KR20140019288A

KR20140019288A - 섬광 형태로 빛의 불연속적인 공급하의 혼합영양 단세포 조류의 배양 방법

Info

Publication number: KR20140019288A
Application number: KR1020137009344A
Authority: KR
Inventors: 피에르 카레자
Original assignee: 페르망탈그
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2014-02-14
Also published as: BR112013006153A2; EP2616536A1; IL225216A0; EP2616536B1; CN103249831B; CA2811270A1; ES2653964T3; DK2616536T3; FR2964667B1; WO2012035262A1; AU2011303696B2; CN103249831A; FR2964667A1; AU2011303696A1; US20130171702A1

Abstract

본 발명은 조류의 지질 함량의 강화를 가능하게 하는 혼합영양 단세포 조류의 새로운 배양 방법에 관한 것으로, 상기 강화는 특히 섬광 형태의 빛의 가변적이거나 불연속적인 제공에 의해 유발된다.

Description

섬광 형태로 빛의 불연속적인 공급하의 혼합영양 단세포 조류의 배양 방법{METHOD FOR CULTURING MIXOTROPHIC SINGLE-CELL ALGAE IN THE PRESENCE OF A DISCONTINUOUS PROVISION OF LIGHT IN THE FORM OF FLASHES}

본 발명은 혼합영양 조건하에서 단세포 조류(미세조류)를 배양하기 위한 새로운 방법, 특히 이러한 조류의 지질 함량의 강화를 가능하게 하는 것에 관한 것이다.

이러한 방법은 배양 배지에 시간에 따라 가변적이거나 불연속적인 빛의 공급에 기초하며, 상기 공급은 조류의 지질 함량 및 배양물의 수득률 증가를 유발한다.

단세포 조류는 현재 그들의 보조식품으로서의 직접적인 용도 또는 녹색화학의 원료로서의 간접적인 용도를 목적으로 하는 수많은 산업적 프로젝트의 대상이다.

이러한 미세조류에서 얻은 지질은 그것이 우수한 영양 특성이 있기 때문에 특히 수요가 있다. 구체적으로, 그것은 특히 모유를 대신하는 제제에 사용되는 EPA 및 DHA와 같은 필수 장쇄 다가불포화 지방산(PUFA)을 함유한다. 수경재배에서, 미세조류는 어유 및 어분을 대신하는 역할을 한다.

유리한 조건 하에서 미세조류는 지방산에서 그것의 건조 중량의 최대 80 %까지 축적할 수 있음에 기초하여, 후자는 바이오연료의 생산을 위한 기름 함유 육생식물 재배의 믿을 만한 대안을 제공한다(문헌 [Li, Y. et al., 2008 Biotechnol . Prog., 24: 815-820]).

단세포 조류는 독립영양 특징의 광합성 미생물이다, 즉 그것은 광합성에 의해 독자적으로 자라는 역량이 있다.

민물에서 또는 바다에서 접하게 되는 단세포 조류의 대부분의 종은 엄격하게는 독립영양체이다, 즉 광합성에 의하지 않고서는 자랄 수 없다. 후자에 의할 때, 그것의 환경에서 탄소-함유 기질 또는 유기 물질의 존재는 그것에게 유리하지 않고, 심지어 그것의 성장을 저해하는 경향도 있다.

그러나 매우 다양한 족 및 기원의 단세포 조류의 특정수의 종은 엄격하게는 독립영양체는 아니라는 것을 발견했다. 종속영양생물이라 불리는, 이들 중 일부는 발효에 의해, 즉 유기 물질을 이용하여 빛의 완전한 부재에서 자랄 수 있다.

성장을 위해 필수적으로 광합성을 해야 하는 조류의 다른 종은 그들의 환경 속에 있는 유기 물질 및 광합성 둘 다 사용할 수 있다. 혼합영양체라 불리는 이러한 중간 종을 빛이 있을 때와 유기 물질이 있을 때 모두 배양할 수 있다.

소위 "혼합영양" 조류의 이러한 특별한 특징은 그들이 광합성 및 발효를 동시에 진행할 수 있게 하는 그의 대사와 관계가 있는 것으로 보인다. 대사의 이 두 유형은 조류의 성장에 전체적으로 긍정적인 영향과 공존한다(문헌 [Yang C. et al. (2000) Biochemical Engineering Journal 6: 87-102]).

현재, 조류의 분류는 대체로 형태학적 기준 및 그것이 함유한 광합성 색소의 본질에 여전히 기초한다. 조류가 매우 많은 다양성의 종 및 형태를 포괄하는 반면에, 이러한 분류는 독립영양, 종속영양 또는 혼합영양 특성에 관해 거의 정보를 주지 못한다(문헌 [Dubinsky et al. 2010, Hydrobiologia , 639: 153-171]).

