KR20140033490A - 혼합영양 배양 모드에서의 epa 및 dha의 제조를 위한 오돈텔라 속의 미세조류의 신규 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혼합영양 모드에서 성장할 수 있는 오돈텔라 속의 미세조류의 신규 균주에 관한 것이고, 종속영양 또는 혼합영양 모드에서 다중불포화 지방산, 특히 EPA 및 DHA의 제조를 가능하게 하는 그러한 균주를 선택 및 배양하기 위한 방법에 관한 것이다 .

Description

혼합영양 배양 모드에서의 EPA 및 DHA의 제조를 위한 오돈텔라 속의 미세조류의 신규 균주 {NOVEL STRAIN OF MICROALGAE OF THE ODONTELLA GENUS FOR THE PRODUCTION OF EPA AND DHA IN MIXOTROPHIC CULTIVATION MODE}

본 발명은 종속영양 (heterotrophic) 및 혼합영양 (mixotrophic) 조건 하에서 성장 가능한 오돈텔라 속 (Odontella genus)의 미세조류의 신규 균주에 관한 것이고, 종속영양 또는 혼합영양 모드에서 다중불포화 지방산, 특히 EPA 및 DHA의 제조를 가능하게 하는 상기 미세조류의 선택 및 배양을 위한 방법에 관한 것이다.

이 신규 균주는 특히 혼합영양 모드에서 수행되는 배양 방법에서 EPA 및 DHA를 제조하는데 특히 유용하고, 이때 광 공급은 플래쉬 형태이다.

서문

미세조류는 독립영양 (autotrophic) 특징을 갖는 광합성 미생물이고, 즉 그들이 광합성에 의해 자율적으로 성장할 능력을 가지는 것으로 공지된다.

미세조류는 해양 수상 매체, 및 담수 또는 기수 (brackish water)뿐만 아니라 다양한 육지 서식지에서도 성장한다.

담수 또는 대양에서 마주칠 수 있는 대부분의 미세조류 종은 절대적으로 독립영양성이고, 즉 그들은 오로지 광합성에 의해서만 성장할 수 있다.

그러나, 매우 다양한 과 (family) 및 기원의 미세조류 종의 특정 수는 절대적으로 독립영양성은 아닌 것으로 발견된다. 따라서, 종속영양성인 것으로 언급되는, 그들 중 일부는 빛의 완전한 부재에서 발효작용에 의해, 즉 유기 물질을 사용함으로써 성장할 수 있다.

그의 성장에 광합성이 필수적인 다른 미세조류 종은, 그들의 환경에 존재하는 유기 물질 및 광합성 둘 다로부터 이익을 얻을 수 있다. 혼합영양성인 것으로 언급되는 이러한 중간체 종은 빛 및 유기 물질 둘 다의 존재 하에 배양될 수 있다.

소위 ≪ 혼합영양 ≫ 미세조류의 이 특수성은 그들의 대사에 관련된 듯 하고, 이는 그들이 광합성 및 발효 작용을 동시에 수행 가능하게 한다. 두 가지 유형의 대사는 모두 상기 미세조류의 성장에 대한 긍정적인 전체적 효과와 공존한다 [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6:87-102].

현재, 미세조류의 분류는 여전히 형태적 기준 및 그들의 세포가 함유하는 광합성 안료의 특징을 크게 바탕으로 한다. 결과적으로, 이는 상이한 조류의 종의 독립영양, 종속영양 또는 혼합영양 특징을 바로 나타내지 않는 반면에 후자는 매우 다양한 종 및 다양한 형태를 아우른다 [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia, 639:153-171].

미세조류는 특정한 종이 상당한 양의 지질, 특히 다중불포화 지방산을 축적 또는 분비할 수 있기 때문에 현재 많은 산업 프로젝트의 대상체이다.

