JP6329940B2 - ユーグレナ属微細藻類、多糖類の製造方法、及び有機化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
また、斯かるユーグレナ属微細藻類は、培養条件に応じて、蓄積された多糖類をワックスエステルへと変換したり、多糖類を産生しつつ蛋白質も産生したりし得る。そして、産生され該微細藻類の細胞内に蓄積された多糖類、脂質、蛋白質などの有機化合物は、燃料や食品等の用途において利用され得る。
また、本発明の多糖類の製造方法の他態様として、前記培養において用いる培養液が、酵母分解物を含む態様を採用することができる。
また、本発明の多糖類の製造方法の他態様として、前記培養において用いる培養液が、AF6培地の組成を有する態様を採用することができる。
また、本発明の多糖類の製造方法の他態様として、前記多糖類がパラミロンである態様を採用することができる。
本実施形態のユーグレナ属微細藻類は、少なくとも多糖類を十分に産生できるという効果を奏する。
前記ユーグレナ属微細藻類の性質の詳細について以下に示す。
前記ユーグレナ属微細藻類の栄養型細胞は、鞭毛を有し、活発に運動する。また、細胞の形状は、おおよそ紡錘形である。細胞内には、核、葉緑体、ミトコンドリアなどの一般的なオルガネラに加えて眼点という赤色の小器官を有する。
(1)培地:主として淡水からなる培養液中で増殖できる(廃水由来の有機物を利用しても増殖可能)。
(2)光合成能:光合成による光独立栄養増殖ができる。
(3)含有色素:クロロフィルa、クロロフィルb、及び他のカロテノイド類を含む。
(4)同化蓄積物質:蛋白質、脂質(ワックスエステル)、多糖類(パラミロン)。
(5)増殖温度域:15℃〜35℃(至適温度25℃)。
(6)好適増殖pH域:pH3.5〜5.5(ただし、左記pH範囲外でも増殖可能)
前記ユーグレナ属微細藻類は、配列番号1で表される18S rDNA(18S rRNA遺伝子)を有する。
なお、18S rRNA遺伝子の解析は、微細藻類の同定方法として常用されている方法によって行うことができる。具体的には、18S rRNA遺伝子の解析は、例えば、実施例に記載された方法によって行うことができる。
なお、データベースとしてはEMBL、DDBJなどを使用することもできる。
さらに、分子系統樹作成ソフトMega5プログラム(Tamuraら.2011,Mol. Biol. Evol. 28:2731−2739)を用いて、最尤法によって分子系統樹を作成することができる。作成した分子系統樹については、後の実施例において詳細を示す。
また、前記ユーグレナ属微細藻類は、ブドウ糖などの有機栄養素を栄養素として利用しても増殖し得る。即ち、前記ユーグレナ属微細藻類は、従属栄養生物でもある。
このように、前記ユーグレナ属微細藻類は、光独立栄養のみによっても増殖し、従属栄養のみによっても増殖し、光独立栄養及び従属栄養を同時に行っても増殖し得る。
本実施形態の多糖類の製造方法は、多糖類を十分に得ることができるという効果を奏する。
前記無機栄養素の培養液における濃度は、通常、一般的に知られている程度の濃度である。
前記培養工程において微細藻類に光を照射すると、微細藻類は、光合成によって二酸化炭素を細胞内に取り込み、少なくともパラミロンなどの多糖類を産生しつつ増殖し得る。さらに、微細藻類は、蛋白質、及び、脂質、色素やビタミン類などの二次代謝物などを産生しつつ増殖し得る。
即ち、前記培養工程においては、光独立栄養培養を行う期間と、光独立栄養培養を行わない期間とを交互に繰り返すことができる。
なお、光を照射しない暗条件下とは、光合成光量子束密度(PPFD)が50μmol/m2・s以下の条件である。
前記培養工程においては、微細藻類の増殖をより促進できるという点で、光独立栄養培養、及び、従属栄養培養の両方を同時に行うことが好ましい。即ち、前記培養工程においては、光従属栄養培養を行うことが好ましい。
なお、上述の各有機栄養素の少なくとも一部を含むものとして、醸造酒、蒸留酒、清酒粕、焼酎粕、糖蜜、廃糖蜜などが挙げられる。そして、これら酒類などは、有機栄養素の供給源として従属栄養培養や光従属栄養培養において用いられ得る。
前記醸造酒は、蒸留処理を行わず、酵母によるアルコール発酵代謝物を含んでいるため、エタノール、水以外に、酵母が産生したブドウ糖(グルコース)などの糖類、蛋白質、アミノ酸、ビタミン、リン、カリウムなどの栄養素を含んでいる。
前記麦芽としては、通常、大麦の麦芽が用いられる。
また、前記酵母としては、例えば、いわゆる清酒酵母、いわゆるワイン酵母、又は、いわゆるビール酵母などが挙げられる。
斯かるガスの供給は、培養液を曝気すること、培養液を撹拌することなどにより行うことができる。
具体的には、前記培養工程においては、微細藻類に呼吸用の酸素を供給すべく、例えば空気によって培養液を曝気することができる。また、前記培養工程においては、微細藻類の光合成を促進させるべく、例えば、二酸化炭素を比較的多く含む排気ガスなどによって培養液を曝気することができる。
