JP5922377B2 - 油脂産生微細藻類の培養方法 - Google Patents
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Description
本発明で使用される培地は、藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む培地である。栄養塩としては、窒素源となるNaNO3、KNO3、NH4Cl、尿素等や、リン源となるK2HPO4、KH2PO4、グリセコリン酸ナトリウム等が挙げられる。微量金属塩としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられる。ビタミンとしては、ビタミンB1、ビタミンB12等が挙げられる。培地中のpHは、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はないが、例えばpH3〜6とすることが好ましい。
[第1実施形態]
1.[シュードコリシスチス エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)N1株の培養方法、及び炭化水素類の生産方法]
(1−1)培地の調製
AF6培地を500mL調製した。なお、AF6培地の組成は以下に示す通りである。
(1−2)シュードコリシスチス エリプソイディアN1株の培養、及び炭化水素類の生産
4つの500mL扁平フラスコを準備し、それぞれをフラスコ1、フラスコ2、フラスコ3、フラスコ4とした。各フラスコに(1−1)に記載の培地を入れて、藻類株としてシュードコリシスチス エリプソイディアN1株をそれぞれの培地に加えた後、蛍光灯で光をあてながら通気条件下、CO2の供給と共に室温で攪拌することによって培養を開始した。各フラスコについて培地の光学濃度(Optical Density、以下、ODとも訳す)が、フラスコ1では1.2ODに達した時に、フラスコ2では3.5ODに達した時に、フラスコ3では5ODに達した時に、フラスコ4では8.8ODに達した時に、それぞれのフラスコに培地のNaCl濃度が0.4重量%になるように、NaClを投入した。光学濃度(OD)については後述する。培養を9日間行った後、フラスコ1〜フラスコ4の培地をそれぞれ遠心分離し、上澄みを除去した後シュードコリシスチス エリプソイディアN1株の沈殿物を回収した。フラスコ1〜フラスコ4の培地から得られた沈殿物はそれぞれについて以下に記載の処理を行って炭化水素類を得た。沈殿物を乾燥後、その乾燥体を入れた試験管にn−ヘキサンを加え、30分間静置した。その後、超音波をかけて乾燥体に含まれる炭化水素類をn−ヘキサン中に抽出した。抽出液のみをフラスコに移した。残渣には再度n−ヘキサンを加え、上記と同様にして炭化水素類を抽出した。抽出液を上記フラスコに移した。この操作を、残渣に加えたヘキサン層が、超音波をかけた後でも透明となるまで繰り返した。その後、上記フラスコに集めた抽出液中のn−ヘキサンを、遠心エバポレーターを用いて除去することによって、炭化水素類を得た。
(1−1)に記載のAF6培地にシュードコリシスチス エリプソイディアN1株を加えて蛍光灯で光をあてながら通気条件下、CO2の供給と共に室温で攪拌して培養した。培養開始から5〜48時間毎に培地を約1mL取り出し、吸光光度計を使用して波長720nmにおける光学濃度を測定した。波長720nmにおける光学濃度の変化を図1に示す。図1の横軸は培養時間、縦軸は波長720nmにおける光学濃度である。
シュードコリシスチス エリプソイディアN1株の炭化水素類収率を算出することによって炭化水素類生産能を評価した。
(1−2)に記載のシュードコリシスチス エリプソイディアN1株の沈殿物を乾燥後に、その乾燥体の乾燥重量を測定した。
(1−2)に記載の沈殿物を乾燥後、油分分析用TD-NMR(Time Domain Nuclear Magnetic Resonance、時間領域核磁気共鳴)装置を使用して炭化水素類含有率を測定した。標準試料にオリーブ油を使用した。その結果を図2(b)に示す。図2(b)の横軸はNaCl投入時のOD、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、NaCl投入時のODがいずれの場合でもコントール培地で培養した場合と比較して炭化水素類含有率は上昇することが明らかとなった。
シュードコリシスチス エリプソイディアN1株の炭化水素類収率を、(2−1)で得られた各ODにおける乾燥重量及び、(2−2)で得られた各ODにおける炭化水素類含有率から式1を用いて算出した。計算式を式1に示す。
(式1)炭化水素類収率[g/L]=炭化水素類含有率/100×乾燥重量[g/L]
図2(c)に示されるように、NaCl投入時のODが1.2,3.5ODの場合、コントロール培地で培養した場合と比較してそれぞれ炭化水素類収率が高くなり炭化水素類生産能が向上することが明らかとなった。さらにNaCl投入時のODが3.5ODの場合が、最も炭化水素類生産能が向上することが示された。
(1−2)に記載の炭化水素類の組成をGC−MS(Gas Chromatograph Mass Spectometer、ガスクロマトグラフ質量)分析によって評価した。
(1−2)に記載の抽出液を1mL以下に濃縮した後、測定前に濃縮溶液の容量を1mLにメスアップし、メチルエステル化したものをGC−MS分析用の試料とした。比較対照にコントロール培地(塩濃度0重量%)で培養した培養物の試料も同様に調製した。
GC−MS分析条件は以下に示す通りである。
測定機器:GCMS−QP5000(島津製作所),GC−MS分析用キャピラリーカラム:DB−23,イオン化法:電子イオン化(electron ionization、EI)法、化学イオン化(chemical ionization、CI)法,標準試料:スペルコ社FAME mix(C14〜C24),インジェクター温度:280℃,試料注入量:1μ,注入方法:スプリットレスモード,インターフェース温度:300℃,サンプリング時間:0.5分,カラム入り口圧:100kPa,ガス流量:50.0mL/min,キャリアーガス:ヘリウムガス,昇温条件:分析開始より50℃で2分保持、6℃/minで300℃まで昇温後、300℃で18分保持,イオン化電圧(EI):70cV,反応ガス(CI):メタン,スキャン範囲:m/z 50〜500
