JP7286183B2 - ユーグレナの培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ユーグレナの培養方法に関する。
微細藻類の一種であるユーグレナ（Euglena gracilis）は長さが約50μm、幅が約10μm、植物にも動物にも属する生き物である。ユーグレナはミドリムシとしても知られており、光合成によって水と二酸化炭素から有機化合物を合成し、酸素を放出する。
ユーグレナは、それ自身の栄養価が高いことから、乾燥粉末が食品添加物や栄養補助食品（サプリメント）として利用されている。また、ユーグレナの産生物質のひとつであるパラミロンは、ナノファイバーの原料物質として利用され、ワックスエステル（炭素数が十数個のアルコールとカルボン酸からなるエステル化合物）は燃料としての活用が期待されている。
Ogbonna, JC., Tomiyama, S., Tanaka, H., Heterotrophic cultivation of Euglena gracilis Z for efficient production of alpha-tocopherol. Journal of Applied Phycology 10, 67.
Doucha, J., Livansky, K.,(2011), Production of high-density Chlorella culture grown in fermenters. J Appl Phycol, 24, 35-43.
Swaaf, ME., Sijtsma, L.,Pronk, JT., (2003), High-cell-density fed-batch cultivation of the docosahexaenoic acid producing marine alga Crypthecodinium cohnii. Biotechnol Bioeng, 81, 666-672.
Schmidt, RA., Wiebe, MG., Eriksen, NT., (2005), Heterotrophic high cell-density fed-batch cultures of the phycocyanin-producing red alga Galdieria sulphuraria. Biotechnol Bioeng, 90, 77-84. 29-36.
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ユーグレナが産生する物質の工業的、商業的利用を実現するためには、目的とする物質を産生する能力に優れたユーグレナを安定的に且つ大量に培養する技術が求められる。
一般的に、微生物を大量に培養する場合、培養槽内に微生物を高密度に充填して培養する高密度培養法が用いられる。高密度培養における培養能力は、例えば、一度に培養可能な単位容量当たりの微生物の量（これを最大バイオマス収量という）で表すことができる。これまでに報告されている高密度培養における微細藻類の最大バイオマス収量は、クロレラ属（chlorella vulgaris）が117.2g/L、クリプテコディヌウム属（Cryptecodiniumu cohnii）が109.0g/L、ガルディエリア属（Galdieria sulphurariaha ）が116.0g/L、スラウストキトリアルス（Thraustochytriales）が221.0g/Lであるのに対して、ユーグレナ（Euglena gracilis）では48.2g/Lであり、他の微細藻類に比べるとユーグレナは最大バイオマス収量が低く（特許文献１、非特許文献１～４）、ユーグレナの最大バイオマス収量を高めることができる培養条件が模索されていた。なお、ここでは、単位容量当たりの微細藻類の乾燥重量でバイオマス収量が表されている。
本発明が解決しようとする課題は、ユーグレナを大量培養する技術の提供である。
上記課題を解決するために成された本発明に係るユーグレナの培養方法は、
グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、
前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程とを有することを特徴とする。
グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、
前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程とを有することを特徴とする。
上記課題を解決するために成された本発明に係るユーグレナの培養方法は、
グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液と、グルコース濃度が前記低濃度培養液よりも高く、前記高濃度培養液よりも低い濃度である中間濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、
前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程と
を有することを特徴とする。
グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液と、グルコース濃度が前記低濃度培養液よりも高く、前記高濃度培養液よりも低い濃度である中間濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、
前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程と
を有することを特徴とする。
上記のユーグレナの培養方法において、前記中間濃度培養液が、濃度が異なる複数種類の培養液から成るものとしても良い。
一般的に培養液に含まれるグルコース等の炭素源の濃度が高いほど微細藻類の高密度培養が可能となり、バイオマスス収量が増加する。ところが、ユーグレナを培養する場合、培養液に含めることができるグルコール濃度はせいぜい２％程度で、それ以上にグルコースの濃度を高めるとかえって増殖率が低下したり、増殖阻害が起きたりすることが知られていた。これに対して、本発明者は、ユーグレナの培養液に含まれるグルコース濃度を徐々に高めていくことにより、グルコース濃度が高い培養液に対して、つまり高濃度グルコースに対して耐性を有するユーグレナが現れることを見いだした。本発明はこのような知見に基づきなされたものである。本発明では、ユーグレナに高濃度グルコースに対する耐性を獲得させることを「馴化」と呼ぶこととする。
