RU2810308C1 - Способ культивирования морских гетеротрофных динофлагеллят oxyrrhis marina - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области морской аквакультуры и предназначено для получения массы высококачественных живых кормовых организмов для использования в качестве промежуточных живых кормов для морских копепод, для проведения экспериментальных работ, а также в качестве источника ценных химических соединений, таких как высоконенасыщенные жирные кислоты и стеролы. Выделяют клетки Oxyrrhis marina из природных резервуаров и осуществляют адаптацию к условиям культивирования. В процессе адаптации отбирают наиболее быстрорастущие клетки при культивировании в течение 7-14 суток с использованием стерильной морской воды, при исходной плотности О. marina 0.5 кл/мл, с кормлением один раз в течение 3 суток нанопланктонными микроводорослями при концентрации ~10⁴ кл/мл и постоянном освещении 500 лк, а затем рекультивируют культуру О. marina в условиях пониженного метаболизма при 15°С с минимальным освещением ~100-500 люкс, при кормлении 1-2 раза в месяц суспензией ~10⁴ кл/мл зеленых микроводорослей Tetraselmis или Dunaliella. Для получения массовой культуры гетеротрофных динофлагеллят О. marina их переводят в условия активации метаболизма клеток и стимуляции ускоренного деления путем повышения температуры до оптимальной 24±1°С и оптимизацией кормления микроводорослями Isochrysis galbana 10⁵ кл/мл и в течение 3 сут с постепенным увеличением объема культуры динофлагеллят от 20 до 200 мл при плотности клеток О. marina ~300 кл/мл и средней скорости роста численности популяции 1.4 сут^-1, затем в течение 5 суток при скорости роста численности 0.7-1.4 сут^-1 производят постепенное увеличение плотности клеток от 300 до ~40000 кл/мл при одновременном наращивании объема до 1000 мл, добавляя питательную суспензию клеток I. galbana в стерильной морской воде. Для перевода полученной маточной культуры в полупромышленную ежесуточно производят изъятие 0.5 объема интенсивной культуры О. marina, восполняя изъятие до полного объема суспензией стерильной морской воды с добавлением смеси микроводорослей Tetraselmis, Rhodomonas, Phaeodactylum, а через сутки повторяют процедуру изъятия. Изобретение обеспечивает возможность получения биомассы Oxyrrhis marina. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области морской аквакультуры и предназначено для получения массы живых кормовых одноклеточных организмов - гетеротрофных динофлагеллят, для проведения экспериментальных работ в области научных исследований по аквакультуре, морской биологии, биохимии, молекулярной биологии и биологического тестирования.

Известно, что морскими микроводорослями (фотосинтезирующим фитопланктоном) питаются копеподы, для которых именно фитопланктон является источником незаменимых компонентов, таких как длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, в частности, высоконенасыщенные жирные кислоты (ВНЖК, омега-3), и эти планктонные ракобразные передают омега-3 далее вверх по пищевой цепи личинкам и планктоноядным рыбам. Незаменимые ПНЖК играют важную роль в разнообразных метаболических процессах высших животных, не только морских, но и наземных, они участвуют в регуляции экспрессии генов, начиная с эмбрионального развития, играют значительную роль в процессах воспроизводства и замедления старения, и используются в фармацевтической промышленности в качестве антидепрессантов и профилактики сердечно-сосудистых и нервных заболеваний.

Однако, во-первых, многие фотосинтезирующие и производящие ВНЖК микроводоросли меньше оптимальных размеров (менее 5 мкм) для питания взрослых стадий каланоидных копепод. Во-вторых, планктонные циклопоидные копеподы, играющие роль в переходе на внешнее питание мелкоразмерных ранних пелагических личинок морских рыб, не потребляют некоторые микроводоросли, имеющие высокое содержание омега-3. В-третьих, некоторые технологически легко культивируемые нанопланктонные микроводоросли (например, p. Dunaliella) не содержат омега-3, и, соответственно, их нельзя использовать для культивирования копепод, или как источник ВНЖК для промышленности.