이러한 다중불포화 지방산 중에, 일련의 오메가-3 (PUFA-ω3)로부터의 특정한 고도 불포화 산, 특히 에이코사펜타엔산 (EPA, C20:5 ω3) 및 도코사헥사엔산 (DHA, C22:6 ω3)은 인정된 영양적 중요성을 갖고 치료 적용 면에서 강한 잠재력을 갖는다 [Horrocks L.A. et al. (2000) Health Benefits of DHA. Pharmacol. Res. 40: 211-225].

수산 가공업의 피쉬 오일은 현재 이러한 유형의 지방산의 주요 상업적 공급원이다. 그러나, 이러한 오일은 새로운 응용품 (수산양식에서의 식품 보충제, 마가린 내 혼합)을 발견했지만, 해양 수산 자원은 집중적인 어업 활동 때문에 부족해지고 있다.

따라서, 미래에 이러한 유형의 다중불포화 지방산에 대한 시장으로부터의 증가하는 수요를 충족시키기 위해서 EPA 및 DHA의 새로운 공급원을 찾아야 한다.

미세조류는 지방산을 새로이 합성하는 그들의 능력 외에도 피쉬 오일에 비해 여러 이점을 제공한다. 특히, 그들은 통제된 조건 하에서 시험관내 배양될 수 있고, 이는 상대적으로 일정한 생화학적 조성을 갖는 바이오매스의 제조를 가능하게 한다. 한편, 피쉬 오일과는 달리, 미세조류로부터의 지질은 임의의 불쾌한 냄새를 갖지 않고 콜레스테롤을 거의 또는 아예 함유하지 않는다. 마지막으로, 미세조류에 의해 제조된 지질은 피쉬 오일의 지방산 프로파일에 비해 일반적으로 더욱 단순한 지방산 프로파일을 갖고, 이는 관심 있는 지방산을 분리하기 위한 단계를 한정한다.

주요 EPA- 및 DHA-제조 미세조류는 다양한 문에 속하는 해양 종이다. 그러나, 이러한 문에 포함되는 다수의 종으로부터, 분류학상 계급에서 서로 떨어져 있는 오로지 소수의 종만이 고 함량의 EPA 및 DHA를 갖는다. 상당한 양의 EPA 및/또는 DHA를 제조할 수 있는 종 중에, 가장 빈번하게 언급되는 것은 속 쉬조트리움 (Schizotrium) 종, 크립테코디늄 ( Crypthecodinium ) 종 (와편모조류 (Dinophyceae)), 파에오닥틸룸 ( Phaeodactylum ) 종 (규조류, 쪽배돌말목 (Bacillariophyceae, Naviculales)) 및 오돈텔라 종 (규조류, 체돌말강 (Bacillariophyceae, Coscinodiscophyceae),에 속하는 것들이다.

오돈텔라 속의 미세조류는 크기가 크고 길이가 35 내지 50 마이크로미터에 이르는 단세포 조류이다. 그들은 2개의 대칭 밸브로 이루어진 실리카 규조각 (frustule)을 갖는다. 이들은 얕은 해수층 (neritic zone)의 흔히 볼 수 있는 전세계적인 미세조류이고, 조밀한 플랑크톤 집단을 형성하지 않으며 이는 종종 연안 지대의 다양한 종의 저수생성 대형조류 (benthic macroalgae)와 관련되는 것으로 나타난다. 천연 상태에서, 종 오돈텔라 아우리타는 EPA의 총 건조 중량 1.6% 내지 3.4%를 축적하고, 이는 이 미세조류에 의해 생산되는 총 지방산의 평균 21%를 나타낸다.

오돈텔라 아우리타는 동물 식품에서의 그의 용도, 특히 어류 및 갑각류의 유생의 먹이 공급을 위해 외부 풀 (pool) 중 독립영양 모드에서 일반적으로 배양된다 [Pulz et Gross (2004) Valuable products from biotechnology of microalgae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65(6):635-648].