つまり、本発明では、馴化用培養液として、グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とを用意する。あるいは、馴化用培養液として、低濃度培養液及び高濃度培養液と、グルコース濃度が前記低濃度培養液よりも高く、前記高濃度培養液よりも低い濃度である１又は複数種類の中間濃度培養液とを用意する。そして、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養することで、従来のユーグレナが耐え得る培養液中のグルコース濃度である２％よりも高濃度のグルコースにユーグレナを馴化させる。馴化工程で得られたユーグレナは、増殖工程において、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養することで増殖する。なお、厳密な意味では「８％以下の所定の濃度」には８％を超える濃度は含まれないが、実質的に同一とみなされる範囲であれば８％を多少上回る濃度も含まれることとする。
例えば、低濃度培養液のグルコース濃度を1.0％、高濃度培養液のグルコース濃度を2.5%とすることで、ユーグレナは少なくとも2.5%のグルコース濃度に対する耐性を獲得する。また例えば、低濃度培養液のグルコース濃度を1.0％、中間濃度培養液のグルコース濃度を2.0%、高濃度培養液のグルコース濃度を3.0%としたとき、ユーグレナは少なくとも3.0%のグルコース濃度に対する耐性を獲得する。また例えば、低濃度培養液のグルコース濃度を2.0％、中間濃度培養液のグルコース濃度を2.2％～4.8％の１又は複数種類の濃度、高濃度培養液のグルコース濃度を5.0%としたとき、ユーグレナは少なくとも5.0%のグルコース濃度に対する耐性を獲得する。馴化工程によりグルコース濃度が高い培養液に対する耐性を獲得したユーグレナ（糖耐性ユーグレナ）を本出願人は「ハイパー株」と呼んでいる。ハイパー株を作出したことで、増殖工程においてグルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の高濃度の培養液を使ってユーグレナを培養しても、増殖率が低下したり増殖が阻害されたりすることがなく、ユーグレナを安定的に且つ効率よく増殖させることができる。
馴化工程で使用される馴化用培養液は、グルコース濃度が２％の低濃度培養液及び５％の高濃度培養液と、グルコース濃度が２％から５％までの間の複数種類の中間濃度培養液から成ると良い。このとき、グルコース濃度が２％～５％までの間の中間濃度培養液の当該グルコース濃度は、２％から５％までの範囲を等分した値に設定すると、馴化工程で用いられる馴化用培養液のグルコース濃度を直線的に高めることができる点で好ましいが、これに限らない。
また、高濃度培養液のグルコース濃度が５％であるとき、前記増殖用培養液のグルコース濃度は５％～８％の間の所定の濃度にすると、ユーグレナを効率よく増殖させることができる。
また、本発明においては、前記馴化工程と前記増殖工程の間に、該馴化工程において得られたユーグレナの中から増殖率の高いユーグレナを選抜する選抜工程を有すると良い。これにより、増殖工程におけるユーグレナの増殖率を高めることができる。
ところで、グルコース濃度が２％よりも高い培養液に対する耐性を既に有しているユーグレナの場合には、馴化工程を経なくても、培養当初からグルコース濃度が２％よりも増殖用培養液を使って培養することができる。そこで、本発明に係るユーグレナの培養方法は、グルコース濃度が２％よりも高く、且つ８％以下である所定の濃度の増殖用培養液を使ってユーグレナを培養するものとすることができる。また、本発明はユーグレナの製造方法にも適用できる。つまり、本発明に係るユーグレナの製造方法は、グルコース濃度が２％よりも高く、且つ８％以下である所定の濃度の増殖用培養液を使ってユーグレナを培養し、増殖させることを特徴とする。
グルコース濃度が２％よりも高い培養液に対する耐性を有しているユーグレナ（糖耐性ユーグレナ）は、本発明の糖耐性ユーグレナの製造方法で製造することができる。本発明の糖耐性ユーグレナの製造方法は、グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する工程を有するもの、あるいは、グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液と、グルコース濃度が前記低濃度培養液よりも高く、前記高濃度培養液よりも低い濃度である中間濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する工程を有するものである。
また、上述した以外に糖耐性ユーグレナは、天然の淡水中又は海水中から採取した、天然のユーグレナの中から所定の条件を満たすものを選抜し分離することで取得しても良く、天然のユーグレナ若しくは微生物保存機関から取得したユーグレナの継代培養を続けるなかで現れた自然変異種であっても良い。また、糖耐性ユーグレナは、公知の方法で突然変異を誘導させたり、遺伝子組み換えやゲノム編集等の技術を利用したりして人為的に作出することもできる。
本発明によれば、ユーグレナを安定的に且つ効率よく大量培養することができる。
本発明は、グルコース濃度が２％よりも高く、且つ８％以下である所定の濃度の増殖用培養液を使ってユーグレナを培養することを特徴とする。具体的には、本発明に係るユーグレナの培養方法は、グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程とを有するものである。
また、本発明に係るユーグレナの培養方法は、グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液と、グルコース濃度が前記低濃度培養液よりも高く、前記高濃度培養液よりも低い濃度である中間濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程とを有するものである。
本発明の培養方法で用いられるユーグレナは、典型的にはユーグレナ属のユーグレナ グラシリス（Euglena gracilis）であるが、ユーグレナ属であればそれ以外の種類（species）であっても良い。また、ユーグレナは、湖沼や池、水田等の天然の淡水中あるいは海水中から採取したもの、微生物保存機関から入手したもののいずれを用いても良い。さらに、天然の淡水中又は海水中から採取したユーグレナ、あるいは微生物保存機関から入手したユーグレナを継代培養したものでも良く、公知の方法で突然変異を誘導させたり、遺伝子組み換えやゲノム編集等の技術を利用したりして人為的に作出した変異種を用いても良い。
馴化用培養液は、ユーグレナ等の微細藻類の培養に一般的に使用される培養液に適宜の量のグルコースを添加してグルコース濃度を調整したものを用いることができる。
以下、本発明の実施例について説明する。
［実施例１］
１．馴化工程
図１は本実施例の馴化工程の手順を示す模式図である。本実施例では以下の表１に示す、ユーグレナ グラシリス（以下、ユーグレナという）の６種類の株を使用した。
［実施例１］
１．馴化工程