Гетеротрофные протесты оказываются промежуточным звеном между микроводорослями и копеподами, являясь важными консументами автотрофного фитопланктона различного размерного и таксономического состава, и в то же время оптимальным кормовым организмом для копепод, а, следовательно, - критическим звеном для направления питательных веществ от основы пелагической пищевой сети к более высоким трофическим уровням. Некоторые гетеротрофные протесты ассимилируют/переупаковывают питательные вещества из фитопланктона (включая нано- и пико- фракции) и повышают эффективность переноса углерода на границе между фитопланктоном и зоопланктоном. В результате усвоения и переработки ассимилированного фитопланктона гетеротрофные протесты могут накапливать незаменимые вещества, отсутствующие в потребляемых ими микроводорослях, которые могут быть использованы на более высоких трофических уровнях. Соответственно, копеподы, питающиеся гетеротрофными протестами, обеспечивают незаменимыми компонентами питающихся ими личинок морских рыб.

Гетеротрофные динофлагелляты Oxyrrhis marina (Dujardin, 1841) являются космополитами и с определенной периодичностью встречаются в прибрежных водах Черного моря (Сеничкина. 1983). Динофлагелляты О. marina могут периодически образовывать внезапные кратковременные «цветения», возникающие в разных прибрежных акваториях Мирового океана, которые связаны с быстрым ростом численности их популяций, достигающих концентрации 4.4 10⁵ кл мл^-1 в «пятнах цветения» (Бегун и др., 2014). Быстрое размножение этих динофлагеллят связано с их основным способом питания - фагоцитозом, в результате которого они могут поглощать нанопланктонные микроводоросли и другие пищевые частицы с максимальной избыточной скоростью потребления от 10 до 50 кл экз^-1 час^-1 (1.5 - 3.9 нг С экз^-1 сут^-1) в зависимости от их размерных характеристик (Ханайченко и др., 2023 подано в печ.).

Одна из особенностей гетеротрофных динофлагеллят Oxyrrhis marina состоит в том, что они могут накапливать в клетке стеролы (Chu et ah, 2008) и незаменимые ВНЖК (Parrish et al., 2013), отсутствующие в некоторых микроводорослях, в результате десатурации жирных кислот из потребляемых ими микроводорослей, или ре-синтеза de novo. Известно, что жирнокислотный состав О. marina, независимо от состава микроводорослей, которыми они питаются, остается практически неизменным, и содержание омега-3, в частности докозагексаеновой жирной кислоты (ДГК, 20:6n-3) составляет 30-43% от общего содержания жирных кислот, что значительно выше содержания ДГК у микроводорослей, которыми они питаются (Parrish et al., 2013).

Второе преимущество О. marina заключается в быстром усвоении материала микроводорослей, и, в результате, высокой скорости роста численности (превышающей скорость роста численности микроводорослей) и достижении высокой концентрации (не менее 5⋅10⁴ кл мл^-1) (Ханайченко и др., 2023 подано в печ.). Еще одним преимуществом О. marina является способность фагоцитировать/отфильтровывать/седиментировать практически любые планктонные взвеси, включая бактериальную взвесь или мелкие жгутиковые. Это позволяет использовать его в аквакультурной практике в бассейнах выращивания для редуцирования вспышек численности нежелательных микроорганизмов.

Известно, что О. marina в отличие от разных видов нанопланктонных микроводорослей, селективность к которым значимо отличается у разных видов копепод (Ханайченко и др., 2016), является универсальным кормом для морских планктонных копепод как каланоидных (Acartia tonsa), так и циклопоидных (Oithona davisae), которые активно потребляют О. marina, и в результате, получают необходимые для интенсивного воспроизводства количество и соотношение незаменимых эссенциальных компонентов пищи, таких как ВНЖК и стеролы. Таким образом, О. marina могут быть использованы для культивирования всех видов планктонных копепод, обеспечивая выход качественной продукции в условиях массового производства в марикультуре.