그럼에도 불구하고, 개방 (open) 풀 중 독립영양 모드에서 미세조류를 배양하는 것은 후자의 산업 활용에 그다지 적용되지 않는다. 사실, 미세조류의 집중적인 활용 면에서, 바이오매스 제조는 폐쇄되고 큰 광-생물반응기에서 다량으로 성취되어야 한다. 그러나, 그러한 조건 하에서 배양 배지에 함유된 세포의 전체에, 특히 미세조류의 밀도가 상당해질 경우에 만족할만한 조명을 제공하는 것은 어렵다.

오돈텔라 속의 미세조류의 독립영양 배양의 대안은 종속영양 배양을 실시하는 것, 즉 빛의 부재 하에, 탄소-함유 기재 형태로 에너지를 제공하거나, 그렇지 않으면, 혼합영양 배양을 실시하는 것, 즉 보다 낮은 강도의 광 공급의 존재 하에, 유기 기재를 공급하는 것이다.

그러나, 현재까지, 오돈텔라 속의 미세조류가 그러한 조건 하에서 배양되는 것은 불가능했다.

따라서 예기치 않게 출원인은 종속영양 및 혼합영양 모드에서 배양될 수 있고, DHA 및 EPA를 만족할만한 양으로 제조하는 것이 가능한 오돈텔라 속의 미세조류 균주를 단리하는데 성공했다.

이 신규한 오돈텔라 균주는 본 발명자들에 의해 환경으로부터 단리되었고, 더욱 특히 혼합영양 조건 하에서 불연속 조명, 특히 플래쉬 형태의 존재 하에 미세조류를 배양하는 것으로 이루어진, 후자에 의해 개발된 방법에 따라 배양되었다.

미세조류에게 스트레스인 것으로 일반적으로 이해되는 조광 상 및 암 상의 근접 교체는, 놀랍게도 이 균주로부터 다중불포화 지방산을 고생산 하는 것을 성취 가능하게 했다. 본 발명에 따른 그러한 균주의 적용은 감소된 광 공급으로부터 이익을 얻는 발효기에서의 다중불포화 지방산의 산업 제조의 전망을 열고, 따라서 기존의 독립영양 배양 모드에 비해 에너지 및 표면적에서의 절약이 가능해진다.

본 발명에 따라 선택된 이러한 균주의 첫번째인 오돈텔라의 균주, FCC 675는 부다페스트의 조약의 조항에 따라 CCAP (조류 및 원충 균주 은행, 스코틀랜드 해양 과학 협회, 던스타프나지 마린 래보라토리, 영국 스코틀랜드 PA371QA 아가일 오반 소재)에 2011년 5월 27일자로 기탁되었고 등록 번호 CCAP 1054/5를 부여받았다.

본 발명의 다양한 측면 및 이점이 이후에 상술된다.

따라서, 본 발명은 종속영양 또는 혼합영양 모드에서 배양될 수 있는 것을 특징으로 하는 오돈텔라 속의 단리된 미세조류 (문 (Phylum): 바실라리오피타 (Bacillariophyta), 강 (Class): 코시노디스코피시아이 (Coscinodiscophyceae), 과 (Family): 유포디카시아이 (Eupodicaceae)) [ITIS, Catalogue of Life, 2010]에 관한 것이다.

이 미세조류가 종속영양 모드에서 배양될 수 있다는 사실은 암 조건에서, 독립영양 모드에서 오돈텔라를 배양하기 위해 보통 사용되는 표준 배양 배지에서, 바람직하게는 탄소-함유 기재가 첨가된 무기물 배지에서 증식하는 그의 능력으로 이해된다. 무기질 배지는 흔히, 무기 화합물뿐만 아니라 임의로 비타민 및 특정한 아미노산이 용해된 바닷물을 바탕으로 하는 수용액으로 이루어진 배양 배지를 의미한다. 오돈텔라의 배양에 적합한 무기질 배지는 예를 들어 f/2 배지이다 [Guillard, R.R.L. (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. pp 26-60. In Smith W.L. and Chanley M.H (Eds.) Culture of Marine invertebrate Animals. Plenum Press, New York, USA; Guillard, R.R.L. and Ryther, J.H. (1962) Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea Cleve. Can. J. Microbiol. 8: 229-239].