前記培養工程においては、昼などにて、微細藻類に光を照射しつつ培養液に二酸化炭素を供給することによって微細藻類の光合成を促進させることができる。また、夜などの光が照射されないときに、有機栄養素の存在下で培養液に空気を供給して微細藻類を従属栄養培養することができる。
このようにして培養工程を実施することにより、微細藻類の増殖がより促進され、しかも、微細藻類によるパラミロン等の産生がより促進されるという利点がある。
なお、培養液のpHを調整するためには、塩酸のような無機酸を培養液に添加しても良く、酢酸のような有機酸を培養液に添加してもよい。有機酸を培養液に添加することにより、微細藻類が該有機酸を有機栄養素として利用し増殖できるという利点がある。
また、培養液のpHを調整するためには、アルカリ剤を培養液に添加しても良い。アルカリ剤としては、通常、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等が用いられる。
具体的には、前記培養工程においては、例えば、培養液への曝気を停止すること、又は、酸素を含まない不活性ガスなどを培養液に供給すること等により、嫌気条件下にて微細藻類を培養することができる。
前記培養工程においては、細胞内にパラミロンなどの多糖類を蓄積した微細藻類を嫌気条件下にてさらに培養することにより、ユーグレナ属微細藻類がパラミロンをワックスエステルへと変換し、該脂質を細胞内に蓄積し得る。
前記培養工程においては、ワックスエステルの産生をより促進できるという点で、嫌気条件下且つ光が照射されない暗条件下にて微細藻類を培養することが好ましい。
また、前記培養工程においては、培養条件を適宜調整することにより、上記の有機化合物以外の色素、ビタミンCやビタミンEなどのビタミン類、蛋白質、リノレン酸,アラキドン酸,エイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸や飽和脂肪酸などの脂肪酸といった有機化合物をも微細藻類に産生させることができる。
そして、これらの有機化合物が細胞内に蓄積された微細藻類は、食品、医薬品、飼料、化成品、又は燃料など様々な用途にて使用され得るバイオマスとして利用することができる。
前記脂質としては、例えば、ワックスエステルが挙げられる。ワックスエステルは、高級脂肪酸と高級アルコールとがエステル結合したものであり、ワックスエステルとしては、例えば、C−14の脂肪酸とC−14の高級アルコールとがエステル結合したものが挙げられる。
本実施形態の有機化合物の製造方法は、多糖類、脂質、ビタミンC、ビタミンE、色素、及び、蛋白質からなる群より選択される少なくとも1種の有機化合物を十分に得ることができるという効果を奏する。
このうち、ビタミンC、ビタミンE、色素、及び蛋白質については、多糖類の製造方法を行うことによって、多糖類と共に製造され得る。
好ましくは、本実施形態の有機化合物の製造方法は、上述した培養工程と、さらに、培養後の微細藻類の分量を高める濃縮工程と、濃縮工程を経た微細藻類の水分をさらに減少させることにより微細藻類を乾燥させる乾燥工程とを有する。なお、前記有機化合物の製造方法においては、濃縮工程や乾燥工程が必ずしも必要でない。
前記脱水装置としては、具体的には例えば、真空脱水機、加圧脱水機(フィルタープレス)、ベルトプレス、スクリュープレス、遠心濃縮脱水機(スクリューデカンタ)、又は、多重円盤脱水機などが挙げられる。
前記濃縮工程は、製造する多糖類、脂質、蛋白質などの利用用途に応じて、濃縮装置のみによって行ってもよく、濃縮装置及び脱水装置の両方によって行ってもよい。
また、濃縮工程を経た微細藻類や、前記乾燥工程を経た微細藻類が、必要に応じて、一般的な抽出処理を施されることによって、多糖類、脂質、ビタミンC、ビタミンE、色素、及び、蛋白質のうちの少なくとも1種が有機化合物として微細藻類から取り出される。取り出された有機化合物は、例えば、食品原料や燃料の用途において利用され得る。
また、一般のユーグレナ属微細藻類、多糖類の製造方法、及び有機化合物の製造方法において用いられる種々の態様を、本発明の効果を損ねない範囲において、採用することができる。
今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記の説明ではなく、特許請求の範囲によって示される。また、本発明の範囲には、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
長崎県の湖沼から採取した湖水をAF-6培地(後述)に接種し、室温にて蛍光灯の光を照射しながら2ヶ月間培養した。
培養後の培地中における対象微細藻類をマイクロピペットによって単離した。単離した微細藻類を、AF−6培地において、蛍光灯の光を照射しながら室温にて培養した。
[塩基配列の決定]
単離した微細藻類がユーグレナ属に属する種であることを確認すべく、下記の操作を行った。
