KR101839411B1 - 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101839411B1
KR101839411B1 KR1020170025541A KR20170025541A KR101839411B1 KR 101839411 B1 KR101839411 B1 KR 101839411B1 KR 1020170025541 A KR1020170025541 A KR 1020170025541A KR 20170025541 A KR20170025541 A KR 20170025541A KR 101839411 B1 KR101839411 B1 KR 101839411B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ksn1
strain
parachlorella
microalgae
linoleate
Prior art date
Application number
KR1020170025541A
Other languages
English (en)
Inventor
이창수
김지환
남승원
임경준
권현진
Original Assignee
국립낙동강생물자원관
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 국립낙동강생물자원관 filed Critical 국립낙동강생물자원관
Priority to KR1020170025541A priority Critical patent/KR101839411B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101839411B1 publication Critical patent/KR101839411B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/186—Fatty acids
    • A23V2250/1872—Linoleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/18—Lipids
    • A23V2250/186—Fatty acids
    • A23V2250/1874—Linolenic acid
    • C12R1/89—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 KSN1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 파라클로렐라 속 KSN1 균주는 생산된 지질의 약 70%가 불포화 지방산인 리놀레산과 리놀렌산으로 구성되어 있어, 리놀레산과 리놀렌산을 이용한 고부가가치 산업과 바이오오일 산업에 활용될 수 있으며, 배양 시 세포들이 군체를 형성하고 빠르게 침전되는 특성이 있어 미세조류 배양공정 상에 생산 비용 절감 효과도 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 KSN1 균주 및 이의 용도{Microalgae Parachlorella sp. KSN1 strain producing bio-oil containing high concentration of linoleate and linolenate and uses thereof}
본 발명은 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 KSN1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 지방산 총 중량 기준 60~70% 함유하는, 기탁번호가 KCTC18553P로 기탁된 미세조류인 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주에 관한 것이다.
미세조류는 뿌리, 줄기, 잎이 분화하지 않은 하등식물 중, 미역이나 다시마와 같은 대형조류에 비해 크기가 작아 현미경으로 볼 수 있는 단세포 조류를 미세조류라고 한다. 미세조류는 강, 호수, 바다와 같은 환경에서 흔히 발견되며 광합성 색소를 이용하여 광합성을 하는 일차생산자로서 생태계의 구성원이다. 미세조류는 비타민, 미네랄, 아미노산은 물론 DHA(docosahexaenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid) 등 필수지방산에 이르기까지 많은 필수영양소를 함유하고 있기 때문에 건강기능식품의 원료로 주목을 받고 있다. 미세조류를 이용한 건강보조식품의 원료로 대표적인 예는 클로렐라인데, 클로렐라는 단백질 함량이 높고 감마리놀렌산(γ-linolenic acid)과 같은 유용한 물질이 다량 함유되어 있어 건강보조식품의 원천소재로 활용되고 있다. 클로렐라는 1990년도부터 수요가 확대되어 국내에서 연간 500억원 이상의 건강보조식품 시장이 형성되어 있다.
미세조류가 생산하는 지방성분 중 리놀레산(linoleate)은 탄소사슬의 끝에서 6번째 탄소에 이중결합이 시작되는 오메가-6지방산으로 체내에서 지방산 연장효소의 도움을 받아 아라키돈산(arachidonic acid)으로 변환되는데 이 성분이 부족하면 습진과 여드름 등 피부장애가 나타날 수 있다. 리놀렌산(linolenate)은 탄소사슬의 끝에서 3번째 탄소에 이중결합이 시작되는 지방산으로 뇌, 눈, 신경의 정상적인 발달을 돕는 DHA의 합성 원료로 사용이 되는 성분이다. 따라서 리놀렌산이 부족한 경우에는 학습능력과 시각 기능이 떨어질 수 있어 외부 식품 섭취를 통한 지속적인 공급이 필수적인 지방성분이다.
