JP4454906B2 - ヒ素耐性に関わる遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、藻類のリン酸高親和性トランスポーターを抑制しているタンパク質をコードする遺伝子であり、藻類のヒ素耐性に関与する遺伝子ＰＴＢ１に関する。
また本発明は、ＰＴＢ１を破壊することによりヒ素耐性の藻類を得る技術に関する。更に本発明は、ＰＴＢ１を破壊して得られたヒ素耐性藻類を用いてヒ素を回収・無毒化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒ素は生物に有毒な元素であり、インド、バングラデッシュなどの国では、河川のヒ素汚染に非常に悩まされている。日本においても地域的にヒ素の多いところがあり、対策が求められている。また、近年の急速なコンピューター産業の発達のため、発光素子に用いられるガリウムヒ素やインジウムヒ素の生産が増加しつつある。これらのヒ素化合物が産業廃棄物として工場から流出してしまうことが危惧されるが、これらの毒性についての研究も始まったばかりである（Flora et al.,1999,Chem Biol Interact,122(1)1-3; Bustamante et al.,1997,Toxicol,118(2-3)129-136;Omura et al.,1996,Toxicol-Lett,89(2)123-129)。
そのため、環境中に流出しているヒ素を迅速に除去する必要性に迫られている。
ヒ素の除去法は数多く開発されているが、現在日本国内でもっとも多く採用されているのは共沈法と呼ばれている方法である。これは原水に鉄やアルミニウムなどを添加し、ヒ素を抱き込ませて沈める方法であるが、沈殿には大きな槽を必要とし、またヒ素を抱き込んだ汚泥が大量に発生する。井戸水など飲料水中に含まれるヒ素の除去については、億単位に上る費用などがネックとなり、対策が遅れているのが現状である。
【０００３】
自然界には周辺の水に含まれるヒ素を濃縮する藻類の種がいくつか存在する。ヒ素の除去方法の一つとして藻類などを用いた生物濃縮が考えられ、ヒ素の無毒化や回収技術の開発を視野に入れてこれらの藻類に関する研究が進められてきた。
ヒ素は細胞内でさまざまな分子形態をとることが知られている。無機のヒ素はヒ酸（ＡｓＯ４ ２−）、亜ヒ酸（ＡｓＯ３ −）などだが、自然界に存在するヒ素化合物のなかでも毒性が特に強いものである。
海藻では蓄積された無機ヒ素が生理反応により、ヒ素含有糖類などのヒ素化合物へ転換されることが明らかとなっている（Edmonds and Francesconi,1981,Nature,289,602-604: Shibata et al.,1987,Agric.Biol.Chem.,51,391-398: Edmonds et al.,1987,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,577-580: Kaise et al.,1998,Organomet.Chem.,12,137-143）。そして、無機ヒ素を高度にアルキル化したヒ素化合物は、哺乳類の細胞にたいして無機のヒ素よりも低い毒性を示すことが確かめられている（Kaise et al.,1996,J.Food Hyd.Soc.Japan,37,135-141: Oya-Ohta et al.,1996,Mutat.Res.,357,123-129: Kaise et al.,1998,Appl.Organomet.Chem.,2,539-546）。
微細藻類に関し、生理学的、遺伝学的な研究が詳細に行われている。しかしながら、微細藻類のヒ素への耐性メカニズムについてはいまだ明らかにされていない。クロレラ（Chlorella）、クリプトモナス（Cryptomonas）、ヒメノモナス（Hymenomonas）、シネココッカス（Synechococcus）、ホルミジウム（Phormidium）、およびアナベナ（Anabaena）を含む、いくつかの種の微細藻類とシアノバクテリアが自然の水よりも何桁も高い濃度のヒ素にも耐性があると報告されている（Bottino et al.,1978、J.Exp.Mar.Biol.Ecol.,33,153-168: Planas and Healey,1978,J.Phycol.,14,337-341: Budd and Craig,1981,Can.J.Bot.,59,1518-1521: Maeda et al.,1983,Separation Sci.Technol.,18,375-385）。これらの種においては、ヒ素は無機体あるいはメチル化された化合物として蓄積される（Andreae and Klumpp,1979,Environ.Sci.Technol.,13,738-741: Maeda et al.1990,Appl.Organomet.Chem.4,251-254: Kaise et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,297-304: Kuroiwa et al.,1994,Appl.Organomet.Chem,8,325-333: Gossler et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,57-66）。緑藻のドナリエラ（Dunaliella sp.）では、培地の中のヒ酸塩は細胞に吸収されて、亜ヒ酸塩に還元される（Takimua et al.,1996,Appl.Organomet.Chem,10,753-756）。別の緑藻、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、および、ホルミジウム（Phormidium sp.）では、少なくともヒ素の９５％は無機のヒ素として存在しているが、残りはジメチル化された形態となっていると報告されている（Maeda et al.,1990,Appl.Organomet.Chem.4,251-254: Gossler et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,57-66）。従って、微細藻類においては、無機のヒ酸塩は亜ヒ酸塩に還元されてからジメチル化されたヒ素化合物へと変換されるのではないかと推定できる。ジメチル化されたヒ素化合物は無機のヒ素よりも毒性が低いため、藻類はある程度の量のヒ素を吸収しても生存できるのである。
【０００４】
一部の藻類によりヒ素が無毒化されることについては明らかとなっているが、微細藻類は大型藻類に比べてヒ素毒性に対する感受性が強く、高濃度のヒ素の含まれる環境では生存できないものである。微細藻類を用いたヒ素の回収あるいは無毒化技術に関しては、より強いヒ素耐性能を持つ微細藻類を得る必要があった。
【０００５】
本発明者らは以前に微細藻類の一種である緑藻クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）のゲノムにに無作為挿入変異法によって変異を導入した変異株を、いろいろな濃度のヒ酸塩存在下で生育させてヒ酸抵抗性株のスクリーニングを行った。このスクリーニングによりクラミドモナス・ラインハルディのヒ酸抵抗性株を得た（Fujiwara,et al., 2000, Plant Cell Physiol., 41(1),77-83 ）。
さらにクラミドモナス・ラインハルディでは、吸収されたヒ酸がジメチルヒ酸へと代謝されることが確かめられた（Fujiwara,et al.,2000,Plant Cell Physiol., 41(1),77-83）。
緑藻であるクラミドモナスは淡水域に生息する真核単細胞の藻類で、２本の鞭毛、眼点、ピレノイド、一つの葉緑体などを持っているのが特徴である。クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）という種は、クラミドモナスの一種であり、掛け合わせや形質転換が比較的容易であるため、分子レベル・細胞レベルでの植物生理生化学の研究材料として適したものである。
【０００６】
ヒ素の同族元素であるリンは、生物において核酸の成分となっているほか、代謝調節に関与するとともに、呼吸で生産されたエネルギーを貯蔵して、必要とする酵素に伝達するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の成分である。また、酵素のはたらきに不可欠な補酵素の成分になるなどの働きもあり、生体に必須の元素である。このように生体に必須の元素であるため、リンは窒素、カリウムとともに化学肥料として多量に消費される元素である。農業のほか、洗浄剤など工業においても重要な資源である。リンの供給源としてはリン鉱石に頼っているが、リン鉱石は２１世紀中あるいは２２世紀には枯渇することが予想されている。リン資源の枯渇は農業及び人類の生存に深刻な障害となるため、リン回収技術の開発が活発に行われている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子破壊した緑藻クラミドモナスの系から得られたヒ素耐性変異株の一つであるＡＲ３より、ヒ素耐性に関わる遺伝子を単離・同定することを目的とする。また、本発明はヒ素耐性変異株ＡＲ３のヒ素耐性メカニズムと、ヒ素耐性に関わるＰＴＢ１遺伝子の役割を解明することにより、藻類によるヒ素の無毒化・回収技術を開発することを目的とする。
その他の目的については、以下の記載により明らかである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子破壊した緑藻クラミドモナスの系から得られたヒ素耐性変異株の一つであるＡＲ３より、ヒ素耐性に関わる遺伝子ＰＴＢ１を同定・単離した。
また、ＰＴＢ１遺伝子の破壊されたヒ素耐性変異株ＡＲ３について生理学的実験を行った結果、ＰＴＢ１は緑藻のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子であることが判明した。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
以上のことを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００９】
すなわち本発明は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するるタンパク質、それをコードする遺伝子、ヒ素耐性のメカニズム、及びこれらを利用する方法に関する。
【００１０】
本発明のタンパク質は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
本発明の遺伝子はまた、以下の（ｃ）及び（ｄ）から選択されるゲノムＤＮＡであって、そのゲノムＤＮＡを破壊することによりヒ素耐性能が得られるゲノムＤＮＡからなる遺伝子である。
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡ。
【００１１】
本発明により明らかとなったヒ素耐性メカニズムは次のとうりである。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
【００１２】
本発明は、ＰＴＢ１遺伝子を破壊してヒ素耐性形質転換体及びリン蓄積能を有する形質転換体（以下、単に「リン蓄積性形質転換体」と略す）を得る方法を提供するものである。さらに、この方法により得られたヒ素耐性藻類を用いて環境中のヒ素を回収しジメチルヒ酸へと無毒化する方法、及びこの方法により得られたリン蓄積性形質転換体を用いて環境中のリンを回収する方法を提供するものである。
また本発明は、リン吸収能を活性化させて細胞にヒ素耐性能を与える方法、本発明のＤＮＡ及びその一部を含むベクター、本発明のＤＮＡの部分配列及びその相補配列からなるポリヌクレオチド、本発明のタンパク質に対する抗体、並びに本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子はヒ素耐性に関与する遺伝子であり、その遺伝子を破壊することによりヒ素耐性能を与えることができる遺伝子である。本発明の遺伝子配列を後期配列表の配列番号２と配列番号３に示す。配列番号２は本発明の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す。配列番号３は本発明の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。
また本発明の遺伝子はリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。本発明の遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列を後期配列表の配列番号１に示す。
【００１４】
本発明の遺伝子ＰＴＢ１は次の方法により同定・単離されたものである。
まず、クラミドモナス・ラインハルディのアルギニン要求性変異株ＣＣ４２５にアルギニン合成酵素の遺伝子ＡＲＧ７を染色体上に無作為に導入することにより、種々の変異株を作製した。次に、変異株をヒ酸含有培地でスクリーニングすることによりヒ素耐性株ＡＲ３を得た。
