CN106795538A - 在无氯化物和无钠的培养基中培养橙壶菌属的微观藻类以产生dha的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及红树橙壶菌(Aurantiochytrium mangrovei)类别的原生生物的培养方法。该类别在遗传方面和通过其脂质谱来进行表征。所述方法使得能够获得高的生物质产率和如此培养的原生生物对于脂质(更特别地，二十二碳六烯酸(DHA))的富集。本发明涉及调制出一种培养基，其使得能够以高细胞密度产生富含DHA的红树橙壶菌类别的原生生物。所述培养基是化学成分确知的，其中具有低含量的钠离子(Na+)和氯离子(Cl‑)。

Description

在无氯化物和无钠的培养基中培养橙壶菌属的微观藻类以产 生DHA的方法
本发明涉及红树橙壶菌(Aurantiochytrium mangrovei)类别的破囊壶菌类细胞的培养方法.所述方法使得能够获得高的生物质产率和如此培养的原生生物对于脂质(更特别地，二十二碳六烯酸(DHA))的富集.本发明涉及制定出一种培养方法，其使得能够在具有低含量的钠离子(Na+)和氯离子(Cl-)的化学成分确知的培养基上以高细胞密度产生富含DHA的破囊壶菌类.
本发明仅涉及属于橙壶菌属(Aurantiochytrium)的破囊壶菌类。该属通过遗传、代谢和生理学特征来界定.
所述培养方法(通过该培养方法，在既不显著添加钠离子(Na+)也不显著添加氯离子(Cl-)的情况下培养细胞)使得能够以高细胞密度(大约125至140g/L干物质)产生红树橙壶菌.该生物质富含DHA，其中具有15至20g/L培养物，优选地20至25g/L培养物，或甚至25至30g/L培养物的比率.
非常少量的氯化钠，特别地非常少量的氯离子(Cl-)和钠离子(Na+)，存在于对于该方法来说必需的培养基中.因此，在所述培养基中，存在小于1g/L，优选地小于0.5g/L，更优选地小于0.2g/L的氯离子，以及小于100mg/L，优选地小于50mg/L，和更优选地小于6mg/L的钠离子(Na+).这使得能够摆脱对于与培养基相接触的设备来说必需的超额投资成本以及大幅降低处理排放物的成本，摆脱与在生物质中钠盐或氯化物的存在相关联的弊端，并且通过减少投料(为了改善产率而添加到培养物中的产品)来降低培养基的成本.
序言
目前，原生生物是许多工业项目的目标，因为某些物种能够积累或分泌重大量的脂质，尤其是多不饱和脂肪酸.
在多不饱和脂肪酸之中，某些ω-3系列的高度不饱和的脂肪酸(HUFA)(PUFA-ω3)，特别是二十碳五烯酸(EPA或C20：5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA或C22：6ω3)，以及某些ω-6系列的高度不饱和的脂肪酸(PUFA-ω6)，特别是花生四烯酸(ARA或AA或者二十碳四烯酸C20：4ω6)，具有公认的营养重要性并且在治疗应用方面具有强大的潜力.
被认为是必需营养素的DHA对于细胞的正常的和功能性的发育来说是必需的，并且在各种生物化学过程和功能中发挥关键作用.DHA通过掺入到细胞膜中而对于中枢神经系统的发育和视网膜的功能来说是必不可少的，并且在视觉和记忆的机制的令人满意的获取和维持中发挥首要作用.
已知破囊壶菌类(特别是橙壶菌属)产生DHA，当它们以异养方式进行培养时[W.K.Hong等人，(2011)，Production of lipids containing high levels ofdocosahexaenoic acid by a newly isolated microalga，Aurantiochytriumsp.KRS101.Appl.Biochem.Biotechnol.，164(8)：1468-80].还已知橙壶菌属产生类胡萝卜素，例如虾青素、玉米黄质、角黄素、海胆酮、β-胡萝卜素和芬尼黄质(phoenicoxanthin)[Yokoyama，R，Honda，D.(2007)Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytriumsensu lato based on morphology，chemotaxonomic characteristics，and 18S rRNAgene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation forSchizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.；Mycoscience，Vol.48，pp.199-211].
为了实施以工业规模由原生生物生产脂肪酸，应当考虑多种因素以使得该生产是赢利的.在这些因素之中，可以提及：
-原料和设备(其购买或租赁及其维护)的成本，以及劳动力的成本；
-生产的技术要求：例如预培养和培养步骤的数量和技术困难，培养的在线监测，和为了对产物再利用而对来自所述培养的生物质进行处理的步骤；
-来自所述培养的排放物的处理.
目前用于以异养方式或兼养方式培养破囊壶菌科的原生生物的培养基包含显著量的盐，特别是氯化钠.作为例子，可以提及ATCC Medium No.790这种培养基(11g/L的Na+和19g/L的Cl-).