Известен способ культивирования О. marina на аксеничной органико-минеральной среде (Droop, 1959). Однако, во-первых, этот способ требует абсолютной стерильности, которую нереально поддерживать в условиях масового культивирования, а, во-вторых, высокая плотность О. marina не достижима.

Известен способ кормления О. marina культурами бактерий Eischerihia coli (Lowe et al., 2011), но он требует добавления нежелательных антибиотиков - смеси стрептомицина, пенициллина и гентамицина) для подавления роста нежелательных бактерий.

Известен способ накопительного культивирования гетеротрофных динофлагеллят (Patent, 2016 «Baits and simple culture method for sea Oxyrrhis marina», CN 201610070619.9A 2016-02-01 Application filed by Hebei Agricultural University2016-02-01 Priority to CN201610070619.9A 2016-07-06 Publication of CN105733952A), по которому О. marina помещают в 1 л колбы и при 2000-4000 люкс со световым периодом 10-12 час, при температуре 18-25°С, желтка 10-50 мг/л, и культивируют в течение 10 сут до приобретения культивационной суспензии молочно-розовато-опалесцирующего оттенка (обычно наблюдаемом при достижении окзирисом максимальной плотности при полном истощении пищи) до достижения плотности 1.5 - 5.5 × 10⁵ экз/л (то есть 1.5 - 5.5 × 10² экз/мл). Недостатками вышеприведенного метода накопительного культивирования О. marina является невозможность контроля обеспеченности динофлагеллят пищей, неконтролируемый биохимический состав и возможность бактериального загрязнения кормов. При этом известно, что качество пищи влияет как на уровень воспроизводства копепод, пригодных для кормления личинок рыб. При использовании данного способа культивирования конечная плотность культуры - невысока, и качество клеток О. marina - непредсказуемо, а также ее рост занимает слишком длительный период времени. При использовании этого метода в бассейны для выращивания личинок могут быть занесены патогенные микроорганизмы, влияющие на выживаемость личинок рыб.

В связи с недостаточной изученностью популяций О. marina в естественной среде, несмотря на их частое использование в качестве модельных объектов в морской экспериментальной биологии, методы их культивирования до настоящего времени не регламентированы. Однако, как в технологическом цикле выращивания копепод для ларвикультуры морских рыб, так и в фармацевтической промышленности можно успешно использовать морских гетеротрофных динофлагеллят, О. marina (Daday, 1888), для которых характерен широкий размерный и таксономический спектр объектов питания фагоцитозом при высокой скорости потребления пищевых частиц в оптимальных условиях, и ускоренное воспроизводство, максимальная скорость роста численности которых может варьировать в зависимости от трофических и температурных условий от 0.7 до 1.4 сут^-1, приводя к быстрому увеличению численности популяции, соответствуя 1-2 делениям клеток О. marina в сутки.

Задачей изобретения является разработка технологии культивирования морских гетеротрофных динофлагеллят О. marina

Технический результат от решения поставленной задачи заключается в том, что сочетание технических приемов позволяет выделять клетки О. marina из естественной среды, получать чистую линию лабораторной популяции гетеротрофных динофлагеллят, рекультивировать чистые маточные культуры О. marina, и, при необходимости, быстро активировать метаболизм гетеротрофных динофлагеллят, наращивать их массовую культуру, и производить длительную эксплуатацию массовой моновидовой популяции (культуры) гетеротрофных динофлагеллят О. marina в экспоненциальной фазе роста в полу-проточном режиме при ежесуточном получении урожая запрограммированной биомассы качественных живых клеток О. marina с высоким содержанием омега-3 и стеролов, а в отсутствии необходимости использования динофлагеллят сокращать популяцию О. marina до маточных культур и длительно содержать их искусственную популяцию (маточную культуру) в условиях пониженного метаболизма.