ＡＲ３ゲノムの中から、ＡＲＧ７遺伝子を目印としてＡＲＧ７周辺領域をクローニングした。このＤＮＡ断片をプローブとして野生型ｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡの３’端を含む部分を単離した。また５’−ＲＡＣＥにより５’端を含む部分を単離した。このｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、全長６０３２塩基であった。
このｃＤＮＡ配列塩基配列より推定されるアミノ酸配列を後期配列表の配列番号１に示す。１６６６アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするものと推定される。生理学的解析によりこのタンパク質は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質であることが明らかとなった。その生理学的解析の詳細については後述する。
次に、上記のｃＤＮＡ配列をもとに、ゲノムＤＮＡライブラリーから相同性のある配列を持つクローンをスクリーニングし、その塩基配列を決定した。このＰＴＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を後期配列表の配列番号３に示す。配列決定部分の長さが１２８５１塩基であり、ＰＴＢ１をコードする１９個のエクソン領域を含むゲノムＤＮＡ塩基配列である。染色体上のＰＴＢ１遺伝子のエクソン／イントロン構造を図１に示す。
ＰＴＢ１遺伝子の同定・単離方法については、実施例においてより詳細に記載する。
【００１５】
後記配列番号１に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号２に示される塩基配列について、既知プロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）及びＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、この配列は、新規なものであると考えられる。
【００１６】
本発明のタンパク質としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制する機能が失われない程度であればよく、通常１〜約３３３個、好ましくは１〜約１６７個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００１７】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００１８】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子は、適当な藻類の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。藻類としては、クラミドモナス、ドナリエラ、コナミドリムシ、クロロモナス、クロレラ、クリプトモナス、ヒメノモナス、シネココッカス、ホルミジウム、およびアナバエナが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、紅藻スサビノリを遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ(expressed sequence tag) データベースの検索によって得られるＰＴＢ１類似配列（例えば、GenBankＴＭ/EBI/DDBJ accession No. AV430785) に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる
【００１９】
得られたＰＢＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調製した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法[Hedigerら、Biochim. Biophys. Acta、第1064巻、360項、1991年]により、ＰＴＢ１タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２０】
得られたＰＢＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」[Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊] に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、ＰＴＢ１遺伝子が破壊されたヒ素耐性株の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡまたはその一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合した後ベクターに組み込み、ＰＴＢ１遺伝子を破壊するためのベクターとすることができる。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、ゲノム上のＰＴＢ１遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＰＴＢ１遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＰＴＢ１のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＰＴＢ１のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。また相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００２２】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＰＢＴ１をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、酵母を用いることが好ましい。
本発明は、前記した本発明の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、好ましくは相同組み換えのためのベクター又は発現ベクター、及び当該ベクターを用いて形質転換された宿主細胞（形質転換体）を提供する。
【００２３】
リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）[Mark, D.F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662項（1984年）] 等によって実施できる。
【００２４】
本発明はまた、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質コードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などによりリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
【００２５】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００２６】
本発明は、ヒ素耐性に関わる遺伝子を提供するのみならず、ヒ素耐性のメカニズムをも提供するものである。そのメカニズムは次のとうりである。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
【００２７】
本発明のヒ素耐性のメカニズムは、クラミドモナスの野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３について生理学的な比較をすることにより解明された。
図３に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。ＡＲ３は野生株の１０倍以上ヒ酸に対する耐性能力を持っていた。
図５に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ素蓄積量の経時変化、並びにそのときの光合成活性を示す。ＡＲ３のヒ酸取り込みはヒ酸添加後すぐに抑制され、その蓄積量は低いままであった。またＡＲ３はヒ酸取り込みの抑制に平行して光合成活性が回復した。
図６に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のリン酸蓄積量を示す。ＡＲ３はＣＣ１２５の約２倍のリン含量を示した。ＡＲ３では細胞内に多量に存在するリンが、ヒ素の取り込みの抑制に役立っている可能性が考えられた。
図７に、ヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害と、リン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を示す。培地中のヒ酸濃度が増すにつれ細胞に取り込まれるリン酸の濃度は低下した。逆に、培地中のリン酸の濃度が増すにつれ細胞に取り込まれるヒ酸の濃度は低下した。すなわち、ヒ酸の取り込みはリン酸により阻害され、リン酸の取り込みはヒ酸により阻害された。このことから、ヒ酸とリン酸は同じ取り込み経路を通じて競合的に取り込まれていることが明らかとなった。
図８に、いろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸による生育の阻害を示す。野生株では、培地中のリン酸濃度が高いと（５あるいは１０ｍＭ）、１ｍＭヒ酸存在下でも生育できた。この実験からもヒ酸とリン酸が競合的に取り込まれることが示された。
図９に、リン酸取り込み活性を測定してミカエリスメンテンプロットを描いて解析を行った結果を示す。リン酸高親和性トランスポーターとリン酸低親和性トランスポーターの二つの経路が存在することが確認された。そして、ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの活性がＣＣ１２５の４倍以上高まっていることが明らかとなった。
クラミドモナスの野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３について生理学的な解析については、実施例においてより詳細に記載する。
【００２８】
上記の生理学的解析により、リン酸とヒ酸は競合的に取り込まれることが明らかとなった。また、ＡＲ３では高親和性トランスポーターの活性が野生株の約５倍高まっており、細胞内のリン濃度も野生株の２倍となっていることが明らかとなった。ＡＲ３では細胞内のリン濃度が上昇してリン酸トランスポーターにフィードバック阻害がかかる。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
従って、ヒ素耐性株ＡＲ３において変異の導入されている遺伝子ＰＴＢ１は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質であることが明らかとなった。
【００２９】
本発明のＰＴＢ１遺伝子を破壊または改変して細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法としては、遺伝子の相同組み換えを利用したＰＴＢ１遺伝子の破壊法などが挙げられる。
本発明のＤＮＡの一部と選択マーカーをプラスミドに組み込んで相同組み換えのためのベクターとし、これを宿主に導入して形質転換することによりＰＴＢ１遺伝子を破壊することが可能である。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。ベクターとしてはシャトルベクターが好ましい。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、染色体上のＰＴＢ１遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＰＴＢ１遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＰＴＢ１遺伝子のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＰＴＢ１のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
相同組み換えのベクターを作製する前に、本発明のＤＮＡを用いて宿主の遺伝子構造を明らかにするのもより好ましい形態である。すなわち、ＥＳＴ(expressed sequence tag) データベースの検索によって得られるＰＴＢ１類似配列に相当するプローブを用いて、宿主のゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによってＰＴＢ１遺伝子のコピー数及びその塩基配列を決定する。決定された塩基配列からなるＤＮＡを相同組み換えベクターに用いるＤＮＡとすることができる。