미세조류는 크기가 작고 물과 유사한 밀도를 보유하고 있어서 물에서 쉽게 침전이 되지 않아 수거에 어려움이 있다. 일반적으로 액체배지를 이용하여 키운 생물 배양체를 수거하기 위해 관형원심분리, 응집제 첨가 후 침전 등과 같은 물리화학적인 방법이 동원된다. 그러나 이러한 부가적인 회수과정으로 인한 비용이 전체 미세조류 배양공정의 약 20~30%로 많은 부분을 차지하고 있어 생산된 미세조류 배양체의 경제적인 회수방안이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 국내 담수로부터 지질 함량이 높으면서 유용한 지방성분을 다량 함유한 신규 미세조류를 발굴하였으며, 유용 지방의 생산성을 높이기 위한 최적 배양조건을 탐색하였다. 또한 미세조류가 배양과정에서 자발적으로 군체를 형성하여 침전물로 빠르게 수거되는 조건을 탐색하였다.
한편, 한국등록특허 제1496783호에는 '신규한 미세조류 클라미도모나스 레인하르티 KNUA021 균주 및 이로부터의 지방 알코올 및 지방산 생산 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1406039호에는 '신규한 미세조류 노스톡 KNUA003 균주 및 이로부터 알칸, 지방 알코올 및 지방산 생산 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 KSN1 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 담수로부터 지질 함량이 높으면서 유용한 지방성분을 다량 함유한 신규 미세조류인 파라클로렐라 속 균주를 분리동정하였다. 분리된 파라클로렐라 속 균주는 생체량(biomass) 생산성 대비 지질 생산성이 38% 수준으로 확인되었으며, 전체 지방산의 70% 수준이 유용한 지방성분인 리놀레산과 리놀렌산으로 이루어져 있는 것을 확인하였다. 또한, 분리된 파라클로렐라 속 균주는 배양 시 세포들이 군체를 형성하고 빠르게 침전되는 특징이 있어 생체량 수거가 용이하여 경제적으로 다양한 활용성이 있는 신규의 미세조류임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하며, 기탁번호가 KCTC18553P로 기탁된 미세조류인 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산 또는 리놀렌산 제조용 생물소재를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 리놀레산 또는 리놀렌산을 분리하는 것을 특징으로 하는 리놀레산 또는 리놀렌산의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산 및 리놀렌산 고함유 바이오오일 제조용 생물소재를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 리놀레산 및 리놀렌산 고함유 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 파라클로렐라 속 KSN1 균주는 생산된 지질의 약 70%가 불포화 지방산인 리놀레산과 리놀렌산으로 구성되어 있어, 리놀레산과 리놀렌산을 이용한 고부가가치 산업과 바이오오일 산업에 유용하게 활용될 수 있으며, 배양 시 세포들이 군체를 형성하고 빠르게 침전되는 특성이 있어 미세조류 배양공정 상에 생산 비용 절감 효과를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 분리된 미세조류 배양체의 콜로니 형성 및 형태 관찰 결과이다.
도 2는 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 계통수를 보여주는 그림이다. 괄호 안에 있는 숫자는 GenBank/EMBL/DDBJ 접근 수치이며, 가로줄은 뉴클레오티드 위치당 0.001개 치환을 의미한다.
도 3은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 다양한 광도 조건에서 생체량의 증가량을 분석한 결과이다.
도 4는 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 다양한 온도 조건에서 생체량의 증가량을 분석한 결과이다.
도 5는 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 다양한 pH 조건에서 생체량의 증가량을 분석한 결과이다.
도 6은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 생체량(biomass)과 지질(lipid) 생산성을 분석한 결과이다.
도 7은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 지질성분 분석 결과로, a는 가스크로마토그래피(gas chromatography) 분석 결과이며, b는 전체 지방산의 조성을 보여주는 결과이다.
도 8은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 활성산소저해반감도를 분석한 결과이다.
도 9는 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 배양 초기, 중기, 후기의 세포 응집현상을 보여주는 사진이다.
도 10은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1의 자가응집에 의한 침전경향을 보여주는 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 고농도로 포함한 바이오오일을 생산하며, 기탁번호가 KCTC18553P로 기탁된 미세조류인 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주를 제공한다.
