KR20170012205A - Dha의 생산을 위해 클로라이드가 없고 소듐이 없는 배양 배지 내에서 아우란티오키트리움 속의 미세조류를 배양하는 방법 - Google Patents

Dha의 생산을 위해 클로라이드가 없고 소듐이 없는 배양 배지 내에서 아우란티오키트리움 속의 미세조류를 배양하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아우란티오키트리움 만그로베이( Aurantiochytrium mangrovei ) 속의 원생생물을 배양하는 방법에 관한 것이다. 상기 속은 유전적으로, 그리고 그의 지질 프로파일에 의해 특성화된다. 본 방법은 높은 바이오매스 수율, 및 그렇게 배양된 원생생물의 지질, 더욱 특히 도코사헥사엔산(DHA) 보강을 얻는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 아우란티오키트리움 만그로베이 속의 DHA-강화 원생생물을 높은 세포 밀도로 생산하는 것을 가능하게 하는 배양 배지의 개발에 관한 것이다. 상기 배지는 낮은 소듐 이온(Na+) 및 클로라이드 이온(Cl-) 함량에서 화학적으로 정의된다.

Description

DHA의 생산을 위해 클로라이드가 없고 소듐이 없는 배양 배지 내에서 아우란티오키트리움 속의 미세조류를 배양하는 방법 {METHOD FOR CULTURING MICROALGAE OF THE AURANTIOCHYTRIUM GENUS IN A CULTURE MEDIUM WITHOUT CHLORIDE AND WITHOUT SODIUM FOR THE PRODUCTION OF DHA}
본 발명은 아우란티오키트리움 만그로베이( Aurantiochytrium mangrovei ) 속의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 높은 수율의 바이오매스, 및 지질, 더욱 특히 도코사헥사엔산(DHA)이 보강된 그렇게 배양된 원생생물(protist)을 얻는 것을 가능하게 한다. 본 발명은 소듐 이온(Na+) 및 클로라이드 이온(Cl-)의 함량이 낮은 화학적으로 정의된 배지 상에서 DHA-강화 트라우스토키트리드를 높은 세포-밀도로 생산하는 것을 가능하게 하는 배양 방법의 개발에 관한 것이다.
본 발명은 아우란티오키트리움 속에 속하는 트라우스토키트리드에만 관한 것이다. 이 속은 유전적, 대사적, 및 생리학적 특징에 의해 구별된다.
소듐 이온(Na+) 또는 클로라이드 이온(Cl-)의 유의적인 첨가 없이 세포를 배양하는 배양 방법은 아우란티오키트리움 만그로베이를 높은 세포-밀도(약 125 내지 140 g/L의 건조물(dry matter))로 생산하는 것을 가능하게 한다. 이 바이오매스는 배양물의 15 내지 20 g/L, 바람직하게 배양물의 20 내지 25 g/L, 또는 심지어 배양물의 25 내지 30 g/L의 수준으로 DHA-강화된다.
이 방법에 필요한 배양 배지 내에는 매우 소량의 소듐 클로라이드, 구체적으로 매우 소량의 클로라이드 이온(Cl-) 및 소듐 이온(Na+)이 존재한다. 따라서, 배양 배지 내에는, 1 g/L 미만, 바람직하게 0.5 g/L 미만, 더욱 바람직하게 0.2 g/L 미만의 클로라이드 이온, 및 100 mg/L 미만, 바람직하게 50 mg/L 미만, 더욱 바람직하게 6 mg/L 미만의 소듐 이온(Na+)이 존재한다. 이는 배지와 접촉되는 장비에 필요한 추가 투자 경비를 방지하고, 유출물의 처리 비용을 실질적으로 감소시키며, 바이오매스 내의 클로라이드 염 또는 소듐 염의 존재와 연계된 단점을 방지하고, 투입(수율을 개선하기 위해 배양물에 첨가되는 산물)을 감소시킴으로써 배지의 비용을 감소시키는 것을 가능하게 한다.
현재 원생생물은 다수의 산업적 프로젝트의 대상이며, 이는 소정의 종이 다량의 지질, 특히 다가 불포화 지방산을 축적하거나 분비할 수 있기 때문이다.
다가 불포화 지방산 중에서, 오메가-3 계열(PUFA-ω3)의 소정의 고도로 불포화된 지방산(HUFA), 특히 에이코사펜타엔산(EPA 또는 C20:5 ω3) 및 도코사헥사엔산(DHA 또는 C22:6 ω3), 및 오메가-6 계열(PUFA-ω6)의 소정의 고도로 불포화된 지방산, 특히 아라키돈산(ARA 또는 AA 또는 에이코사테트라엔산 C20:4 ω6)은 공인된 영양학적 중요성 및 치료적 응용의 관점에서 강력한 잠재력을 가지고 있다.
필수 영양소로 간주되는 DHA는 세포의 정상적 기능 발달에 필요하며, 다양한 생화학적 과정 및 기능에 있어서 중대한 역할을 한다. 그것은 세포막에 혼입됨으로써 중추 신경계의 발달 및 망막 기능에 필수적이며, 시각 및 기억에 참여하는 기전의 습득 및 만족스러운 유지에 있어서 중심 역할을 한다.
트라우스토키트리드, 특히 아우란티오키트리움은 종속영양 상태로 배양할 때 DHA를 생산하는 것으로 공지되어 있다(문헌[W.K. Hong et al. (2011); Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga, Aurantiochytrium sp. KRS101. Appl. Biochem. Biotechnol.: 164(8):1468-80]). 아우란티오키트리움은 또한 카로티노이드, 예를 들어 아스타잔틴, 제아잔틴, 칸타잔틴, 에키네논, 베타-카로틴, 및 피니코잔틴을 생산하는 것으로 공지되어 있다(문헌[Yokoyama, R, Honda, D. (2007) Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov.; Mycoscience, Vol. 48, pp. 199-211]).
원생생물에 의한 지방산의 생산을 산업적 규모로 구현하기 위해서는, 생산이 수익성이 되도록 몇가지 인자를 고려해야 한다. 이들 인자 중에서 하기의 것들을 언급할 수 있다:
- 원재료 및 장비(그의 구매 또는 임차 및 유지)와 더불어 노동력의 비용;
- 생산의 기술적 요건: 예를 들어, 전배양 및 배양 단계, 배양의 온라인 모니터링, 및 산물을 가치화(valorize)하기 위해 배양으로부터 유래하는 바이오매스를 처리하는 단계의 수 및 기술적 난이도;
- 배양으로부터 생성되는 유출물의 처리.
트라우스토키트리드 계열의 원생생물을 종속영양 상태로, 또는 혼합영양 상태로 배양하기 위해 현재 사용되는 배양 배지는 유의적인 양의 염, 특히 소듐 클로라이드를 함유한다. 예를 들어, 배양 배지 ATCC 배지 번호 790(11 g/L Na+ 및 19 g/L Cl-)을 언급할 수 있다.
관심의 대상인 오일 및/또는 다른 분자의 생산 방법에서 트라우스토키트리드 계열의 해양 원생생물을 배양하기 위한 소듐 클로라이드(NaCl)의 사용은 투자 및 유출물 처리의 관점에서 많은 추가 경비를 포함하며 부산물의 가치화를 제한한다.
실제로, 클로라이드 이온은 발효기, 배양 배지의 제조 및 멸균을 위한 도구, 및 미세조류의 배양 및 생성되는 바이오매스의 처리를 위한 다른 장비의 제조에 사용되는 재료인 스테인리스강의 손상을 야기한다. 이 현상의 한가지 결과는 바이오매스 생산 및 처리(다운스트림 가공, 또는 DSP)에 사용되는 도구의 조기 손상이다.
이 손상 문제를 방지하기 위해, 클로라이드 이온에 대해 더 내성인 특수 합금으로 제조된 장비를 사용할 수 있다. 더 큰 염-내성을 가진 이들 재료는 더 고가이다. 이 경우에 생산 투자 비용이 실질적으로 더 높다.