【００３０】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊して細胞にヒ素耐性能を与える方法、ＰＴＢ１遺伝子を破壊して細胞にリン酸蓄積能を与える方法としては、前段落番号の段落に記載した遺伝子破壊方法が挙げられる。遺伝子を破壊する細胞としてはＰＴＢ１遺伝子を持つものであれば可能であるが、ＰＴＢ１遺伝子を持つ藻類が好ましく、ＰＴＢ１遺伝子を持つクラミドモナス等の緑藻がより好ましい。
【００３１】
細胞の有するリン吸収能を活性化させて細胞にヒ素耐性能を与える方法としては、リン酸トランスポーターを過剰発現させる方法、リン酸トランスポーターの活性促進剤を用いる方法などが挙げられる。またリン酸の投与も細胞へのリン吸収能を活性化させる効果があるものである。
過剰発現させるリン酸トランスポーターとしては、ヒ酸の輸送能力の低いものが好ましい。リン酸トランスポーターのリン酸取り込みに対するヒ酸の阻害定数の測定などによりヒ酸に対するリン酸トランスポーターの親和性の測定が可能である。
【００３２】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたヒ素耐性形質転換体を用いたヒ素の回収方法としては、高濃度のヒ素を含む水溶液中において、光照射下でヒ素耐性形質転換体を培養することによりこのヒ素耐性形質転換体にヒ素を取り込ませ、次に培養したヒ素耐性形質転換体を回収することによってヒ素を除去する方法が挙げられる。
ヒ素耐性形質転換体としては、高濃度のヒ素を含む水溶液では生育できない藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊することにより得られたヒ素耐性藻類が挙げられる。また鉱山などのヒ素濃度の高い環境中からサンプリングされた藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊してヒ素耐性がより強化されたものであってもよい。藻類の中でも微細藻類である緑藻が形質転換に好ましく、また培養も容易であるためこの方法に使用するのに好ましいものである。
ヒ素耐性形質転換体を回収する方法としては、培養液を必要に応じ冷却したのち、遠心分離などの手段によりヒ素耐性形質転換体を沈殿、濃縮させ回収する方法が挙げられる。
【００３３】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたヒ素耐性藻類を用いてヒ素を無毒化する方法としては、クラミドモナス、クロレラ、クリプトモナス、ヒメノモナス、シネココッカス、ホルミジウム、及びアナバエナなどの無機ヒ素を有機ヒ素に無毒化する能力をもつ藻類を用いる方法が挙げられる。これらの藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊することによりヒ素耐性を付与し、高濃度のヒ素を含む水溶液中にて培養することにより、ヒ素を無毒化することが可能である。
ヒ素耐性藻類としてＰＴＢ１遺伝子を破壊した糸状緑藻を用い、これを処理槽に固定化させてヒ素の無毒化を行う方法も好ましい形態である。
【００３４】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたリン蓄積性形質転換体を用いてリンを回収する方法としては、リンを含む水溶液中において、光照射下でリン蓄積性形質転換体を培養することによりこのヒ素耐性形質転換体にリンを取り込ませ、培養したリン蓄積性形質転換体を回収することによりリンを回収する方法が挙げられる。
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたリン蓄積性形質転換体としてはＰＴＢ１遺伝子を持つ藻類が好ましく、ＰＴＢ１遺伝子を持つ緑藻がより好ましい。
リン蓄積性形質転換体を回収する方法としては、培養液を必要に応じ冷却したのち、遠心分離などの手段によりリン蓄積性形質転換体を沈殿、濃縮させ回収する方法が挙げられる。回収されたリン蓄積性形質転換体の生体内に取り込まれたリンは、適当な処理を施すことにより該生体内から取り出し有用リン資源として回収することができる。
【００３５】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法としては、当該タンパク質をリン酸高親和性トランスポーターの発現抑制剤として用いる方法が挙げられる。また、本発明のタンパク質の特異抗体を作製してそれを使用する方法、本発明のタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質をスクリーニングにより発見して使用する方法が挙げられる。
リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質の特異抗体を作製する方法としては、本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質をスクリーニングする方法としては、当該タンパク質に結合する物質をスクリーニングすることにより機能促進物質または抑制物質の候補となる物質を得た後、その薬剤活性を検定する方法が挙げられる。例えば、本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をフィルター及びメンブレンなどの担体に結合させ、このタンパク質に親和性を有する物質をドラッグライブラリーの中から分離・検出する。この親和性を有する物質は薬剤としての有用性が期待される物質であり、その作用を実際に確かめることにより本発明のタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質として使用することが可能となる。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００３７】
実施例１
ヒ素耐性に関わる遺伝子ＰＴＢ１のクローニング
（１）ヒ素耐性株のスクリーニング
本発明者らにより以前に、無作為挿入変異法で得られたクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）の変異株をいろいろな濃度のヒ酸塩存在下で生育させてスクリーニングを行い、ヒ酸耐性変異株ＡＲ３を得た（Fujiwara,et al., 2000, Plant Cell Physiol., 41(1),77-83）。
すなわち、クラミドモナス・ラインハルディの株であるＣＣ４２５（アルギニン琥珀酸エステル脱離酵素遺伝子を欠損している）にプラスミドｐＪＤ６７をエレクトロポレーション法により形質転換した。プラスミドｐＪＤ６７はアルギニン琥珀酸エステル脱離酵素遺伝子ＡＲＧ７を持っており、ＣＣ４２５の染色体上にランダムに挿入される。プラスミドｐＪＤ６７が挿入されたものは、アルギニン無添加培地で生育できる株として選抜された。この無作為挿入変異法により、さまざまな遺伝子破壊されたＣＣ４２５の系が作製された。
上記の遺伝子破壊されたＣＣ４２５の系からヒ酸耐性変異株のスクリーニングを行った。プラスミドｐＪＤ６７で形質転換処理された約１０９個の細胞を直接、０．１ｍＭの無機リン酸と０．３ｍＭのヒ酸ナトリウムを含むＴＡＰ培地上に移した。プレート上でよく生育するコロニーとして１３の系が得られた。それぞれＡＲ１〜ＡＲ１３と名付けられた。抵抗性変異株は光合成活性が損なわれていないかどうかを調べた。なぜなら、光合成がヒ酸に影響を受けない変異株が選抜されることも考えられたからである（Togasaki and Hudock,1972,Plant Physiol,49,s52; Harris et al.,1974,J.Cell Biol.,63,106-179; Shepherd et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,1353-1357; Hudock et al.,1979,Biochem.Biophys.Res.Commun.,87,66-71）。この実験により得られたすべての変異株は光合成に関する変異株ではなかった、それは３／１０ ＨＳＭ培地（Sueoka et al.,1967,J.Mol.BIol.,25,44-67）上で独立栄養により生育することにより確かめられた。
変異株はＡＲＧ７遺伝子が染色体に外部から挿入されたものであるかどうかを確認するために、サザンブロット解析を行った。その結果、ヒ素耐性変異株ＡＲ３は染色体上に１コピーの外来性のＡＲＧ７タグが挿入されたものであることが明らかとなった。
また野生株ＣＣ１２５とＣＣ１２４を用いて４回戻し交配して得られたＦ４世代のＡＲ３の６つの接合子について４分子分析を行ったところ、このタグとヒ酸耐性は共分離していた。このことから、ヒ酸耐性はタグによって変異をうけた遺伝子によるものであることが示唆された。
【００３８】
（２）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
ＡＲ３に挿入されたＡＲＧ７遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして、ＡＲ３のゲノムＤＮＡのＡＲＧ７挿入部位周辺領域をクローニングした。このＤＮＡ断片をプローブとして野生型クラミドモナスのｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡの３’末端を含む部分を単離した。また、５’−ＲＡＣＥ法により５’端を含む部分を単離した。
ダイターミネーターサイクルシーケンシング法により、得られたｃＤＮＡ断片の全長の塩基配列を決定した。この配列を後期配列表の配列番号２に示した。
ｃＤＮＡ全塩基配列より、この遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列を推定した。１６６６のアミノ酸残基からなり分子量１７２ｋＤのポリペプチドからなるタンパク質をコードしているものと推定された。この配列を後期配列表の配列番号１に示した。
【００３９】
（３）ゲノム塩基配列の決定
ｃＤＮＡ配列をプローブとして、クラミドモナスの野生型ゲノムＤＮＡライブラリーから相同性のある配列を持つクローンをスクリーニングした。これらの断片の塩基配列を一部決定したところ、これらの断片の一つがｃＤＮＡの塩基配列とほぼ完全に一致する塩基配列を持つものであった。このクローンの塩基配列を決定し遺伝子の全塩基配列を決定した。この配列を後期配列表の配列番号３に示した。この遺伝子をＰＴＢ１と命名した。
図１にＰＴＢ１のエクソン／イントロン構造を示す。ＰＴＢ１の構造遺伝子は１９個のエクソン領域からなるものである。図１はまた、ヒ素耐性変異株ＡＲ３においてタグ（ＡＲＧ７遺伝子からなる）が挿入されていた場所を示す。
図２にＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列についてハイドロパシー分析を行った結果を示す。ＰＴＢ１のコードするタンパク質は１２回の膜貫通領域を持つことが推測された。
ＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列について相同性検索を行ったところ、酵母（Saccharomyces）のナトリウム依存性リン酸トランスポーターであるＰＨＯ８９と有意の相同性を示すが、中央部分にグルタミンとグリシンに富む大きな挿入領域があることがわかった。
【００４０】
実施例２
ヒ素耐性変異株ＡＲ３と野生型株ＣＣ１２５の生理学的な比較による解析
（１）ヒ酸に対する耐性の評価
ヒ酸耐性以外の変異を取り除くために、ＡＲ３を野生株ＣＣ１２５と３回戻し交配させた。以後の実験には、この戻し交配を行ったＡＲ３（Ｆ３世代）を用いることにした。
図３に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。１ｍＭのリン酸を含む培地において、いろいろな濃度のヒ酸を添加しヒ酸による生育阻害を調べた。ＡＲ３は野生株の１０倍以上ヒ酸に対する耐性能力を持っていた。
野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３の培養にはＴＡＰ培地（リン酸を含む、Ｈａｒｒｉｓ１９８９）を用い、８０μｍｏｌ光子／ｍ・ｓの光照射下、２７℃で培養を行った。
図４にヒ酸含有培地で生育した細胞のヒ素蓄積量を調べた結果を示す。野生株ＣＣ１２５と耐性株ＡＲ３ではヒ素蓄積量が異なっており、ＣＣ１２５は０．２ｍＭヒ酸含有培地で培養すると、５０ｎｍｏｌ／ｍｇ以上のヒ素蓄積量があるのに対して、ＡＲ３は培地のヒ酸濃度が高くなってもヒ素蓄積量は低いままであり、２ｍＭヒ酸含有培地では３０ｎｍｏｌ／ｍｇ以下であった。
ヒ酸含有培地で生育している細胞のヒ素蓄積量は、以下のように定量した。指数増殖期の細胞を各濃度（０．１，０．２，０．４，１，２，４，８ｍＭ）のヒ酸（Ｎａ２ＡｓＨＯ４・７Ｈ２Ｏ、和光純薬）を含むＴＡＰ培地で約１０倍に希釈した後、指数増殖期まで培養し、培養液４０ｍＬを１，５００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離して細胞を集め、細胞外のヒ酸を除去するために洗浄バッファー１（ＴＡＰ、２０ｍＭリン酸、０．００５％ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ６．０）で細胞を３回洗浄した。得られたヒ素溶液を、貝瀬らの方法（Kaise et al.,1999,Appl.Organomet.Chem,13,107-111）を用いて湿式分解による還元気化原子吸光法によりヒ素を定量した。