상기 파라클로렐라 속 KSN1 균주는 경상북도 상주시 상주보 인근의 낙동강 담수시료를 채집한 뒤 이를 미세조류가 자랄 수 있는 고체배지에 도말하여 분리하였으며, 분리한 균주의 분자생물학적 동정을 위해 18S rRNA 유전자 서열 상동성을 분석한 결과, 파라클로렐라 속의 파라클로렐라 케스러리(Parachlorella kessleri) 종과는 차별되며, 파라클로렐라 허씨(P. hussii) 종과 단계통 분기군을 형성하고 있어 파라클로렐라 속의 신규한 1종으로 확인되었고, 분리된 미세조류를 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2017년 2월 16일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC18553P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 파라클로렐라 속 KSN1 균주는 생체량(biomass) 생산성 대비 35~40% 수준으로 지질을 생산할 수 있고, 불포화지방산인 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)의 함량이 전체 지방산의 60~70%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주 (기탁번호: KCTC18553P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산 또는 리놀렌산 제조용 생물소재를 제공한다. 상기 생물소재는 리놀레산 및 리놀렌산의 함량이 생산되는 전체 지방산의 60~70%를 차지하는 파라클로렐라 속 KSN1 균주를 유효성분으로 포함하고 있어, 리놀레산 또는 리놀렌산의 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 리놀렌산과 리놀레산은 18개의 탄소사슬로 구성되어 있으며, 체내에서는 합성이 되지 않기 때문에 식품으로 섭취해야하는 필수 지방산이다.
또한, 본 발명은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주 (기탁번호: KCTC18553P)를 배양하고, 그 배양액으로부터 리놀레산 또는 리놀렌산을 분리하는 것을 특징으로 하는 리놀레산 또는 리놀렌산의 제조방법을 제공한다.
상기 균주는 다양한 배양 조건에서 리놀레산 또는 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일을 축적할 수 있으며, 상기 배양 조건은 바람직하게는 500~700μmol photons/m2/s의 광도 조건과 25~35℃의 온도 조건 및 pH 7.0~10.0의 조건일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 600μmol photons/m2/s의 광도 조건과 30℃의 온도 조건 및 pH 8.0의 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 균주 배양액으로부터 리놀레산 또는 리놀렌산을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주 (기탁번호: KCTC18553P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산 및 리놀렌산 고함유 바이오오일 제조용 생물소재를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일 제조용 생물소재에 있어서, 상기 바이오오일은 지방산 총 중량 기준으로 리놀레산 및 리놀렌산을 60~70% 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주 (기탁번호: KCTC18553P)를 배양하고, 그 배양액으로부터 리놀레산 및 리놀렌산 고함유 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법을 제공한다.
상기 균주는 다양한 배양 조건에서 바이오오일을 고농도로 축적할 수 있으며, 상기 배양 조건은 바람직하게는 500~700μmol photons/m2/s의 광도 조건과 25~35℃의 온도 조건 및 pH 7.0~10.0의 조건일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 600μmol photons/m2/s의 광도 조건과 30℃의 온도 조건 및 pH 8.0의 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 균주 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 균주 배양은 당업계에서 일반적으로 통용되는 배양 배지를 이용할 수 있다. 또한, 상기 균주의 배양 조건은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 바이오오일과 지질은 같은 의미로 혼용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주 (기탁번호: KCTC18553P)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 항산화용 건강기능식품 조성물은 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)의 함량이 높은 파라클로렐라 속 KSN1 균주의 추출물을 유효성분으로 포함하고 있으며, 상기 균주의 추출물은 자유라디칼 소거 활성이 있으므로, 항산화용 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 균주 추출물은 균주의 배양체에 포함된 액상의 형태로 생산될 수 있으며, 바이오오리 추출과정의 부산물로 생산될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 파라클로렐라 속 KSN1 균주의 추출물, 또는 추출물의 분획물을 그대로 첨가하거나, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있으며, 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀의 형태로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 항산화용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01g 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 항산화 효과를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세조류 분리 및 동정
경상북도 상주시 상주보 인근의 낙동강 담수시료를 채집한 뒤 이를 미세조류가 자랄 수 있는 고체배지에 도말하여 조류주를 분리하였다. 구체적으로, 담수시료 100㎕를 BG11(표 1) 또는 F/2 고체배지(표 2)에 도말한 후, 25℃, 200~300μmol photons/m2/s, 광주기 16(명):8(암) 시간의 광배양기에서 2주간 정치배양으로 미세조류를 배양하였다. 미세조류 콜로니를 고체배지에 계대배양하며 순수한 단일종의 미세조류 배양체를 확보하였다. 이후 분리된 미세조류를 BG11 또는 F/2 액체배지에 배양하고 배양상태를 현미경으로 관찰하였다. 분리된 미세조류는 구형 또는 난형의 부유성 단세포로 세포의 크기는 5㎛ 내외인 단세포성 녹조류로 확인되었다(도 1).