추가로, 소듐 클로라이드(또는 예를 들어 소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 유형의 다른 소듐 염)의 사용은 유출물 처리, 특히 물 탈염의 관점에서 유의적인 추가 경비를 유발한다.
마지막으로, 오일 추출 후에 잔류하는 바이오매스로 구성된 오일 케이크-유형의 부산물 내의 소듐 염의 존재는, 특히 동물 사료, 양어용으로서, 또는 화장품용 성분으로서, 또는 약제 산업에서의 그들의 가치화를 더 어렵게 한다.
미국특허 제5,518,918호에는 소듐 클로라이드를 다른 유형의 소듐 염(소듐 설페이트, 소듐 카보네이트 등)으로 대체하는 것이 기재되어 있다. 그것이 스테인리스강 장비의 조기 마모를 방지하는 것을 가능하게 하더라도, 배지에 소듐 염을 첨가하면 유출물 처리에 관련된 부가적인 비용 및 상기 언급된 부산물의 가치화 문제를 방지할 수 없다.
또한, NaCl을 다른 소듐 염으로 대체하는 것은 대용 염의 구매에 관련된 부가적인 비용을 유발한다.
문헌[Yokochi et al., "Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21" (1998) Appl . Microbiol. Vol. 49, pp. 72-76]에는, 염 조건에 대한 균주 사이조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum) SR21의 용인성이 연구되어 있다. 균주는 높은 염 농도에 대한 넓은 용인성을 가졌으며, 그 농도는 해수 염 농도의 50% 내지 200%이다. 염이 없는 배양에서 균주 성장은 50% 해수를 함유하는 배양에서의 균주 성장의 절반이었다. 본 발명자들은 이 연구에 사용된 기본 배양 배지가 3% 글루코스 및 1% 효모 추출물 또한 함유했음을 언급한다. "염이 없는", 또는 "낮은 농도"의 염을 갖는 청구된 배양 배지가 미국특허 제8,900,831호에 기재되어 있다. 그러나, 요코시(Yokoshi) 등의 경우, 미생물 성장을 위해 효모 추출물의 첨가가 필요하다. 그러나, 효모 추출물로 보충된 이러한 배지는 30 mg 초과의 클로라이드 염 및 소듐 염을 함유한다.
더욱이, 효모 추출물의 첨가는 배지를 위한 부가적인 비용, 및 또한 식품 산물 또는 약제학적 산물로 사용하기 위한 최종 바이오매스의 품질의 관점에서 단점을 나타낸다. 효모 추출물은 표준화된 산물이 아니므로 효모 추출물의 회분은 균질하지 않다. 그러므로 이는 효모 추출물을 함유하는 배양 배지의 바이오매스로부터 유래하는 최종 산물의 균질성에 영향을 미친다.
문헌[Shabala et al., "Osmotic adjustment and requirement for sodium in marine protist thraustochytrid" (2009) Environmental Microbiology Vol. 11(7), pp. 1835-1843]은, 배지가 만니톨 또는 수크로스와 같은 화합물로 보충되는 한(이는 소듐이 없는 배양 배지의 삼투압 조정을 가능하게 함), 낮은 소듐 함량(1 mM)을 가진 배양 배지에서 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)이 성장할 수 있다는 것을 나타냈다. 그러나, 후자의 화합물의 존재는 이들 재료의 비용과 연계된 추가 경비를 유발한다. 또한, 배양 배지의 삼투성을 조정하는 화합물의 첨가에도 불구하고, 염의 부재 및 만니톨의 존재 하에 얻어지는 바이오매스 수율(200,000 세포/밀리리터)은 DHA의 산업적 생산에 불충분한 채로 남아 있다.
최근의 문헌[Shabala et al., "Thraustochytrids can be grown in low-salt media without affecting PUFA production", Marine Biotechnology (2013) 15: 437-444]에서는, 사이조키트리움 리마시눔 SR21(OUC88이라고 명명함)의 UV-유도 무작위 돌연변이유발에 의해 돌연변이체를 얻고 지방산 조성의 변화를 유도하는 환경적 인자를 결정하기 위해 시험하였다. 상기 논문의 도 2는 염 농도가 0.9% 미만으로 하락하면, 바이오매스 및 지질의 양이 크게 감소(바이오매스는 20 g/L 미만이고 지질은 10 g/L 미만임)한다는 것을 나타낸다.
강철 장비의 마모에 관련된 문제를 방지하면서, 발효를 위한 생산 비용과 더불어 생성되는 바이오매스의 처리를 위한 생산 비용을 감소시키면서, 생산하고자 하는 지방산(들)의 수율을 증가시키기 위하여, 최적 조건 하에 트라우스토키트리드를 배양할 수 있는 것이 바람직하다. 특히, 유출물의 처리에 관련된 추가 경비와 더불어 최종 산물의 가치화의 문제 및 부가적인 DSP 단계에 관련된 추가 경비를 유발할 수 있는 다른 배양 구성요소의 첨가 없이, 배양 배지 내의 소듐 이온 및 클로라이드 이온을 감소시키거나 심지어 실질적으로 제거하는 것을 가능하게 하는 아우란티오키트리움의 배양 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, DHA의 산업적 생산에 충분한 바이오매스 및 지질 수율을 얻는 것이 바람직하다. 따라서 예를 들어, 100 g/L를 초과하는 건조물, 바람직하게 130 g/L를 초과하는 건조물, 더욱 바람직하게 150 g/L를 더 초과하는 건조물의 수율을 얻는 것이 바람직하다. 따라서 건조물의 총 중량에 대해, 예를 들어 40%, 심지어 50% 초과의 지방산을 얻는 것이 바람직하다. 또한 건조물의 총 중량에 대해, 예를 들어 지방산 중에 30%, 심지어 40% 초과의 DHA를 얻는 것이 바람직하다.
따라서 출원인이, 소듐, 클로라이드, 효모 추출물과 같은 유기 공급원, 및 샤발라(Shabala) 등의 논문(2013)에 정의된 만니톨 또는 수크로스와 같은 삼투제(또는 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다른 삼투제)의 첨가 없이 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서 성장할 수 있는 아우란티오키트리움 속의 원생생물의 균주 동정에 성공했다는 것이 다수의 균주 스크리닝 실험의 결론이다.
본 발명의 조건 하에 배양되는 이들 균주는 바이오매스(110 g/L, 바람직하게 120 g/L 초과) 및 다가 불포화 지방산(15 g/L, 바람직하게 20 g/L 초과), 특히 DHA의 높은 수율을 가진 생산을 얻는 것을 가능하게 한다.
그렇게 단리되고 선택된 아우란티오키트리움 균주를 대표하는 본 발명에 관련된 하나의 균주(FCC 1324)를 부다페스트 조약의 조례에 따라 2013년 6월 21일자로 CCAP(영국 스코틀랜드 오반 아르길 PA371QA 소재의 던스타프나지 해양 연구소(Dunstaffnage Marine Laboratory), 스코틀랜드 해양과학협회(Scottish Association for Marine Science), 조류 및 원생동물 은행(Culture Collection of Algae and Protozoa))에 수탁 번호 CCAP 4062/1로 기탁하였다.
도 1은 소단위체 리보솜 RNA를 암호화하는 DNA 서열들 사이의 관계를 나타내는 계통학적 분석이다. 메가 5.1(Mega 5.1)의 클러스탈W(ClustalW)로 서열을 정렬하였다. 최대-가능도 방법을 사용하여 분석을 실행하였다. 본 연구에 사용된 트라우스토키트리드 균주는 하기의 속에 속한다: 아우란티오키트리움 만그로베이, 사이조키트리움 sp., 및 사이조키트리움 아그레가툼, 울케니아 비수르겐시스(Ulkenia visurgensis), 울케니아 sp., 울케니아 프로푼다(Ulkenia profunda), 보트리오키트리움 sp.(Botryochytrium sp .), 보트리오키트리움 라디아툼(Botryochytrium radiatum), 파리에티키트리움 sp.(Parieticytrium sp .), 파리에티키트리움 사카리아눔(Parieticytrium sarkarianum), 아플라노키트리움 케르구엘렌스(Aplanochtytrium kerguelense), 아플라노키트리움 스토키노이(Aplanochtytrium stocchinoi), 오브롱기키트리움 멀티루디멘테일(Oblongichytrium multirudimentale), 오브롱기키트리움 sp.(Oblongichytrium sp .), 및 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans). 부트스트랩 값은 그들이 75% 초과인 경우에 유의적인 것으로 간주된다.