(3−3)「GC−MS分析結果」
(3−2)に記載の条件下、GC−MS分析を行い、(1−2)に記載の炭化水素類の組成を評価した。図3は、(1−2)に記載の培養方法において、NaClが投入されない以外は同一の培養条件となるコントロール培地で生産された炭化水素類の組成を示す。図4は、(1−2)に記載の培養方法において、培地の光学濃度が3.5ODを示した時に、NaCl濃度が0.4重量%になるようにNaClを投入した場合において生産された炭化水素類の組成を示す。この結果から、NaCl濃度が0.4重量%になるようにNaClを投入した場合に生産されたトリグリセリドの含有率は、64.5重量%であり、コントロール培地から得られた炭化水素類に含まれるトリグリセリドの含有率(53.8%)と比較して高くなることが明らかとなった。トリグリセリドはバイオ燃料の原料になる。したがって、培地の光学濃度が3.5ODを示した時に、NaCl濃度が0.4重量%になるようにNaClを投入することによって、効率的にバイオ燃料の原料を得ることができると考えられる。
[第2実施形態]
前記第1実施形態と同様にしてシュードコリシスチス エリプソイディアN1株を培養した。ただし、培地の光学濃度が3.5ODを示したときに、NaCl濃度がそれぞれ0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.8重量%となるようNaClを投入した。それぞれのNaCl濃度で培養後、前記第1実施形態と同様にして炭化水素類を得た。
上記シュードコリシスチス エリプソイディアN1株について、それぞれの塩濃度で培養した場合の炭化水素類生産能を、2.の記載と同様にして評価した。
(2−1)記載と同様にして乾燥重量を測定した。測定結果を図6(a)に示す。
図6(a)の横軸はNaClの濃度、縦軸は、乾燥重量である。図6(a)に示すようにNaCl濃度が高くなるほど乾燥重量は減少することが明らかとなった。
(2−2)記載と同様にして炭化水素類含有率を決定した。その結果を図6(b)に示す。図6(b)の横軸はNaCl濃度、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、NaCl濃度が0重量%の場合と比較して、NaClを加えることによって炭化水素類含有率は上昇することが明らかとなった。
(2−3)記載と同様にして、(4−1)で得られた各NaCl濃度における乾燥重量及び、(4−2)で得られた各NaCl濃度における炭化水素類含有率から炭化水素類収率を算出した。その結果を図6(c)に示す。図6(c)の横軸はNaCl濃度、縦軸は、炭化水素類収率を示す。この結果から、NaCl濃度が0.2,0.3,0.4,0.5重量%になるようにNaClを投入した場合は、NaCl濃度が0重量%の場合と比較して炭化水素類収率が高くなり、炭化水素類生産能が向上することが明らかとなった。さらに、NaCl濃度が0.4重量%になるように投入した場合が、最も炭化水素類生産能が向上することが示された。
[第3実施形態]
前記第1実施形態と同様にしてシュードコリシスチス エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株培養した。ただし、培地の光学濃度が3.5ODに達した時に、NaCl濃度がそれぞれ1,2,3重量%となるようにNaClを投入した。それぞれのNaCl濃度で培養後、前記第1実施形態と同様にして炭化水素類を得た。
シュードコリシスチス エリプソイディアObi株について、上記それぞれのNaCl濃度で培養した場合の炭化水素類生産能を、2.の記載と同様にして評価した。
(2−1)記載と同様にして乾燥重量を測定した。その結果を図8(a)に示す。図8(a)の横軸はNaClの濃度、縦軸は、乾燥重量を示す。この結果からNaClを加えてもNaCl濃度が0重量%の場合と比較して乾燥重量の変化は少なく、NaClは増殖に影響を与えないことが示された。
(2−2)記載と同様にして炭化水素類含有率を決定した。その結果を図8(b)に示す。図8(b)の横軸はNaCl濃度、縦軸は、炭化水素類含有率を示す。この結果から、NaCl濃度が0重量%の場合と比較してNaClを加えることによって炭化水素類含有率は上昇することが示された。
(2−3)記載と同様にして、(5−1)で得られた各NaCl濃度における乾燥重量及び、(5−2)で得られた各NaCl濃度における炭化水素類含有率から炭化水素類収率を算出した。その結果を図8(c)に示す。図8(c)の横軸はNaCl濃度、縦軸は、炭化水素類収率を示す。この結果から、各NaCl濃度における炭化水素類収率は、NaCl濃度が0重量%の場合と比較して、NaCl濃度が1,2,3重量%の場合は高くなり炭化水素類生産能は向上することが明らかとなった。しがたって、シュードコリシスチス エリプソイディアObi株のそれぞれのNaCl濃度における炭化水素類生産能は、NaClを投入することによって向上し、その中でもNaCl濃度が1重量%になるように投入した場合は、炭化水素類生産能が最も向上することが示された。
Claims (3)
- 油脂成分生産能を有する藻類の藻類株であるシュードコリシスチス エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)N1株、またはシュードコリシスチス エリプソイディア(Pseudochoricystis ellipsoidea)Obi株を培地で培養する培養方法において、
前記藻類株の培養を開始し、前記藻類株を培養する前記培地の光学濃度が飽和状態を示す光学濃度の35分の4に達してから3分の1に達するまでの間に前記培地にNaClを投入する工程を含む、
ことを特徴とする藻類の培養方法。 - 前記培地にNaClを投入した後の前記培地のNaCl濃度は0.2重量%〜3重量%である
ことを特徴とする請求項1に記載の培養方法。 - 請求項1または請求項2に記載の培養方法によって前記藻類株を培養し、前記藻類株から油脂成分を取り出すことを特徴とする油脂成分の生産方法。
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