即ち、培養したユーグレナ属微細藻類の18S rRNA遺伝子の塩基配列をユーグレナ属微細藻類18S rRNA遺伝子専用プライマーセット(Zakrysら.2002,Journal of Phycology 38:1190−1199)を用い、DNAシーケンサー(Beckman Coulter社製「CEQ8000」によって決定した。決定した塩基配列を配列表の配列番号1に示す。
[塩基配列の比較]
決定した塩基配列を、BLASTホモロジー検索を用いて、GenBankから得た既知のユーグレナ属微細藻類の18S rRNA遺伝子の塩基配列と比較した。また、既知のユーグレナ属微細藻類との配列相同性の一致の程度を比較した。単離したユーグレナ属微細藻類の18S rRNA遺伝子の塩基配列と、既知のユーグレナ属微細藻類の18S rRNA遺伝子の塩基配列との比較表を図1に示す。
また、分子系統樹作成ソフトMega5プログラム(Tamuraら.2011,Mol. Biol. Evol. 28:2731−2739)を用いて、最尤法によって分子系統樹を作成した。その系統樹を図2に示す。
その結果、上記のごとく単離した微細藻類が、ユーグレナ属に属する種(Euglena gracilis Klebs)であることを同定した。なお、図2におけるEOD−1株のKa、Kb、Na、及びNbは、単離した微細藻類の試験サンプルに付した記号である。いずれの試験サンプルを用いても同様な結果が得られた。
さらに、単離したユーグレナ属微細藻類と、既知のユーグレナ属微細藻類とを比較するために、RAPD解析(Random Amplified Polymorphic DNA)(参考文献:Williams ら.(1990) Nucleic Aids Res. 18(22), 6531-6535)によって、単離したユーグレナ属微細藻類のバンドパターンと、国立環境研究所保存株6株のバンドパターンとを得た。
RAPD解析におけるPCR条件は、下記の通りである。
サンプル数:3
プライマー1:AAATCGGGCTG:RAPD-6 配列番号2
酵素:Ex Taq(TAKARA社製)
反応バッファー量:50μL
DNAテンプレート量:約0.5ng
PCRの温度条件:表1に示す通り。詳しくは、94℃で1分間で処理した後、(94℃1分間、40℃45秒間、72℃1分間)×35回の繰り返し処理、その後72℃で7分間処理。
泳動条件:2.5質量%アガロースゲル、100V、40分
Euglena gracilis NIES-47
Euglena gracilis NIES-48
Euglena gracilis NIES-49
Euglena gracilis NIES-253
Euglena gracilis NIES-286
Euglena gracilis NIES-2149
プライマー2:ATCGGGTCCG:RAPD-4 配列番号3
プライマー3:GCGATCCCCA:RAPD-3 配列番号4
なお、上記プライマー2〜4の塩基配列は、Mostafa ら. (2011) Molecules 16, 2598-2608 に記載されているものである。
そして、上記のごとく単離したユーグレナ属微細藻類をユーグレナグラシリス(Euglena gracilis)EOD−1株と命名した。
ユーグレナ属微細藻類を培養するために、下記のものを用意し、下記の培養条件下にて培養工程を行った。
「本発明のユーグレナ属微細藻類株」:
ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株
(受託番号:FERM BP−11530)
(独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託済み)
「既知のユーグレナ属微細藻類株」:
ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)NIES−48株
(独立行政法人国立環境研究所 微生物系統保存施設より入手)
「培養容器」:300〜500mLフラスコなど、後述の通り
「培養液へのガスの供給」:130rpmの振とう
(培養液を振とうすることによって培養液中に空気を供給する)
「培養温度」:28℃
「培養期間」:後述の通り
「培養液のpH」:後述の通り
「培養のための培養液中の成分」:
表2、表3に示す組成を基本組成として採用した。
なお、表2に示す組成は、独立行政法人国立環境研究所 微生物系統保存施設によって開示されている「AF−6培地」の組成に対して、「P IV metals」培地の組成(独立行政法人国立環境研究所 微生物系統保存施設によって開示)の成分を加えたものである。また、培養液に含まれる栄養素以外は、水である。
また、表3に示す組成は、Cramer−Myers培地の組成を基にしたものである。
「有機栄養素」:下記のものを培養に応じて適宜変更
・グルコース
・酵母エキス(酵母自己消化物)−
製品名「Dried Yeast Extract D−3」日本製薬社製
・醸造酒としてのビール−市販のビール(麦芽の使用率が66.7%以上)
エタノール5容量%