이 미세조류가 혼합영양 모드에서 배양될 수 있다는 사실은, 광 공급의 존재 하에, 상기 기재된 것과 유사한 배양 배지, 즉 독립영양 모드에서 오돈텔라를 배양하는데 보통 사용되지만 그 내부에 탄소-함유 기재가 첨가된 배지에서 미세조류가 증식하는 능력으로 이해된다.

일반적으로, 광 공급의 강도는 5 μE 이상이고, 우선적으로, 5 내지 300 μE, 더욱 우선적으로, 10 내지 200 μE, 및 보다 더욱 우선적으로, 20 내지 150 μE을 포함한다.

종속영양 또는 혼합영양에서, 탄소-함유 기재를 배양 내로 이동시킨다. 탄소-함유 기재는 순수한 형태로 또는 혼합물로서, 일반적으로, 하나 또는 여러 개의 하기 화합물을 포함하거나 또는 이들로 이루어진다: 전분, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 락토스, 락테이트, 셀룰로스 및 그의 유도체, 사카로스, 아세테이트 및/또는 글리세롤.

예를 들어, 옥수수, 밀, 또는 감자로부터의 전분의 생체변형으로부터의 생성물, 특히, 소형 분자로 이루어진 전분 가수분해 생성물이 종속영양 또는 혼합영양 모드에서 미세조류를 배양하는데 사용될 수 있는 탄소-함유 기재를 형성할 수 있다.

상기 미세조류의 혼합영양 또는 종속영양 모드에서의 배양은 5 mM 이상, 바람직하게는, 10 mM 이상, 더욱 우선적으로, 20 mM 이상 및 더욱 더 우선적으로, 50 mM 초과의 탄소-함유 기재의 존재 하에 우선적으로 수행된다. 당업자는 사용할 탄소-함유 기재의 최대 농도를 능숙하게 결정한다. 일반적으로, 상기 미세조류의 혼합영양 또는 종속영양 모드에서의 배양은 10 내지 200 mM, 바람직하게는, 20 내지 50 mM의 탄소-함유 기재의 존재 하에 수행될 수 있다.

배양 동안 세포가 유의한 농도의 지질을 축적하는 것이 가능하도록 지속적인 기재 공급을 보장한다. 배양 방법 동안 배양 배지에 추가의 기재를 첨가하여 일정한 농도를 유지시킨다. 당업자는 배양 배지 내에서 탄소-함유 기재의 일정한 농도를 유지하기 위하여 배양물에 첨가될 탄소-함유 기재의 양을 능숙하게 결정한다. 그에 따라, 일반적으로 배양은 5 mM 내지 1 M, 바람직하게는, 50 mM 내지 800 mM, 더 우선적으로, 70 mM 내지 600 mM 및 더욱 더 우선적으로, 100 mM 내지 500 mM의 누적 농도의 탄소-함유 기재로 수행될 수 있다.

본 발명의 목적상, 아라비노스 및 크실로스는 본 발명에 따른 종속영양 모드에서 오돈텔라를 배양하기 위한 우선적인 탄소-함유 기재이다.

아세테이트 및 사카로스는 본 발명에 따른 혼합영양 모드에서 오돈텔라를 배양하기 위한 우선적인 탄소-함유 기재이다.

따라서 본 발명은

- 오돈텔라 속의 하나 또는 여러 균주를 암 조건에서 또는 광 공급의 존재 하에 배양하는 단계;

- 상기 배양 배지에서 앞서 기재된 바와 같이 상기 배양을 탄소-함유 기재의 존재 하에 여러 세대에 걸쳐 유지하는 단계;

- 이에 따라 수득된 오돈텔라 세포를 수확하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 종속영양 또는 혼합영양 특징을 갖는 오돈텔라 속의 미세조류를 배양 또는 선택하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 배양 방법은 특히 그로 인해 선택되거나 제조된 미세조류 내에 축적되는 다중불포화 지방산, 더욱 특히 EPA 및 DHA의 제조에 관한 것이다.