그러므로 글루코스, 아세테이트 또는 글리세롤과 같은 탄소-함유 기질을 첨가한 무기질 배지에서 광합성으로 성장하는 능력을 갖추고 있음이 실험적으로 증명된다면, 그 균주는 혼합영양체인 것으로 생각된다. 탄소-함유 기질의 이러한 보충물이 빛을 비추는 시기 동안에 성장 저해를 일으키지 않는다면, 그 균주는 혼합영양체인 것으로 생각된다.

특정 종의 조류의 경우에, 혼합영양 조건하에서 자랄 수 있는 것은 이론상 배양시에 세포의 생물량 및 지질의 생산에 대해 더 높은 수득률을 달성할 수 있게 함에도 불구하고(문헌 [Ceron Garcia M.C. et al. 2000, Journal of Applied Phycology, 13: 239-248]), 이러한 수준의 수득률은 매우 드물게 얻어진다.

사실, 최적의 수득률을 얻기 위해 배양 배지에 첨가되는 빛의 양 대 탄소-함유 기질의 양 비율의 관리는, 특히 상업적으로 유용한 지질량의 생산에 관해서 여전히 결정하기 어렵다(문헌 [Lee Y.K. et al. 2001, Journal of Applied Phycology, 13: 307-315]).

그러므로 생물량의 높은 수준 및 지질의 높은 농도를 제공하는 생산 조건을 얻기 위해 혼합영양 미세조류를 위한 기존의 배양 기술을 여전히 향상시킬 필요가 있다.

미세조류의 각각 다른 종에서 수행된 연구는 빛의 세기가 혼합영양 방식에서 수행된 배양의 정량적 및 정성적 수득률에 직접 영향을 준다는 것을 밝혀냈다.

따라서 독립영양 방식에서 사용된 것과 같은 빛의 세기는 일반적으로 혼합영양 방식에서 조류가 성장하기에는 너무 세다. 이러한 광-저해 현상 때문에, 더 높은 수득률을 얻기 위해 빛의 세기를 감소하는 것이 보통 바람직하다(문헌 [Liang Y. et al., 2009, Biotechnol . Lett., 31: 1043-1049; Chojnacka, K. et al., 2004, Enzyme and Microbial Technology, 34: 461-465; Bouarab L. et al., 2004, Water Research, 38: 2706-2712; Jeon Y.C. et al. 2006, Enzyme and Microbial Technology, 39: 490-495]).

산업적 규모의 조류는 보통 야외에서, 즉 자연조명으로 배양하기 때문에, 혼합영양 방식으로의 배양을 위한 최적의 조건을 결정하기 위해 수행된 실험을 일반적으로 연속적인 조명 상태로 수행한다. 특정 경우에, 매일 조명 상태가 암흑 상태와 번갈아가며 나타나게 하여(광주기), 이리하여 낮과 밤을 재생산한다. 그러나 선행기술에서는 배양에 공급되는 빛의 세기의 반복되는 교대 또는 시간에 따른 상당한 변화에 관해 언급하고 있지 않다.

각각 몇 시간의 독립영양 방식(조명) 및 종속영양 방식(암흑 속)에서, 배양 상태를 교대시켜 배양한 이전 실험은 배양의 최적화에 관해 실망스러움을 입증하였는데, 왜냐하면 조류가 배양 조건의 변화에 대한 적응을 필요로 하기 때문이다. 배양의 수득률 하락에 기여하는, 소위 광-활성화 현상과 관계가 있는 지체 시간은 각 사이클의 시작에서 관찰된다(문헌 [Ogbonna J.C. et al., 1997, Journal of Applied Phycology 9: 359-366]).

이것은 의심할 여지 없이 혼합영양 방식에서 조류 배양의 최적화를 위한 다양한 연구의 저자가 조명 및 암흑 상태의 교대가 배양물의 수득률에 유리한 영향을 줄 수 있다는 것을 고려하지 않은 이유이다.

놀랍게도, 이와는 반대로 본 발명자는 불연속적인 빛의 공급이 혼합영양 방식에서 수행된 배양물의 수득률에 유해하지 않음을 발견했다. 구체적으로, 암흑 상태 및 조명 상태의 빠른 교대(섬광)에 의하거나 시간에 따라 빛의 세기의 변동을 일으키면서, 빛의 세기를 변화시킴으로써, 생물량에 관한 배양물의 수득률에 및 더 구체적으로는 세포의 지질 함량에 긍정적으로 작용할 수 있음을 관찰했다.

이러한 관찰에 기초하여, 본 발명자는 한편으로는 생물량 증가의 달성을, 다른 한편으로는 조류의 지질 함량의 강화를 가능하게 하는 혼합영양 조류의 배양 방법을 발견했다. 이 방법은 시간에 따라 가변적이거나 불연속적인 빛 공급에 기초한다.