次に、この蓄積量の違いがヒ酸添加後どの時期に起こるものなのかを調べるために、指数増殖期の細胞培養液に１ｍＭヒ酸になるように添加し、ヒ素蓄積量の経時変化、並びにそのときの光合成活性を調べた。その結果を図５に示す。ＣＣ１２５は２時間目までヒ酸を取り込み続けるが、ＡＲ３のヒ酸取り込みはヒ酸添加後１０分後から抑制され、その蓄積量は低いまま一定に保たれていた。またＡＲ３はヒ酸取り込みの抑制に平行して光合成活性が回復した。光合成活性の測定はＷｙｋｏｆｆらの方法（Wykoff et al.,1998,Plant Physiol,117,129-139）を参考とした。酸素発生量と酸素消費量をClark-type oxygen electrode units(Hansatech,King's Lynn, UK)を用いて測定し、その和を光合成活性とした。
【００４１】
（２）リン含量の測定
図６に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のリン蓄積量を示す。ヒ素耐性株ＡＲ３は野生株ＣＣ１２５に比べて細胞内のリン蓄積量が２倍であった。
細胞のリン含量は以下のようにして測定した。指数増殖期にある細胞１ｍｌをＴＡＰ培地（３２Ｐ−リン酸を含む）９ｍＬで１／１０に希釈し、指数増殖期まで生育させた後、培養液１ｍＬを１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心して細胞を集め、洗浄バッファー１で４回洗浄して、細胞内３２Ｐを測定した。
【００４２】
（３）リン酸によるヒ酸吸収の阻害について
図７にヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害、及びリン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を調べた結果を示す。Ａはいろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸の取り込み速度の測定を行った結果である。Ｂはいろいろな濃度のヒ酸を含む培地中でのリン酸の取り込み速度の測定を行った結果である。
ヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害を調べる場合には、細胞をＴＡＰ−Ｐ培地で２回洗浄し、２０分後、１０ｍＬずつ分注し、１ｍＭヒ酸と各濃度（０，１，１０ｍＭ）のリン酸（カリウム塩、ｐＨ７．０）になるように同時に添加した。各時間ごとに細胞に取り込まれたヒ素を測定した。
リン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を調べる場合は、タイタープレートに０．２５ｍＬずつ分注した細胞に、１ｍＭ３２Ｐ−リン酸と各濃度（０，１，１０ｍＭ）のヒ酸になるように同時に添加した。各時間（５，１０分）ごとに０．１ｍＬずつ１．５ｍＬマクロチューブに移し、１ｍＬの洗浄バッファー１を添加し、リン酸の取り込みを停止させた。チューブの底に洗浄バッファー２（ＴＡＰ、２０ｍＭリン酸、０．００５％ｔｗｅｅｎ２０、１０％ショ糖、適量のブロモフェノールブルー、ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ入れ、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心した。この操作を４回繰り返して細胞を洗浄した後、細胞内３２Ｐを測定した。
図８に、いろいろなリン酸濃度の培地中でのヒ酸による生育阻害を調べた結果を示す。培地中のリン酸濃度が高い時には、ＣＣ１２５でもヒ酸による生育阻害を受けなかった。
【００４３】
（４）リン酸取り込みのミカエリスメンテンプロット解析
図９に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３についてリン酸取り込み活性のミカエリスメンテンプロット解析を行った結果を示す。横軸を培地中のリン酸濃度、縦軸をリン酸の取り込み速度としてプロットを描き、ミカエリスメンテン式からＶｍａｘとＫｍ値を求めた。ＣＣ１２５、ＡＲ３ともにリン酸高親和性トランスポーターによるものとリン酸低親和性トランスポーターによるものの二つの取り込み経路が確認されたが、リン酸高親和性トランスポーターの活性（Ｖｍａｘ値）が、ＡＲ３ではＣＣ１２５の４倍以上高まっていた。また、ＡＲ３のリン酸低親和性トランスポーターのＫｍ値がＣＣ１２５のＫｍ値よりも大きくなっていた。
リン酸取り込み速度は、フリハタらの方法（Furihata et al.,1992,Plant Cell Physiol.,33(8),1151-1157）を参考にして以下のように測定した。細胞１０ｍＬをＴＡＰ−Ｐ培地で２回洗浄し、細胞懸濁液をタイタープレート（２４ウェル）に０．２５ｍＬずつ分注し、２７℃、２０分、インキュベーションした後、各濃度（０．０１，０．１，１，１０，１００，１０００ｍＭ）の３２Ｐ−リン酸を添加した。リン酸添加後２分後に、各ウェルに０．７５ｍＬ洗浄バッファー１を加え、リン酸の取り込みを停止させた。０．８ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、チューブの底に洗浄バッファー２を０．２ｍＬ混ざらないように静かに入れ、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心した。沈殿した細胞を洗浄バッファー１で懸濁し、再びチューブの底に洗浄バッファー２を入れて、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心分離した。この操作を３回繰り返して細胞を洗浄した後、細胞内３２Ｐを測定した。取り込みの速度は、次の式
Ｖ＝Ｓ・Ｖｍａｘ１／（Ｋｍ１＋Ｓ）＋Ｓ・Ｖｍａｘ２／（Ｋｍ２＋Ｓ）
からリン酸と親和性の低いトランスポーターのＶｍａｘ１Ｋｍ１と、リン酸と親和性の高いトランスポーターのＶｍａｘ２とＫｍ２を求めた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質及びそそれをコードする遺伝子を利用することにより、細胞に取り込まれるヒ素及びリン酸の濃度を制御することが可能となる。すなわち、本発明の遺伝子ＰＴＢ１を破壊することにより、ヒ素耐性能及びリン酸蓄積能を細胞に与えることができる。さらに、この方法を用いて得られたヒ素耐性藻類を用いることにより環境中又は排水中のヒ素を回収・無毒化することが可能となる。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＴＢ１のエクソン／イントロン構造を示す。また、ヒ素耐性変異株ＡＲ３においてＴＡＧ（ＡＲＧ７遺伝子からなるもの）が挿入されていた場所を示す。
【図２】ＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列についてハイドロパシー分析を行った結果を示す。
【図３】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。
【図４】いろいろな濃度のヒ酸を含有する培地で生育した細胞のヒ素蓄積量を示す。
【図５】ヒ酸含有培地で野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３を培養したときに、ヒ素蓄積量の経時変化とそのときの光合成活性を示す。
【図６】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３の細胞内リン蓄積量を示す。
【図７】野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３においてのヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害、及びリン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を示す。
（Ａ）いろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸の取り込み速度
（Ｂ）いろいろな濃度のヒ酸を含む培地中でのリン酸の取り込み速度
【図８】いろいろなリン酸濃度の培地中でのヒ酸による生育阻害を調べた結果を示す。
【図９】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３についてリン酸取り込み活性のミカエリスメンテンプロット解析を行った結果を示す。横軸を培地中のリン酸濃度、縦軸をリン酸の取り込み速度としてプロットを描き、ミカエリスメンテン式からＶｍａｘとＫｍ値を求めた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、藻類のリン酸高親和性トランスポーターを抑制しているタンパク質をコードする遺伝子であり、藻類のヒ素耐性に関与する遺伝子ＰＴＢ１に関する。
また本発明は、ＰＴＢ１を破壊することによりヒ素耐性の藻類を得る技術に関する。更に本発明は、ＰＴＢ１を破壊して得られたヒ素耐性藻類を用いてヒ素を回収・無毒化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒ素は生物に有毒な元素であり、インド、バングラデッシュなどの国では、河川のヒ素汚染に非常に悩まされている。日本においても地域的にヒ素の多いところがあり、対策が求められている。また、近年の急速なコンピューター産業の発達のため、発光素子に用いられるガリウムヒ素やインジウムヒ素の生産が増加しつつある。これらのヒ素化合物が産業廃棄物として工場から流出してしまうことが危惧されるが、これらの毒性についての研究も始まったばかりである（Flora et al.,1999,Chem Biol Interact,122(1)1-3; Bustamante et al.,1997,Toxicol,118(2-3)129-136;Omura et al.,1996,Toxicol-Lett,89(2)123-129)。
そのため、環境中に流出しているヒ素を迅速に除去する必要性に迫られている。
ヒ素の除去法は数多く開発されているが、現在日本国内でもっとも多く採用されているのは共沈法と呼ばれている方法である。これは原水に鉄やアルミニウムなどを添加し、ヒ素を抱き込ませて沈める方法であるが、沈殿には大きな槽を必要とし、またヒ素を抱き込んだ汚泥が大量に発生する。井戸水など飲料水中に含まれるヒ素の除去については、億単位に上る費用などがネックとなり、対策が遅れているのが現状である。
【０００３】
自然界には周辺の水に含まれるヒ素を濃縮する藻類の種がいくつか存在する。ヒ素の除去方法の一つとして藻類などを用いた生物濃縮が考えられ、ヒ素の無毒化や回収技術の開発を視野に入れてこれらの藻類に関する研究が進められてきた。
ヒ素は細胞内でさまざまな分子形態をとることが知られている。無機のヒ素はヒ酸（ＡｓＯ４ ２−）、亜ヒ酸（ＡｓＯ３ −）などだが、自然界に存在するヒ素化合物のなかでも毒性が特に強いものである。
海藻では蓄積された無機ヒ素が生理反応により、ヒ素含有糖類などのヒ素化合物へ転換されることが明らかとなっている（Edmonds and Francesconi,1981,Nature,289,602-604: Shibata et al.,1987,Agric.Biol.Chem.,51,391-398: Edmonds et al.,1987,J.Chem.Soc.Perkin Trans.1,577-580: Kaise et al.,1998,Organomet.Chem.,12,137-143）。そして、無機ヒ素を高度にアルキル化したヒ素化合物は、哺乳類の細胞にたいして無機のヒ素よりも低い毒性を示すことが確かめられている（Kaise et al.,1996,J.Food Hyd.Soc.Japan,37,135-141: Oya-Ohta et al.,1996,Mutat.Res.,357,123-129: Kaise et al.,1998,Appl.Organomet.Chem.,2,539-546）。