図１は本実施例の馴化工程の手順を示す模式図である。本実施例では以下の表１に示す、ユーグレナ グラシリス（以下、ユーグレナという）の６種類の株を使用した。
また、馴化工程では、Ａ培地に２Ｎ（規定度）の水酸化ナトリウム又は２Ｎの塩酸を添加してｐＨ４．５に調整した後、20g/L～50g/Lの範囲の適宜の量のグルコースを添加してグルコース濃度を2.0％～5.0％に調整した培養液を用いた。Ａ培地の組成、及びＡ培地に含まれるＤ溶液及びＥ溶液の組成をそれぞれ表２、表３、表４に示す。Ｄ溶液は、透明になるまで５Ｎの塩酸を添加したものを用いた。なお、本明細書では、グルコース濃度（％）はいずれも溶質重量／容量％（W/V％）を意味する。
馴化工程では、100mL容量のバッフル付きフラスコを６個用意し、それぞれに上述した培養液を20mLずつ入れ、滅菌した後、上述したユーグレナ グラシリスの６種類の株をそれぞれ所定量ずつ植藻（植菌ともいう）した。これを、温度28℃、撹拌速度110rpm、暗黒下の条件で７２時間、回転振とう培養した後、そこから増殖したユーグレナを含む培養液を１mL採取し、別のフラスコに収容された培養液に植え継ぎ、同じ条件、同じ時間で培養を行った。
馴化工程では、初発グルコース濃度を2.0％とし、植え継ぎを行う毎に培養液中のグルコース濃度を0.2％高くした。そして、培養液中のグルコース濃度が5.0％に達した時点で、培養を終了した（つまり、同じフラスコ内での培養を1サイクルとすると、第15サイクルで終了）。以上の馴化工程で得られた株を以下では「耐性株」と呼ぶこととする。
一方、比較工程として、グルコース濃度が2.0％の培養液を用いた以外は上記馴化工程と同じ条件、同じ時間で、ユーグレナの６種類の株の培養を行った。この比較工程で得られた株を以下では「非馴化株」と呼ぶこととする。
２．増殖能力の高い株の選抜
(1) 馴化工程終了後の培養液（つまり耐性株を含む培養液）、及び比較工程収量後の培養液（つまり非馴化株を含む培養液）をそれぞれ１mLずつ、1.5mL容量のチューブ（エッペンドルフ ジャパン製）に移し、生理食塩水で10万倍に希釈した。
(2) 希釈液100μLを、培養皿に入った寒天培地（Ａ培地、グルコース濃度5.0％）に接種し、コンラージ棒で均等に塗り広げた。
(3) １週間後、寒天培地に出現したコロニーを観察し、増殖速度が最も速かったコロニーを採取し、これらをそれぞれ６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株の選抜株とした。
(1) 馴化工程終了後の培養液（つまり耐性株を含む培養液）、及び比較工程収量後の培養液（つまり非馴化株を含む培養液）をそれぞれ１mLずつ、1.5mL容量のチューブ（エッペンドルフ ジャパン製）に移し、生理食塩水で10万倍に希釈した。
(2) 希釈液100μLを、培養皿に入った寒天培地（Ａ培地、グルコース濃度5.0％）に接種し、コンラージ棒で均等に塗り広げた。
(3) １週間後、寒天培地に出現したコロニーを観察し、増殖速度が最も速かったコロニーを採取し、これらをそれぞれ６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株の選抜株とした。
３．増殖工程
６種類のユーグレナの耐性株の選抜株をグルコース濃度を5.0％に調整した培養液で、及び６種類のユーグレナの非馴化株の選抜株をグルコース濃度を2.0％に調整した培養液で、それぞれ、上述した馴化工程と同じ条件で72時間培養を継続し、そこから採取した1.0mLの培養液を、グルコース濃度が同じ新たな培養液に植え継ぐ作業を繰り返した。植え継ぐ際にバッフル付きフラスコから所定量の培養液をサンプルとして採取し、後述するバイオマス収量（１Ｌあたりの乾燥藻体重量）、残糖量、細胞内成分含量の測定に供した。
６種類のユーグレナの耐性株の選抜株をグルコース濃度を5.0％に調整した培養液で、及び６種類のユーグレナの非馴化株の選抜株をグルコース濃度を2.0％に調整した培養液で、それぞれ、上述した馴化工程と同じ条件で72時間培養を継続し、そこから採取した1.0mLの培養液を、グルコース濃度が同じ新たな培養液に植え継ぐ作業を繰り返した。植え継ぐ際にバッフル付きフラスコから所定量の培養液をサンプルとして採取し、後述するバイオマス収量（１Ｌあたりの乾燥藻体重量）、残糖量、細胞内成分含量の測定に供した。
４．バイオマス収量の測定
(1) 恒量になった1.5mL容量のエッペンドルフチューブに、増殖工程で採取した1.0mLの培養液を入れ、遠心分離（5000rpm、5分間）を行った。
(2) 遠心分離の後、上清を除去し、そこに、0.8％生理食塩水を1.0mL加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。
(3) 再び、遠心分離（5000rpm、5分間）を行い、上清を除去した。
(4) (2)及び（3）の工程を再度繰り返した。
(5) エッペンドルフチューブを加熱し、該チューブ内の細胞（ユーグレナの細胞）を乾燥した（105℃、12時間）。
(6) エッペンドルフチューブをデシケーターに入れて放冷した後、エッペンドルフチューブの重量を測定し、そこから該エッペンドルフチューブの初期重量を差し引いて細胞の乾燥細胞重量を算出した。
(1) 恒量になった1.5mL容量のエッペンドルフチューブに、増殖工程で採取した1.0mLの培養液を入れ、遠心分離（5000rpm、5分間）を行った。
(2) 遠心分離の後、上清を除去し、そこに、0.8％生理食塩水を1.0mL加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。
(3) 再び、遠心分離（5000rpm、5分間）を行い、上清を除去した。
(4) (2)及び（3）の工程を再度繰り返した。
(5) エッペンドルフチューブを加熱し、該チューブ内の細胞（ユーグレナの細胞）を乾燥した（105℃、12時間）。
(6) エッペンドルフチューブをデシケーターに入れて放冷した後、エッペンドルフチューブの重量を測定し、そこから該エッペンドルフチューブの初期重量を差し引いて細胞の乾燥細胞重量を算出した。
５．残糖量の測定
植え継ぎ時に採取した1.5mLの培養液に含まれるグルコースの濃度を、グルコースC-IIテストワコーキット（ムタローゼ・GOD法、和光純薬株式会社製）を用いて測定した。測定波長は550nmに設定した。
植え継ぎ時に採取した1.5mLの培養液に含まれるグルコースの濃度を、グルコースC-IIテストワコーキット（ムタローゼ・GOD法、和光純薬株式会社製）を用いて測定した。測定波長は550nmに設定した。
６．バイオマス収量及び残糖量の測定結果
図２は、６種類のユーグレナの耐性株及び６種類のユーグレナの非馴化株のバイオマス収量の時間的変化を示すグラフである。これらのグラフの横軸は培養時間を、縦軸は細胞の乾燥重量を表している。
図２は、６種類のユーグレナの耐性株及び６種類のユーグレナの非馴化株のバイオマス収量の時間的変化を示すグラフである。これらのグラフの横軸は培養時間を、縦軸は細胞の乾燥重量を表している。