그러한 배양 방법은 가변적 또는 불연속 광 공급이 적용되는 경우, 다시 말해, 배양된 조류에 제공된 광속(light flux)이 시간에 따라 가변적이거나 불연속인 경우, 특히 유리한 것으로 입증된다.

일반적인 신념과 반대로, 배양의 가변적 또는 불연속 조명은, 특히 혼합영양 모드에서의 배양에서 사용되는 경우에, 조류의 성장에 호의적인 영향을 주었고, 특히 그들의 지질 제조에 관한 한, 그들의 생산성을 증가시키는 것을 가능하게 한 것으로 나타났다.

이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명자들은 미세조류로의 불연속 또는 가변적 광 공급이 지질의 합성에 호의적인 ≪스트레스≫를 유발하는 효과를 갖는다고 믿는다. 이러한 현상은 자연상태에서 미세조류가 그들의 환경의 제약을 견디기 위하여 지질 보유량을 축적하는 경향이 있다는 사실에 의해 부분적으로 설명될 수 있다.

불연속 조명이란, 암 조건의 기간으로 중단된 조명을 의미한다. 암 조건의 기간은 조류가 배양되는 시간의 4분의 1 초과, 바람직하게는, 2분의 1 초과일 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에 따라, 조명은 불연속적이고, 더 바람직하게는, 플래쉬 형태, 즉 단기의 기간에 걸친 것이다. 이때 연속적인 조명 상은 일반적으로 5 초 내지 10 분, 바람직하게는, 10 초 내지 2 분, 더욱 우선적으로, 20 초 내지 1 분으로 구성된다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 따라, 조명은 가변적일 수 있는데, 이는 조명이 암 상에 의해 차단되지 않고 광 강도가 시간에 따라 변동하는 것을 의미한다. 이러한 광 변이는 주기적(periodical)이거나, 순환적(cyclic)이거나 또는 심지어 랜덤일 수 있다.

본 발명에 따라, 조명은 연속적으로 변할 수 있고, 즉 광 강도가 일정하지 않고 시간에 따라 영구적으로 변한다 (dμmol (광자)/dt ≠ 0).

본 발명에 따라, 연속 및 불연속 조명 상을 조합한 광 공급을 갖는 것이 또한 가능하다.

본 발명은 특히, 오돈텔라 속의 미세조류가 시간에 따른 불연속 또는 가변적 광 공급으로 암 조건에서 배양되고, 광 공급의 강도는 마이크로몰의 광자 단위로, 10 μmol.m^-2.s^-1 이상, 바람직하게는, 50 μmol.m^-2.s^-1 이상, 더 우선적으로, 100 μmol.m^-2.s^-1 이상의 진폭으로, 시간 당 1 회 또는 여러 회의 속도로, 유리하게는, 시간 당 1 회 초과로 변동하는 것을 특징으로 하는, 상기 조류를 배양하는 방법에 관한 것이다. 이러한 상이한 불연속 또는 가변적 조명 모드의 공통점은, 본 발명에 따라, 초 당 제곱 미터 당 마이크로몰의 광자단위 (μmol.m^-2.s^-1)로 표현되는 배양물 내 조류에 제공되는 광 강도가 동일한 시간 내에 1회 이상 변동한다는 점에 있다. 광 강도 변이의 상기 변이의 진폭은 일반적으로 10 μmol.m^-2.s^-1 초과, 우선적으로, 20 μmol.m^-2.s^-1 이상, 더 우선적으로, 50 μmol.m^-2.s^-1 이상이다. 다시 말해, 광 강도는 매 시간, 바람직하게는 시간내 여러 회, 높은 값과 낮은 값에 이르고, 이러한 값의 차이는 상기 나타낸 것 이상이다. 바람직하게는, 상기 광 강도는 연속적으로 매 시간 50 μmol.m^-2.s^-1 및 100 μmol.m^-2.s^-1의 값, 더 우선적으로, 0 및 50 μmol.m^-2.s^-1의 값, 더욱 더 우선적으로, 0 및 100 μmol.m^-2.s^-1의 값에 이른다.