Figure 112017019892348-pat00001
Figure 112017019892348-pat00002
상기에서 분리한 미세조류는 형태적으로 구형, 부유성 단세포로 엽록소를 포함하고 있었다. 형태학적으로는 트레보욱시강(Trebouxiophyceae), 클로렐라목(Chlorellales), 클로렐라과(Chlorellaceae)와 유사하였다.
분리된 미세조류의 추가 동정을 위해 유전학적 방법을 사용하였다. 구체적으로, 분리된 미세조류의 18S rRNA 유전자 염기서열을 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 분석하였다. PCR 증폭 및 유전자 염기서열 분석은 상업용 서비스(마크로젠, http://dna.macrogen.co.kr)를 사용하였다.
미세조류 염기서열 분석을 위한 프라이머
표적 유전자 프라이머명 염기서열 정보(5'→3')
18S rRNA NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC (서열번호 1)
NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA (서열번호 2)
염기서열 분석결과 분리된 미세조류는 파라클로렐라 속의 파라클로렐라 케스러리(Parachlorella kessleri) 종과는 차별되며, 파라클로렐라 허씨(P. hussii) 종과 단계통 분기군을 형성하고 있어 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.)의 신규한 1종으로 확인되었고, 분리된 미세조류를 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주로 명명하고(도 2), 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호 KCTC18553P).
실시예 2. 파라클로렐라 속 KSN1 조류주의 배양 조건 최적화
상기 실시예 1에서 분리한 파라클로렐라 속 KSN1 조류주의 최적 배양조건을 확립하기 위해 광도, 온도, pH 조건 테스트를 수행하였다. 최적온도는 pH 7, 광도 400μmol photons/m2/s에서 15℃∼35℃까지 5℃ 간격의 온도구배로 7일간 배양한 후, 각 온도에서의 생체량 증가량을 흡광도로 측정하여(680nm) 결정하였다. 최적광도는 온도 25℃, pH 7 조건에서 200, 400, 600 및 800μmol photons/m2/s 광도조건으로 7일간 배양 후, 조류 생체량을 비교하여 최적광도를 결정하였다. 최적 pH 조건은 25℃, 400μmol photons/m2/s에서 pH 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 BG11 액체배지에서 성장하는 배양체의 증가량으로 결정하였다. 액체배지의 pH를 적정하기 위하여 5% 염산과 5% 수산화나트륨 용액을 이용하였다. 생체량의 증가량은 접종 후 7일 배양 후의 흡광도 측정으로 표시하였다.
그 결과, 파라클로렐라 속 KSN1의 배양에 있어서, 최적광도는 600μmol photons/m2/s로 확인되었다(도 3). KSN1 조류주는 800μmol photons/m2/s의 강한 광도조건에서도 성장 저해현상이 나타나지 않았다. 또한, 파라클로렐라 속 KSN1의 배양에 있어서 최적온도는 30℃로 확인되었으며, 35℃의 고온에서도 성장이 활발한 것으로 확인되었다(도 4). 광도와 온도 영향에 비해서 수소이온이 파라클로렐라 속 KSN1 세포의 성장에 미치는 영향이 더 뚜렷하게 나타났다. 파라클로렐라 속 KSN1의 세포성장은 pH 8일 때 가장 활발하였으며 pH 6, 7, 9 및 10일 때는 세포의 성장이 pH 8에 비해 70% 내지 85% 수준의 성장을 보였고, pH 5에서는 성장저해가 나타났고 타 pH 조건에 비해 50% 미만의 세포성장이 관찰되었다(도 5).