Заявленный технический результат достигается тем, что в Способе культивирования морских гетеротрофных динофлагеллят Oxyrrhis marina, выделяют клетки О. marina из природных резервуаров и осуществляют адаптацию к условиям культивирования. В процессе адаптации отбирают наиболее быстрорастущие клетки при культивировании в течение 7-14 сут с использованием стерильной морской воды, при исходной плотности О. marina 0.5 кл/мл, с кормлением один раз в течение 3 суток нанопланктонными микроводорослями при концентрации ~10⁴ кл/мл и постоянном освещении 500 лк, а затем рекультивируют культуру О. marina в условиях пониженного метаболизма при 15°С с минимальным освещением ~100-500 люкс, при кормлении 1-2 раза в месяц суспензией ~10⁴ кл/мл зеленых микроводорослей Tetraselmis или Dunaliella. Для получения массовой культуры гетеротрофных динофлагеллят О. marina их переводят в условия активации метаболизма клеток и стимуляции ускоренного деления путем повышения температуры до оптимальной 24±1°С и оптимизацией кормления микроводорослями Isochrysis galbana 10⁵ кл/мл и в течение 3 сут с постепенным увеличением объема культуры динофлагеллят от 20 мл до 200 мл при плотности клеток О. marina ~300 кл/мл и средней скорости роста численности популяции 1.4 сут^-1, затем в течение 5 суток при скорости роста численности 0.7-1.4 сут^-1 производят постепенное увеличение плотности клеток от 300 до ~40000 кл/мл при одновременном наращивании объема до 1000 мл, добавляя питательную суспензию клеток I.galbana в стерильной морской воде. Для перевода полученной маточной культуры в полупромышленную ежесуточно производят изъятие 0.5 объема интенсивной культуры О. marina, восполняя изъятие до полного объема суспензией стерильной морской воды с добавлением смеси микроводорослей TRP Tetraselmis+Rhodomonas+Phaeodactylum, а через сутки повторяют процедуру изъятия.

Отличительные признаки изобретения, совокупное осуществление которых позволяет достигнуть заявленный технический результат, включают:

- изолирование клеток Oxyrrhis marina из местного природного резервуара;

- очистка клеток О. marina в культуральных условиях от посторонних организмов;

- создание лабораторной популяции О. marina в условиях регулярного пересева в стерильных условиях с внесением чистых культур морских микроводорослей;

- постоянное содержание маточных культур О. marina в условиях пониженной скорости роста с периодическим пересевом культуры;

- создание комплексных условий для активации/стимуляции высокой скорости роста численности О. marina;

- наращивание объема накопительной культуры О. marina при постоянной плотности и скорости роста численности до эксплуатационного объема массовой культуры;

- эксплуатация определенного объема культуры О. marina в условиях полу-проточного культивирования, включающей ежесуточный отбор части объема культуры О. marina и последующее добавление равнозначного объема суспензии стерильной морской воды с добавлением определенной концентрации микроводорослей для поддержания экспоненциального роста;

- соблюдение стабильных стандартизованных условий длительного содержания динофлагеллят для поддержания жизнеспособности их популяции;

- перевод в условия пониженного метаболизма отвивок культуры О. marina по истечении срока ее эксплуатации и создание стандартных условий для длительного содержания живой культуры О. marina в условиях пониженного метаболизма.

Заявляемый способ соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень», т.к. впервые предложены оптимальные температурные, трофические и плотностные условия для синхронизации и стандартизации процессов продуцирования постоянной биомассы, стандарной скорости воспроизводства гетеротрофных динофлагеллят с эквивалентным сферическим диаметром (ESD)~23±3 мкм, с высоким содержанием омега-3. Заявленный способ соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. может быть осуществлен промышленным способом с использованием известного стандартного оборудования.

Способ поясняется описанием, рисунками, представленными на Фиг. 1 - Фиг. 4 и Таблицей 1:

Фиг. 1.1. Клетки Oxyrrhis marina из природной пробы.

Фиг. 1.2. Клетка Oxyrrhis marina и микроводорослей, которыми она питается в цикле 1.

Фиг. 2. Клетки Oxyrrhis marina с массой фагоцитированных клеток Isochrysis galbana в начале цикла 2.