微細藻類に関し、生理学的、遺伝学的な研究が詳細に行われている。しかしながら、微細藻類のヒ素への耐性メカニズムについてはいまだ明らかにされていない。クロレラ（Chlorella）、クリプトモナス（Cryptomonas）、ヒメノモナス（Hymenomonas）、シネココッカス（Synechococcus）、ホルミジウム（Phormidium）、およびアナベナ（Anabaena）を含む、いくつかの種の微細藻類とシアノバクテリアが自然の水よりも何桁も高い濃度のヒ素にも耐性があると報告されている（Bottino et al.,1978、J.Exp.Mar.Biol.Ecol.,33,153-168: Planas and Healey,1978,J.Phycol.,14,337-341: Budd and Craig,1981,Can.J.Bot.,59,1518-1521: Maeda et al.,1983,Separation Sci.Technol.,18,375-385）。これらの種においては、ヒ素は無機体あるいはメチル化された化合物として蓄積される（Andreae and Klumpp,1979,Environ.Sci.Technol.,13,738-741: Maeda et al.1990,Appl.Organomet.Chem.4,251-254: Kaise et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,297-304: Kuroiwa et al.,1994,Appl.Organomet.Chem,8,325-333: Gossler et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,57-66）。緑藻のドナリエラ（Dunaliella sp.）では、培地の中のヒ酸塩は細胞に吸収されて、亜ヒ酸塩に還元される（Takimua et al.,1996,Appl.Organomet.Chem,10,753-756）。別の緑藻、クロレラ・ブルガリス（Chlorella vulgaris）、および、ホルミジウム（Phormidium sp.）では、少なくともヒ素の９５％は無機のヒ素として存在しているが、残りはジメチル化された形態となっていると報告されている（Maeda et al.,1990,Appl.Organomet.Chem.4,251-254: Gossler et al.,1997,Appl.Organomet.Chem,11,57-66）。従って、微細藻類においては、無機のヒ酸塩は亜ヒ酸塩に還元されてからジメチル化されたヒ素化合物へと変換されるのではないかと推定できる。ジメチル化されたヒ素化合物は無機のヒ素よりも毒性が低いため、藻類はある程度の量のヒ素を吸収しても生存できるのである。
【０００４】
一部の藻類によりヒ素が無毒化されることについては明らかとなっているが、微細藻類は大型藻類に比べてヒ素毒性に対する感受性が強く、高濃度のヒ素の含まれる環境では生存できないものである。微細藻類を用いたヒ素の回収あるいは無毒化技術に関しては、より強いヒ素耐性能を持つ微細藻類を得る必要があった。
【０００５】
本発明者らは以前に微細藻類の一種である緑藻クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）のゲノムにに無作為挿入変異法によって変異を導入した変異株を、いろいろな濃度のヒ酸塩存在下で生育させてヒ酸抵抗性株のスクリーニングを行った。このスクリーニングによりクラミドモナス・ラインハルディのヒ酸抵抗性株を得た（Fujiwara,et al., 2000, Plant Cell Physiol., 41(1),77-83 ）。
さらにクラミドモナス・ラインハルディでは、吸収されたヒ酸がジメチルヒ酸へと代謝されることが確かめられた（Fujiwara,et al.,2000,Plant Cell Physiol., 41(1),77-83）。
緑藻であるクラミドモナスは淡水域に生息する真核単細胞の藻類で、２本の鞭毛、眼点、ピレノイド、一つの葉緑体などを持っているのが特徴である。クラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）という種は、クラミドモナスの一種であり、掛け合わせや形質転換が比較的容易であるため、分子レベル・細胞レベルでの植物生理生化学の研究材料として適したものである。
【０００６】
ヒ素の同族元素であるリンは、生物において核酸の成分となっているほか、代謝調節に関与するとともに、呼吸で生産されたエネルギーを貯蔵して、必要とする酵素に伝達するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の成分である。また、酵素のはたらきに不可欠な補酵素の成分になるなどの働きもあり、生体に必須の元素である。このように生体に必須の元素であるため、リンは窒素、カリウムとともに化学肥料として多量に消費される元素である。農業のほか、洗浄剤など工業においても重要な資源である。リンの供給源としてはリン鉱石に頼っているが、リン鉱石は２１世紀中あるいは２２世紀には枯渇することが予想されている。リン資源の枯渇は農業及び人類の生存に深刻な障害となるため、リン回収技術の開発が活発に行われている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、遺伝子破壊した緑藻クラミドモナスの系から得られたヒ素耐性変異株の一つであるＡＲ３より、ヒ素耐性に関わる遺伝子を単離・同定することを目的とする。また、本発明はヒ素耐性変異株ＡＲ３のヒ素耐性メカニズムと、ヒ素耐性に関わるＰＴＢ１遺伝子の役割を解明することにより、藻類によるヒ素の無毒化・回収技術を開発することを目的とする。
その他の目的については、以下の記載により明らかである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、遺伝子破壊した緑藻クラミドモナスの系から得られたヒ素耐性変異株の一つであるＡＲ３より、ヒ素耐性に関わる遺伝子ＰＴＢ１を同定・単離した。
また、ＰＴＢ１遺伝子の破壊されたヒ素耐性変異株ＡＲ３について生理学的実験を行った結果、ＰＴＢ１は緑藻のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子であることが判明した。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
以上のことを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００９】
すなわち本発明は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するるタンパク質、それをコードする遺伝子、ヒ素耐性のメカニズム、及びこれらを利用する方法に関する。
【００１０】
本発明のタンパク質は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）から選択されるタンパク質であって、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質である。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
本発明の遺伝子は、以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるＤＮＡであって、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。
（ａ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
本発明の遺伝子はまた、以下の（ｃ）及び（ｄ）から選択されるゲノムＤＮＡであって、そのゲノムＤＮＡを破壊することによりヒ素耐性能が得られるゲノムＤＮＡからなる遺伝子である。
（ｃ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡ。
【００１１】
本発明により明らかとなったヒ素耐性メカニズムは次のとうりである。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
【００１２】
本発明は、ＰＴＢ１遺伝子を破壊してヒ素耐性形質転換体及びリン蓄積能を有する形質転換体（以下、単に「リン蓄積性形質転換体」と略す）を得る方法を提供するものである。さらに、この方法により得られたヒ素耐性藻類を用いて環境中のヒ素を回収しジメチルヒ酸へと無毒化する方法、及びこの方法により得られたリン蓄積性形質転換体を用いて環境中のリンを回収する方法を提供するものである。
また本発明は、リン吸収能を活性化させて細胞にヒ素耐性能を与える方法、本発明のＤＮＡ及びその一部を含むベクター、本発明のＤＮＡの部分配列及びその相補配列からなるポリヌクレオチド、本発明のタンパク質に対する抗体、並びに本発明のタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法を提供するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子はヒ素耐性に関与する遺伝子であり、その遺伝子を破壊することによりヒ素耐性能を与えることができる遺伝子である。本発明の遺伝子配列を後期配列表の配列番号２と配列番号３に示す。配列番号２は本発明の遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を示す。配列番号３は本発明の遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列を示す。
また本発明の遺伝子はリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子である。本発明の遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列を後期配列表の配列番号１に示す。
【００１４】
本発明の遺伝子ＰＴＢ１は次の方法により同定・単離されたものである。
まず、クラミドモナス・ラインハルディのアルギニン要求性変異株ＣＣ４２５にアルギニン合成酵素の遺伝子ＡＲＧ７を染色体上に無作為に導入することにより、種々の変異株を作製した。次に、変異株をヒ酸含有培地でスクリーニングすることによりヒ素耐性株ＡＲ３を得た。
ＡＲ３ゲノムの中から、ＡＲＧ７遺伝子を目印としてＡＲＧ７周辺領域をクローニングした。このＤＮＡ断片をプローブとして野生型ｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡの３’端を含む部分を単離した。また５’−ＲＡＣＥにより５’端を含む部分を単離した。このｃＤＮＡの塩基配列を決定したところ、全長６０３２塩基であった。
このｃＤＮＡ配列塩基配列より推定されるアミノ酸配列を後期配列表の配列番号１に示す。１６６６アミノ酸残基からなるタンパク質をコードするものと推定される。生理学的解析によりこのタンパク質は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質であることが明らかとなった。その生理学的解析の詳細については後述する。
次に、上記のｃＤＮＡ配列をもとに、ゲノムＤＮＡライブラリーから相同性のある配列を持つクローンをスクリーニングし、その塩基配列を決定した。このＰＴＢ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列を後期配列表の配列番号３に示す。配列決定部分の長さが１２８５１塩基であり、ＰＴＢ１をコードする１９個のエクソン領域を含むゲノムＤＮＡ塩基配列である。染色体上のＰＴＢ１遺伝子のエクソン／イントロン構造を図１に示す。
ＰＴＢ１遺伝子の同定・単離方法については、実施例においてより詳細に記載する。
【００１５】
後記配列番号１に示されるアミノ酸配列もしくは配列番号２に示される塩基配列について、既知プロテインデータベース（ＮＢＲＦ及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）及びＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）に含まれるすべての配列に対してホモロジー検索を行った結果、一致するものはなく、この配列は、新規なものであると考えられる。
【００１６】
本発明のタンパク質としては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもののほか、例えば配列番号１で示されたアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制する機能が失われない程度であればよく、通常１〜約３３３個、好ましくは１〜約１６７個である。このようなタンパク質は、配列番号１で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列のホモロジーを有する。
【００１７】
また、本発明の遺伝子としては、配列番号２で示された塩基配列を有するもののほか、配列番号２で示された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡを含むものが挙げられる。このようにハイブリダイズし得るＤＮＡは、そのＤＮＡにコードされるタンパク質がリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するものであればよい。このようなＤＮＡは配列番号２で示された塩基配列と通常、７０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列のホモロジーを有する。このようなＤＮＡとしては、自然界で発見される変異型遺伝子、人為的に改変した変異型遺伝子、異種生物由来の相同遺伝子等が含まれる。