図２から分かるように、６種類すべてのユーグレナにおいて非馴化株より耐性株の方が長時間、増殖することが確認できたが、株の種類により増殖速度が大きく異なっていた。具体的には、耐性株のうち、NIES48、PO、SM-ZK、IGの４株は培養96時間で定常期に達し、それ以降はバイオマス収量はほとんど変化しなかったのに対し、NIES47は培養120時間、NIES49は培養144時間でそれぞれ定常期に達した。また、耐性株のうち、NIES48、PO、SM-ZKの３株の耐性株は、培養48時間の時点で未馴化株と同様の増殖速度を示したが、NIES47、NIES49、IGの３株の耐性株は、培養48時間の時点では未馴化株に比べて増殖速度が低下していた。
表５は、６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株のバイオマス収量の対糖収率を示している。バイオマス収量の対糖収率は、培養開始時の培養液中のグルコース量に対する培養後のバイオマス収量の割合を意味する。培養開始時の培養液１Ｌ中のグルコース量が1gであり培養後のバイオマス収量が1gであるとき、対糖収率は100％となる。
表５から分かるように、耐性株及び非馴化株のいずれにおいても、株間で顕著な差は確認できなかったが、耐性株と非馴化株の間で大きな差が見られた。すなわち、未馴化株では、すべての株においても対糖収率が50％以上の値を示したのに対し、耐性株では、いずれの株も対糖収率は32％～42％の範囲内にあり、未馴化株よりも対糖収率が低下していた。
表５から分かるように、耐性株及び非馴化株のいずれにおいても、株間で顕著な差は確認できなかったが、耐性株と非馴化株の間で大きな差が見られた。すなわち、未馴化株では、すべての株においても対糖収率が50％以上の値を示したのに対し、耐性株では、いずれの株も対糖収率は32％～42％の範囲内にあり、未馴化株よりも対糖収率が低下していた。
７．細胞内成分の測定
増殖が定常期初期もしくは対数増殖期後期に達した時点で、50mL容量の遠沈管に培養液を回収した。回収した培養液を遠心分離し(3000rpm,5min)、上清を除去して細胞を得、これを凍結乾燥して以下の細胞内成分の分析に供した。未馴化株については、培養72時間の培養液を回収し、耐性株については、株により増殖速度が異なるため培養液の回収時間を次のように設定した。すなわち、NIES49の耐性株は培養144時間、NIES47、NIES48、NIES49、PO、SM-ZK及びIGの耐性株は培養96時間で、それぞれ培養液を回収した。
増殖が定常期初期もしくは対数増殖期後期に達した時点で、50mL容量の遠沈管に培養液を回収した。回収した培養液を遠心分離し(3000rpm,5min)、上清を除去して細胞を得、これを凍結乾燥して以下の細胞内成分の分析に供した。未馴化株については、培養72時間の培養液を回収し、耐性株については、株により増殖速度が異なるため培養液の回収時間を次のように設定した。すなわち、NIES49の耐性株は培養144時間、NIES47、NIES48、NIES49、PO、SM-ZK及びIGの耐性株は培養96時間で、それぞれ培養液を回収した。
７－１．パラミロンの測定
植え継ぎ時に採取した2.0mLの培養液に含まれるパラミロンの含量を以下の手順で測定した。
Ａ．パラミロンの精製
(1) 2mL容量のエッペンチューブに培養液2mLを入れ、遠心分離（5000rpm, 5min）を行い、上清を除去した。
(2) イオン交換水300μLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌して細胞を完全に分散させて、軽くスピンダウンした。
(3) エッペンチューブにフロートを取り付け、超音波洗浄機に浮かべて細胞を破砕した（5min）。
(4) アセトン1200μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌し、遠心分離（5000rpm, 5min）した。
(5) ピペットマン（登録商標）で上清を丁寧に除去し、アセトン1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌し、遠心分離（5000rpm, 5min）した。
(6) アセトン処理及び遠心分離を再度繰り返した。
(7) ピペットマンで上清を除去し、10％ SDS水溶液1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌して細胞を十分分散させ、軽くスピンダウンさせた。
(8) エッペンチューブのキャップを開けた状態で、100℃のアルミブロックヒーター上で30分間加熱した。
(9) 放冷後、遠心分離（5000rpm, 5min）して、ピペットマンで上清を除去し、0.1％SDS水溶液1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌して細胞を十分分散させた。
(10) 遠心分離（5000rpm, 5min）して、ピペットマンで上清を丁寧に除去し、イオン交換水1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌して細胞を十分分散させた。以上により、パラミロンを精製した。
(11) 精製したパラミロンに１Ｎの水酸化ナトリウム溶液1mLを加えて完全に溶解させたものを、次のパラミロンの定量用サンプルとした。
植え継ぎ時に採取した2.0mLの培養液に含まれるパラミロンの含量を以下の手順で測定した。
Ａ．パラミロンの精製
(1) 2mL容量のエッペンチューブに培養液2mLを入れ、遠心分離（5000rpm, 5min）を行い、上清を除去した。
(2) イオン交換水300μLを加え、ボルテックスミキサーで撹拌して細胞を完全に分散させて、軽くスピンダウンした。
(3) エッペンチューブにフロートを取り付け、超音波洗浄機に浮かべて細胞を破砕した（5min）。
(4) アセトン1200μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌し、遠心分離（5000rpm, 5min）した。
(5) ピペットマン（登録商標）で上清を丁寧に除去し、アセトン1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌し、遠心分離（5000rpm, 5min）した。
(6) アセトン処理及び遠心分離を再度繰り返した。
(7) ピペットマンで上清を除去し、10％ SDS水溶液1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌して細胞を十分分散させ、軽くスピンダウンさせた。
(8) エッペンチューブのキャップを開けた状態で、100℃のアルミブロックヒーター上で30分間加熱した。