実施例1〜4、比較例1〜4においては、暗条件下にて従属栄養培養を行い、それ以外の実施例及び比較例においては、光従属栄養培養を行った。微細藻類を光従属栄養培養するときの培養条件の詳細を以下に示す。
「光照射条件」:12時間光照射の後、12時間暗所
「光の強度」:光合成光量子束密度(PPFD)−約100μmol/m2・s又は約200μmol/m2・s
500mLの坂口フラスコに、表2に示す組成物を200mL入れた。さらに、グルコースが15g/Lの濃度となり、酵母エキスが5g/Lの濃度となるように、グルコース及び酵母エキスを添加した。さらに、塩酸の添加によってpHを4.0に調整し、培養液を調製した。
そして、上記の培養条件下、且つ暗条件下(即ち、従属栄養培養条件下)にてフラスコを振とうさせて、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株を3日間培養することにより、培養工程を行った。
培養液中におけるグルコース濃度がそれぞれ20g/L、25g/L、30g/L濃度となるようにグルコース量を変えた点以外は、実施例1と同様にして培養工程を行った。
ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株に代えて、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)NIES−48株を5日間かけて培養した点以外は、実施例1と同様にして培養工程を行った。
培養液中におけるグルコース濃度がそれぞれ20g/L、25g/L、30g/L濃度となるようにグルコース量を変えた点以外は、比較例1と同様にして培養工程を行った。
転換率(%)=
培養によって増加した藻の乾燥重量(g/L)/消費されたグルコース濃度(g/L)
図4から把握されるように、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株は、既知のNIES−48株よりもバイオマス生産量が高いと言える。
300mlの三角フラスコを用いた点、表2に示す組成物50mLに対して、ビール由来のエタノール濃度が2.5容量%となるようにビールを添加した培養液を用いた点、酵母エキスを培養液に添加しなかった点、12時間の光照射環境と12時間の暗環境とを繰り返して培養した点、培養期間を7日間とした点以外は、実施例1と同様にして、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株を培養することにより、培養工程を行った。なお、光合成光量子束密度(PPFD)を約100μmol/m2・sとした。
上記の酵母エキス濃度が2g/Lとなるように酵母エキスを培養液に添加した点以外は、実施例5と同様にして培養工程を行った。
ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株に代えて、ユーグレナ属微細藻類NIES−48株を培養した点以外は、実施例5と同様にして培養工程を行った。
(比較例6)
上記の酵母エキス濃度が2g/Lとなるように酵母エキスを培養液に添加した点以外は、比較例5と同様にして培養工程を行った。
図5から把握されるように、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株は、光従属栄養培養の条件下で培養されても、既知のNIES−48株に比べ高い生産性を有することが分かる。
表2に示す組成物に代えて表3に示す組成物を用いた点、培養液の初期pHをそれぞれpH5.5、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH8.5、又は、pH9.0に変更した点、培養期間を10日間に変更した点以外は、実施例5と同様にして培養工程を行った。
表2に示す組成物に代えて表3に示す組成物を用いた点、光合成光量子束密度(PPFD)を約200μmol/m2・sとした点、培養液の初期pHをそれぞれpH3.5、pH4.0、pH4.5、pH5.0、又は、pH5.5に変更した点、培養期間を10日間に変更した点以外は、実施例5と同様にして培養工程を行った。
表2に示す組成物に代えて表3に示す組成物を用いた点、培養液の初期pHをそれぞれpH3.5、又は、pH5.5にそれぞれ変更した点、培養期間を10日間に変更した点以外は、実施例5と同様にして培養工程を行った。
培養期間を7日間とした点以外は、実施例5と同様にして、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株を培養することにより、培養工程を行った。
なお、培養開始から2日後までは、フラスコを振とうさせることによって好気条件下での培養とし、それ以後は、振とうを停止し、不活性ガス(窒素ガス)を供給することによって嫌気条件下での培養とした。
ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株に代えて、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)NIES−48株を培養した点以外は、実施例20と同様にして培養工程を行った。