本発明において、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、通常、ハイブリダイゼーションを、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。
【００１８】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をコードする遺伝子は、適当な藻類の組織や細胞を遺伝子源として用いてスクリーニングを行うことにより単離取得できる。藻類としては、クラミドモナス、ドナリエラ、コナミドリムシ、クロロモナス、クロレラ、クリプトモナス、ヒメノモナス、シネココッカス、ホルミジウム、およびアナバエナが挙げられる。
遺伝子のスクリーニング及び単離は、ホモロジークローニング法などにより好適に実施できる。
例えば、紅藻スサビノリを遺伝子源として用い、これからｍＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）を調製する。これからｃＤＮＡライブラリーを構築し、ＥＳＴ(expressed sequence tag) データベースの検索によって得られるＰＴＢ１類似配列（例えば、GenBankＴＭ/EBI/DDBJ accession No. AV430785) に相当するプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質のｃＤＮＡを含むクローンを得ることができる。
得られたｃＤＮＡについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定することができる
【００１９】
得られたＰＢＴ１遺伝子のｃＤＮＡから調製した、これに相補的なＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を用いて、インビトロ翻訳法[Hedigerら、Biochim. Biophys. Acta、第1064巻、360項、1991年]により、ＰＴＢ１タンパク質を合成し、電気泳動によりタンパク質のサイズ、糖付加の有無等を検討することができる。
【００２０】
得られたＰＢＴ１遺伝子のｃＤＮＡを用いて、異なる遺伝子源で作製された適当なｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、異なる組織、異なる生物由来の相同遺伝子や染色体遺伝子等を単離することができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列（配列番号２に示された塩基配列、もしくはその一部）の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法によりｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリーから遺伝子を単離することができる。
ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックＤＮＡライブラリー等のＤＮＡライブラリーは、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」[Sambrook, J., Fritsch, E.F.及びManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊] に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
【００２１】
本発明のＤＮＡは、ＰＴＢ１遺伝子が破壊されたヒ素耐性株の作製に用いることができる。本発明のＤＮＡまたはその一部を薬剤耐性遺伝子などのマーカーと結合した後ベクターに組み込み、ＰＴＢ１遺伝子を破壊するためのベクターとすることができる。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、ゲノム上のＰＴＢ１遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＰＴＢ１遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＰＴＢ１のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＰＴＢ１のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。また相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００２２】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質は、それをコードするｃＤＮＡを用い、遺伝子組換え技術により生産することができる。例えば、ＰＢＴ１をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡ等）を適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入することができる。ポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母の発現系等が挙げられる。このうち、機能タンパクを得るためには、酵母を用いることが好ましい。
本発明は、前記した本発明の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、好ましくは相同組み換えのためのベクター又は発現ベクター、及び当該ベクターを用いて形質転換された宿主細胞（形質転換体）を提供する。
【００２３】
リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを用いることができるほか、前記のｃＤＮＡ配列に限定されることなく、アミノ酸配列に対応するＤＮＡを設計し、ポリペプチドをコードするＤＮＡとして用いることもできる。この場合、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは各々１〜６種類知られており、用いるコドンの選択は任意で良いが、例えば発現に利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い配列を設計することができる。設計した塩基配列を持つＤＮＡは、ＤＮＡの化学合成、前記ｃＤＮＡの断片化と結合、塩基配列の一部改変等によって取得できる。人為的な塩基配列の一部改変、変異導入は、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用して部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）[Mark, D.F. et al.、Proceedings of National Academy of Sciences、第81巻、第5662項（1984年）] 等によって実施できる。
【００２４】
本発明はまた、配列番号２で示される塩基配列の中の連続する１４塩基以上、好ましくは２０塩基以上の部分配列もしくはその相補的な配列を含むヌクレオチドを提供するものである。
本発明のヌクレオチドは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質コードする遺伝子を検出するためのプローブとして使用することができ、また、当該タンパク質をコードする遺伝子やそれと相同性の高いタンパク質をコードする遺伝子などを入手する際のプライマーとして使用することができ、さらに、そのアンチセンス鎖などによりリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする遺伝子の発現を変調させるために使用することもできる。
【００２５】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質又はこれと免疫学的同等性を有するポリペプチドを用いて、その抗体を取得することができる。抗体は、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質検出や精製などに利用できる。抗体は、本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は、通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
【００２６】
本発明は、ヒ素耐性に関わる遺伝子を提供するのみならず、ヒ素耐性のメカニズムをも提供するものである。そのメカニズムは次のとうりである。
ヒ素耐性変異株ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制しているタンパク質をコードしている遺伝子ＰＴＢ１が破壊されている。このタンパク質が機能しないことによりリン酸高親和性トランスポーターが発現して細胞内のリン酸濃度が上昇する。次に、細胞内リン酸濃度の上昇によりフィードバック阻害がおこり、他のリン酸トランスポーターの発現または活性が抑制される。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
【００２７】
本発明のヒ素耐性のメカニズムは、クラミドモナスの野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３について生理学的な比較をすることにより解明された。
図３に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。ＡＲ３は野生株の１０倍以上ヒ酸に対する耐性能力を持っていた。
図５に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ素蓄積量の経時変化、並びにそのときの光合成活性を示す。ＡＲ３のヒ酸取り込みはヒ酸添加後すぐに抑制され、その蓄積量は低いままであった。またＡＲ３はヒ酸取り込みの抑制に平行して光合成活性が回復した。
図６に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のリン酸蓄積量を示す。ＡＲ３はＣＣ１２５の約２倍のリン含量を示した。ＡＲ３では細胞内に多量に存在するリンが、ヒ素の取り込みの抑制に役立っている可能性が考えられた。
図７に、ヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害と、リン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を示す。培地中のヒ酸濃度が増すにつれ細胞に取り込まれるリン酸の濃度は低下した。逆に、培地中のリン酸の濃度が増すにつれ細胞に取り込まれるヒ酸の濃度は低下した。すなわち、ヒ酸の取り込みはリン酸により阻害され、リン酸の取り込みはヒ酸により阻害された。このことから、ヒ酸とリン酸は同じ取り込み経路を通じて競合的に取り込まれていることが明らかとなった。
図８に、いろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸による生育の阻害を示す。野生株では、培地中のリン酸濃度が高いと（５あるいは１０ｍＭ）、１ｍＭヒ酸存在下でも生育できた。この実験からもヒ酸とリン酸が競合的に取り込まれることが示された。
図９に、リン酸取り込み活性を測定してミカエリスメンテンプロットを描いて解析を行った結果を示す。リン酸高親和性トランスポーターとリン酸低親和性トランスポーターの二つの経路が存在することが確認された。そして、ＡＲ３ではリン酸高親和性トランスポーターの活性がＣＣ１２５の４倍以上高まっていることが明らかとなった。
クラミドモナスの野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３について生理学的な解析については、実施例においてより詳細に記載する。
【００２８】
上記の生理学的解析により、リン酸とヒ酸は競合的に取り込まれることが明らかとなった。また、ＡＲ３では高親和性トランスポーターの活性が野生株の約５倍高まっており、細胞内のリン濃度も野生株の２倍となっていることが明らかとなった。ＡＲ３では細胞内のリン濃度が上昇してリン酸トランスポーターにフィードバック阻害がかかる。リン酸高親和性トランスポーターにより細胞内のリン酸濃度が高く保たれているため、リン酸低親和性トランスポーターにより取り込まれるヒ酸の影響は抑えられて、ＡＲ３はヒ素耐性となる。
従って、ヒ素耐性株ＡＲ３において変異の導入されている遺伝子ＰＴＢ１は、リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質であることが明らかとなった。
【００２９】
本発明のＰＴＢ１遺伝子を破壊または改変して細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法としては、遺伝子の相同組み換えを利用したＰＴＢ１遺伝子の破壊法などが挙げられる。