본 출원의 대상인, 이 방법은 혼합영양 단세포 조류의 수많은 종에 대해 일반화될 수 있는 것으로 보인다.

본 발명의 다양한 측면 및 장점은 아래에 기술되어 있다.

도 1 : 본 발명(Δ)에 따라 섬광 형태로 공급된 빛이 있는 혼합영양 방식으로 및 독립영양 방식(◆)으로, 즉 연속적인 빛에서 각각 수행된 테트라셀미스(Tetraselmis) 배양물의 생물량 비교 그래프.
도 2 : 본 발명(X)에 따라 섬광 형태로 공급된 빛이 있는 혼합영양 방식으로 및 독립영양 방식(□)으로 각각 배양된 테트라셀미스 세포의 지질 함량 비교 그래프.

따라서 본 발명은 단세포 조류의 생물량 증가 및 그것의 지질 함량 강화를 가능하게 하는 그의 배양 방법에 관한 것이다.

이 방법은 또한 혼합영양 방식에서 지질의 생산에 특히 적합한 미세조류의 균주 선택을 가능하게 한다.

이 방법은 배양에서 조류에 공급된 광속이 시간에 따라 가변적이거나 불연속적인 것을 특징으로 한다.

사회 통념과 대조적으로, 특히 혼합영양 방식에서, 배양의 가변적이거나 불연속적인 조명은 조류의 성장에 유리한 효과가 있고 후자에 의해 지질의 생산의 증가를 가능하게 한다는 것을 발견하였다.

이론에 의해 구속받지 않고, 본 발명자는 빛의 불연속적이거나 가변적인 공급은 조류에서 지질의 합성에 유리한 스트레스 유발 효과가 있는 것으로 생각한다. 사실, 조류가 환경 스트레스를 견딜 수 있으려고 지질 비축물을 축적하는 것이 종종 자연에서 일어난다.

"불연속적인 조명"은 암흑 주기에 의해 간간이 중단된 조명을 의미한다. 암흑 주기는 조류가 배양되는 동안, 그 시간의 4분의 1보다 더 많은, 바람직하게는 그 시간의 절반 이상을 차지할 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 섬광 형태로, 즉 짧은 지속 주기로 불연속적인 조명을 공급한다. 따라서 연속적인 조명 상태는 일반적으로는 5초 내지 10분 사이, 바람직하게는 10초 내지 2분 사이, 더 바람직하게는 20초 내지 1분 사이이다.

"가변적인 조명"은 주기적으로 또는 비-주기적으로, 시간에 따라 빛의 세기를 의도적으로 변화시킨 빛의 공급을 의미한다.

본 발명에 따르면, 조명은 연속적으로 변화할 수 있다, 즉 빛의 세기가 일정하지 않고 시간에 따라 계속 변한다(dμ몰(광자)/dt ≠ 0).

본 발명에 따르면, 연속적이고 불연속적인 조명 상태를 조합한 빛의 공급을 사용하는 것도 가능하다.

특히, 본 발명은 상기 조류를, 시간에 따라 가변적이거나 불연속적인 빛 공급과 함께 암흑에서 배양하며, 그 세기가 광자의 마이크로몰 단위에서, 시간당 여러 번의 속도로 10 μ몰. m^-2. s^-1이상의 진폭으로 변하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법에 관한 것이다.

이러한 조명의 불연속적인 또는 가변적인 다양한 방식이 공통으로 가지는 것은, 본 발명에 따르면, 배양에서 조류에 공급된 제곱미터당 초당 광자의 마이크로몰(μ몰. m^-2. s^-1)로 표현되는 빛의 세기가 일반적으로는 8 μ몰. m^-2. s^-1초과, 바람직하게는 10 μ몰. m^-2. s^-1이상, 더 바람직하게는 15 μ몰. m^-2. s^-1이상의 진폭으로 단지 한 시간 내에 여러 번 변한다는 것이다. 다시 말해서, 빛의 세기는 매시간, 바람직하게는 한 시간에 여러 번 최고값과 최저값에 도달하며, 그 차이는 앞서 언급한 것 이상이다. 바람직하게는, 상기 빛의 세기는 매시간 잇따라서 다음 값에 도달한다(즉, 이 값를 거친다): 2 μ몰. m^-2. s^-1 및 10 μ몰. m^-2. s^-1, 더 바람직하게는 0 μ몰. m^-2. s^-1 및 50 μ몰. m^-2. s^-1인 값, 더욱더 바람직하게는 0 및 20 μ몰. m^-2. s^-1인 값.

1 μ몰. m^-2. s^-1은 본 출원의 실시예에서 사용된 단위인 1 μE m^-2. s^-1(아인슈타인)과 일치함을 주의해야 한다.