1 μmol.m^-2.s^-1이 문헌에서 종종 사용되는 단위인, 1 μE m^-2.s^-1 (아인슈타인(Einstein))에 상응한다는 것은 공지되어 있다.

배양 내 광 공급은 발효기의 외부 벽 주위에 램프를 분포시켜 얻을 수 있다. 시계가 정의된 조명 기간 동안 상기 램프를 작동시킨다. 발효기는 우선적으로 햇빛으로부터 차폐된, 온도-제어된 구내에 설치된다.

본 발명의 한 실시양태에 따르면, 배양물은 배양 배지가 정기적으로 순환하여 발효기의 유조명 부분에 도달하는 발효기 내에서 수득될 수 있다. 그러한 발효기는 예를 들어, 그의 일부분이 투명하고 외부로부터 조명되는 원형 관을 갖는 장치일 수 있다. 배양 배지 및 현탁된 조류는 상기 장치의 유조명 부분을 통해 능동적으로 순환하는 동안 이로 인해 광을 주기적으로 접한다.

본 출원인에 의해 단리, 선택, 및 배양된 오돈텔라의 특정한 균주, FCC 675는 2011년 5월 27일자로 등록 번호 CCAP 1054/5 하에 CCAP에 기탁되었다. 진행중인 분류학상 분석에 따르면, 후자는 오돈텔라 아우리타 종에 속한다. 그럼에도 불구하고, 다른 오돈텔라 종을 포함하는 그의 계통을 참작하여, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 혼합영양 특징을 갖는 오돈텔라 속의 임의의 미세조류 종에 관한 것이다.

본 출원인이 관찰할 수 있었던 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 선택된 균주가 종속영양 또는 혼합영양 모드에서 우수한 성장 능력을 갖는다는 사실은, 상기 균주가 다중불포화 지방산, 특히 EPA 및 DHA를 더 고도로 제조하게 만든다.

따라서, 본 발명에 따른 배양 방법은 다중불포화 지방산의 높은 수득률을 갖는, 출원인에 의해 단리되고 CCAP에 기탁된 균주와 유사한, 혼합영양 특징을 갖는 오돈텔라 균주의 선택을 가능하게 한다.

균주를 스크리닝하기 위해, 다양한 오돈텔라 균주를 조건 및 다양한 배양물의 성장을 정확하게 모니터링하면서, 동일한 구내에서 마이크로플레이트 상에 나란히 배양할 수 있다. 이로써, 필요시 배양 배지 내로 하나 또는 여러 탄소-함유 기재를 첨가하여, 불연속 조명에 대한 다양한 균주의 반응을 측정하는 것이 용이하다. 불연속 조명 및 탄소-함유 기재에 호의적으로 반응하는 균주는, 지질의 제조에 있어서 품질 측면 (지질 프로파일 내에 다중불포화 지방산이 더 풍부함) 및 질적 측면 (지질이 EPA 및 DHA를 더 높은 비율로 함유함)에서 일반적으로 더 우수한 수득률을 제공한다.

미세조류는 발효기에서 미세조류의 다양화된 풀(pool)로부터 선택될 수 있고, 그중 하나는 혼합영양 배양 조건을 갖는 불연속 또는 가변적 광을 조합한 본 발명에 따른 상기 선택 모드에 유리한 변이체를 선택하는 것을 목표로 한다. 이 경우, 다수 세대에 걸쳐 배양물 내 미세조류를 유지하여 배양을 수행한 다음, 배양 배지 내 다수가 된 성분의 단리를 배양 종반에 수행한다.

