Synechococcus WH8102, Nostoc punctiforme, Syncechococcus sp. cepa PCC 7943, Synechocyitis PCC 6714 mutante deficiente en ficocianina PD-1, Cyanothece cepa 51142, Cyanothece sp. CCY0110, Oscillatoria limosa, Lyngbya majuscula, Symploca muscorum, Gloeobacter violaceus, Prochloron didemni, Prochlorothrix hollandica, Synechococcus (MC-A), Trichodesmium sp., Richelia intracellularis, Prochlorococcus marinus, Prochlorococcus SS120, Synechococcus WH8102, Lyngbya majuscula, Symploca muscorum, Synechococcus bigranulatus, Oscillatoria sp. criofila, Phormidium sp., Nostoc sp.-1, Calothrix parietina, Synechococcus bigranulatus termofila, Synechococcus lividus, Mastigocladus laminosus termofila, Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912, Synechococcus vulcanus, Synechococcus sp. cepa MA4, Synechococcus sp. cepa MA19, y Thermosynechococcus elongatus.
5. - El metodo de la reivindicacion 1, en el que la expresion de dicha enzima esta controlada por un promotor inducible.
6. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el alga se modifica geneticamente para que contenga ademas una construccion de ADN para al menos una enzima que facilita la conversion de NADPH/NADH para potenciar la produccion fotobiologica de butanol.
7. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que las celulas de las algas se modifican geneticamente para inactivar ademas la actividad de smtesis de almidon.
8. - El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el alga se modifica geneticamente para que ademas pueda expresar de modo inducible un conjunto de enzimas de diseno que comprende amilasa, almidon fosforilasa, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa-fosfato isomerasa, fosfofructosa quinasa, aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa y sus combinaciones, que facilitan la degradacion del almidon y la glicolisis en la region estromatica del cloroplasto.
9. - Un alga transgenica util para la produccion fotosintetica de butanol, modificada geneticamente para que exprese, de modo inducible, la fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato quinasa, piruvato-ferredoxina oxidorreductasa (o piruvato-NADP+ oxidorreductasa), tiolasa, 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, crotonasa, butiril-CoA deshidrogenasa, butiraldehfdo deshidrogenasa, y butanol deshidrogenasa en el cloroplasto;

en la que dichas butiraldehfdo deshidrogenasa y butanol deshidrogenasa pueden utilizar el NADPH, que es suministrado por el proceso de transporte de electrones fotodirigido; y,

que tambien expresa, de modo inducible, la gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa y fosfoglicerato, aldolasa y triosa fosfato isomerasa, fosfofructosa quinasa y amilasa, almidon fosforilasa, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa-fosfato isomerasa en el cloroplasto.
10. - Un alga transgenica segun la reivindicacion 9, que ademas expresa, de modo inducible, al menos una de las 5 siguientes en el cloroplasto: NADPH fosfatasa; NAD quinasa; una molecula de ARN de interferencia que inhibe la

expresion de la glucosa-fosfato isomerasa (G-P-isomerasa) o fosfoglucomutasa; o parte o todo el conjunto de enzimas que facilitan la degradacion del almidon y la glicolisis, que consisten en amilasa, almidon fosforilasa, hexoquinasa, fosfoglucomutasa, glucosa-fosfato isomerasa, fosfofructosa quinasa, aldolasa, triosa fosfato isomerasa, gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa, fosfoglicerato quinasa, fosfoglicerato mutasa, enolasa, piruvato 10 quinasa y sus combinaciones.
11. - El alga transgenica segun una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que dicha alga es un alga verdeazulada (cianobacteria u oxiclorobacteria).