실시예 3. 파라클로렐라 속 KSN1 조류주의 지질량 및 지질 성분비 확인
본 발명의 KSN1 조류주의 지질량과 지질 성분비를 분석하기 위하여, 약 2주간 최적의 배양조건에서 배양한 조류세포 활성배양체 200㎖을 여과지(0.22㎛)에 모은 후 클로로포름:메탄올(2:1 v/v) 혼합액을 첨가하고 1시간동안 교반하여 조류세포안의 지질성분을 추출하였다. 지질함량은 상기 혼합액에 증류수를 첨가하여 클로로포름:메탄올:증류수의 비율을 1:1:0.9로 조절한 뒤, 클로로포름층을 회수하고 건조시켜 측정하였다.
배양한 파라클로렐라 속 KSN1 조류를 원심분리로 수거한 후 건조중량을 측정한 결과, 생체량 생산성(biomass productivity)은 156.7 mg/L/일(day)로 확인되었고, 이 중에서 지질 생산성(lipid productivity)은 60.1 mg/L/일로 확인되었다(도 6). 파라클로렐라 속 KSN1의 지질성분 비율은 38%로 확인되었으며, 흡광도 분석으로 측정된 파라클로렐라 속 KSN1의 클로로필 함량은 세포건조량의 2.32%인 23.2 ㎍/mg이었다(표 4).
파라클로렐라 속 KSN1 균주의 생체량, 지질 생산성 및 지질성분비
생체량 생산성
(mg/L/day)		 지질생산성
(mg/L/day)		 지질성분비(%) 클로로필 함량
(㎍/mg)
Parachlorella sp. KSN1 156.7 60.1 38 23.2
또한, 지방산 성분분석을 위해 추출된 지질층에 수산화칼륨-메탄올용액 1㎖을 첨 가하여 75℃에서 10분간 비누화반응(saponification)을 시키고, 핵산과 TBME(tert-butylmethylether)를 첨가하여 반응시킨 후 증류수를 첨가하여 지방산을 분리하였다. 분리된 층의 불순물은 PVDF 주사기 필터(0.22㎛)로 여과하여 제거하였다. 정제된 지방산의 성분 및 농도는 표준시약(FAME Mix C8-C24 standard)으로 확인하였고, 지방산 조성은 가스크로마토그래피(gas chromatography)를 이용하여 FAME(fatty acid methyl esters) 성분을 분석하여 확인하였다.
지질의 성분분석을 수행한 결과, 파라클로렐라 속 KSN1의 팔미트산(plamitate, C16:0) 함량은 전체 지질의 10% 미만이었으며, 리놀렌산(linolenate, C18:3)과 리놀레산(linoleate, C18:2)이 각각 전체 지질의 30% 이상으로 확인되었다(도 7).
실시예 4. 파라클로렐라 속 KSN1 조류주의 항산화 활성 분석
항산화활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시약의 발색을 이용한 DPPH 자유라디칼 소거법으로 측정하였다. 액체배지에서 자라고 있는 파라클로렐라 속 KSN1 25㎖을 500㎖의 액체배지(BG11 또는 F/2)에 5%(v/v) 접종한 후 25℃, 200~300μmol photons/m2/s의 광도, 18(명):6(암) 시간의 광주기가 유지되는 배양실에서 약 2주간 배양 하였다. 배양 후 담수조류는 여과지에 수거한 후 PBS(phosphate buffered saline) 버퍼와 유리구슬(직경 0.1mm와 0.5mm)을 넣고 bead-beating법으로 세포를 파쇄하여 세포액을 추출하였다. 추출물 1㎖과 0.2mM의 DPPH 용액 1㎖을 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 흡광도는 블랭크(blank)와 대조구로 보정하였다. 블랭크는 추출물 1㎖에 메탄올 1㎖를 첨가하여 준비하였고, 대조구는 추출물 1㎖에 DPPH 용액 1㎖를 첨가하여 준비하였다. 자유라디칼 소거능은 하기 식을 이용하여 계산하였다.