Фиг. 3. Лабораторная популяция Oxyrrhis marina на промежуточном этапе накопительного культивирования (цикла 2) в 100 мл колбах с только что внесенным кормом - колбы слева направо: с микроводорослями Rhodomonas, Tetraselmis, Isochrysis

Фиг 4. Динамика численности (N, 10³ кл/мл) Oxyrrhis marina при культивирования в течение 4 сут при температуре 20±2°С: в отсутствие микроводорослей (Ох-Ох) и при единоразовом внесении разных нанопланктонных микроводорослей (Ph - Phaeodactylum tricornutum, Rh - Rhodomonas salina, PI - Platymonas viridis, Is - Isochrysis galbana)

Таблица 1. Параметры наращивания объема (от 200 до 1000 мл) культуры Oxyrrhis marina в накопительном режиме (цикл 2) и эксплуатации культуры в объеме 1000 мл в полу-проточном режиме (цикл 3).

Способ культивирования О. marina включает следующие циклы.

Цикл 1 (выделение клеток О. marina из природных резервуаров, проведение очистки и рекультивация маточной культуры О. marina).

Клетки О. marina, найденные и изъятые из пробы морской воды из прибрежных заплесковых водоемов, очищают от примесей, адаптируют к условиям культивирования в течение 2 суток, под микроскопом, в лунках Multidish, проверяют чистоту отобранных клеток со стерильной морской водой при исходной плотности О. marina 0.5 кл/мл, осуществляя их кормление (раз в 3 суток) нанопланктонными микроводорослями, при концентрации ~10⁴ мл и постоянном освещении 500 лк.

После 7-14 сут культивирования в лунках, отбирают отвивки наиболее быстро растущих клеток О. marina, и переносят ее для культивирвания в колбы 50 мл с суспезией микроводорослей в стерильной морской воде.

Затем полученные чистые отвивки О. marina рекультивируют в небольших объемах маточной культуры (несколько повторностей по 50 мл) с периодичностью пересева 1-2 раза в месяц до перехода к циклу производства биомассы О. marina.

Цикл 2: производство биомассы О. marina включает несколько этапов:

1) Переход к циклу производства биомассы О. marina - активация культуры;

2) Ускоренная «разгонка» - перевод от маточной культуры к массовому культивированию;

3) Интенсивное накопительное культивирование - наращивание объема культуры при поддержании постоянной максимальной плотности О. marina;

Конечный объем культуры для массового культивирования зависит от цели и рассчитывается согласно массы необходимой продукции в единицу времени, например, для одноразового получения биомассы клеток О. marina для экспериментальных работ, или для постоянного использования их в качестве сырья для получения определенной липидной фракции); или для длительного периода ежесуточного получения определенного количества клеток О. marina для кормления массовой культуры копепод.

4) При достижении необходимого объема культуры с соответствующей оптимальной плотностью гетеротрофных динофлагеллят, производят переход к Циклу 3.

Цикл 3. Эксплуатация полу-проточной культуры постоянного объема при ежесуточном изъятии определенного объема.

Трех-ступенчатый перевод культуры из маточной в полу-промышленный вариант

Пример реализации способа.

Цикл 1: выделение клеток О. marina из природных резервуаров, проведение очистки клеток от примесей, выявление быстрорастущих клеток и рекультивация маточной культуры О. marina.

1) Для получения культуры морских гетеротрофных динофлагеллят производили поиск возможных прибрежных временных водоемов, в которых могут обитать естественные популяции О. marina, отбирали из них и доставляли в лабораторию живые пробы. Живые клетки О. marina (Фиг. 1.1) были найдены в заплесковых временных водоемах на скальном берегу Гераклейского полуострова (Севастополь, Крым), характеризующихся частыми изменениями солености (4-25%) и температуры (15-29°С) в летнее время.