본 발명에 따른 배양 방법은 더욱 특히 균주의 배양이 여러 세대에 걸쳐, 바람직하게는 혼합영양 모드에서 수행되는 것, 및 지질이 로딩된 세포가 수확되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 혼합영양 또는 종속영양 모드에서, 더욱 특히 앞서 기재된 배양 방법에 따라 오돈텔라 속의 미세조류를 선택 및 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 오돈텔라 속의 미세조류를 다중불포화 지방산에 있어서 풍부화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 종속영양 또는 혼합영양 특징을 갖는 오돈텔라 속의 미세조류를 배양한 다음, 및 그로 인해 배양된 미세조류를 회수하여 그로부터 지질 성분, 특히, EPA 및/또는 DHA를 추출하는 것을 통한, 지질, 특히 다중불포화 지방산의 제조에 관한 것이다. 이러한 미세조류는 바람직하게는 앞서 언급된 방법에 따라 배양 또는 선택된다.

본 발명에 따른 오돈텔라 균주의 혼합영양 또는 종속영양 모드에서의 배양은 일반적으로 동일한 오돈텔라 균주의 독립영양 모드에서의 배양과 비교하여, 총 바이오매스를 20% 초과, 가장 빈번하게는 30% 초과, 및 더욱 빈번하게는 40% 초과만큼 증가하도록 한다.

더불어, 이에 따라 배양된 오돈텔라 균주로부터 추출된 총 지질 중 총 EPA 및 DHA 지질의 함량은 건조 중량으로 총 세포 지질의 10% 초과, 일반적으로 30% 초과, 빈번하게는 40% 초과, 또는 심지어 50% 초과로 나타난다.

EPA 및 DHA를 선택적으로 추출하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 블라이, 이.쥐. (Bligh, E.G.) 및 다이어, 더블유.제이. (Dyer, W.J.)의 문헌 [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J. Biochem. Physiol., 37: 911-917]에 의해 기재되어 있다. 이로써 추출된 EPA 및 DHA는 영양 조성물, 예컨대 조제 우유 내에서, 아니면 화장품 조성물 또는 치료적 조성물 내에서 첨가제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 선택되거나, 배양되거나 또는 다중불포화 지방산이 풍부화된 미세조류는 수화 또는 탈수화된 형태로 바로 사용되거나, 또는 변환 후, (특히, 양어에서의) 영양 보조 식품으로서, 또는 화장품 또는 치료제의 조성물에 사용되는 성분으로서 사용될 수 있다.

실시예

생물반응기에서의 오돈텔라 아우리타 균주의 배양

배양물을 전산 감독되는 전용 자동 장비가 구비된 2L 가용 용량 발효기 (생물반응기) 내에서 성장시켰다. 시스템의 pH를 염기 (1N 수산화나트륨 용액) 및/또는 산 (1N 황산 용액)을 첨가함으로써 조정하였다. 배양 온도는 23 ℃로 설정하였다. 러쉬턴 배치(Rushton configuration) (다운 펌핑(down pumping)하는 3-블레이드 프로펠러)에 따라 통로(shaft)에 배치한 3개의 교반 로터를 사용하여 교반을 달성하였다. 교반 속도 및 급기 유속을 각각 최소 100 rpm 및 최대 250 rpm, 및 Q_min = 0.5 vvm / Q_max = 2 vvm로 조절하였다. 생물반응기는 투명한 탱크를 둘러싸는 외부 조명 시스템을 갖추었다. 강도 및 광 사이클은 전산 감독되는 전용 자동 장비에 의해 제어되었다.

온도-제어된 구내 (22 ℃)에서 혼합 테이블 (140 rpm) 상에서 제조된 전배양물을 반응기에 투입하고 100 μE m^-2.s^-1로 연속적으로 조명하였다. 전배양물 및 배양물을 f/2 배지의 생물반응기에서 제조하였다. 생물반응기 내 혼합영양 배양에 사용된 유기 탄소는 20 mM 내지 50 mM의 농도의 아세트산나트륨이다. 탄소-함유 유기 기재를 ≪유가 (fed-batch)≫ 모드로 배양 배지에 첨가하였다. 종속영양 배양 조건은 광의 부재하의 혼합영양 조건과 동일하다.