본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 빛의 세기는 0 내지 20 μ몰. m^-2. s^-1사이, 바람직하게는 0 내지 50 μ몰. m^-2. s^-1사이에서 변한다.

배양에 빛의 공급은 발효조의 외벽 둘레에 분포된 램프로 제공될 수 있다. 클록(clock)이 정해진 조명 시간 동안에 이들 램프를 켠다. 발효조를 챔버의 실온을 제어할 수 있는, 햇빛으로부터 차단된 챔버에 위치시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법은 더 구체적으로는 혼합영양 조건하에서 성장 가능한 단세포 조류에 적용한다.

본 출원의 서두에서 지적한 바와 같이, 혼합영양 방식에서 조류의 배양을 탄소-함유 기질이 강화된 배양 배지에서 독립영양 방식으로 수행된 배양으로 정한다.

바람직하게는, 상기 탄소-함유 기질은 아세테이트, 글루코스, 셀룰로오스, 녹말, 락토스, 사카로스 또는 글리세롤을 포함하거나, 또는 이들로 이루어진다.

본 발명의 취지에서, 조류의 종은, 예를 들어 5 mM 이상의 글리세롤 또는 아세테이트인 탄소의 농도 비율로 탄소-함유 기질이 첨가된 최소 배지(예를 들면 MM 또는 f/2)에서, 성장 저해가 관찰되지 않으면서, 즉, 탄소-함유 기질이 결핍된 동일한 최소 배지에서(즉, 독립영양 방식으로) 수행된 배양에 비해 건조물에서의 생물량 손실 발견이 없으면서, 빛에서 배양될 수 있는 한, 혼합영양체로 여겨진다.

본 발명의 목적을 위해, 생산한 에너지의 적어도 25 %, 바람직하게는 적어도 50 %를 상기 탄소-함유 기질의 사용으로 얻는 혼합영양 미세조류가 사용하기에 바람직하다.

배양 배지는 조류의 성장 저해를 피하기 위해, 발효하기에 충분하지만 너무 높지는 않은 탄소-함유 기질의 양을 함유해야 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 배양 배지는 10 g/L 미만, 바람직하게는 4 내지 6 g/L 사이의 이용 가능한 글루코스 농도를 포함한다.

본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 탄소-함유 기질은 아세테이트, 바람직하게는 아세트산 나트륨을 포함하고, 배양 배지에서 그것의 농도는 일반적으로 5 mM 내지 50 mM 사이, 바람직하게는 15 내지 25 mM 사이에 포함된다.

유리하게는, 혼합영양 조류의 종은 다음의 강(class) 중에서 선택된다: 유글레나조강(Euglenophyceae), 담녹조강(Prasinophyceae), 진암점조강(Eustigmatophyceae), 규조강(Bacillariophyceae), 후각편모조강(Prymnesiophyceae), 핀귀오조강(Pinguiophyceae), 와편모조강(Dinophyceae), 트레복시조강(Trebouxiophyceae), 비코소엑조강(Bicosoecophyceae), 카타블레파리조강(Katablephariophyceae), 녹조식물강(Chlorophyceae), 착편모조강(Haptophyceae), 침편모조강(Raphidophyceae), 키소조강(Chysophyceae), 체돌말강(Coscinodiscophyceae), 알베올라타상문(Alveolata), 원시홍조강(Bangiophyceae), 홍조강(Rhodophyceae), 특히 지질-생산 균주 및 바람직하게는 독립영양 방식에서 적어도 5 %의 지질을 생산하는 균주.

담녹조강에 속하는 미세조류는 바람직하게는 테트라셀미스 속(genus)의 것이다.

예를 들면 섬광 형태로 공급된 빛이 있는 혼합영양 조건하에서 본 발명에 따른 배양 방법을 수행하며, 바람직하게는 시간당 20 내지 30번 사이의 섬광이고, 그것의 세기는 일반적으로 5 내지 50 μ몰. m^-2. s^-1사이, 바람직하게는 5 내지 15 μ몰. m^-2. s^-1사이에 포함된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 글루코스 또는 아세트산 나트륨 및 칼슘을 포함하는 배양 배지에 약 10 μ몰. m^-2. s^-1의 세기로 시간당 30초의 섬광을 30번 적용한다.

배양 배지는 칼륨, 마그네슘, 미량원소 및 비타민과 같은 다른 원소를 함유할 수 있다.

바람직한 실시태양은 공급형-배치 배양(fed-batch culture) 기술 사용으로 이루어지며, 이것은 생물량의 증가를 촉진하면서, 비-억제 농도로 탄소-함유 기질 유지를 가능하게 한다.

바람직하게는, 배양 배지에 사용된 글루코스는 D-글루코스 또는 덱스트로스, 특히 녹말, 예를 들면 옥수수, 밀 또는 감자의 생변환으로 얻은 덱스트로스이다. 녹말 가수분해물은 생물량의 더 좋은 성장을 제공하는, 조류에 의해 쉽게 동화될 수 있는 작은 크기의 분자로 이루어진다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 균주의 성장은 배양 배지 안의 높은 농도의 칼슘, 즉, 80 mg/L 초과, 바람직하게는 120 내지 190 mg/L 사이의 칼슘 존재에 의존한다.

구체적으로 적합한 실시태양에 따르면, 배양 배지는 3 내지 10 g/L 사이의 글루코스 및 100 내지 200 g/L 사이의 칼슘을 포함한다.

유리하게는, 이러한 배지는 약 18시간의 지체 시간 및 3 내지 4시간 사이의 세대 기간을 얻는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 배양 방법은 조류의 좋은 성장을 하게 하는 평균 온도, 바람직하게는 4 내지 32 ℃에서 수행되어야 한다.

이러한 조건하에서는, 40시간 미만으로 배양 시간 단축이 관찰되고, 지체 시간 및 세대 기간이 매우 짧다.

본 발명의 방법에 따라 얻어진 조류는, 단백질 및 다가불포화 지방산(예를 들면 EPA 및 DHA)이 잠재적으로 풍부하기 때문에, 음식 재료와 같은 것, 특히 동물 사료로 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 앞서 정해진 배양 방법은 또한 지질의 생산도 가능하게 한다.

지질 생산을 위한 이러한 방법은 하나 이상의 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:

ⅰ) 상기 기술된 방법에 따라 단세포 조류를 배양하는 단계,

ⅱ) 단계 ⅰ)에서 배양된 단세포 조류를 회수하는 단계, 및

ⅲ) 단계 ⅱ)에서 회수된 조류의 세포 내 함유물로부터 지질을 추출하는 단계.

지질은 세포 용해에 의해 추출되고, 당업자에게 알려진 기술에 따라 분별될 수 있다.

따라서 얻어진 지질은 다가불포화 지방산의 형태로, 특히 어유의 대체와 같은 보조 식품으로 또는 트리글리세리드의 형태로, 예를 들어 바이오연료 생산을 위해, 다양한 응용에 사용될 수 있다.

아래 주어진 실시예는 본 발명의 예증 목적일 뿐 이것에 제한되지 않는다.

실시예

Ⅰ- 테트라셀미스 속의 혼합영양 균주의 스크리닝

1 - 균주:

국제 배양 기탁 기구인 CCAP(스코틀랜드), SAG(독일), CCMP(미국) 및 CSIRO(호주)에서 테트라셀미스 속(n=78)의 균주를 주문했다.

2 - 배양액:

민물 조류를, 액체 최소 배지 MM[베이저링크(Beijerink) 용액 50 mL/L(NH₄Cl 8 g/L, CaCl₂ 1 g/L, MgSO₄ 2 g/L), 포스페이트 완충액 1 mL/L(K₂HPO₄ 106　g/L, KH₂PO₄ 53　g/L), 미량원소 용액 1 mL/L(BO₃H₃ 11.4　g/L, ZnSO₄ 7H₂O 22　g/L, MnCl₂ 4H₂O 5.06　g/L, FeSO₄ 7H₂O 4.99　g/L, CoCl₂ 6H₂O 1.61　g/L, CuSO₄ 5H₂O 1.57　g/L, Mo₇O₂₄(NH₄)₆ 4H₂O 1.1　g/L, EDTA 50 g/L), 트리즈마(Trizma) 염기 2.42 g/L, HCl로 조정된 pH 7.2 내지 7.4, 비타민 B₁ 1.2 mg/L 및 비타민 B₁₂ 0.01　mg/L(즉석으로 첨가됨)] 및 고체 배지 MM(+1.5 % 아가)에서 독립영양 조건하 배양한다.

먼저, 해양 미세조류를 재구성된 해수 또는 액체 배지 f/2[NaNO₃ 0.64　g/L, KCl 0.74　g/L, NaCl 또는 트로픽(Tropic) 해수염 26 g/L, CaCl₂ 1 g/L, MgSO₄ 7H₂O 1.92　g/L, NaH₂PO₄ 2H₂O 50　mg/L, 미량원소 용액 1　mL/L(Na₂EDTA 2H₂O 4.36　g/L, FeCl₃ 6H₂O 5.82　g/L, MnCl₂ 4H₂O 2.46　g/L, ZnSO₄ 7H₂O 34.5　mg/L, CoCl₂ 6H₂O 12　mg/L, CuSO₄ 5H₂O 9.8　mg/L, Na₂MoO₄ 2H₂O 2.2　mg/L), HCl로 조정된 pH 7.2 내지 7.4, 비타민 B₁ 0.1　mg/L, 비타민 B₈ 0.6　mg/L 및 비타민 B₁₂ 0.6　mg/L(즉석으로 첨가됨)] 및 고체 배지 f/2(+1.2 % 아가)에서 독립영양 조건하 배양한다.

혼합영양 조건 및 종속영양 조건하에서 미세조류의 배양을 다음 탄소-함유 기질: 아세테이트 5　mM, 글루코스 5　g/L, 락토스 10　g/L, 사카로스 10　g/L 및 글리세롤 5　g/L 각각의 첨가가 있는 배지 MM 또는 f/2에서 수행했다.

3 - 24- 및 96-웰 마이크로플레이트에서 액체 배지 내의 균주 성장의 고-처리량 스크리닝:

테트라셀미스 균주의 종속영양 및 혼합영양 특징을 기체-투과성 필름으로 밀봉한, 24-웰(V=2　mL) 또는 96-웰(V=1　mL) 마이크로플레이트내의 탄소-함유 기질이 존재하는 배지 MM(민물 균주) 또는 f/2(해수 균주)에서 미세조류 균주를 수용하는 즉시 배양하여 평가했다. 독립영양 조건(MM 또는 f/2)에서의 성장을 체계적으로 모니터링하여 혼합영양 및 종속영양 조건하의 배양물에 대한 참고로 사용하였다.

마이크로플레이트를 독립영양 및 혼합영양 조건하의 배양을 위해 22 ℃, 60 % 습도 및 10 μE 빛의 세기인 인큐베이션 챔버(incubation chamber)(산요(SANYO) MLR-351H) 안쪽에 배치하고, 종속영양 조건하의 배양을 위해 22 ℃, 60 % 습도 및 암흑(0 μE)인 인큐베이션 챔버(바인더(BINDER) KB53) 안쪽에 배치하였다.

인큐베이션 챔버를 10 μE의 섬광 형태로 시간당 30초의 섬광을 30번의 비율로 제어된 조명을 공급하기 위해 변경했다.

4 - 혼합영양 및 종속영양 조건하에서 각각 배양된 미세조류 균주의 세포 내 지질 함량의 스펙트럼 형광분석에 의한 고-처리량 스크리닝:

3 내지 4주 동안 24- 또는 96-웰 마이크로플레이트내의 성장을 모니터링한 후, 혼합영양 및 종속영양 미세조류의 세포 내 지질 함량을 스펙트럼 형광분석으로 평가했다. 세포 내 지질을 형광색소, 나일 레드(Nile Red)로 특이적으로 표지했다.

488 nm의 형광 여기에 대응하여, 나일 레드로 염색된 중성 지질은 570 nm에서 형광을 발광하고 극성 지질은 610-620 nm에서 방출한다.

이러한 목적을 위해, 혼합영양 및 종속영양하에서 수행된 미세조류 균주의 액체 배양물을 96-웰 PCR 마이크로플레이트(V= 배양의 100 내지 200 μl)로 이전하고 나일 레드(0.1　mg/mL) 1-2 μl로 염색한다. 인큐베이션 또는 암흑에서 20분 후에, PCR 마이크로플레이트를 스펙트럼 형광분석기(바리안(Varian))에 배치하고 500 내지 700 nm의 형광 발광 스캔을 수행한다.

테트라셀미스 속의 78개 균주의 성장에 미치는, 섬광의(독립영양 및 혼합영양 컬럼) 및 글루코스(Glc 5 g/L), 아세테이트(Ac 1 g/L), 사카로스(Sac 10 g/L), 락토스(Lac 10 g/L) 및 글리세롤(Gly 5 g/L)과 같은 탄소-함유 기질의(혼합영양 및 종속영양 컬럼) 효과를 액체 배지 MM 또는 f/2의 96-웰 마이크로플레이트에서 스크리닝으로 평가했다. 배양의 육안 관찰 및 쌍안 현미경(10X 및 32X 대물렌즈)을 통한 현미경 관찰로 3 내지 4주 동안 주 2회 성장을 모니터링한다.

5- 결과:

테트라셀미스 속의 시험된 78개 균주 중에서, 22개가 종속영양 특징을 보였고 단지 7개의 균주가 엄격히 독립영양체인 것으로 입증되었다. 사실, 시험된 기질 중 하나에서 22개의 종속영양 균주가 0 μE에서, 독립영양 조건과 유사하거나 그보다 더 큰 상당한 성장을 보여준 것이 관찰되었다. 테트라셀미스 속 균주의 바람직한 탄소-함유 기질은 21개 중에서 혼합영양 균주 17개의 경우 글루코스인 것으로 나타난다. 빛의 유무에서 탄소-함유 기질의 첨가가 독립영양 조건하에서 배양하는 것에 비해 세포 성장 향상이 없을 때의 균주를 엄격히 독립영양체라고 부른다. 본 경우에서, 빛(10 μE)의 공급 및 탄소-함유 기질이 테트라셀미스 속의 71개 균주를 독립영양 조건하에서의 대조물의 것과 유사하거나 그보다 더 큰 세포 농도에 도달하게 했다. 그러므로 혼합영양 조건하의 배양이 테트라셀미스 속의 가장 많은 수의 균주 배양을 위한 최상의 조건을 구성한다.

정지-기 배양 조건하에서, 96-웰 마이크로플레이트 내의, 연속적이고 불연속적인 조명의 혼합영양 조건하에서 성장할 수 있는 테트라셀미스 속의 혼합영양 균주 21개에서 세포 내 지질의 축적에 미치는 빛의 효과를 평가했다. 실제로, 테트라셀미스의 종속영양 균주 21개 각각의 배양 분취액(200 μl)을 96-웰 마이크로플레이트에 이전하고, 이어서 나일 레드(1 μg/mL)로 염색했다. 세포 내 지질의 축적이 나타낸 형광 발광 신호(570 nm에서 중성 지질 및 620 nm에서 극성 지질)를 스펙트럼 형광분석기에 의해 수집한다.

시험된 21개의 균주에서, 섬광이 있을 때 배양된 균주가 연속적인 조명으로 배양된 것에 비해 나일 레드로 더 진하게 염색되었다.

Ⅱ - 섬광 방식에서 테트라셀미스 속 혼합영양 균주의 성장

1 - 생물반응기에서 테트라셀미스 속 균주의 배양:

앞선 파트Ⅰ에 기술된 스크리닝 동안 선택된 21개의 혼합영양 균주에서 임의로 뽑은, 테트라셀미스의 두 균주를 발효조(공급형-배치)에서 본 발명에 따른 섬광 방식으로 배양했다. 동시에, 동일한 균주를 연속적인 조명으로 독립영양 조건하에서 배양했다.

배양을 전용 자동 장비 및 전산화된 통제와 함께 사용하는 2-리터 발효조(바이오컨트롤러(BioController) ADI 1030)에서 수행했다. 시스템의 pH를 염기(1 N 수산화 나트륨 용액) 및/또는 산(1 N 황산 용액) 첨가로 조정했다. 배양 온도를 23 ℃로 고정한다. 교반은 루쉬톤(Rushton) 배열(다운 펌핑하는 3-블레이드 교반날개)에 따라 샤프트에 장착된 3개의 교반 로터에 의해 제공되었다. 교반 속도 및 통기 흐름 속도를 각각 Q_최소. = 0.5 vvm / Q_최대. = 2 vvm과 함께 최소 100 rpm 및 최대 250 rpm으로 조절했다. 생물반응기는 투명 탱크를 둘러싼 외부 조명 시스템을 장착했다. 조명 주기뿐 아니라 방출된 빛의 세기도 컴퓨터 스테이션으로 프로그래밍했다. 반응기를 연속적인 100 μE 조명, 자동 온도 조절 챔버(22 ℃) 안의 교반 테이블(140 rpm)에서 수행된 예비배양물로 접종했다. 생물반응기안의 예비배양 및 배양은 10　mM NaHCO₃가 보충된 배지 f/2에서 수행되었다. 생물반응기 내의 혼합영양 조건하의 배양에 사용된 탄소-함유 기질은 20 mM 농도의 아세트산 나트륨이다. 배양 92시간부터 시작해서, 매 24시간마다 농축된 배지 f/2를 첨가하여 0.5X 최종 농도에 도달하게 하였다. 혼합영양 조건하의 "섬광" 배양의 경우, 농축된 배지 f/2뿐 아니라 5 mM의 아세트산 나트륨도 첨가했다.

2 - 섬광 형태의 빛 공급:

상기 발효조의 외부 벽 둘레에 분포된 LED 램프를 사용하여 생물반응기에 섬광 형태로 빛을 공급했다. 클록이 조명 시간 동안에 또는 8 내지 50 μE 사이의 펄스로 이 LED 램프를 켰다. 섬광 시스템의 빛의 세기는 독립영양 조건하의 대조용 배양에서 연속적인 방식으로 사용된 것과 같다.

3 - 생물량 모니터링 :

생물량의 총 농도를 건조 중량(와트만(Whatman)지로, GFC 필터로 여과, 이어서 65 ℃ 및 -0.8 바의 진공 스토브에서 적어도 24시간 동안 건조 후 무게측정)을 측정하며 모니터링했다.

4 - 세포 내 지질의 정량화:

10 ⁷ 세포/ mL 의 샘플을 뽑아 총 지질의 정량화를 수행했다. 지질 추출 방법은 Bligh , E.G. 및 Dyer , W.J.에 의해 기술되어 있다(문헌 [A rapid method of total lipid extraction and purification (1959) Can . J. Biochem . Physiol 37: 911-917]).

5 - 결과:

다양한 배양에서 얻은 결과가 도 1 및 2의 그래프에 표현되어 있다.

첫 번째 그래프는 독립영양 방식에서 수행된 동일한 균주의 배양에 비해 섬광 방식(선택된 각각 다른 혼합영양 균주의 평균값)에서 수행된 배양일 때의 생물량의 큰 증가를 보여준다.

두 번째 그래프는 섬광 방식에서 배양된 세포 내 지질 축적이 독립영양 방식에서 배양된 세포 내의 것보다 최대 30 % 더 큰 것을 보여준다.

6 - 결론:

앞선 연구는 테트라셀미스 속의 다양한 미세조류의 배양에 탄소-함유 기질뿐 아니라 섬광(시간당 30초의 30번의 약 10 μE 섬광) 형태의 빛 공급이, 혼합영양 특징을 가진 모든 것에서, 세포 내 지질의 상당히 더 큰 축적을 유발함을 보여준다.

생물량에 관해서, 수득률은 독립영양 조건하에서보다 섬광 형태로 공급된 빛이 있는 혼합영양 방식에서 훨씬 더 높았다. 얻어진 미세조류의 농도는 100 내지 150 g/L(도 1) 사이이며, 이것은 연속적인 빛에서의 배양으로 얻은 농도보다 훨씬 더 높다.

게다가, 본 발명에 따른 단세포 조류의 배양 방법은 매우 짧은 지체 시간 및 세대 기간과 함께, 40시간 미만으로 상기 조류의 배양 시간을 감소시키는 것이 가능하다.

Claims

조류를 암흑에서 배양하되, 시간에 따라 가변적이거나 불연속적으로 빛을 공급하고, 빛의 세기가 광자의 마이크로몰 단위로 시간당 여러 번의 비율로 10 μ몰. m^-2. s^-1 이상의 진폭으로 변화하는 것을 특징으로 하는, 혼합영양 방식에서 배양된 단세포 조류의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 빛의 세기가 시간당 여러 번의 비율로 2 μ몰. m^-2. s^-1 및 10 μ몰. m^-2. s^-1의 값에 연속적으로 도달하는 것을 특징으로 하는, 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 빛의 세기가 주기적으로 변하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 빛의 세기가 0 내지 20 μ몰. m^-2. s^-1사이, 바람직하게는 0 내지 50 μ몰. m^-2. s^-1사이의 값으로 변하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 빛의 공급이 불연속적인 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제5항에 있어서, 빛을 섬광으로 공급하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제6항에 있어서, 상기 섬광은 5초 내지 10분 사이, 바람직하게는 10초 내지 2분 사이, 더 바람직하게는 20초 내지 1분에 포함되는 지속기간을 갖는 연속적인 조명 상태로 이루어진 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제7항에 있어서, 상기 섬광은 시간당 20 내지 30번 사이의 섬광을 포함하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 섬광의 세기가 5 내지 15 μ몰. m^-2. s^-1사이에포함되는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 빛의 세기가 시간에 따라 계속적으로 변하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지는 아세테이트, 글루코스, 셀룰로오스, 녹말, 락토스, 사카로스 또는 글리세롤을 포함하는 탄소-함유 기질이 보충된 최소 배지인 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제11항에 있어서, 탄소-함유 기질이 아세트산 나트륨을 주로 포함하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단세포 조류가 다음의 강(class): 유글레나조강(Euglenophyceae), 담녹조강(Prasinophyceae), 진암점조강(Eustigmatophyceae), 규조강(Bacillariophyceae), 후각편모조강(Prymnesiophyceae), 핀귀오조강(Pinguiophyceae), 와편모조강(Dinophyceae), 트레복시조강(Trebouxiophyceae), 비코소엑조강(Bicosoecophyceae), 카타블레파리조강(Katablephariophyceae), 녹조식물강(Chlorophyceae), 착편모조강(Haptophyceae), 침편모조강(Raphidophyceae), 키소조강(Chysophyceae), 체돌말강(Coscinodiscophyceae), 알베올라타상문(Alveolata), 원시홍조강(Bangiophyceae), 홍조강(Rhodophyceae) 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단세포 조류가 담녹조강에, 바람직하게는 테트라셀미스(Tetraselmis) 속(genus)에 속하는 것을 특징으로 하는 단세포 조류의 배양 방법.
ⅰ) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 배양 방법에 따라 단세포 조류를 배양하는 단계,
ⅱ) 단계 ⅰ)에서 배양된 단세포 조류를 회수하는 단계, 및
ⅲ) 단계 ⅱ)에서 회수된 조류의 세포 내 함유물로부터 지질을 추출하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 지질의 생산 방법.