2) В день доставки в лабораторию производили просмотр живых проб под микроскопом, и, при обнаружении интактных клеток О. marina, каждую из них с помощью стекляной пипетки переносили в небольшое количество (~2 мл) стерилизованной морской воды и производили «проводку» выделенной клетки через не менее 7 смен стерильной морской воды для отделения от ненужных примесей в «живой капле».

3) Отмытые от примесей клетки О. marina помещали по-одиночке в стерильные лунки культурального планшета с 2 мл стерильной морской воды (т.е. 0.5 кл/мл) и добавляли 2 раза в неделю зеленые нанопланктонные микроводоросли {Tetraselmis или Dunaliella, выращенные на среде Уолна в условиях постоянного освещения 500 лк и температуре ~20°С) до концентрации 10⁴ кл/мл.

4) В течение двух недель пересевов при содержании в стандартных условиях (3) выбирали самые быстрорастущие отвивки, полученные от «диких» клеток О. marina (Фиг. 1.2) и использовали его для инициации маточных культур.

5) Отвивки (по 1 мл) О. marina инокулировали в стерильные стеклянные колбы (20 мл среды в 50 мл колбах) с суспензией разных нанопланктонных микроводорослей (Фиг. 2) из экспоненциальных культур и стерильной морской воды (соленость 18%) и содержали в условиях освещения 1000 лк (12 час день: 12 час ночь) при температуре 21±1°С) при концентрации 10⁴-10⁵ кл/мл, проверяли скорость роста численности популяции О. marina на разных микроводорослях (Фиг. 3), и в течение 2 недель проверяли на чистоту культуры в живых каплях-аликвотах, отобранных из культуральных емкостей.

6) Отвивки О. marina в нескольких (3-5) повторностях рекультивировали в течение длительного времени в небольших объемах маточной культуры (по 20 мл в 50 мл колбах) в условиях пониженного метаболизма при 15°С с минимальным освещением (~100-500 люкс), при кормлении 1-2 раза в месяц суспензией ~ 10⁴ кл/мл зеленых микроводорослей (например, Tetraselmis или Dunaliella) при небольшой скорости роста численности популяции с периодичностью пересева (переноса в новую стерильную колбы), сопровождаемого контролем чистоты отвивок культуры под микросокпом, 1-2 раза в месяц до перехода к циклу 2.

Для получения массовой культуры гетеротрофных динофлагеллят О. marina производили их накопительное культивирование (наращивание от начальной до максимальной плотности в разбавляемой по мере нарастания численности их популяции среде с ежедневным внесением корма.

Цикл 2 («разгонка» популяции О. marina - интенсивное накопительное культивирование - наращивание объема культуры при поддержании роста численности клеток в экспоненциальной фазе роста популяции).

1) Ускоренную «разгонку» - быстрый переход от маточной культуры (20 мл к массовому культивированию производили в результате перевода искусственной популяции динофлагеллят в условия активации метаболизма их клеток и стимуляции их ускоренного деления путем повышения температуры до оптимальной 24±1° и оптимизации кормления микроводорослями Isochrysis galbana 10⁵ кл/мл;

2) В вышеуказанных условиях повышенного метаболизма О. marina (Фиг. 2) в течение 3 сут производили постепенное увеличение объема культуры динофлагеллят от 20 мл до 200 мл (Фиг. 3) при поддержании относительно постоянной плотности клеток О. marina (~ 300 кл/мл) и средней скорости роста численности популяции 1.4 сут^-1.

3) При достижении объема культуры О. marina 200 мл в течение 5 суток при скорости роста численности 0.7-1.4 сут^-1 производили постепенное увеличение плотности клеток (от 300 до ~ 40000 кл/мл) при одновременном наращивании объема до 1000 мл за счет добавления питательной суспензии клеток Isochrysis galbana в стерильной морской (Табл. 1, цикл 2, 1-5 сутки);

4) При достижении плотности клеток О. marina (>4000 кл/мл) в объеме 1000 мл (Табл. 1, 6 сутки) переходили к циклу 3.

Цикл 3 - Эксплуатация массовой культуры О. marina в конечном объеме культиватора в полу-проточном режиме.