なお、培養開始から4日後までは、フラスコを振とうさせることによって好気条件下での培養とし、それ以後は、振とうを停止し、不活性ガス(窒素ガス)を供給することによって嫌気条件下での培養とした。
培養後のパラミロン量の測定は、下記の手順で行った。即ち、培養後の微細藻類と培養液との混合物(40mL)を遠心管に入れて、遠心分離した。遠心分離後の沈殿物に純水を加えて懸濁させ再度遠心分離する操作を2回繰り返した。そして、遠心分離後の沈殿物に少量の純水を加えて懸濁させ、懸濁物を凍結乾燥させた。このようにして、培養液の成分を除去した。
次に、凍結乾燥後の微細藻類の細胞を、秤量した遠心管(ブランク値となる)に400mg程度正確に量り取った。アセトンを加えて懸濁させ、遠心分離後の上澄液を取り除いた。上澄液の色がなくなるまで、アセトンによる洗浄操作を5回程度繰り返した。このようにして、微細藻類が産生した色素成分を除去した。
続いて、ドデシル硫酸ナトリウム溶液を用いて、パラミロン以外の成分を除去する操作を行った。即ち、色素成分を除去した後の残分に、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液を20mL加え、懸濁させた後、100℃で10分間加熱した。そして、遠心分離した後の上澄液を除去した。このような操作を2回繰り返した後、SDS溶液に代えて純水を用いて同様な操作を3回繰り返して、SDSを洗浄除去した。
最後に、105℃の乾燥器内に遠心管ごと入れて水分を除去し、パラミロンが入った遠心管の重さを測定した。そして、上記のブランク値との差から、パラミロン量を求めた。
一方、培養後のワックスエステル量の測定は、BLIGHT−DYER法によって行った。
図8A及び図8Bから把握されるように、従来のユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)NIES−48株と比較して、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株は、パラミロンの産生速度がNIES−48株よりも速い。また、EOD−1株は、細胞あたりのパラミロン含有量が約55%以上であり、NIES−48株よりも多い。
また、図9A及び図9Bから把握されるように、ユーグレナ属微細藻類(Euglena gracilis)EOD−1株は、脂質(ワックスエステル)の産生速度がより速く、細胞あたりのワックスエステル含有量が、より短期間で高くなる。
微細藻類としての上記のEOD−1株を光従属栄養培養によって2日間培養した。
微細藻類としての上記のNIES−48株を光従属栄養培養によって2日間培養した。
培養方法の詳細は、以下の通りである。
「培養液」:塩酸によってpHを4.0に調整
「培養容器」:500mL坂口フラスコ
「培養前の仕込み」:培養液200mLと培養前微細藻類とを坂口フラスコに収容
(初期バイオマス量を合わせるため、EOD−1株では計220mL、
NIES−48株では計236mL)
「培養時の温度」:28℃
「培養時の明暗条件」:遮光した暗条件にて培養
「培養時の好気条件」:振とう機に坂口フラスコをセットし、130rpmの往復振とうで運転することにより培養液中に空気を供給
得られた有機化合物は、微細藻類の細胞内に蓄積されたまま、又は、抽出処理などによって取り出すことにより、健康食品、医薬品、飼料、化成品、又は燃料等の用途で利用することができる。具体的には、培養により微細藻類の細胞内に蓄積された有機化合物としての脂質は、例えば、細胞内から取り出されて燃料の原料として好適に使用される。
Claims (7)
- ユーグレナグラシリス(Euglena gracilis)EOD−1株(受託番号FERM BP−11530)である、少なくとも多糖類の産生能を有するユーグレナ属微細藻類。
- 請求項1記載のユーグレナ属微細藻類を多糖類産生生物として培養することによって多糖類を製造する、多糖類の製造方法。
- 前記培養において用いる培養液が、グルコースを15〜30g/L含む、請求項2に記載の多糖類の製造方法。
- 前記培養において用いる培養液が、酵母分解物を含む、請求項2又は3に記載の多糖類の製造方法。
- 前記培養において用いる培養液が、AF6培地の組成を有する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の多糖類の製造方法。
- 前記多糖類がパラミロンである、請求項2〜5のいずれか1項に記載の多糖類の製造方法。
- 請求項1記載のユーグレナ属微細藻類を培養することにより、多糖類、脂質、ビタミンC、ビタミンE、色素、及び、蛋白質からなる群より選択される少なくとも1種の有機化合物を製造する、有機化合物の製造方法。
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