(9) 放冷後、遠心分離（5000rpm, 5min）して、ピペットマンで上清を除去し、0.1％SDS水溶液1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分攪拌して細胞を十分分散させた。
(10) 遠心分離（5000rpm, 5min）して、ピペットマンで上清を丁寧に除去し、イオン交換水1500μLを加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌して細胞を十分分散させた。以上により、パラミロンを精製した。
(11) 精製したパラミロンに１Ｎの水酸化ナトリウム溶液1mLを加えて完全に溶解させたものを、次のパラミロンの定量用サンプルとした。
Ｂ．パラミロンの定量（フェノール硫酸法）
(1) 上述した定量用サンプルに100μLに、イオン交換水900μLを加えて希釈した。
(2) 200μg/mLのグルコース溶液 250μLにイオン交換水750μLを加え、グルコース濃度が50μg/mLの標準試料を調製した。
(3) 希釈した定量用サンプル、標準試料に80％フェノール溶液を25μL加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌した。
(4) ドラフト内で濃硫酸2.5mLを加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌した。
(5) 放冷後、吸光波長490nmで吸光度を測定した。
(1) 上述した定量用サンプルに100μLに、イオン交換水900μLを加えて希釈した。
(2) 200μg/mLのグルコース溶液 250μLにイオン交換水750μLを加え、グルコース濃度が50μg/mLの標準試料を調製した。
(3) 希釈した定量用サンプル、標準試料に80％フェノール溶液を25μL加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌した。
(4) ドラフト内で濃硫酸2.5mLを加え、ボルテックスミキサーで十分撹拌した。
(5) 放冷後、吸光波長490nmで吸光度を測定した。
Ｃ．パラミロン含量の算出方法
以下の式(1)から、パラミロン含量（μg）を算出した。式(1)中、Eは試料の吸光度を、E0は標準試料の吸光度をそれぞれ表している。なお、式(1)中、「180.16」は標準試料に含まれるグルコースの分子量であり、「162.14」はグルコースが脱水縮合しβ-1,3結合した多糖類であるパラミロンの分子量である。
パラミロン含量(μg)＝E/E0×50（μg/mL）×1(mL)/（180.16/162.14）×希釈倍率
…(1)
以下の式(1)から、パラミロン含量（μg）を算出した。式(1)中、Eは試料の吸光度を、E0は標準試料の吸光度をそれぞれ表している。なお、式(1)中、「180.16」は標準試料に含まれるグルコースの分子量であり、「162.14」はグルコースが脱水縮合しβ-1,3結合した多糖類であるパラミロンの分子量である。
パラミロン含量(μg)＝E/E0×50（μg/mL）×1(mL)/（180.16/162.14）×希釈倍率
…(1)
７－２．その他の成分の定量
タンパク質の定量は、Kjeldahl法を用いた（特許文献２）。また、脂質は、改訂されたFolch法（非特許文献５）を用いた。
タンパク質の定量は、Kjeldahl法を用いた（特許文献２）。また、脂質は、改訂されたFolch法（非特許文献５）を用いた。
８．細胞内成分の測定結果
８－１．パラミロン含量の対糖収率
表６は、６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株のパラミロン含量の対糖収率を示している。パラミロン含量の対糖収率は、培養開始時の培養液中のグルコース量に対する培養後のパラミロン含量の割合を意味する。培養開始時の培養液中のグルコース量が1gであり培養後のパラミロン含量が1gであるとき、対糖収率は100％となる。
表６から分かるように、パラミロン含量における対糖収率は、PO及びSM-ZKの２株は未馴化株よりも耐性株の方が高い値を示したが、NIES47、NIES48、NIES49の３株は耐性株と未馴化株とで同等の値を示した。また、耐性株においてバイオマス収量の対糖収率が最も低かったIGのパラミロン含量の対糖収率については、耐性株の方が未馴化株よりも低い値を示した。
８－１．パラミロン含量の対糖収率
表６は、６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株のパラミロン含量の対糖収率を示している。パラミロン含量の対糖収率は、培養開始時の培養液中のグルコース量に対する培養後のパラミロン含量の割合を意味する。培養開始時の培養液中のグルコース量が1gであり培養後のパラミロン含量が1gであるとき、対糖収率は100％となる。
表６から分かるように、パラミロン含量における対糖収率は、PO及びSM-ZKの２株は未馴化株よりも耐性株の方が高い値を示したが、NIES47、NIES48、NIES49の３株は耐性株と未馴化株とで同等の値を示した。また、耐性株においてバイオマス収量の対糖収率が最も低かったIGのパラミロン含量の対糖収率については、耐性株の方が未馴化株よりも低い値を示した。
８－２．バイオマス収量に占める各成分の割合
図３及び図４は、６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株の最大バイオマス収量と細胞内組成を示している。図３及び図４の横軸はユーグレナの種類の名称を、縦軸は細胞内組成物及び最大バイオマス収量の値（g/L）を示している。つまり、各棒グラフの高さが各種類の最大バイオマス収量を表している。
図３及び図４は、６種類のユーグレナの耐性株及び非馴化株の最大バイオマス収量と細胞内組成を示している。図３及び図４の横軸はユーグレナの種類の名称を、縦軸は細胞内組成物及び最大バイオマス収量の値（g/L）を示している。つまり、各棒グラフの高さが各種類の最大バイオマス収量を表している。
図３と図４の比較から分かるように、６種類のユーグレナの全てにおいて、耐性株の最大バイオマス収量は、未馴化株の最大バイオマス収量の約１．５倍から２．０倍であった。また、NIES48の耐性株においては20g/L以上の最大バイオマス収量を示し、Tukeyの多重比較検定の結果、IGに比べ有意に高い値を示した（p<0.05）が、その他の株との間では有意な差は認められなかった。
また、パラミロン含量及びパラミロン含有率については、６種類のユーグレナの全てにおいて、未馴化株よりも耐性株の方が高い値を示した。特に、６種類のユーグレナのうちPO及びSM-ZKの耐性株は、パラミロン含有率が50％以上であり、他の４種類の耐性株に比べて有意に高い値を示した（p<0.05）。
以上の結果から、本実施例の培養方法は、パラミロンを得る目的でユーグレナを培養する方法として有用であるといえる。