도 2는 낮은 Na + 및 Cl - 함량을 갖는 FCC-M 배지를 이용하는 삼각 플라스크 내에서의 성장 시험이다. 본 발명의 실시양태에 따른 배양 배지 내에서 본 발명에 관련된 균주(흑색) 및 본 발명에 관련되지 않은 균주(회색 및 빗금)의 성장을 비교한다. 각각의 균주에 대한 컬럼의 길이는 광학 밀도를 나타낸다(실시예 1).
도 3은 삼각 플라스크 내에서 배양된 다양한 트라우스토키트리드 균주의 지방산 프로파일이다( 실시예 2).
(A) 및 (B)는 아우란티오키트리움 만그로베이(아우란티오키트리움 리마시눔이 그의 구성원임)(패널의 최초 3개 라인), 및 사이조키트리움 sp. 속(이는 균주 ATCC 20888과 더불어 균주 아우란티오키트리움 sp. SEK 217 및 SEK 209를 포함함)(패널의 최종 3개 라인)에 의해 예시되는 본 발명에 따른 속 사이의 지방산 프로파일의 비교이다. 배양 조건은 실시예 2에 기재되어 있다.
도 4는 생물반응기 내에서 배양된 다양한 트라우스토키트리드 균주의 지방산 프로파일이다(실시예 3 및 4).
(A) 및 (B)는 본 발명에 따른 균주의 지질 프로파일이다. (A) 총 다가 불포화 지방산(PUFA)에 대한 퍼센트로서 표현된 PUFA. (B) 총 포화 지방산에 대한 퍼센트로서 표현된 포화 산. KOH 또는 NH4OH에 의해 pH가 조정된 배양을 각각 약어 (KOH) 또는 (NH4OH)로 식별하였다. 배양 조건은 실시예 3 및 4에 기재되어 있다.
"균주"는 본 발명에 따라 정의된 아우란티오키트리움 속의 천연 균주 뿐 아니라, 상기 천연 균주의 돌연변이체 또한 의미한다.
"화학적으로 정의된"은, 그의 화학적 조성이 공지되고 그의 산물 또는 혼합물을 구성하는 각각의 요소의 함량 또한 공지된 임의의 산물 또는 산물의 혼합물을 의미한다.
"화학적으로 정의된 배양 배지"는 각각의 요소의 함량이 공지된 배양 배지, 즉, 효모 추출물, 또는 펩톤 또는 다른 복잡한 성장제와 같은 단백질 또는 다른 유기 물질의 다른 복잡한 공급원(양자 모두 조성이 천연적으로 가변적임)의 부재 하의, 그리고 고정된 농도의 이들 각각의 구성요소의 부재 하의 배양 배지를 의미한다.
"삼투 조절제"는 배지 내의 삼투압 유지를 가능하게 하는, 배양 배지 내에 존재하는 작용제를 의미한다.
"유전적 동일성"은 BLAST-유형 소프트웨어에 의해 평가되는 바와 같은, 2개의 DNA 서열 사이의 동일성을 의미한다.
따라서 본 발명은 소듐(Na+) 및 클로라이드(Cl-)가 실질적으로 없는 유기 배지 내에서 종속영양 또는 혼합영양 모드로 아우란티오키트리움 만그로베이 및 아우란티오키트리움 리마시눔 유형의 소정의 원생생물을 배양하는 방법을 목적으로 한다. 이 배양 방법은 지질의, 구체적으로 DHA의 바이오매스의 높은 수율을 얻는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 관련된 균주는 유의적인 양의 클로라이드 이온 또는 소듐 이온의 첨가 없이, 그리고 만니톨, 소르비톨, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 삼투 조절제의 첨가 없이, 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서 높은 밀도로 성장하는 능력을 나타낸다. 최근의 계통학적 분류에 따라, 그들은 DHA를 생산하는 것으로 공지된 아우란티오키트리움 만그로베이 및 아우란티오키트리움 리마시눔 유형의 트라우스토키트리드 균주이다(문헌[Yokoyama R, et al. (2007). Taxonomic rearrangement of the genus Ulkenia sensu lato based on morphology, chemotaxonomical characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Ulkenia and erection of Botryochytrium, Parietichytrium. Mycoscience . 48(6) p. 329-341]; 문헌[Yokoyama, R., Honda, D. (2007) Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomical characteristics and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes, stramenopiles): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov. Mycoscience 48, 199-211]; 문헌[Tsui CK, et al. (2009) Labyrinthulomycetes phylogeny and its implications for the evolutionary loss of chloroplasts and gain of ectoplasmic gliding. Mol Phylogenet Evol. 50(1): p. 129-40]).
관용적으로, 미국 세포주 은행(American Type Culture Collection)에서 사용하는 것, 배지 ATCC 790 By+(1.0 g 효모 추출물, 1.0 g 펩톤, 5.0 g D(+)-글루코스, 및 1 리터 해수)와 같은 해수-기반의 배양 배지로 이들 미세조류 속의 종속영양 배양을 실행하였음을 상기해야 한다.
균주는 유전적으로, 또한 그들의 지질 프로파일에 의해 특성화된다.
본 발명에 관련된 균주는, 그들의 유전자 중 4개인 18s, 액틴, 튜불린, 및 EF1-알파의, 본 발명의 균주를 대표하는 균주인 균주 FCC 1324의 유전자에 대한 유전적 동일성에 의해 특성화된다. 균주 FCC 1324는 그렇게 단리되고 선택된 신규 아우란티오키트리움 균주를 대표하며, 부다페스트 조약의 조례에 따라 2013년 6월 21일자로 CCAP(영국 스코틀랜드 오반 아르길 PA371QA 소재의 던스타프나지 해양 연구소, 스코틀랜드 해양과학협회, 조류 및 원생동물 은행)에 수탁 번호 CCAP 4062/1로 기탁하였다.
표 1(a)는 아우란티오키트리움 만그로베이 속과, 유전적으로 가장 가까운 사이조키트리움 sp. 속과 더불어 유전적으로 가까운 다른 균주 사이의 4개 유전자의 서열의 비교이다. 비교한 유전자에 따라, 균주 CCAP 4062-1의 유전자와 91% 내지 100%의 동일성을 갖는 서열을 가진 모든 균주는 아우란티오키트리움 속인 것으로 간주될 수 있다. 관련된 CCAP 4062-1 18s 유전자에 대해 적어도 92%의 유전적 동일성은 본 발명에 따른 균주를 특성화한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
18s 유전자(서열 번호 1)에 대해 적어도 92%의 유전적 동일성을 나타내는 균주는 본 발명에 관련되며, 따라서 저-소듐 및 저-클로라이드 배지에서 성장할 가능성이 있다. 본 출원인들은 또한 18s 유전자에 대해 그들의 유전적 동일성에 의해 그렇게 정의된 이들 균주가 액틴 유전자(서열 번호 2)에 대해 적어도 96%, 튜불린 유전자(서열 번호 3)에 대해 적어도 91%, 그리고 EF1-알파 유전자(서열 번호 4)에 대해 적어도 95%의 유전적 동일성을 나타낸다는 것을 언급하였다. 이들 퍼센트 동일성은 표 1(b)에 제공되어 있다.
Figure pct00004
도 1은 본 발명에 관련된 균주의 상기 정의에 이르는 계통학적 분석을 나타낸다.