1) После достижения культуры О. marina в объеме массовой эксплуатации, в нашем конкретном случае, 1000 мл (1 л), и достижением популяции в данном объеме плотности клеток >40000 кл/мл (Табл. 1, цикл 3, сутки 6, выделено красным шрифтом), начинали полу-проточное культивирование динофлагеллят при ежедневном сборе части популяции для кормления копепод с ежедневной подменой данного объема свежей средой и внесением корма, и повторяя эту процедуру через сутки (Табл. 1, цикл 3).

2) Ежесуточно производили изъятие половины объема интенсивной культуры О. marina (~0.5 объема -500 мл, Табл. 1, цикл 3, с 6 сут - выделено желтым цветом), в котором содержалось ~ 20 млн. клеток динофлагеллят.

3) Ежедневно после изъятия 0.5 части объема культуры О. marina, ее восполняли 500 мл суспензии стерильной морской воды с добавлением смеси микроводорослей TRP (Tetraselmis+Rhodomonas+Phaeodactylum) при их совокупной биомассе ~ 10 С/мл, доводя объем до 1000 мл (Табл. 1, цикл 3, с 6 сут - выделено голубым цветом)

4) Через сутки в объеме 1000 мл плотность клеток О. marina нарастала до ~ 4000 кл/мл (Табл. 1, цикл 3, 7 сут, выделено красным шрифтом), и процедуру цикла 3 (см. пункты 1-3) повторяли (Табл. 1, цикл 3, 7 сут, изъятие выделено желтым цветом, зеленым выделен оставшийся объем культуры, а голубым цветом - объем культуры после разбавления суспензией с микроводорослями).

5) Эксплуатацию массовой культуры врежиме цикла 3 производили в течение необходимомго срока культивирования массовой культуры копепод, после которого экспериментальную популяцию переводили в режим маточной культуры (см. цикл 1, пункт 6).

Культивируемые авторами изобретения гетеротрофные динофлагелляты О. marina, выведенные авторами изобретения из природного резервуара, применяли в качестве кормовых организмов в течение длительного периода при искусственном массовом выращивании морских и солоноватоводных копепод в отделе марикультуры и морской фармакологии, в экспериментальных работах по экофизиологии и биологии морских копепод (Svetlichny et al, 2016), а также при изучении структуры морских трофических сетей с включением микропластика (Rauen et al., 2023), проводимых в Институте биологии южных морей, и, в дальнейшем, будут использованы неоднократно.

Размеры Oxyrrhis marina варьируют в зависимости от режима культивирования, и при оптимальном культивировании их жирнокислотный состав с содержанием в клетках высоконенасыщенных жирных кислот ДГК (22:6n-3) не менее 30% и ЭПК ~2-4% (Parrish et al., 2012) полностью удовлетворяют потребностям морских копепод.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Бегун А.А. Случай «цветения» воды, вызванный динофитовой водорослью Oxyrrhis marina / А.А. Бегун, Т.Ю. Орлова, М.С. Селина // Биол. моря. 2004. Т. 30, №1. С. 68-71.

2. Сеничкина Л.Г. Фитопланктон северо-западной части Черного моря в зимний период моря / Сезонные изменения черноморского планктона. - М: Наука, 1983. С. 55-65.

3. Ханайченко А.Н., Аганесова Л.О., Муханов B.C., Сахонь Е.Г., Рауэн Т.В. Селективность питания копепод разных экологических групп микроводорослями // Морские биологические исследования: достижения и перспективы: Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференция с международным участием, приуроченной к 145-летию Севастопольской биологической станции (Севастополь, 19-24 сентября 2016 г. ). Т. 1. Севастополь: ЭКОСИ-Гидрофизика, 2016. С.323-326.

4. Chu FL, Lund ED, Littreal PR, Ruck KE, Harvey E, Le Coz JR, Marty Y, Moal J, Soudant P. Sterol production and phytosterol bioconversion in two species of heterotrophic protists, Oxyrrhis marina and Gyrodinium dominans. Marine biology. 2008 Dec; 156(2): 155-69.