以上の結果から、本実施例の培養方法は、パラミロンを得る目的でユーグレナを培養する方法として有用であるといえる。
６種類のユーグレナの全てにおいてタンパク質含量は耐性株の方が未馴化株よりも多かったが、タンパク質含有率については耐性株の方が未馴化株よりも低かった。一方、脂質含量については、耐性株の方が未馴化株よりも多かったが、脂質含有率については、耐性株と未馴化株との間に顕著な差は確認できなかった。
なお、本実施例では、馴化工程で用いられた、グルコース濃度が2.0％の培養液が本発明の低濃度培養液に、グルコース濃度が2.2％～4.8％の培養液が中間濃度培養液に、グルコース濃度が5.0％の培養液が高濃度培養液に相当するが、視点を変えると、グルコース濃度が2.0％の培養液を低濃度培養液、2.2％の培養液を高濃度培養液とみなすことができる。この場合は、グルコース濃度が2.2％又は2.4％の培養液が増殖用培養液に相当する。また、グルコース濃度が2.0％の培養液を低濃度培養液、4.0％の培養液を高濃度培養液、2.2％～3.8％の培養液を中間濃度培養液とすると、グルコース濃度が3.8％又は4.0％の培養液は増殖用培養液に相当する。つまり、本実施例の結果から、グルコース濃度が２％よりも高く、且つ５％以下の培養液に対する耐性を有するユーグレナを作出できることが分かる。
［実施例２］
本発明の増殖工程における培養条件を検討するため、培養液の液量、培地のｐＨ、培地に含まれる炭素源（Ｃ）と窒素源（Ｎ）との比率（Ｃ／Ｎ）を異ならせた複数種類の培養液を用いて、耐性株の培養を行った。耐性株としては、実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を用いた。
１．液量の影響
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液を、それぞれ5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mLずつ、それぞれ別のバッフル付きフラスコに入れ、実施例１の増殖工程と同じ条件でNIES48の耐性株を培養した。24時間培養を継続した後、そこから採取した1.0mLの培養液を、同じ液量の新たな培養液に植え継ぐ（継代）という作業を繰り返した。植え継ぐ際に各培養液をサンプルとして採取し、バイオマス収量（１Ｌあたりの乾燥藻体重量）、濁度（ＯＤ６６０）の測定に供した。濁度は、増殖率を表す指標であり、濁度が大きいほど耐性株が増殖したこと（増殖率が大きいこと）を示す。
本発明の増殖工程における培養条件を検討するため、培養液の液量、培地のｐＨ、培地に含まれる炭素源（Ｃ）と窒素源（Ｎ）との比率（Ｃ／Ｎ）を異ならせた複数種類の培養液を用いて、耐性株の培養を行った。耐性株としては、実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を用いた。
１．液量の影響
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液を、それぞれ5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mLずつ、それぞれ別のバッフル付きフラスコに入れ、実施例１の増殖工程と同じ条件でNIES48の耐性株を培養した。24時間培養を継続した後、そこから採取した1.0mLの培養液を、同じ液量の新たな培養液に植え継ぐ（継代）という作業を繰り返した。植え継ぐ際に各培養液をサンプルとして採取し、バイオマス収量（１Ｌあたりの乾燥藻体重量）、濁度（ＯＤ６６０）の測定に供した。濁度は、増殖率を表す指標であり、濁度が大きいほど耐性株が増殖したこと（増殖率が大きいこと）を示す。
図５は培養液量とバイオマス収量との関係を示している。同図から分かるように、バイオマス収量が最も高い値を示したのは培養液量が5mLの試験区であり、Tukeyの多重比較法の結果、その他の試験区に比べて有意に高かった（p<0.05）。一方、バイオマス収量が最も低い値を示したのは培養液量が30mLの試験区であり、培養液量が25mLの試験区との間には有意差が認められなかったが、その他の試験区と比べると有意に低い値を示した（p<0.05）。つまり、培養液量が少ないほどバイオマス収量が高くなる傾向を示した。培養液量が少ないほど培養液中への空気供給量が多くなり、その結果、バイオマス収量が増加したものと思われる。
また、図６は24時間毎に測定したＯＤ６６０の結果を示している。同図から分かるように、培養48時間までは、全ての試験区でＯＤ６６０がほぼ同様に増加し、同様に増殖していることが確認された。培養72時間以降では、培養液量が25mL及び30mLの試験区で、ＯＤ６６０の数値が横ばいになり増殖が停滞する傾向を示したが、その他の試験区では、培養72時間以降もＯＤ６６０が増加する傾向を示した。以上より、培養液量が少ないほど培養後期において良好な増殖を示すことが示唆された。
２．ｐＨの影響
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液のｐＨを、それぞれ2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5に調整し、各培養液をバッフル付きフラスコに入れ、実施例１の増殖工程と同じ条件でNIES48の耐性株を培養した。２４時間培養を継続した後、そこから採取した1.0mLの培養液を、同じ液量の新たな培養液に植え継ぐ作業を繰り返し、植え継ぐ際に5mLの培養液をサンプルとして採取し、バイオマス収量、濁度（ＯＤ６６０）の測定に供した。また、72時間、96時間、120時間培養した後の培養液5mLを回収し、それぞれ遠心分離（6000rpm、5min）した後、上清を回収し、ｐＨを測定した。
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液のｐＨを、それぞれ2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5に調整し、各培養液をバッフル付きフラスコに入れ、実施例１の増殖工程と同じ条件でNIES48の耐性株を培養した。２４時間培養を継続した後、そこから採取した1.0mLの培養液を、同じ液量の新たな培養液に植え継ぐ作業を繰り返し、植え継ぐ際に5mLの培養液をサンプルとして採取し、バイオマス収量、濁度（ＯＤ６６０）の測定に供した。また、72時間、96時間、120時間培養した後の培養液5mLを回収し、それぞれ遠心分離（6000rpm、5min）した後、上清を回収し、ｐＨを測定した。
図７は培養液のｐＨとバイオマス収量との関係を示している。同図から分かるように、バイオマス収量が最も高い値を示したのはｐＨが7.5の試験区であった。Tukeyの多重比較法の結果、ｐＨが7.5の試験区とｐＨが6.5の試験区との間には有意差がみられなかったが、その他の試験区との間には有意差がみられた（p<0.05）。また、ｐＨが3.5及び4.5の試験区の間では有意差は認められず、ｐＨが2.5の試験区はその他の試験区に比べ有意に低い値を示した。以上より、ｐＨが高い試験区ほどバイオマス収量が高くなる傾向を示すことが示唆された。