본 연구에 사용된 트라우스토키트리드 균주는 아우란티오키트리움 만그로베이, 사이조키트리움 sp., 및 사이조키트리움 아그레가툼 속의 구성원이다.
메가 5.1의 클러스탈 W로 서열을 정렬하였다. 도면에서, 분지에 위치한 숫자는 부트스트랩 값이다.
70%의 부트스트랩 값은 2개 그룹 사이의 분지가 유의적이기 위한 하한으로서 간주된다. 문헌[Hillis D.M. and Bull J.J., "An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis" (1993) Systematic Biology Vol. 42, pp. 182-192]에 따라, 70% 초과의 부트스트랩 비율은 통상적으로 상응하는 분기군(그룹)이 사실일 확률이 적어도 95%임에 상응한다.
도 1에서, 2개의 그룹을 분리하는 마디가 100%의 값을 가지므로, 이는 A. 만그로베이 및 사이조키트리움 sp. 그룹 사이의 차이가 유의적임을 의미하며, 따라서 2개의 상이한 속이 존재함을 의미한다. 문헌[Yokoyama and Honda (2007), Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology, chemotaxonomic characteristics, and 18S rRNA gene phylogeny (Thraustochytriaceae, Labyrinthulomycetes): emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen. nov.; Mycoscience Vol. 48, pp. 99-211]에 이미 나타난 바와 같이 이들 2개의 그룹은 그 자체가 사이조키트리움 아그레가툼 그룹으로부터 매우 멀리 떨어져 있다.
도 1에서, 본 발명에 관련된 균주는 도면의 상부에 있는 제1 그룹의 것들이며 명칭이 아우란티오키트리움 만그로베이이다.
본 발명에 관련된 균주의 예로서, 본 발명자들에 의해 동정된 바와 같이 분류된 계통학적 부류 내의 균주 아우란티오키트리움 sp. SD116(JX863672), 아우란티오키트리움 리마시눔(AB022107), 아우란티오키트리움 만그로베이(DQ367049), 아우란티오키트리움 리마시눔 SL1101(JN986842), 아우란티오키트리움 리마시눔(JN986842), 아우란티오키트리움 sp. LY2012(JX847370), 아우란티오키트리움 리마시눔(HM042909), 및 아우란티오키트리움 sp. BL10(FJ821477)을 언급할 수 있다. 괄호 내의 숫자는 수탁 번호이다.
실제로, 이들 균주 각각은 균주 CCAP 4062/1의 서열에 대해, 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4의 서열에 대해 적어도 92%, 96%, 91%, 및 94%의 퍼센트 동일성을 나타낸다.
예를 들어, 서열 번호 1의 서열에 대해 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 유전적 동일성을 나타내는 아우란티오키트리움 속의 균주는 본 발명에 관련된다. 이들 균주는 또한 서열 번호 2의 서열에 대해 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 유전적 동일성, 서열 번호 3의 서열에 대해 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 유전적 동일성, 및 서열 번호 4의 서열에 대해 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 유전적 동일성을 나타낸다.
표 1(a)는 본 발명에 관련되거나 관련되지 않은 균주의, 균주 CCAP 4062/1과의 유전적 동일성의 비교를 상세하게 나타낸다.
균주 사이조키트리움 sp. ATCC 20888(DQ367050) 및 균주 FCC1412 사이조키트리움 sp. SEK 209(AB290574)가 본 발명에 관련된 균주의 구성원이 아님을 언급한다. 이들 균주의 경우에 서열 번호 1에 대한 동일성 값은 91%이다.
이들 균주는 매우 소량의 소듐 클로라이드를 갖는 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서(즉, 효모 추출물 또는 다른 단백질 추출물의 부재 하에) 높은 밀도로 성장하는 능력을 나타낸다. 이 배지는 그것이 3.5 g/L 미만, 바람직하게 1 g/L 미만, 더욱 바람직하게 10 mg/L 미만의 소듐 이온, 및 1 g/L 미만, 바람직하게 0.5 g/L 미만, 더욱 바람직하게 0.2 g/L 미만의 클로라이드 이온을 함유한다는 사실에 의해 특성화된다.
실시예 1에서, 본 출원인들은 이러한 배양 배지(주 배양 배지에 대해 표 2(a)를 참조한다) 내에서 본 발명에 따른 균주와 더불어 본 발명에 관련되지 않은 비교 균주로 삼각 플라스크 내에서 성장 시험을 실행하였다. 무기 질소 (NH4)2SO4, 및 탄소원으로서의 글루코스의 존재 하에, 그리고 유기 질소 공급 없이 배양물을 제조하였다. 따라서, 도 2는 이들 실험의 결과를 예시한다. 결과는, 시험한 다른 트라우스토키트리드 속, 사이조키트리움 sp., 및 사이조키트리움 아그레가툼과는 달리, 모든 아우란티오키트리움 만그로베이 균주가 이 배지 상에서 성장하는 능력을 가지고 있음을 나타낸다.
본 발명에 따른 균주는 균주 FCC 1324의 18s, 액틴, 튜불린, 및 EF1-알파 유전자에 대해 각각 적어도 92%, 96%, 91%, 및 95%의 유전적 동일성을 나타냄을 언급한다.
본 발명에 관련된 균주는 또한, 그들의 지질 프로파일에 의해 특성화된다. 본 발명에 따른 균주의 대표적인 예로서 균주 CCAP 4062/1을 들 수 있다.
도 3(a) 및 3(b)는 2개의 상이한 속의 균주들 사이의 지방산 프로파일의 비교를 나타낸다. 아우란티오키트리움 리마시눔이 그의 일부인, 아우란티오키트리움 만그로베이에 의해 예시되는, 본 발명에 따른 속(각각의 패널의 최초 3개 라인), 및 균주 ATCC 20888과 더불어 균주 아우란티오키트리움 sp. SEK 217 및 SEK 209를 포함하는 사이조키트리움 sp. 속(각각의 패널의 최종 3개 라인). 실시예 2에 기재된, 본 발명의 실시양태에 따른 배양 조건에서 아우란티오키트리움 만그로베이 속의 지질 프로파일은 대부분의 DHA를 나타낸다(총 PUFA의 80% 초과).
도 3(a)에서, 균주 ATCC 20888, 아우란티오키트리움 sp. SEK 217 및 SEK 209는 본 발명에 따른 균주에 비해 더 많은 EPA를 가진 상이한 프로파일을 나타내는 것이 보인다.
DPA(n-6)는 소량의 AA 및 EPA와 함께 총 PUFA의 약 20%를 나타낸다(도 3(a) 참조). 균주 CCAP 4062/1에 대한 유전적 유사성을 가진 다른 균주 또한 이 프로파일을 나타낸다.
도 3(b)는 균주 ATCC 20888, 아우란티오키트리움 sp. SEK 217 및 SEK 209가 더 적은 팔미트산 및 더 많은 양의 홀수 지방산 C15:0 및 C17:0을 가진 상이한 포화 지방산 프로파일을 갖는다는 것을 나타낸다.
도 4(a)는 총 PUFA에 대한 퍼센트로 표현된 다가 불포화 지방산(PUFA)을 나타낸다. 도 4(b)는 총 포화 지방산에 대한 퍼센트로 표현된 포화 지방산을 나타낸다. KOH 또는 NH4OH로 pH를 조정한 배양을 약어 (KOH) 또는 (NH4OH)에 의해 각각 식별하였다. 프로파일은 배양 조건에 따라 사실상 변하지 않고 유지된다. DHA는 총 불포화 산의 거의 80%인 주류 다가 불포화 지방산이다. 실시예 3 및 4에 기재된, 본 발명의 실시양태에 따른 배양 조건에서, C16:0은 총 포화 산의 90%를 초과하는 주류 포화 지방산으로 유지된다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 관련된 균주를 정의하였다. 이들 균주는 유의적인 양의 소듐 또는 클로라이드의 첨가 없이, 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서 높은 밀도로 성장하는 능력을 나타낸다.