배양의 모니터링

총 바이오매스 농도는 건조 매스 (와트만 GFC 필터 상에 여과한 후, 진공하에서 65 ℃ 및 -0.8 bars로, 칭량 전 최소 24시간 동안 오븐 건조함)를 측정함으로써 모니터링한다.

지질의 총 수의 정량화에 관하여, 10⁷ 세포/mL를 추출하였다. 지질을 추출하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 블라이, 이.쥐. 및 다이어, 더블유.제이.의 문헌 [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can. J.Biochem. Physiol 37:911-917]에 의해 기재되어 있다.

플래쉬 광

생물반응기 배양 내 광 공급은 발효기의 외부 벽 주위에 분포시킨 LED 램프로 얻었다. 시계가 조명 시간 또는 10 내지 100 μE의 펄스 동안 상기 LED를 작동시킨다. 혼합영양에 사용된 플래쉬 시스템의 광 강도는 독립영양 (대조군)에 사용된 것과 동일하다.

CCAP CCAP1054/5 20110527

Claims (12)

1. 2011년 5월 27일자로 등록 번호 CCAP 1054/5 하에 CCAP에 기탁된 오돈텔라 (Odontella) 균주에 상응하는 미세조류.
2. - 오돈텔라 속 (genus)의 하나 또는 여러 균주를 암 조건에서 또는 광 공급의 존재 하에 배양하는 단계;
   - 배양 배지에서 상기 배양을 20 mM 이상의 아세테이트, 글루코스, 크실로스, 아라비노스, 락토스, 사카로스, 아세테이트 또는 글리세롤을 포함하는 탄소-함유 기재의 존재 하에 여러 세대에 유지하는 단계;
   - 이에 따라 수득된 오돈텔라 세포를 수확하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 오돈텔라 속의 미세조류의 배양 또는 선택 방법.
3. 제2항에 있어서, 탄소-함유 기재가 아세테이트 또는 사카로스를 포함하는 것인 배양 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 오돈텔라 속의 미세조류 균주가 제1항에 정의된 바와 같은 것인 배양 방법.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 균주의 배양이 혼합영양 (mixotrophic) 모드에서 광 공급으로 수행되고, 광 공급의 강도는 5 내지 300 μE, 바람직하게는, 10 내지 200 μE, 더욱 바람직하게는, 20 내지 150 μE로 구성되는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 탄소-함유 기재가 아라비노스 또는 크실로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 균주의 배양이 혼합영양 모드에서 시간에 따른 불연속 또는 가변적 광 공급으로 수행되고, 광 공급의 강도는 마이크로몰의 광자 단위로 50 μmol.m^-2.s^-1 초과의 진폭에 따라 시간 당 1회 이상의 속도로 변동하는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 광 공급이 플래쉬 (flash) 형태인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
9. 제8항에 있어서, 플래쉬가 5 초 내지 10 분, 바람직하게는, 10 초 내지 2 분, 더욱 바람직하게는, 20 초 내지 1 분으로 구성되는 기간의 연속적인 조명 상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 배양 방법.
10. 오돈텔라 속의 하나 이상의 미세조류 균주를 종속영양 (heterotrophic) 또는 혼합영양 모드에서 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배양 방법에 따라 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 오돈텔라 속의 미세조류를 EPA (에이코사펜타엔산) 및/또는 DHA (도코사헥사엔산)에 있어서 풍부화하는 방법.
11. EPA 및 DHA 함량이 총 세포 지질의 40% 초과, 더욱 바람직하게는 50% 초과인 것을 특징으로 하는, 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 배양 방법에 따라 수득될 수 있는 오돈텔라 속의 미세조류.
12. EPA 및/또는 DHA가 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득된 미세조류의 지질 함량으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는, EPA 또는 DHA 제조 방법.