本発明のＤＮＡの一部と選択マーカーをプラスミドに組み込んで相同組み換えのためのベクターとし、これを宿主に導入して形質転換することによりＰＴＢ１遺伝子を破壊することが可能である。ベクター及び宿主への形質転換法は、宿主に応じて適したものが選択される。マーカーとしてはカナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子が挙げられ、形質転換方法としてはエレクトロポレーション法、パーティクルガン法などが挙げられる。ベクターとしてはシャトルベクターが好ましい。
相同組み換えを行うための本発明のＤＮＡとは、リン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質をコードする必要はなく、生理的条件下、すなわち細胞内で、染色体上のＰＴＢ１遺伝子と相同組み換えを起こすことができ、それによってＰＴＢ１遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性があげられる。また、ＰＴＢ１遺伝子のエクソン部分と相同性を有するＤＮＡを必ず含む必要はなく、ＰＴＢ１のゲノムＤＮＡと相同性を有するＤＮＡであればよい。相同組み換えを行うためのＤＮＡは本発明のＤＮＡの一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
相同組み換えのベクターを作製する前に、本発明のＤＮＡを用いて宿主の遺伝子構造を明らかにするのもより好ましい形態である。すなわち、ＥＳＴ(expressed sequence tag) データベースの検索によって得られるＰＴＢ１類似配列に相当するプローブを用いて、宿主のゲノミックライブラリーをスクリーニングすることによってＰＴＢ１遺伝子のコピー数及びその塩基配列を決定する。決定された塩基配列からなるＤＮＡを相同組み換えベクターに用いるＤＮＡとすることができる。
【００３０】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊して細胞にヒ素耐性能を与える方法、ＰＴＢ１遺伝子を破壊して細胞にリン酸蓄積能を与える方法としては、前段落番号の段落に記載した遺伝子破壊方法が挙げられる。遺伝子を破壊する細胞としてはＰＴＢ１遺伝子を持つものであれば可能であるが、ＰＴＢ１遺伝子を持つ藻類が好ましく、ＰＴＢ１遺伝子を持つクラミドモナス等の緑藻がより好ましい。
【００３１】
細胞の有するリン吸収能を活性化させて細胞にヒ素耐性能を与える方法としては、リン酸トランスポーターを過剰発現させる方法、リン酸トランスポーターの活性促進剤を用いる方法などが挙げられる。またリン酸の投与も細胞へのリン吸収能を活性化させる効果があるものである。
過剰発現させるリン酸トランスポーターとしては、ヒ酸の輸送能力の低いものが好ましい。リン酸トランスポーターのリン酸取り込みに対するヒ酸の阻害定数の測定などによりヒ酸に対するリン酸トランスポーターの親和性の測定が可能である。
【００３２】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたヒ素耐性形質転換体を用いたヒ素の回収方法としては、高濃度のヒ素を含む水溶液中において、光照射下でヒ素耐性形質転換体を培養することによりこのヒ素耐性形質転換体にヒ素を取り込ませ、次に培養したヒ素耐性形質転換体を回収することによってヒ素を除去する方法が挙げられる。
ヒ素耐性形質転換体としては、高濃度のヒ素を含む水溶液では生育できない藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊することにより得られたヒ素耐性藻類が挙げられる。また鉱山などのヒ素濃度の高い環境中からサンプリングされた藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊してヒ素耐性がより強化されたものであってもよい。藻類の中でも微細藻類である緑藻が形質転換に好ましく、また培養も容易であるためこの方法に使用するのに好ましいものである。
ヒ素耐性形質転換体を回収する方法としては、培養液を必要に応じ冷却したのち、遠心分離などの手段によりヒ素耐性形質転換体を沈殿、濃縮させ回収する方法が挙げられる。
【００３３】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたヒ素耐性藻類を用いてヒ素を無毒化する方法としては、クラミドモナス、クロレラ、クリプトモナス、ヒメノモナス、シネココッカス、ホルミジウム、及びアナバエナなどの無機ヒ素を有機ヒ素に無毒化する能力をもつ藻類を用いる方法が挙げられる。これらの藻類のＰＴＢ１遺伝子を破壊することによりヒ素耐性を付与し、高濃度のヒ素を含む水溶液中にて培養することにより、ヒ素を無毒化することが可能である。
ヒ素耐性藻類としてＰＴＢ１遺伝子を破壊した糸状緑藻を用い、これを処理槽に固定化させてヒ素の無毒化を行う方法も好ましい形態である。
【００３４】
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたリン蓄積性形質転換体を用いてリンを回収する方法としては、リンを含む水溶液中において、光照射下でリン蓄積性形質転換体を培養することによりこのヒ素耐性形質転換体にリンを取り込ませ、培養したリン蓄積性形質転換体を回収することによりリンを回収する方法が挙げられる。
ＰＴＢ１遺伝子を破壊されたリン蓄積性形質転換体としてはＰＴＢ１遺伝子を持つ藻類が好ましく、ＰＴＢ１遺伝子を持つ緑藻がより好ましい。
リン蓄積性形質転換体を回収する方法としては、培養液を必要に応じ冷却したのち、遠心分離などの手段によりリン蓄積性形質転換体を沈殿、濃縮させ回収する方法が挙げられる。回収されたリン蓄積性形質転換体の生体内に取り込まれたリンは、適当な処理を施すことにより該生体内から取り出し有用リン資源として回収することができる。
【００３５】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質、その特異抗体、その機能促進物質あるいは機能抑制物質を用いて、細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法としては、当該タンパク質をリン酸高親和性トランスポーターの発現抑制剤として用いる方法が挙げられる。また、本発明のタンパク質の特異抗体を作製してそれを使用する方法、本発明のタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質をスクリーニングにより発見して使用する方法が挙げられる。
リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質の特異抗体を作製する方法としては、本発明のリン酸高親和性トランスポーターを抑制するタンパク質、その断片、またはその部分配列を有する合成ペプチドなどを抗原として用いて製造できる。ポリクロナール抗体は、宿主動物（例えば、ラットやウサギ等）に抗原を接種し免疫血清を回収する通常の方法により製造することができ、モノクロナール抗体は通常のハイブリドーマ法などの技術により製造できる。
リン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質をスクリーニングする方法としては、当該タンパク質に結合する物質をスクリーニングすることにより機能促進物質または抑制物質の候補となる物質を得た後、その薬剤活性を検定する方法が挙げられる。例えば、本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質をフィルター及びメンブレンなどの担体に結合させ、このタンパク質に親和性を有する物質をドラッグライブラリーの中から分離・検出する。この親和性を有する物質は薬剤としての有用性が期待される物質であり、その作用を実際に確かめることにより本発明のタンパク質の機能促進物質または機能抑制物質として使用することが可能となる。
【００３６】
【実施例】
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００３７】
実施例１
ヒ素耐性に関わる遺伝子ＰＴＢ１のクローニング
（１）ヒ素耐性株のスクリーニング
本発明者らにより以前に、無作為挿入変異法で得られたクラミドモナス・ラインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）の変異株をいろいろな濃度のヒ酸塩存在下で生育させてスクリーニングを行い、ヒ酸耐性変異株ＡＲ３を得た（Fujiwara,et al., 2000, Plant Cell Physiol., 41(1),77-83）。
すなわち、クラミドモナス・ラインハルディの株であるＣＣ４２５（アルギニン琥珀酸エステル脱離酵素遺伝子を欠損している）にプラスミドｐＪＤ６７をエレクトロポレーション法により形質転換した。プラスミドｐＪＤ６７はアルギニン琥珀酸エステル脱離酵素遺伝子ＡＲＧ７を持っており、ＣＣ４２５の染色体上にランダムに挿入される。プラスミドｐＪＤ６７が挿入されたものは、アルギニン無添加培地で生育できる株として選抜された。この無作為挿入変異法により、さまざまな遺伝子破壊されたＣＣ４２５の系が作製された。
上記の遺伝子破壊されたＣＣ４２５の系からヒ酸耐性変異株のスクリーニングを行った。プラスミドｐＪＤ６７で形質転換処理された約１０９個の細胞を直接、０．１ｍＭの無機リン酸と０．３ｍＭのヒ酸ナトリウムを含むＴＡＰ培地上に移した。プレート上でよく生育するコロニーとして１３の系が得られた。それぞれＡＲ１〜ＡＲ１３と名付けられた。抵抗性変異株は光合成活性が損なわれていないかどうかを調べた。なぜなら、光合成がヒ酸に影響を受けない変異株が選抜されることも考えられたからである（Togasaki and Hudock,1972,Plant Physiol,49,s52; Harris et al.,1974,J.Cell Biol.,63,106-179; Shepherd et al.,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76,1353-1357; Hudock et al.,1979,Biochem.Biophys.Res.Commun.,87,66-71）。この実験により得られたすべての変異株は光合成に関する変異株ではなかった、それは３／１０ ＨＳＭ培地（Sueoka et al.,1967,J.Mol.BIol.,25,44-67）上で独立栄養により生育することにより確かめられた。
変異株はＡＲＧ７遺伝子が染色体に外部から挿入されたものであるかどうかを確認するために、サザンブロット解析を行った。その結果、ヒ素耐性変異株ＡＲ３は染色体上に１コピーの外来性のＡＲＧ７タグが挿入されたものであることが明らかとなった。
また野生株ＣＣ１２５とＣＣ１２４を用いて４回戻し交配して得られたＦ４世代のＡＲ３の６つの接合子について４分子分析を行ったところ、このタグとヒ酸耐性は共分離していた。このことから、ヒ酸耐性はタグによって変異をうけた遺伝子によるものであることが示唆された。
【００３８】
（２）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
ＡＲ３に挿入されたＡＲＧ７遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとして、ＡＲ３のゲノムＤＮＡのＡＲＧ７挿入部位周辺領域をクローニングした。このＤＮＡ断片をプローブとして野生型クラミドモナスのｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡの３’末端を含む部分を単離した。また、５’−ＲＡＣＥ法により５’端を含む部分を単離した。
ダイターミネーターサイクルシーケンシング法により、得られたｃＤＮＡ断片の全長の塩基配列を決定した。この配列を後期配列表の配列番号２に示した。
ｃＤＮＡ全塩基配列より、この遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列を推定した。１６６６のアミノ酸残基からなり分子量１７２ｋＤのポリペプチドからなるタンパク質をコードしているものと推定された。この配列を後期配列表の配列番号１に示した。
【００３９】
（３）ゲノム塩基配列の決定
ｃＤＮＡ配列をプローブとして、クラミドモナスの野生型ゲノムＤＮＡライブラリーから相同性のある配列を持つクローンをスクリーニングした。これらの断片の塩基配列を一部決定したところ、これらの断片の一つがｃＤＮＡの塩基配列とほぼ完全に一致する塩基配列を持つものであった。このクローンの塩基配列を決定し遺伝子の全塩基配列を決定した。この配列を後期配列表の配列番号３に示した。この遺伝子をＰＴＢ１と命名した。
図１にＰＴＢ１のエクソン／イントロン構造を示す。ＰＴＢ１の構造遺伝子は１９個のエクソン領域からなるものである。図１はまた、ヒ素耐性変異株ＡＲ３においてタグ（ＡＲＧ７遺伝子からなる）が挿入されていた場所を示す。
図２にＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列についてハイドロパシー分析を行った結果を示す。ＰＴＢ１のコードするタンパク質は１２回の膜貫通領域を持つことが推測された。
ＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列について相同性検索を行ったところ、酵母（Saccharomyces）のナトリウム依存性リン酸トランスポーターであるＰＨＯ８９と有意の相同性を示すが、中央部分にグルタミンとグリシンに富む大きな挿入領域があることがわかった。
【００４０】
実施例２
ヒ素耐性変異株ＡＲ３と野生型株ＣＣ１２５の生理学的な比較による解析
（１）ヒ酸に対する耐性の評価
ヒ酸耐性以外の変異を取り除くために、ＡＲ３を野生株ＣＣ１２５と３回戻し交配させた。以後の実験には、この戻し交配を行ったＡＲ３（Ｆ３世代）を用いることにした。
図３に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。１ｍＭのリン酸を含む培地において、いろいろな濃度のヒ酸を添加しヒ酸による生育阻害を調べた。ＡＲ３は野生株の１０倍以上ヒ酸に対する耐性能力を持っていた。
野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３の培養にはＴＡＰ培地（リン酸を含む、Ｈａｒｒｉｓ１９８９）を用い、８０μｍｏｌ光子／ｍ・ｓの光照射下、２７℃で培養を行った。
図４にヒ酸含有培地で生育した細胞のヒ素蓄積量を調べた結果を示す。野生株ＣＣ１２５と耐性株ＡＲ３ではヒ素蓄積量が異なっており、ＣＣ１２５は０．２ｍＭヒ酸含有培地で培養すると、５０ｎｍｏｌ／ｍｇ以上のヒ素蓄積量があるのに対して、ＡＲ３は培地のヒ酸濃度が高くなってもヒ素蓄積量は低いままであり、２ｍＭヒ酸含有培地では３０ｎｍｏｌ／ｍｇ以下であった。
ヒ酸含有培地で生育している細胞のヒ素蓄積量は、以下のように定量した。指数増殖期の細胞を各濃度（０．１，０．２，０．４，１，２，４，８ｍＭ）のヒ酸（Ｎａ２ＡｓＨＯ４・７Ｈ２Ｏ、和光純薬）を含むＴＡＰ培地で約１０倍に希釈した後、指数増殖期まで培養し、培養液４０ｍＬを１，５００×ｇ、１５分、４℃で遠心分離して細胞を集め、細胞外のヒ酸を除去するために洗浄バッファー１（ＴＡＰ、２０ｍＭリン酸、０．００５％ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ６．０）で細胞を３回洗浄した。得られたヒ素溶液を、貝瀬らの方法（Kaise et al.,1999,Appl.Organomet.Chem,13,107-111）を用いて湿式分解による還元気化原子吸光法によりヒ素を定量した。
次に、この蓄積量の違いがヒ酸添加後どの時期に起こるものなのかを調べるために、指数増殖期の細胞培養液に１ｍＭヒ酸になるように添加し、ヒ素蓄積量の経時変化、並びにそのときの光合成活性を調べた。その結果を図５に示す。ＣＣ１２５は２時間目までヒ酸を取り込み続けるが、ＡＲ３のヒ酸取り込みはヒ酸添加後１０分後から抑制され、その蓄積量は低いまま一定に保たれていた。またＡＲ３はヒ酸取り込みの抑制に平行して光合成活性が回復した。光合成活性の測定はＷｙｋｏｆｆらの方法（Wykoff et al.,1998,Plant Physiol,117,129-139）を参考とした。酸素発生量と酸素消費量をClark-type oxygen electrode units(Hansatech,King's Lynn, UK)を用いて測定し、その和を光合成活性とした。
【００４１】
（２）リン含量の測定
図６に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のリン蓄積量を示す。ヒ素耐性株ＡＲ３は野生株ＣＣ１２５に比べて細胞内のリン蓄積量が２倍であった。
細胞のリン含量は以下のようにして測定した。指数増殖期にある細胞１ｍｌをＴＡＰ培地（３２Ｐ−リン酸を含む）９ｍＬで１／１０に希釈し、指数増殖期まで生育させた後、培養液１ｍＬを１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心して細胞を集め、洗浄バッファー１で４回洗浄して、細胞内３２Ｐを測定した。
【００４２】
（３）リン酸によるヒ酸吸収の阻害について
図７にヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害、及びリン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を調べた結果を示す。Ａはいろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸の取り込み速度の測定を行った結果である。Ｂはいろいろな濃度のヒ酸を含む培地中でのリン酸の取り込み速度の測定を行った結果である。
ヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害を調べる場合には、細胞をＴＡＰ−Ｐ培地で２回洗浄し、２０分後、１０ｍＬずつ分注し、１ｍＭヒ酸と各濃度（０，１，１０ｍＭ）のリン酸（カリウム塩、ｐＨ７．０）になるように同時に添加した。各時間ごとに細胞に取り込まれたヒ素を測定した。
リン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を調べる場合は、タイタープレートに０．２５ｍＬずつ分注した細胞に、１ｍＭ３２Ｐ−リン酸と各濃度（０，１，１０ｍＭ）のヒ酸になるように同時に添加した。各時間（５，１０分）ごとに０．１ｍＬずつ１．５ｍＬマクロチューブに移し、１ｍＬの洗浄バッファー１を添加し、リン酸の取り込みを停止させた。チューブの底に洗浄バッファー２（ＴＡＰ、２０ｍＭリン酸、０．００５％ｔｗｅｅｎ２０、１０％ショ糖、適量のブロモフェノールブルー、ｐＨ６．０）を０．２ｍＬ入れ、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心した。この操作を４回繰り返して細胞を洗浄した後、細胞内３２Ｐを測定した。
図８に、いろいろなリン酸濃度の培地中でのヒ酸による生育阻害を調べた結果を示す。培地中のリン酸濃度が高い時には、ＣＣ１２５でもヒ酸による生育阻害を受けなかった。
【００４３】
（４）リン酸取り込みのミカエリスメンテンプロット解析
図９に、野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３についてリン酸取り込み活性のミカエリスメンテンプロット解析を行った結果を示す。横軸を培地中のリン酸濃度、縦軸をリン酸の取り込み速度としてプロットを描き、ミカエリスメンテン式からＶｍａｘとＫｍ値を求めた。ＣＣ１２５、ＡＲ３ともにリン酸高親和性トランスポーターによるものとリン酸低親和性トランスポーターによるものの二つの取り込み経路が確認されたが、リン酸高親和性トランスポーターの活性（Ｖｍａｘ値）が、ＡＲ３ではＣＣ１２５の４倍以上高まっていた。また、ＡＲ３のリン酸低親和性トランスポーターのＫｍ値がＣＣ１２５のＫｍ値よりも大きくなっていた。
リン酸取り込み速度は、フリハタらの方法（Furihata et al.,1992,Plant Cell Physiol.,33(8),1151-1157）を参考にして以下のように測定した。細胞１０ｍＬをＴＡＰ−Ｐ培地で２回洗浄し、細胞懸濁液をタイタープレート（２４ウェル）に０．２５ｍＬずつ分注し、２７℃、２０分、インキュベーションした後、各濃度（０．０１，０．１，１，１０，１００，１０００ｍＭ）の３２Ｐ−リン酸を添加した。リン酸添加後２分後に、各ウェルに０．７５ｍＬ洗浄バッファー１を加え、リン酸の取り込みを停止させた。０．８ｍＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、チューブの底に洗浄バッファー２を０．２ｍＬ混ざらないように静かに入れ、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心した。沈殿した細胞を洗浄バッファー１で懸濁し、再びチューブの底に洗浄バッファー２を入れて、１８，５００×ｇ、２分、４℃で遠心分離した。この操作を３回繰り返して細胞を洗浄した後、細胞内３２Ｐを測定した。取り込みの速度は、次の式
Ｖ＝Ｓ・Ｖｍａｘ１／（Ｋｍ１＋Ｓ）＋Ｓ・Ｖｍａｘ２／（Ｋｍ２＋Ｓ）
からリン酸と親和性の低いトランスポーターのＶｍａｘ１Ｋｍ１と、リン酸と親和性の高いトランスポーターのＶｍａｘ２とＫｍ２を求めた。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のリン酸高親和性トランスポーターの発現を抑制するタンパク質及びそそれをコードする遺伝子を利用することにより、細胞に取り込まれるヒ素及びリン酸の濃度を制御することが可能となる。すなわち、本発明の遺伝子ＰＴＢ１を破壊することにより、ヒ素耐性能及びリン酸蓄積能を細胞に与えることができる。さらに、この方法を用いて得られたヒ素耐性藻類を用いることにより環境中又は排水中のヒ素を回収・無毒化することが可能となる。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＴＢ１のエクソン／イントロン構造を示す。また、ヒ素耐性変異株ＡＲ３においてＴＡＧ（ＡＲＧ７遺伝子からなるもの）が挿入されていた場所を示す。
【図２】ＰＴＢ１遺伝子がコードするタンパク質の予想されるアミノ酸配列についてハイドロパシー分析を行った結果を示す。
【図３】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３のヒ酸による生育阻害を示す。
【図４】いろいろな濃度のヒ酸を含有する培地で生育した細胞のヒ素蓄積量を示す。
【図５】ヒ酸含有培地で野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３を培養したときに、ヒ素蓄積量の経時変化とそのときの光合成活性を示す。
【図６】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３の細胞内リン蓄積量を示す。
【図７】野生株ＣＣ１２５及びヒ素耐性株ＡＲ３においてのヒ酸の取り込みに対するリン酸の阻害、及びリン酸の取り込みに対するヒ酸の阻害を示す。
（Ａ）いろいろな濃度のリン酸を含む培地中でのヒ酸の取り込み速度
（Ｂ）いろいろな濃度のヒ酸を含む培地中でのリン酸の取り込み速度
【図８】いろいろなリン酸濃度の培地中でのヒ酸による生育阻害を調べた結果を示す。
【図９】野生株ＣＣ１２５とヒ素耐性株ＡＲ３についてリン酸取り込み活性のミカエリスメンテンプロット解析を行った結果を示す。横軸を培地中のリン酸濃度、縦軸をリン酸の取り込み速度としてプロットを描き、ミカエリスメンテン式からＶｍａｘとＫｍ値を求めた。
Claims (17)
- 以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるゲノムＤＮＡであって、そのゲノムＤＮＡを破壊することによりヒ素耐性能が得られるゲノムＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡ。 - 以下の（ａ）及び（ｂ）から選択されるゲノムＤＮＡであって、そのゲノムＤＮＡを破壊することによりリン蓄積能が得られるゲノムＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡ
（ｂ）配列番号３で示される塩基配列からなるゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノムＤＮＡ。 - 藻類由来である請求項１又は２に記載の遺伝子。
- 緑藻由来である請求項１又は２に記載の遺伝子。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
- ベクターが発現プラスミドである請求項５に記載のベクター。
- 請求項５又は６に記載のベクターで形質転換された形質転換藻類。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子を検出するためのプローブとして使用するものである、配列番号２又は３で示される塩基配列の中の連続する２０塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子を破壊して、藻類細胞内のヒ素及びリンの濃度を制御する方法。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子を破壊して、藻類にヒ素耐性能を与える方法。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の遺伝子を破壊して、藻類にリン蓄積能を与える方法。
- 請求項１１に記載の方法により、細胞の有するリン吸収能を活性化させて、藻類にヒ素耐性能を与える方法。
- 請求項１０又は１２に記載された方法により得られたヒ素耐性形質転換藻類。
- 請求項１１に記載された方法により得られたリン蓄積能を有する形質転換藻類。
- 請求項１３に記載のヒ素耐性形質転換藻類を用いて、ヒ素を回収する方法。
- 請求項１３に記載のヒ素耐性形質転換藻類を用いて、ヒ素を無毒化する方法。
- 請求項１４に記載のリン蓄積能を有する形質転換藻類を用いて、リンを回収する方法。
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