자유라디칼 소거능(%) = [1 - ((시료 흡광도 - 블랭크 흡광도) / 대조구 흡광도)] × 100
파라클로렐라 속 KSN1의 항산화활성은 자유라디칼 50% 소거값인 활성산소저해반감도 값으로 결정하였다. 파라클로렐라 속 KSN1의 추출물 시료를 50, 100, 250 및 500㎍/㎖ 농도로 준비하였고, 각 시료의 활성산소 소거비율을 측정하였다. 활성산소저해반감도(IC50)는 선형회귀분석으로 결정하였다. 그 결과, 파라클로렐라 속 KSN1의 IC50은 회귀식의 기울기와 y 절편값으로부터 역산하여 539.4㎍/㎖으로 확인되었다(도 8).
실시예 5. 파라클로렐라 속 KSN1 조류주의 응집 효율 분석
본 발명의 파라클로렐라 속 KSN1 조류주는 다른 미세조류에 비해 자가응집에 의해 빠른 침전을 보이는 것으로 확인되었다. 배양 초기/중기/후기의 배양체를 현미경으로 관찰하였을 때, 초기 부유성 단일 구체의 세포가 관찰되었고, 중기에는 수개 세포가 응집체를 형성하였으며, 후기에는 점액질의 큰 덩어리를 형성하는 것을 확인하였다(도 9).
또한 파라클로렐라 속 KSN1을 배양한 후 충분히 혼탁한 후에 정치한 결과, 큰 크기의 세포군체가 초당 1cm 이상의 침강속도를 보여 수분내로 바닥에 침전되었으며, 군체의 크기가 1mm 이상의 입자는 한 시간 내로 바닥에 침전하는 것을 확인하였다. 전혀 군집을 형성하지 않은 단일세포의 5~10㎛ 크기의 입자도 존재하였으나 전체 생체량의 5% 미만으로, 95% 이상의 세포 생체량(biomass)이 2~3시간 내로 침강되는 것을 확인하였다(도 10). 이러한 빠른 응집과 침강속도는 미세조류의 효율적인 수거를 가능하게 하여 경제적인 미세조류 생산과 수확을 가능하게 하는 장점이 있다.
한국생명공학연구원 KCTC18553P 20170216
<110> Nakdonggang National Institute of Biological Resources <120> Microalgae Parachlorella sp. KSN1 strain producing bio-oil containing high concentration of linoleate and linolenate and uses thereof <130> PN17074 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtagtcatat gcttgtctc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccgcaggtt cacctacgga 20

Claims (8)

  1. 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 지방산 총 중량 기준으로 60~70%로 포함한 바이오오일을 생산하며, 기탁번호가 KCTC18553P로 기탁된 미세조류인 파라클로렐라 속(Parachlorella sp.) KSN1 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산(linoleate, C18:2) 또는 리놀렌산(linolenate, C18:3) 제조용 생물소재.
  4. 제1항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 리놀레산(linoleate, C18:2) 또는 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 분리하는 것을 특징으로 하는 리놀레산 또는 리놀렌산의 제조방법.
  5. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3) 고함유 바이오오일 제조용 생물소재.
  6. 제5항에 있어서, 상기 바이오오일은 지방산 총 중량 기준으로 리놀레산(linoleate, C18:2) 및 리놀렌산(linolenate, C18:3)을 60~70% 함유하는 것을 특징으로 하는 바이오오일 제조용 생물 소재.
  7. 제1항의 균주를 배양하고, 그 배양액으로부터 바이오오일을 분리하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
  8. 제1항의 균주 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강기능식품 조성물.