이들 균주의 배양은 일반적으로 종속영양 모드로 실행된다.
본 발명에 따른 화학적으로 정의된 배양 배지는 탄소원, 질소원, 및 미생물 성장에 필요한 염을 함유한다. 발효 과정에서 미생물 성장에 필요한 요소는 당업자에게 주지되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 탄소원은 글루코스 및 글리세롤, 바람직하게 글루코스 중에서 선택되는 화학적으로 정의된 공급원이다.
배양 배지 내의 탄소원 함량은 유리하게 10 내지 90 g/L, 또는 10 내지 75 g/L이다.
유리하게, 질소원은 효모 추출물 또는 단백질 추출물의 혼합물과 같은 질소를 함유하는 임의의 복잡한 유기 물질을 제외하고는, 화학적으로 정의된 무기 또는 유기 공급원이다.
바람직하게, 질소원은 암모늄 염, 특히 암모늄 설페이트, 및/또는 니트레이트, 특히 포타슘 니트레이트이다.
배양 배지 내의 질소원 함량은 유리하게 1 내지 10 g/L이다.
주 배양 배지는 본 발명에 따른 미세조류의 배양을 위해 당업자에게 공지된 다른 모든 구성요소를 함유할 수 있다. 일반적으로 배지는 화학적으로 정의된 무기 염, 예를 들어 알칼리 및 알칼리-토금속 염과 더불어 다른 금속의 염을 함유한다. 예를 들어, Ca, Mg, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo, 또는 Zn 염을 언급할 수 있다. 예를 들어, 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트, 철 설페이트, 암모늄 설페이트, 마그네슘 설페이트, 또는 구리 설페이트, 니켈 설페이트, 아연 설페이트와 같은 설페이트를 언급할 수 있다. 포타슘 산 포스페이트와 같은 포스페이트, 또는 칼슘 카보네이트와 같은 카보네이트 또한 언급할 수 있다. 코발트 클로라이드, 망간 클로라이드, 칼슘 클로라이드와 같은 클로라이드 또한 언급할 수 있다. 알칼리 금속 산화물 또한 언급할 수 있다. 소듐 몰리브데이트 및 소듐 셀레나이트와 같은 셀레나이트 및 몰리브데이트 또한 언급할 수 있다. 사용 가능한 다른 무기 염은, 예를 들어, 포타슘 브로마이드 또는 포타슘 요오다이드와 같은 할라이드이다.
배양 배지 내의 다양한 염의 함량은 성장의 관점에서 미생물의 필요에 의존한다. 소정의 염은 아연, 코발트, 망간, 몰리브덴, 셀레늄, 니켈, 또는 구리 염과 같은 미량 원소의 공급으로서 소량으로만 채용된다.
본 발명의 방법에 특히 바람직한 배양 배지는, 필요한 경우에, 예를 들어 영양 구성요소와 같은 다른 요소 외에, 마그네슘 설페이트, 칼슘 클로라이드, 포타슘 보레이트 및 포스페이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 염을 함유한다. 염(들)은 본 발명에 따른 총 염 함량을 초과하지 않으면서 첨가된다. 마그네슘 설페이트, 칼슘 클로라이드, 및 포타슘 포스페이트를 배지에 첨가하는 경우가 특히 바람직하다.
유리하게, 이온 함량은 표 2(a)에 상술된 범위 내에 포함된다(하기 표 참조).
Figure pct00005
모든 경우에, 배양 배지 내의 이들 염의 성질 및 비율은 소듐 이온 함량이 3.5 g/L 미만, 바람직하게 1 g/L 미만, 더욱 바람직하게 10 mg/L 미만이고, 클로라이드 이온 함량이 1 g/L 미만, 바람직하게 500 mg/L 미만, 더욱 바람직하게 약 200 mg/L이도록 선택된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 배양 배지는 아미노산, 퓨린, 피리미딘, 화학적으로 정의된 비타민과 같은, 즉, 효모와 같은 복잡한 공급원에 의해 배양 배지 내에 공급되는 다량 영양소 또는 미량 영양소 이외의, 부가적인 다량 영양소 또는 미량 영양소 또한 포함한다. 일반적으로, 배지는 당업자에게 공지된 다른 배지 구성요소를 함유한다. 필요한 경우, 소포제를 첨가할 수 있다. 그러나, 배지는 화학적으로 정의할 수 없는 복잡한 구성요소를 함유하지 않는다.
유리하게, 비타민은 티아민, 비타민 B12, 판토테네이트, 및 그의 혼합물 중에서 선택된다.
유리하게, 배양 배지 내의 비타민 함량은 표 2(a)에 기재된 값의 범위이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 화학적으로 정의된 배양 배지는 화학적으로 정의된 탄소원, 화학적으로 정의된 질소원, 염, 및 화학적으로 정의된 비타민의 혼합물로 구성된다.
이 배양 배지는 발효기에서의, 유리하게 적어도 1000 리터의 발효기에서의, 특히 소위 "회분식" 불연속 모드의, 소위 "유가식" 반-연속 모드의, 또는 연속 모드의 배양에 특히 적합하다는 것을 언급하고자 한다.
본 발명의 실시양태에 따른 배양 배지의 예는 하기 표 2(b)에서와 같이 정의된다.
Figure pct00006
본 발명의 실시양태에 따른 배양 배지의 예는 하기 표 2(c)에서와 같이 정의된다. 명칭이 FCC-M인 이 배지는 0.00038 g/L의 소듐(Na+) 및 0.437 g/L의 클로라이드(Cl-)를 함유한다. 배지는 첨가된 NaCl을 함유하지 않는다.
Figure pct00007
관용적으로, 생물반응기 또는 발효기 내에서 종속영양 또는 혼합영양 조건 하에 본 발명에 따른 균주를 배양하는 중에, 미생물 성장을 유지하기 위해 첨가 용액과 함께 기본 배양 배지를 보충한다. 탄소-함유 기질, 예를 들어 글루코스 또한 첨가할 수 있다(첨가 용액 2). 첨가 용액의 각각의 요소의 농도를 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 표 3(a)에는 예시적인 요소의 함량이 표시되어 있다.
Figure pct00008
이러한 첨가 용액의 예는 표 3(b)에 제공되어 있다.
Figure pct00009
본 발명의 실시양태에 따라, 발효기 또는 생물반응기 내에서 배양을 실행하는 경우, 전형적으로, 세포 성장을 유지하기 위해 첨가 용액을 첨가한 후에, 최종 Na+ 농도는 약 10 mg/L, 바람직하게 6 mg/L 미만이고, 최종 Cl- 농도는 약 250 mg/L, 바람직하게 200 mg/L 미만이다.
본 발명의 다른 실시양태에 따라, 삼각 플라스크 내에서 배양을 실행하는 경우, Na+ 농도는 5 mg/L 미만, 바람직하게 2 mg/L 미만, 더욱 바람직하게 1 mg/L 미만이고, Cl- 농도는 약 1 g/L, 바람직하게 0.750 g/L 미만, 더욱 바람직하게 0.5 g/L 미만이다.
일반적으로, 세포가 높은 농도의 지질을 축적하는 것을 가능하게 하기 위하여, 배양 중에 유기 탄소-함유 기질의 첨가를 실행한다(예를 들어, 표 3(a 또는 b)의 첨가 용액 2를 참조한다). 충분한 농도를 유지하기 위하여, 배양 과정 중에 부가적인 기질(첨가 용액 2)을 배양 배지에 첨가한다. 이 유기 탄소-함유 기질은 글루코스, 셀룰로스 유도체, 수크로스, 및/또는 글리세롤을 순수한 형태로, 또는 혼합물로 바람직하게 함유한다. 유기 기질 농도는 일반적으로 200 mM 내지 500 mM이다.