また、図８は24時間毎に測定したＯＤ６６０の結果を示している。同図から分かるように、ｐＨが3.5、4.5、5.5、6.5、7.5の試験区では、培養96時間で定常期に達し増殖が停滞した。ｐＨが2.5の試験区は、その他の試験区に比べて増殖速度が遅く、培養120時間に達しても増殖する傾向が見られた。
また、初発培養液のｐＨと培養後の培養液のｐＨを表７に示す。この表から分かるように、初発培養液のｐＨが2.5～6.5の試験区ではいずれも培養後のｐＨが3.0以下に低下していた。また、初発培養液のｐＨが7.5の試験区では培養後のｐＨが3.59に低下し、ｐＨが2.5の試験区では培養後のｐＨが1.77に低下していた。以上より、全ての試験区において培養後のｐＨは酸性に偏る傾向が示された。
また、初発培養液のｐＨと培養後の培養液のｐＨを表７に示す。この表から分かるように、初発培養液のｐＨが2.5～6.5の試験区ではいずれも培養後のｐＨが3.0以下に低下していた。また、初発培養液のｐＨが7.5の試験区では培養後のｐＨが3.59に低下し、ｐＨが2.5の試験区では培養後のｐＨが1.77に低下していた。以上より、全ての試験区において培養後のｐＨは酸性に偏る傾向が示された。
３．Ｃ／Ｎの影響
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液に、グルコース量は変えずに窒素源としてポリペプトンを添加し、Ｃ／Ｎをそれぞれ１０、２０、３０、４０、５０に調整して培養試験を行った。なお、実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液のＣ／Ｎは22.9である。
実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液と同じ組成の培養液に、グルコース量は変えずに窒素源としてポリペプトンを添加し、Ｃ／Ｎをそれぞれ１０、２０、３０、４０、５０に調整して培養試験を行った。なお、実施例１の増殖工程において、耐性株に用いた培養液のＣ／Ｎは22.9である。
図９は培養液のＣ／Ｎとバイオマス収量との関係を示している。Tukeyの多重比較の結果、バイオマス収量が最も高い値を示したＣ／Ｎ４０の試験区は、Ｃ／Ｎ５０の試験区との間では有意差は見られなかったが、それ以外の試験区（Ｃ／Ｎ１０、２０、３０）に比べ有意差が認められた。また、Ｃ／Ｎが高い試験区ほどバイオマス収量が高くなる傾向を示した（p<0.05）。
また、各試験区のパラミロン含量及び含有率に関しては、Tukeyの多重比較の結果、全ての試験区の間で有意差が認められ、Ｃ／Ｎが高い試験区ほどパラミロン含量が高くなる傾向を示した（p<0.05）。
また、図１０に24時間毎に測定したＯＤ６６０の結果を示している。同図から分かるように、培養48時間の時点では、Ｃ／Ｎ１０の試験区では、その他の試験区に比べてＯＤ６６０の値が低かったが、培養96時間の時点では、Ｃ／Ｎ１０の試験区でＯＤ６６０の値が最も高くなり、Ｃ／Ｎ５０の試験区でＯＤ６６０の値が最も低い値を示した。よって、培養後半ではＣ／Ｎが低いほどＯＤ６６０の値が高くなる傾向が示された。
表８は、培養後の上清に含まれる残糖量とＣ／Ｎとの関係を示している。この表から分かるように、培養106時間の時点では全ての試験区で培養液中にグルコースが残っていた。また、培養120時間の時点では、Ｃ／Ｎが１０、２０、３０の試験区ではグルコース濃度は１％ほどしか確認できなかったが、Ｃ／Ｎ４０の試験区ではグルコース濃度が３％、Ｃ／Ｎが５０の試験区ではグルコース濃度が７％残っていることが確認された。さらに、培養144時間の時点では、Ｃ／Ｎ５０以外の試験区では培養液中のグルコースは枯渇していた。以上より、Ｃ／Ｎが低い試験区ほど糖の消費が速く、Ｃ／Ｎが高いほど糖の消費が遅くなる傾向が示された。
表９は、バイオマス収量が最も高い値を示したＣ／Ｎ４０の試験区の上清に含まれる窒素及びリンの定量結果を示している。この表から、培養106時間の時点で上清には窒素が0.13mg/ml、リンが0.15mg/ml含まれていたことが分かった。これは、初発培養液に含まれる窒素及びリンの含量の26.0％、55.6％に相当する。
［実施例３］
培養液に含まれるグルコース濃度を６％、７％、８％、９％、10％に調整した以外は、実施例１と同じ条件で増殖工程における耐性株の培養を行った。耐性株としては、実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を用いた。
培養液に含まれるグルコース濃度を６％、７％、８％、９％、10％に調整した以外は、実施例１と同じ条件で増殖工程における耐性株の培養を行った。耐性株としては、実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を用いた。
実施例１、２と同様、24時間培養を継続した後、そこから採取した1.0mLの培養液を、同じ液量の新たな培養液に植え継ぐ作業を繰り返し、植え継ぐ際に培養液を採取して、乾燥藻体重量を測定した。培養液中のグルコースが枯渇した時点で培養を終了した。
図１１はグルコース濃度と１Ｌあたりの乾燥藻体重量（バイオマス収量（g/L））との関係を示すグラフを、図１２はＯＤ６６０の時間的変化をそれぞれ示している。図１１から分かるように、乾燥藻体重量が最も高い値を示したのはグルコース濃度が７％の試験区で、その他の試験区との間に有意差がみられた。乾燥藻体重量が最も低い値を示したのはグルコース濃度が９％の試験区で、グルコース濃度が８％、10％の試験区との間には有意差が認められなかったが、他の試験区との間で有意差がみられた。
図１２は、ＯＤ６６０の値で表した増殖曲線である。図１２には、増殖速度の比較のため、グルコース濃度が２％での増殖曲線も示した。図１２より、グルコース濃度が６％では、グルコース濃度が２％の培養液とほぼ同じ増殖速度を示し、グルコース濃度が７％ではグルコース濃度が２％の培養液よりも若干遅い増殖速度を示した。また、グルコース濃度が８～10％の試験区ではほとんど増殖しなかった。
［実施例４］
実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を、グルコース濃度を８％に調整した培養液を使って培養する増殖工程を行った。グルコース濃度を８％に調整した培養液の組成を以下の表１０に示す。
実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株（選抜株）を、グルコース濃度を８％に調整した培養液を使って培養する増殖工程を行った。グルコース濃度を８％に調整した培養液の組成を以下の表１０に示す。