5. Droop, M.R. 1959. Water-soluble factors in the nutrition of Oxyrrhis marina. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 38(3), 605-620

6. Lowe CD, Martin LE, Roberts EC, Watts PC, Wootton EC, Montagnes DJ. Collection, isolation and culturing strategies for Oxyrrhis marina. Journal of Plankton Research. 2011 Apr 1; 33(4):569-78.

7. Parrish CC, French VM, Whiticar MJ. Lipid class and fatty acid composition of copepods (Calanus finmarchicus, C. glacialis, Pseudocalanus sp., Tisbe furcata and Nitokra lacustris) fed various combinations of autotrophic and heterotrophic protists. Journal of Plankton Research. 2012 May 1; 34(5):356-75).

8. Patent CN105733952A "Baits and simple culture method for sea Oxyrrhis marina" // Application CN201610070619.9A events 2016-02-01 Application filed by Hebei Agricultural University 2016-02-01 Priority to CN201610070619.9A 2016-07-06 Publication of CN105733952A

9. Rauen Т.V., Mukhanov, V.S., Aganesova, L. O.2023. Ingestion of microplastics by the heterotrophic dinoflagellate Oxyrrhis marina // Marine Biological Journal (in print).

10. Svetlichny, L., Hubareva, E., Khanaychenko, A., Gubanova, A., Altukhov, D., & Besiktepe, S. (2016). Adaptive strategy of thermophilic Oithona davisae in the cold Black Sea environment. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 16(1), 077-090.

11. Jeong HJ, Kim JS, Yoo YD, Kim ST, Kim TH, Park MG, Lee CH, Seong KA, Rang NS, Shim JH. Feeding by the heterotrophic dinoflagellate Oxyrrhis marina on the red-tide raphidophyte Heterosigma akashiwo: a potential biological method to control red tides using mass-cultured grazers. Journal of eukaryotic microbiology. 2003 Jul; 50(4):274-82.

Claims (1)

1. Способ культивирования морских гетеротрофных динофлагеллят Oxyrrhis marina, включающий выделение клеток О. marina из природных резервуаров, адаптацию к условиям культивирования, отличающийся тем, что отбирают наиболее быстрорастущие клетки при культивировании в течение 7-14 суток с использованием стерильной морской воды, при исходной плотности О. marina 0,5 кл/мл, с кормлением один раз в течение 3 суток нанопланктонными микроводорослями при концентрации ~10⁴ кл/мл и постоянном освещении 500 лк, а затем рекультивируют О. marina в условиях пониженного метаболизма при 15°C с минимальным освещением ~100-500 люкс, при кормлении 1-2 раза в месяц суспензией ~10⁴ кл/мл зеленых микроводорослей Tetraselmis или Dunaliella, а для получения массовой культуры гетеротрофных динофлагеллят О. marina их переводят в условия активации метаболизма клеток и стимуляции ускоренного деления, путем повышения температуры до оптимальной 24±1°С и оптимизацией кормления микроводорослями Isochrysis galbana 10⁵ кл/мл, и в течение 3 суток с постепенным увеличением объема культуры динофлагеллят от 20 мл до 200 мл при плотности клеток О. marina ~300 кл/мл и средней скорости роста численности популяции 1,4 сут^-1, затем в течение 5 суток при скорости роста численности 0,7-1,4 сут^-1 производят постепенное увеличение плотности клеток от 300 до ~ 40000 кл/мл при одновременном наращивании объема до 1000 мл, добавляя питательную суспензию клеток I.galbana в стерильной морской воде, и для перевода полученной маточной культуры в полу-промышленную ежесуточно производят изъятие 0.5 объема интенсивной культуры О. marina, восполняя изъятие до полного объема суспензией стерильной морской воды с добавлением смеси микроводорослей Tetraselmis+Rhodomonas+Phaeodactylum, а через сутки повторяют процедуру изъятия.