KR1020170025541A 2017-02-27 2017-02-27 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도 KR101839411B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170025541A KR101839411B1 (ko) 2017-02-27 2017-02-27 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170025541A KR101839411B1 (ko) 2017-02-27 2017-02-27 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101839411B1 true KR101839411B1 (ko) 2018-04-26

Family

ID=62082327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170025541A KR101839411B1 (ko) 2017-02-27 2017-02-27 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101839411B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022117885A1 (fr) 2020-12-03 2022-06-09 Odontella Produit comprenant au moins une microalgue d'eau douce capable d'être cultivée en eau salée et procédé associé

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110124034A1 (en) * 2009-11-25 2011-05-26 Kuehnle Adelheid R Enrichment of process feedstock
US20120130099A1 (en) * 2008-10-14 2012-05-24 Solazyme, Inc. Methods of microbial oil extraction and separation
KR20130045263A (ko) * 2010-04-06 2013-05-03 헬리아에 디벨롭먼트, 엘엘씨 조류로부터 카르테노이드 및 오메가-3 풍부 오일을 분리하는 방법 및 시스템
US9249252B2 (en) * 2013-04-26 2016-02-02 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120130099A1 (en) * 2008-10-14 2012-05-24 Solazyme, Inc. Methods of microbial oil extraction and separation
US20110124034A1 (en) * 2009-11-25 2011-05-26 Kuehnle Adelheid R Enrichment of process feedstock
KR20130045263A (ko) * 2010-04-06 2013-05-03 헬리아에 디벨롭먼트, 엘엘씨 조류로부터 카르테노이드 및 오메가-3 풍부 오일을 분리하는 방법 및 시스템
US9249252B2 (en) * 2013-04-26 2016-02-02 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022117885A1 (fr) 2020-12-03 2022-06-09 Odontella Produit comprenant au moins une microalgue d'eau douce capable d'être cultivée en eau salée et procédé associé
FR3117128A1 (fr) * 2020-12-03 2022-06-10 Odontella Produit comprenant au moins une microalgue capable d’être cultivée en eau salée

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106916747B (zh) 索罗金小球藻藻株及其培养方法和用途
Palanisamy et al. Production of lipids by Chaetoceros affinis in media based on palm oil mill effluent
US20130309719A1 (en) Heterotrophic microbial production of xanthophyll pigments
KR20140033490A (ko) 혼합영양 배양 모드에서의 epa 및 dha의 제조를 위한 오돈텔라 속의 미세조류의 신규 균주
JP6397556B1 (ja) 多価不飽和脂肪酸生産用微細藻類培養培地組成物及び方法
KR101521274B1 (ko) 신규 미세조류 오란티오키트리움（Aurantiochytrium sp.) LA3（KCTC12685BP) 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법
KR101839411B1 (ko) 리놀레산 및 리놀렌산을 고농도로 포함한 바이오오일 생산 미세조류인 파라클로렐라 속 ksn1 균주 및 이의 용도
CN107384800B (zh) 克莱曼都普帝藻(chlamydopodium sp.)和其用途
Kumon et al. A new labyrinthulid isolate, which solely produces n-6 docosapentaenoic acid
TW202016289A (zh) 新穎的破囊壼菌屬微藻菌株及使用該微藻菌株製造多元不飽和脂肪酸的方法
JP5371750B2 (ja) 微生物発酵によるｄｈａ含有リン脂質の製造方法
KR101654219B1 (ko) 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도
JP6611715B2 (ja) オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類の低塩分濃度条件順化方法
TWI589692B (zh) 微藻及其用途
KR101692695B1 (ko) 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 ga 및 이의 용도
TWI687517B (zh) 具有高脂質生產能力的鏈帶藻屬物種t9分離株及其用途
TWI589693B (zh) 克萊曼都普帝藻（ｃｈｌａｍｙｄｏｐｏｄｉｕｍ ｓｐ.）及其用途
KR102455445B1 (ko) 신규한 미세조류 에프레니움 보라튬 mabiklp88 및 그 용도
KR20080087820A (ko) 도코사헥사엔산〔ｄｈａ〕을 생산하는 트라우스토키트리드균주－ｓｃ１
WO2024043739A1 (ko) 신규한 유트렙티엘라 속 균주 및 이를 이용한 지방산의 생산방법
KR102162832B1 (ko) 헤테로클로렐라 루테오비리디스 mm0014 균주 및 그 용도
CN115820423B (zh) 一种波斯枝藻及其培养方法和应用
EP4431593A1 (en) Novel strain of schizochytrium sp. with easy intracellular oil extraction and a method for producing oil containing omega-3 using same
EP4431594A1 (en) Novel strain of schizochytrium sp. with easy intracellular oil extraction and method for producing oil containing omega3 using same
KR102126441B1 (ko) 신규한 로보스페라 인시사(Lobosphaera incisa)K-1 미세조류 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant