CN114015575A - 一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，包括如下步骤：接种后的微藻采用闪光LED灯进行培养至生长对数期；进入生长对数期的微藻采用频闪光照进行培养直至进度稳定期。本发明除了研究微藻培养过程的光照周期和光照强度外，还对光源的闪烁频率、调节微藻细胞在光区和暗区之间的频繁循环次数进行了研究，有效促进了微藻光系统的光能利用效率，减少微藻光抑制现象同时提高微藻生长速率。
Description
技术领域
本发明属于微藻培养技术领域，具体涉及一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法。
背景技术
随着生活水平的不断提高，环境中营养物质排放量日益增加，水体污染越来越严重，尤其是水体的富营养化现象日趋加剧，大量的微藻水华频发，不仅破坏水域生态系统，严重危害水体中其它生物的生存，甚至是人类的健康。藻类在环境中释放的大量藻毒已经对公众健康、牲畜和水源供给带来负面影响。为了有效防控微藻水华，对藻类的深入研究显得尤为重要。
为了了解藻类水华爆发的自然条件，现有的微藻规模培养主要有四种方式：开放式池塘培养、封闭式池塘培养、封闭式光照反应器和无光照异养发酵培养。微藻的扩大培养包含对工业规模下微藻培养系统的设计、建造和运行等一系列过程，需要投入大量的资源与设备。目前市场上的光生物反应器为微藻工业生产提供了可能性，光照作为微藻生长的关键因素之一，适宜的光照条件可极大的提高微藻的生长速率。
现有技术CN106434485公开一种铜绿微囊藻的培养方法，通过前期准备藻种、培养器具的消毒处理，铜绿微囊藻的预培养以及铜绿微囊藻的接种及培养。该培养方法，在培养铜绿微囊藻时具有存活率高，生长速率快的特点，培养过程中藻液不会变黄，而且不易被其他细菌污染。CN103555635公开一种铜绿微囊藻的培养方法如下：将上述的培养基经120-125℃灭菌20-30min，室温冷却后，将铜绿微囊藻按2-7％的体积比接种于培养基中，于光照培养箱中培养，每天摇晃2-3次，设置光照培养箱的光照强度为1000lx～1500lx，暖光，光暗比为14h:10h，光室培养温度为30℃，暗室为25℃。从现有技术看，大部分培养方法均从光照周期和光照强度对微藻生长的影响因素方面进行着手研究，如果采用一成不变的光照强度则有可能对微藻的生长造成光抑制；而其在生长的对数期密度不断增加，达到稳定期后密度达到最大，此时微藻细胞因为相互遮蔽而影响了光照效果，如何有效的提高微藻的生长速率成为人们的研究方向。
基于此，有必要提供一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法。
发明内容
基于微藻在持续光照过程中容易产生光抑制带来的培养难题，本发明提供一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，除了研究微藻培养过程的光照周期和光照强度外，还对光源的闪烁频率、调节微藻细胞在光区和暗区之间的频繁循环次数进行了研究，有效促进了微藻光系统的光能利用效率，减少微藻光抑制现象同时提高微藻生长速率。
本发明通过以下技术方案进行实现：
一方面，本发明提供一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，通过在微藻培养过程中采用频闪光照进行培养。
进一步地，所述方法包括如下步骤：接种后的微藻采用闪光LED灯进行培养至生长对数期；进入生长对数期的微藻采用频闪光照进行培养直至进度稳定期。
进一步地，所述方法还包括微藻预培养过程，具体为：接种后的微藻采用闪光LED灯进行培养至生长对数期。
进一步地，所述微藻预培养过程中，所述微藻采用BG11培养基培养，接种量为0.5％～1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为20～35℃，光照强度为1400～2500Lux，维持LED灯强度不变培养3天，直至微藻进入生长对数期。通过微藻预培养使得微藻适应生长环境，快速进入生长对数期。进一步地，所述光照强度为1400、1500、1600、1800、2000、2200、2500Lux；所述温度为20、24、25、26、28℃。
进一步地，所述方法还包括微藻培养过程，具体为：进入生长对数期的微藻采用频闪光照进行培养直至进度稳定期。
进一步地，所述频闪光照的培养条件为：控制培养条件温度为24～35℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为1400～2500Lux，闪光占空比为1:1(即每次闪烁亮光时间等于黑暗时间)，光照/光暗的光照时间比为14:10h(即每天采用闪光光照时长为14小时)，频闪频率为30～600次/分钟；培养7-14天直到微藻进入稳定期。通过微藻培养过程中改变光照强度、光照周期、光照时间和频闪频率等光照条件，提高了微藻光合利用效率，提高了微藻生物量。
进一步地，所述光照强度为1400、1500、1600、1800、2000、2200、2500Lux；所述温度为20、24、25、26、28℃；所述频闪频率为30、60、120、150、300、600次/分钟。
进一步地，所述微藻包括但不限于：铜绿微囊藻、普通小球藻、斜生栅藻、三角褐指藻、菱形藻等。
进一步地，本发明所述光照可使用400～490nm的蓝色光的LED光照射，也可以使用可见光的LED光照射。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
步骤一：微藻预培养：接种微量的铜绿微囊藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为0.5％～1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为24℃，光照强度为2000Lux，维持LED闪光灯光照强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
步骤二：微藻培养：在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2000Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为60次/分钟；培养7～14天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。微藻进入稳定期后，本发明方法达到的微藻数量为1×107～8×107个/mL。
相对于现有技术，本发明提供的技术方案具备有益效果如下：
本发明基于现有技术采用一成不变的光照强度则有可能因为光照不足而影响微藻的生长的问题，根据微藻在不同生长阶段对于光照要求的不同而采取的频闪供给光照的策略，极大的节省在微藻培养适应期和对数期的光能消耗，提高利用微藻光系统的光能利用效率，减少微藻光抑制现象同时提高微藻生长速率。
本发明有效解决了现有技术中由于持续光照微藻产生光抑制的问题。从本发明培养铜绿微囊藻的光合参数及叶绿素变化趋势可知本发明方法有效提高微藻的生长速率。
附图说明
图1为基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法中，微藻进入生长对数期后，LED灯闪光频率的示意图；图1表示在第一秒有光照，光照强度为2000lux，在第二秒无光照，黑暗条件，以此类推。
图2为使用对比例和实施例1方法培养铜绿微囊藻的各参数比对图，其中，a.铜绿微囊藻在不同光照条件下最大光合速率(Fv/Fm)比对图；b.铜绿微囊藻在不同光照条件下光能利用效率(α)比对图；c.铜绿微囊藻在不同光照条件下实际光合速率
比对图；d.铜绿微囊藻在不同光照条件下总叶绿素变化趋势比对图。
具体实施方式
以下实施例旨在说明本发明内容，而不是对本发明保护范围的进一步限定。
实施例1
微藻预培养：接种微量的铜绿微囊藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为24℃，光照强度为2000Lux，维持LED灯光照强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2000Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为60次/分钟；培养7天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。
实施例2
微藻预培养：接种微量的铜绿微囊藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为0.5％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为24℃，光照强度为2000Lux，维持LED灯强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2000Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为60次/分钟；培养14天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。
实施例3
微藻预培养：接种微量的普通小球藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为0.8％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为25℃，光照强度为1500Lux，维持LED灯强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为30℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2500Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为50次/分钟；培养12天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。
实施例4
微藻预培养：接种微量的斜生栅藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为28℃，光照强度为1800Lux，维持LED灯强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2000Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为150次/分钟；培养10天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。
实施例5
微藻预培养：接种微量的三角褐指藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为24℃，光照强度为2000Lux，培养3天，快速进入生长对数期；
在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为1500Lux，光照/光暗周期比为1:1，光照/光暗的光照时间比为14:10h，频闪频率为100次/分钟；培养7天直到微藻进入稳定期，采收微藻，过滤烘干至恒重，计算生物产量。
对比例
具体过程如实施例1，不同之处在于：使用一成不变的LED灯进行光照培养。
从实施例1和对比例的铜绿微囊藻光合效率如图2所示，在普通光照培养下，铜绿微囊藻最大光合速率(Fv/Fm)、实际光合速率
光能利用效率(α)随光照时间延长而下降，总叶绿素含量在第6天增长停滞，本申请实施例1在闪光LED灯照射培养下铜绿微囊藻生长、叶绿素含量显著高于对比例培养的微藻。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，通过在微藻培养过程中采用频闪光照进行培养。
2.根据权利要求1所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述方法还包括微藻预培养过程，具体为：接种后的微藻采用闪光LED灯进行培养至生长对数期。
3.根据权利要求2所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述微藻预培养过程中，所述微藻采用BG11培养基培养，接种量为0.5％～1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为20～35℃，光照强度为1400～2500Lux，维持LED灯强度不变培养3天，直至微藻进入生长对数期。通过微藻预培养使得微藻适应生长环境，快速进入生长对数期。
4.根据权利要求3所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述光照强度为1400、1500、1600、1800、2000、2200、2500Lux；所述温度为20、24、25、26、28℃。
5.根据权利要求1所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述方法包括微藻培养过程，具体为：进入生长对数期的微藻采用频闪光照进行培养直至进度稳定期。
6.根据权利要求1或5所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述频闪光照的培养条件为：控制培养条件温度为24～35℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为1400～2500Lux，闪光占空比为1∶1，光照/光暗的光照时间比为14∶10h，频闪频率为30～600次/分钟；培养7～14天直到微藻进入稳定期。
7.根据权利要求6所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述光照强度为1400、1500、1600、1800、2000、2200、2500Lux；所述温度为20、24、25、26、28℃；所述频闪频率为30、60、120、150、300、600次/分钟。
8.根据权利要求1所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述微藻包括：铜绿微囊藻、普通小球藻、斜生栅藻、三角褐指藻或菱形藻。
9.根据权利要求1所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述光照使用400～490nm的蓝色光的LED光照射或使用可见光的LED光照射。
10.根据权利要求1所述基于微藻闪光效应的微藻规模化培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤一：微藻预培养：接种微量的微藻于三角瓶中进行预培养，采用BG11培养基，接种量为0.5％～1％，使用闪光LED灯进行培养，控制培养条件温度为24℃，光照强度为2000Lux，维持LED灯强度不变培养3天，快速进入生长对数期；
步骤二：微藻培养：在微藻进入生长对数期后，控制培养条件温度为24℃，使用闪光LED灯对微藻进行光照培养，光照强度为2000Lux，闪光占空比为1∶1，光照/光暗的光照时间比为14∶10h，频闪频率为60次/分钟；培养7～14天直到微藻进入稳定期，采收微藻。
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