배양 배지에 함유된 유기 탄소-함유 기질은 복잡한 분자 또는 기질의 혼합물로 구성될 수 있다. 작은 분자로 구성된, 예를 들어 옥수수, 밀, 또는 감자로부터의 전분의 생물전환으로부터 유래된 산물, 특히 전분 가수분해물이, 예를 들어, 본 발명에 따른 원생생물의 종속영양 또는 혼합영양 배양에 적합한 유기 탄소-함유 기질을 구성한다.
배양 중에, pH는 4 내지 8이고, 온도는 20 내지 30　℃이며, 용존 산소 농도는 전형적으로 5% 내지 30%로 조정된다.
본 방법은 배양으로부터 얻어지는 바이오매스 수율을 증가시키는 이점을 갖는다. 그것은 또한, 그렇게 배양된 원생생물을 다가 불포화 지방산, 더욱 특히 도코사헥사엔산(DHA)으로 강화하는 이점을 갖는다.
본 발명의 실시양태에 따라, 예를 들어 질소원으로서의 효모 추출물, 및 예를 들어 탄소원으로서의 글루코스를 함유하는 배지 FCC-M(표 2(c))과 같이 소량의 NaCl을 갖는 배양 배지 내에서 전배양물을 제조한다. 인큐베이션 기간 후, 예를 들어 48 시간 후에 세포를 원심분리하고, 예를 들어, 효모 추출물 및 임의의 다른 무기 또는 유기 질소원을 함유하지 않는 FCC-M과 같이 소량의 NaCl을 갖는 배양 배지 내에서 세포 펠렛을 세척한다. 이 작업의 목적은, 일반적으로 주 용액의 배양 부피의 1/100(v/v)에 상응하는 전배양물 내의 효모 추출물의 존재를 통해 주 배양에 임의의 Na+가 공급되는 것을 방지하는 것이다.
본 발명에 따른 단리된 아우란티오키트리움 균주는 유의적인 양의 바이오매스와 더불어 지질을 생산하는 것을 가능하게 하며, 지질은 DHA-강화된다. 실제로, 본 발명의 방법은 종속영양 또는 혼합영양 조건 하에 100 g/L 초과, 바람직하게 120 g/L 초과의 바이오매스 수율을 얻는 것을 가능하게 하며, 이 바이오매스는 건조물의 중량에 대해 50% 내지 60%의 지질을 갖는다. DHA는 원생생물 내에 함유된 총 지방산의 15% 초과, 또는 20% 초과, 또는 30% 초과를 나타낼 수 있다. 따라서 본 발명의 실시양태에 따른 원생생물은 적어도 0.1 g/L/h, 바람직하게 적어도 0.2 g/L/h, 더욱 바람직하게 적어도 0.3 g/L/h의 DHA 생산성(시간 당, 배양물의 리터 당, 생산되는 관심의 대상인 산물의 양)을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 하기의 단계들을 추가로 포함한다:
a) 1 g/L 미만, 바람직하게 10 mg/L 미만의 소듐(Na+) 및 1 g/L 미만, 바람직하게 200 mg/L 미만의 클로라이드(Cl-)를 갖는 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서, 서열 번호 1의 서열에 대해 적어도 92%의 유전적 동일성을 나타내는, 특히 아우란티오키트리움 속의 하나 이상의 라비린툴로마이세테스(Labyrinthulomycetes ) 균주를 종속영양 조건 하에 배양하는 단계,
b) 상기 배양을 몇 세대 동안 유지하는 단계,
c) 그렇게 배양된 바이오매스를 회수하는 단계.
더욱 특히, "회수하는 단계"는 상기 세대에 걸쳐 그의 세포 수가 가장 많이 증가된 균주(들)를 단리하는 단계를 의미한다.
본 방법은 하기의 부가적인 단계들 또한 포함할 수 있다:
d) 균주의 지질을 회수하는 단계, 및 임의로,
e) 회수된 지질로부터 DHA(도코사헥사엔산)를 추출하는 단계.
단계(a)의 균주는 또한, 서열 번호 2의 서열에 대해 적어도 96%의 유전적 동일성, 및/또는 서열 번호 3의 서열에 대해 적어도 91%의 유전적 동일성, 및/또는 서열 번호 4의 서열에 대해 적어도 95%의 유전적 동일성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 배양 방법은, 바이오매스, 지질, 및 특히 DHA의 높은 수율 및 생산성을 상실하지 않으면서, 낮은 수준의 소듐 및 클로라이드를 가진 배양 배지 내에서 이들 아우란티오키트리움 균주의 배양물을 제조하는 것을 가능하게 한다. 따라서 세포를 배양하고 생성되는 바이오매스를 처리하기 위해 사용되는 발효기 및 다른 스테인리스강 장비의 손상과 더불어 바이오매스 생산 및 처리(다운스트림 가공, 또는 DSP)에 사용되는 도구의 부식에 의한 조기 손상이 방지된다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 DHA-강화 균주의 높은 세포-밀도 생산을 가능하게 하는 배양 배지의 개발에 관한 것이다. 배지는 낮은 함량의 소듐 이온(Na+) 및 클로라이드 이온(Cl-)으로 화학적으로 정의된다. Na+ 농도는 일반적으로 100 mg/L 미만, 바람직하게 50 mg/L 미만, 더욱 바람직하게 6 mg/L 미만이고, Cl- 농도는 바람직하게 0.5 g/L 미만, 더욱 바람직하게 200 mg/L 미만이다. 본 발명의 실시양태에 따라, 본 발명에 관련된 균주의 배양은 0.5 g/L 미만의 NaCl, 6 mg/L 미만의 소듐 이온, 및 200 mg/L 미만의 클로라이드 이온을 갖는 배양 배지 내에서 실행된다.
실시양태에 따라, 배양 배지는 FCC-M이다(표 2(c)). 발효기 또는 생물반응기 내에서 배양이 실행되는 경우, 상기 기재된 바와 같은 첨가 용액이 바람직할 것이다(예를 들어, 표 3(a 또는 b)을 참조한다).
본 발명에 따른 배양 배지가 화학적으로 정의되므로, 그들은 효모 추출물 또는 펩톤과 같은 성장제(이들은 그 자체가 또한 소듐 클로라이드의 양을 포함함), 및 만니톨 또는 소르비톨과 같은 삼투 조절제를 함유하지 않는다. 따라서, 이들 약제의 부재 하에, 최종 산물의 함량을 특성화하거나 최종 산물 내의 이들 원치 않는 첨가 약제를 제거하기 위해 필요한 다수의 DSP 단계 없이, 배양물로부터 유래된 바이오매스 및 지질을 식품 산물(또는 약제학적 산물)에 사용할 수 있다. 따라서 이들 부가적인 단계와 연계된 추가 비용이 방지된다. 마찬가지로, 오일 추출 후에 얻어지는 부산물은, 예를 들어 오일 케이크의 형태로 동물 사료에 사용할 수 있다.
본 발명의 방법 및 본 발명의 배지의 다른 이점은, 배양으로부터 생성되는 유출물이, 부가적인 비용을 유발함으로써 생산을 덜 수익성이 되게 하는 부가적인 처리 단계를 필요로 하는 약제를 함유하지 않는다는 것이다.
본 발명의 방법 및 배지는, 클로라이드 이온 및 소듐 이온의 사용 및 추가 비용의 연계된 문제를 방지하면서 배양으로부터 얻어지는 바이오매스의 생산을 최적화하는 것 뿐 아니라, 그렇게 배양된 유기체를 다가 불포화 지방산으로 보강하는 것 또한 가능하게 한다.
바람직하게, 상기 기재된 방법에 따라 균주를 배양한 후에 회수하여, 그로부터 지질 함유물, 특히 DHA를 포함하는 지질을 추출한다. DHA를 포함하는 지질의 선택적 추출 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Bligh, E.G. and Dyer, W.J. (1959), A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem . Physiol., 37:911-917]에 기재되어 있다.