本実施例では、上記の培養液50mLを100mL容量のバッフル付きフラスコに入れ、そこに実施例１の馴化工程で得られたNIES48の耐性株を含む培養液を約１mL（前記グルコース濃度8％の培養液の２％相当量L）加え、温度28℃、撹拌速度100rpm、暗黒下の条件で458時間、回転振とう培養を行った。培養を開始してから適宜のタイミングで培養液を採取して、その濁度（ＯＤ６６０）、残糖量（糖濃度）、バイオマス収量（g/L）（１Ｌあたりの乾燥藻体重量）を測定した。残糖量、バイオマス収量の測定方法は、実施例１で説明した通りである。
表１１に、培養液の濁度（ＯＤ６６０）、糖濃度、バイオマス収量（g/L）、対糖収率（％）を培養時間とともに示す。また、図１３は、培養液の濁度（ＯＤ６６０）および糖濃度の時間的変化を示すグラフである。
表１１および図１３から分かるように、培養95時間まではほとんど濁度の変化が見られなかったが、培養95時間を超えたあたりから濁度が徐々に上昇し始め、培養212時間以降、濁度が大きく上昇し、耐性株の増殖が観察された。つまり、実施例３では、培養216時間までの間、グルコース濃度が8％の培養液の試験区での耐性株の増殖は観察されなかったが、本実施例では、培養95時間を超えたあたりから耐性株の増殖が観察され、特に培養216時間以降では増殖速度が上昇した。また、培養361時間、406時間、458時間における糖濃度は、それぞれ7.32％、6.37％、6.07％であり、培養液中のグルコースが消費されていたことからも耐性株の増殖が裏付けられた。以上の結果から、グルコース濃度が8％以上の培養液を用いた場合でも耐性株が増殖することが確認された。また、グルコース濃度が8％以上の培養液を用いる場合は、グルコース濃度が8％未満の培養液を用いる場合よりも増殖工程を長くすることが耐性株を増殖させるうえで有効であることが推測された。
一方、培養406時間と培養458時間のバイオマス収量は、いずれも10.0g/Lであり、対糖収率は59.6％、50.6％であった。この結果から、培養406時間程度で耐性株の増殖はほぼ定常期に達したものと思われた。
また、上述した回転振とう培養に用いたものと同じNIES48の耐性株を、グルコース濃度を8％に調整した寒天培地に植藻し、暗黒条件、明条件下で培養したところ、いずれも生育が観察された。さらに、暗黒条件下、明条件下のいずれの培養においても、耐性株の緑化機能（光合成機能）は喪失しなかった。図１４に、暗黒条件、及び明条件で培養した後の耐性株を示す。
以上の結果より、耐性株の培養液のグルコース濃度は５～８％が好ましいことが分かった。また、馴化工程で用いられた高濃度培養液のグルコース濃度（５％）と同じか若しくはそれよりも高いグルコース濃度である５％以上且つ８％以下の培養液に対する耐性を有するユーグレナを作出できることが分かる。さらに、詳しい理由は不明であるが、実施例３、４の結果から分かるように、同じグルコース濃度の培養液であっても、増殖工程の条件によって、耐性株の増殖開始時期や、増殖率に違いが出る。このことから、実際にユーグレナを大量培養するときは、温度、培地組成等の培養条件に応じた適切なグルコース濃度の内容液を使用することが望ましい。
以上、本発明の実施形態について具体的な実施例を挙げて詳細に説明したが、本発明は上述した実施例に限定されず、種々の変形が可能である。例えば、実施例１では、馴化工程によりユーグレナをグルコース濃度が２％から５％までの複数種類の馴化用培養液で培養することにより該ユーグレナをグルコース濃度が５％以上の培養液に馴化させてから増殖工程に移行したが、グルコース濃度が５％以上の培養液に対する耐性を有しているユーグレナ（糖耐性ユーグレナ）であれば、馴化工程は省略することができる。糖耐性ユーグレナは、グルコース濃度が２％の培養液及び５％の培養液を含む、２％から５％までの間の複数種類の馴化用培養液でユーグレナを順に培養する工程を有する製造方法によって製造することができる。また、糖耐性ユーグレナは、天然の淡水中又は海水中から採取した、天然のユーグレナの中から所定の条件を満たすものを選抜し分離することで取得しても良く、天然のユーグレナ若しくは微生物保存機関から取得したユーグレナの継代培養を続けるなかで現れた自然変異種であっても良い。また、糖耐性ユーグレナは、公知の方法で突然変異を誘導させたり、遺伝子組み換えやゲノム編集等の技術を利用したりして人為的に作出することもできる。
Claims (2)
- グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する馴化工程と、
前記馴化工程で得られたユーグレナを、グルコース濃度が前記高濃度培養液と同じか、前記高濃度培養液よりも高く且つ８％以下である増殖用培養液を使って培養する増殖工程と
を有し、
前記ユーグレナが、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Z株 NIES47、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Z株 NIES48、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス（Euglena gracilis bacillaris）株 NIES49から選ばれる１種又は複数種であり、
前記馴化工程では、最初はグルコース濃度が２％の馴化用培養液を用いてユーグレナを培養し、その後、植え継ぎを行う毎に馴化用培養液のグルコース濃度を０．２％ずつ高くし、馴化用培養液のグルコース濃度が５％に達した時点で培養を終了する、ユーグレナの培養方法。 - グルコース濃度が０％から２％までの間の所定の濃度である低濃度培養液と、グルコース濃度が２％よりも高く且つ８％以下の所定の濃度である高濃度培養液とから成る、グルコース濃度が異なる複数種類の馴化用培養液を用意し、グルコース濃度が低い馴化用培養液から順に該馴化用培養液を使ってユーグレナを培養する工程を有し、
前記ユーグレナが、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Z株 NIES47、ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）Z株 NIES48、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス（Euglena gracilis bacillaris）株 NIES49から選ばれる１種又は複数種であり、
前記ユーグレナを培養する工程では、最初はグルコース濃度が２％の馴化用培養液を用いてユーグレナを培養し、その後、植え継ぎを行う毎に馴化用培養液のグルコース濃度を０．２％ずつ高くし、馴化用培養液のグルコース濃度が５％に達した時点で培養を終了する、糖耐性ユーグレナの製造方法。
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