따라서 본 발명의 실시양태에 따른 균주는 적어도 0.1 g/L/h, 바람직하게 적어도 0.2 g/L/h, 더욱 바람직하게 적어도 0.3 g/L/h의 DHA 생산성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로부터 얻어지는 바이오매스 및/또는 부산물 중 일부 또는 전부의, 제품으로서의 용도, 인간 소비용 제품 내의 성분인 산물로서의 용도 또는 동물 사료용, 특히 양식용 원료로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 지질 및 색소 생산용 원생생물을 배양하기 위한, 본 명세서에 기재된 실시양태에 따른 배양 배지, 특히 명칭이 FCC-M인 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
실시예 1
삼각 플라스크 내에서의 성장 시험:
도 2에 열거된 균주를 조제 해수염(reconstituted sea salt)(인스턴트 오션(Instant Ocean)®, 15 g/L)을 함유하는 배지 내에서 2 일 동안 최초 배양하고, 이어서 원심분리하여 FCC-M 용액(표 2(c))으로 1회 세척한 후, 50 mL의 FCC-M 배지를 함유하는 삼각 플라스크 내에 접종하였다(1/1000 v/v). 26　℃에서 교반(220 rpm) 중에 3 일의 인큐베이션 후에 세포 배양물의 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 2
삼각 플라스크 내에서 성장한 세포의 지방산 프로파일:
도 2에 열거된 균주를 조제 해수염(인스턴트 오션®, 15 g/L)을 함유하는 배지 내에서 2 일 동안 최초 배양하고, 이어서 원심분리하여 FCC-M 용액(표 2(c))으로 1회 세척한 후, 암모늄 설페이트가 효모 추출물(4 g/L)로 치환된 50 mL의 FCC-M 배지를 함유하는 삼각 플라스크 내에 접종하였다(1/1000 v/v). 26　℃에서 교반(220 rpm) 중에 3 일 동안 인큐베이션한 세포 배양물로부터 지방산(FAME) 프로파일을 결정하였다.
실시예 3
생물반응기 내에서의 성장 및 DHA 생산의 시험:
1 내지 2 L 사용 가능한 발효기(생물반응기) 내에서 전산화 통제를 동반하는 전용 자동 장비로 아우란티오키트리움 배양물을 제조하였다. 염기(NaOH 또는 KOH) 및/또는 산(황산 용액)을 첨가함으로써 시스템의 pH을 조정하였다. 배양 온도는 26 ℃로 설정하였다. 러쉬톤(Rushton) 구성(다운-펌핑(down-pumping)을 동반하는 3-블레이드 임펠러)에 따라 샤프트 상에 위치하는 3개의 교반 로터에 의해 교반을 실행하였다. 교반 속도(250-1200 rpm), 공기 유속(0.25-1 vvm), 및 산소 유속(0.1-0.5 vvm)에 의해 배양 전체에 걸쳐 배지 내의 용존 산소 압력을 조정하였다. 자동 통제 시스템에 내장된 조정 파라미터가 5% 내지 30%의 일정한 pO2 를 유지하는 것을 가능하게 했다. 배양 시간은 50 내지 200 시간, 바람직하게 65 내지 96 시간, 예를 들어 72 시간이었다.
온도-제어함(26　℃) 내의 진탕 테이블(140 rpm) 상에서 질소원으로서 4 g의 효모 추출물 및 탄소원으로서 30 g의 글루코스를 함유하는 FCC-M 배지 내에 전배양물을 제조하였다. 48 시간의 인큐베이션 후에, 세포를 5 분 동안 3000 g로 원심분리하고 효모 추출물 및 임의의 다른 무기 또는 유기 질소원을 함유하지 않는 FCC-M 배지로 세포 펠렛을 세척하였다. 배양 중에, 첨가 용액 1의 3회 첨가와 더불어 용액 2의 첨가를 실행하여 200 mM 내지 500 mM의 글루코스 농도를 유지하였다.
배양 모니터링 :
건조 질량을 측정함으로써 총 바이오매스 농도를 모니터링하였다(와트만(Whatman) GF/F 필터 상에서 여과하고, 이어서 적어도 24 시간 동안 105 ℃에서 오븐 내에 건조시킨 후에 칭량함).
문헌[Folch J, et al., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J Biol Chem. 1957 May; 226(1):497-509]에 고전적으로 기재된 방법에 따라 총 지질 및 FAME의 함량을 분석하였다.
실시예 4
발효기 내에서의 배양:
실시예 3에 기재된 것과 유사한 방식으로 발효기 내에서 아우란티오키트리움 배양물을 제조하였다. 동물 사료용 부산물의 가치화를 더 어렵게 할 수 있는, NaOH 또는 KOH를 사용하는 pH 조정과 연계된 유의적인 Na+ 또는 K+ 공급을 방지하기 위하여, 암모니아(NH4OH)를 첨가함으로써 pH 조정 방법에 관해 절차를 수정하였다. 암모니아(NH4OH)를 이용하는 pH 조정을 통해 세포 배양에 필요한 질소의 일부가 공급되므로, 첨가 용액 1의 조성에 (NH4)2SO4를 포함하는 것이 더이상 필요하지 않았다.
표 3은 이 실시예의 결과를 제공한다.
Figure pct00010
조류 및 원생동물 은행 CCAP4062/1 20130621
SEQUENCE LISTING <110> Fermentalg <120> Method for culturing microalgae of the Aurantiochytrium genus in a culture medium without chloride and without sodium for the production of DHA <130> IPA161300-FR <150> FR 1452960 <151> 2014-04-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1210 <212> DNA <213> Aurantiochytrium Mangrovei CCAP 4062/1 <400> 1 aagcatatgc taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaatttctg gcatgggcga 60 ccggtgcttt ccctgaatgg ggattgattg tctgcgttgc cttggccatc tttctcatgc 120 tattttggta tgagatcttt cactgtaatc aaagcagagt gttccaagca ggtcgtatga 180 ccggtatgtt tattatggga tgataagata ggacttgggt gctattttgt tggtttgcac 240 gcctgagtaa tggttaatag gaacagttgg gggtattcgt atttaggagc tagaggtgaa 300 attcttggat ttccgaaaga cgaactagag cgaaggcatt taccaagcat gttttcatta 360 atcaagaacg aaagtctggg gatcgaagat gattagatac catcgtagtc tagaccgtaa 420 acgatgccga cttgcgattg ttgggtgctt tatacatggg cctcagcagc agcacatgag 480 aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact taaaggaatt 540 gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac acgggaaaac 600 ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcatg attctatggg 660 tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt ccgttaacga 720 acgagacctc ggcctactaa atagtgcgtg gtatggcaac atagtgcgtt tttacttctt 780 agagggacat gtccggttta cgggcaggaa gttcgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 840 ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgatgggtt catcgggttt taatttcaat 900 ttttggaatt gagtgcttgg tcggaaggcc tggctaatcc ttggaacgct catcgtgctg 960 gggctagatt tttgcaatta ttaatctcca acgaggaatt cctagtaaac gcaagtcatc 1020 agcttgcatt gaatacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgcacc taccgattga 1080 acggtccgat gaaaccatgg gatgtttctg tttggattca tttttggaca gaggcagaac 1140 tcgggtgaat cttattgttt agaggaaggt gaagtcgtaa caaggtttcc gtaggtgaac 1200 ctgcagaagg 1210 <210> 2 <211> 952 <212> DNA <213> Aurantiochytrium Mangrovei CCAP 4062/1 <220> <221> misc_feature <222> (918)..(918) <223> unknown <400> 2 ttgtcggccg ccccaagcac cccggtatca tggttggtat ggaccagaag gacgcctatg 60 tcggtgatga ggcccagtcc aagcgtggtg tcctcaccct caagtacccc attgagcacg 120 gtatcgtgac caactgggac gacatggaga agatctggca ccacaccttc tacaacgagc 180 tccgcgttgc ccccgaggag caccccgttc tcctcaccga ggcccccctc aaccccaagg 240 ccaaccgtga gcgcatgacc cagatcatgt tcgagacctt caacgtgccc gccatgtacg 300 tcaacatcca ggccgttctc tccctctacg cctctggtcg taccaccggt gccgtcctcg 360 actctggtga tggtgtcacc cacaccgtcc ccatctacga gggttacgct ctcccgcacg 420 ccgttctccg tatcgatctt gccggccgtg acctcaccga ctacatgatg aagatcctca 480 ccgagcgtgg ctactccttc accaccaccg ccgagcgcga aattgtccgt gacatcaagg 540 agaagctcgc ctacgtcgcc caggacttcg acgaggagat gcgcctcgcc gccgagtcct 600 ccgccctcga gaagtcctac gagcttccgg acggtaacgt catcaccatc ggcaacgagc 660 gcttccgctg ccccgaggtt ctcttccagc cgtccttcat cggcaaggag gcccagggtg 720 tccacgacac catgttccag accatcatga agtgtgacgt cgatatccgc aaggacctct 780 acgccaacat cgtcatgtct ggtggctcca ccatgtacga gggtctcgcc gctcgtctcg 840 agaaggagat gatcgccctt gccccctcca ccatgaagat caaggtcgtc gccccccctg 900 agcgcaagta ctccgtgngg atcggtggct ccattcttgc ctccctctcc ac 952 <210> 3 <211> 828 <212> DNA <213> Aurantiocytrium Mangrovei CCAP 4062/1 <220> <221> misc_feature <222> (45)..(49) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (554)..(554) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (643)..(643) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (692)..(692) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (704)..(704) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (707)..(707) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (719)..(719) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (723)..(724) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (733)..(733) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (766)..(766) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (769)..(769) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (777)..(777) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (786)..(786) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (788)..(788) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (791)..(791) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (795)..(795) <223> unknown <220> <221> misc_feature <222> (805)..(805) <223> unknown <400> 3 tctcatccat accctcacca gtgtaccagt gaaggaaggc cttannnnng aacatgctgg 60 tgaactgctc agaaacacgc ttgaacatct cctggacggc ggtggtgtta ccgacaaagg 120 tacaagacat cttgagaccc ttggggggga tgtcacagac agaggacttg atgttgttgg 180 ggatccactc aacaaagtag ctcgagttct tgttctgaac gttgagcatc tgctcgtcaa 240 cctccttggt ggacatgcgg ccacggaaga gggtggtggc agtgaggtag cgaccgtggc 300 ggggatcggc ggcgcacatc atgttcttgg catcgaaggc ctgctgggtg agctcgggaa 360 cggtgagagc acggtactgc tgggagccac gggaggtgag gggggagaag ccaatcatga 420 agaagtgaag acgggggaag ggaatcaagt tcacagcgag cttacggagg tcagagttga 480 gctgaccagg gaagcgaagg cagcaagtgc agccagacat ggcagcgcac acaaggtggt 540 tgaggtcacc gtangtgggg gtggtgagct tgagggtgcg gaagcaaata tcgtagaggg 600 cctcgttatc gagaaccatg acctcatcag cgttctcaac aanctggtgg acagagagag 660 tggcgttgta aggctcgacg acggtatcag anaccttggg gganggnaca atagagaang 720 tanncatgat acngtcgggg tactcctcac ggatcttgct gatcanganc gtacccntac 780 cagatncngg naccnccacc gaggnagtgg gtgatctgga agccctgg 828 <210> 4 <211> 879 <212> DNA <213> Aurantiochytrium Mangrovei CCAP 4062-1 <400> 4 tcccaggccg atgttgccgt tctcgtcatt gactcttccc agggtggttt cgaggccggt 60 atcgccaagg atggccagac tcgtgagcac gctctcctcg ccttcaccct cggtatccag 120 cagatcatcg tcgccgtcaa caagatggac gacaagacca ccatgtactc tgaggcccgc 180 ttcaacgaga tcgtcaacga ggtttccgcc tacctcgcca aggtcggctt caagcccaag 240 aagatcaagt tcgtccccat ctccggctgg gctggtgaca acatgatcga gaagtcctcc 300 aacatgccct ggtacaaggg cccctacctt ctcgaggccc tcgacaacat caagcccccc 360 aagcgcccca tcgacaagcc tctccgtctt cccctccagg atgtgtacaa gatcggtggt 420 atcggaacgg tccccgtcgg ccgtgtcgag accggtgtca tcaagcccgg tatgaccgcc 480 tactttgccc ccaccggtgt gcagactgag gtcaagtccg tcgagatgca ccacgagtcc 540 atccccgagg ccacccccgg tgacaacgtt ggcttcaacg tcaagaacgt ttccgtcaag 600 gacatcaagc gcggtaacgt ctgtggtgat gccaagaacg accctccccg tggcgccaac 660 tccttcctcg cccaggttat cgtcatgggc caccccggtg agatccgcgc tggctacgca 720 ccagtcctcg attgccacac cgcccacatt gcctgcaagt tcgccgagat ccagaacaag 780 atggaccgtc gttccggtaa gatccttgag gatgccccca agttcatcaa gtccggtgac 840 tccgccatgg tcaagatgat cccctccaag aagatgtgc 879

Claims (16)

  1. a) 종속영양 또는 혼합영양 조건 하에, 3.5 g/L 미만의 소듐 이온 및 1 g/L 미만의 클로라이드 이온을 가지며 200 mM 내지 500 mM의 유기 탄소-함유 기질을 갖는 화학적으로 정의된 배양 배지 내에서, 서열 번호 1의 서열에 대해 적어도 92%의 유전적 동일성을 나타내는 아우란티오키트리움(Aurantiochytrium) 속의 하나 이상의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, DHA를 생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    아우란티오키트리움 속의 균주(들)가 또한 서열 번호 2의 서열에 대해 적어도 96%의 유전적 동일성, 및/또는 서열 번호 3의 서열에 대해 적어도 91%의 유전적 동일성, 및/또는 서열 번호 4의 서열에 대해 적어도 95%의 유전적 동일성을 나타냄을 특징으로 하는 배양 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    배양 배지가 3.5 g/L 미만, 바람직하게 1 g/L 미만, 더욱 바람직하게 6 mg/L 미만의 소듐 이온, 및 200 mg/L 미만의 클로라이드 이온을 가짐을 특징으로 하는 배양 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지가 만니톨, 소르비톨, 폴리에틸렌 글리콜, 및 수크로스와 같은 삼투압 조절제를 함유하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    b) 상기 배양을 몇 세대 동안 유지하는 단계,
    c) 그렇게 배양된 바이오매스를 회수하는 단계,
    d) 균주의 지질을 회수하는 단계, 및 임의로,
    e) DHA(도코사헥사엔산)를 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    배양 배지가 하기와 같이 구성됨을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00011
  7. 제6항에 있어서,
    단계 b)로부터 유래된 바이오매스가 적어도 100 g/L의 건조물(dry matter)을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    단계 b)의 종결시에 DHA 농도가 적어도 15 g/L를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b)의 종결시에 바이오매스 내에 함유된 DHA가 총 지질의 30% 초과를 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 0.1 g/L/h의 DHA 생산성을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    아우란티오키트리움 속의 상기 유기체가 CCAP(Culture Collection of Algae and Protozoa)에 수탁 번호 CCAP 4062/1로 기탁된 균주 FCC 1324에 상응함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 얻어지는 바이오매스 및/또는 부산물 중 일부 또는 전부의, 인간 소비용 제품 내의 성분인 산물로서의 용도 또는 동물 사료용, 특히 양식용 원료로서의 용도.
  13. 하기와 같이 구성됨을 특징으로 하는 배양 배지:
    Figure pct00012
  14. 제13항에 있어서,
    하기와 같이 구성됨을 특징으로 하는 배양 배지:
    Figure pct00013
  15. 지질 및 색소 생산용 원생생물(protist)을 배양하기 위한, 제13항 또는 제14항에 따른 배양 배지의 용도.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법을 구현하기 위한, 제13항 또는 제14항의 배양 배지의 용도.
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