在生产油和/或其他目的分子的方法中使用氯化钠(NaCl)来培养破囊壶菌科的海洋原生生物导致在投资和排放物处理方面的重大的超额成本，并且限制联产物的再利用.
这是因为，氯离子引起不锈钢的坏损，所述不锈钢是用于制造发酵罐、培养基的制备和灭菌器具以及其他用于培养微观藻类和处理所得生物质的设备的材料.该现象的后果之一是生物质的生产和处理(“下游加工(Down-Stream Processing)”或“DSP”)器具的过早坏损.
为了避免设备坏损这一问题，可以使用由更耐氯离子的特殊合金制成的设备。这些更耐盐的材料是成本更高的。在该情况下，用于生产的投资成本大幅升高.
此外，氯化钠(或者其他钠盐，例如硫酸钠、碳酸钠类型的钠盐)的使用导致在排放物处理(特别是水脱盐)方面的重大的超额成本.
最后，在由在提取油后剩余的生物质构成的油饼型联产物中钠盐的存在妨碍其再利用，尤其是用于动物营养、鱼类养殖，或者作为用于化妆品或在制药工业中的成分.
US 5 518 918描述了用其他类型的钠盐(硫酸钠、碳酸钠......)来代替氯化钠.即使这使得能够摆脱不透钢设备的过早损耗，但在培养基中添加钠盐却既不能允许摆脱与排放物处理相关的超额成本，也不能允许摆脱上面所指出的联产物再利用的问题.
另外，用其他钠盐代替NaCl导致与购买替代品盐相关的超额成本.
在Yokochi等人的标题为“Optimization of docosahexaenoic acid productionby Schizochytrium limacinum SR21”的文章[(1998)Appl.Microbiol.Vol.49，pp.72-76]中，研究了蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21这一菌株对于盐条件的耐受性.该菌株对于高的盐浓度具有大的耐受性，所述浓度在海水浓度的50％和200％之间.该菌株在无盐的培养物中的生长比在包含50％海水的培养物中的生长低两倍.我们注意到，在该研究中所使用的基础培养基还包含3％的葡萄糖和1％的酵母提取物.在专利US 8,900,831中描述了声称“无盐”或“低盐浓度”的培养基.然而，如对于Yokoshi等人一样，酵母提取物的添加对于微观藻类的生长来说是必需的。但是，这样的补充有酵母提取物的培养基包含超过30mg的钠和氯的盐.
此外，酵母提取物的添加代表了关于培养基的额外成本，和还代表了在为了用作食品或药品的最终生物质的质量方面的缺点.酵母提取物不是标准化产品，并因此酵母提取物的批次不是同质的.因此，这对于从包含酵母提取物的培养基的生物质产生的最终产品的同质性具有影响.
Shabala等人[“Osmotic adjustment and requirement for sodium in marineprotist thraustochytrid”(2009)Environmental Microbiology Vol.11(7)，pp.1835-1843]证明，破囊壶菌属(Thraustochytrium)可以在具有低含量的钠(1mM)的培养基中生长，条件是该培养基补充有诸如甘露糖醇或蔗糖的化合物，其允许该无钠的培养基的渗透压调节.然而，这些化合物的存在导致与这些材料的成本相关联的超额成本.另外，尽管添加了调节培养基渗透性的化合物，但是在无盐和用甘露糖醇的情况下获得的生物质产率(200,000个细胞/毫升)对于工业生产DHA来说仍是不足的.
在Shabala等人的最近的一篇文章[“Thraustochytrids can be grown in low-salt media without affecting PUFA production”，Marine Biotechnology(2013)15：437-444]中，通过用UV对蛞蝓裂殖壶菌SR21进行随机诱变而获得了一个突变体(命名为OUC88)，并对其进行了测试以确定引起脂肪酸组成的变化的环境因素.该文章的图2显示，一旦盐浓度低于0.9％，生物质和脂质量就大大减少(小于20g/L的生物质和小于10g/L的脂质).
希望可以在最佳条件下培养破囊壶菌类，以增加待产生的脂肪酸的产率，同时避免与钢制设备的损耗相关的问题，并降低关于发酵以及关于处理所得生物质的生产成本.特别地，希望提供橙壶菌属的培养方法，其使得能够减少(甚至基本上去除)培养基的钠离子和氯离子，并且无需添加其他培养组分，所述其他培养组分可以导致与排放物处理相关的超额成本以及与DSP的额外步骤和最终产物的再利用问题相关的超额成本.
在本发明的背景下，希望获得对于工业生产DHA来说足够的生物质和脂质的产率.因此，希望获得例如大于100g/L干物质，优选地大于130g/L干物质，更优选地大于150g/L干物质的产率.因此，希望获得例如相对于干物质的总重量而言大于40％(甚至大于50％)的脂肪酸.还希望获得例如相对于干物质的总重量而言在脂肪酸中大于30％(甚至大于40％)的DHA。
因此，正是在众多的菌株筛选实验结束时，申请人终于鉴定出能够在化学成分确知的培养基中生长的橙壶菌属的原生生物菌株，所述培养基没有添加钠，氯化物，有机源例如酵母提取物，渗压剂例如甘露糖醇或蔗糖，如在Shabala等人的文章(2013)中所定义的(或者其他渗压剂，例如山梨糖醇、聚乙二醇PEG).
在本发明条件下所培养的这些菌株使得能够获得以高的生物质(大于110g/L，优选地大于120g/L)和多不饱和脂肪酸(尤其是DHA)(大于15g/L，优选地大于20g/L)的产率来进行生产.
[根据布达佩斯条约的规定，本发明所涉及的一个菌株(FCC 1324)(作为如此分离和选择出的橙壶菌属菌株的代表)于2013年6月21日以登录号CCAP 4062/1保藏于CCAP(藻类和原生动物保藏中心(Culture Collection of Algae and Protozoa)，ScottishAssociation for Marine Science，Dunstaffnage Marine Laboratory，Oban，ArgyllPA371QA，苏格兰，英国).]
图1：显示了编码核糖体RNA的小亚基的DNA序列之间的关系的系统发生分析.所述序列用Mega 5.1的ClustalW进行比对.通过使用最大似然法来进行所述分析。在该研究中所使用的破囊壶菌类菌株属于下列类别：红树橙壶菌(Aurantiochytrium mangrovei)、裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)、和聚生裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、威瑟氏吾肯氏壶菌(Ulkenia visurgensis)、吾肯氏壶菌属物种(Ulkenia sp.)、深洋吾肯氏壶菌(Ulkenia profunda)、葡萄壶菌属物种(Botryochytrium sp.)、放射葡萄壶菌(Botryochytrium radiatum)、壁壶菌属物种(Parieticytrium sp.)、沙氏壁壶菌(Parieticytrium sarkarianum)、克尔格伦不游走壶菌(Aplanochtytrium kerguelense)、斯氏不游走壶菌(Aplanochtytrium stocchinoi)、多原状长形壶菌(Oblongichytriummultirudimentale)、长形壶菌属物种(Oblongichytrium sp.)和致病疫霉(Phytophthorainfestans).如果自展值(bootstrap value)大于75％，则其被认为是显著的.
图2：在锥形瓶中用具有低含量的Na+和Cl-的FCC-M培养基来进行的生长测试.根据本发明的实施方式在培养基中进行了本发明所涉及的菌株(黑色的)与本发明不涉及的菌株(灰色的和划有线的)的生长的比较。关于每个菌株的柱的长度表示光密度(实施例1).
图3：在锥形瓶中培养的各种不同的破囊壶菌类菌株的脂肪酸谱(实施例2)。
(A)和(B)：以红树橙壶菌为例的根据本发明的类别(蛞蝓橙壶菌(Aurantiochytrium limacinum)为其成员)(图板的前三行)与裂殖壶菌属物种的类别(其包括菌株ATCC 20888)以及橙壶菌属物种SEK 217和SEK209这些菌株(图板的后三行)之间的脂肪酸谱的比较.培养条件描述在实施例2中.
图4：在生物反应器中培养的各种不同的破囊壶菌类菌株的脂肪酸谱(实施例3和4).
(A)和(B)：根据本发明的菌株的脂质谱.(A)以相对于总PUFA(多不饱和脂肪酸)而言的百分比来表示的PUFA.(B)以相对于总饱和脂肪酸而言的百分比来表示的饱和酸.用KOH或NH4OH来调节pH的培养物分别通过缩写(KOH)或(NH4OH)来识别.培养条件描述在实施例3和4中。
详细描述
“菌株”不仅是指根据本发明所定义的橙壶菌属的天然菌株，而且还是指所述天然菌株的突变体。
“化学成分确知的”是指任何这样的产品或产品混合物，所述产品或产品混合物的化学组成是已知的并且构成所述产品或混合物的其每种组成成分的含量是已知的.
“化学成分确知的培养基”是指这样的培养基，其中每种组成成分的含量是已知的，即不存在酵母提取物或其他复杂的蛋白质来源或其他有机材料，例如蛋白胨或其他复杂的生长试剂，其组成在自然界中和在不存在固定浓度的每种这些组分的情况下均是可变的.
“渗透压调节试剂”是指存在于培养基中的使得能够维持该培养基中的渗透压的试剂.
“遗传一致性”是指通过BLAST类型的软件实现的两个DNA序列之间的一致性。
因此，本发明的目标在于在基本上不含钠(Na+)和氯化物(Cl-)的有机培养基中以异养或兼养方式培养红树橙壶菌和蛞蝓橙壶菌类型的某些原生生物的方法.该培养方法使得能够获得高的生物质产率和脂质(特别是DHA)产率.
本发明所涉及的菌株具有在化学成分确知的培养基中以高密度进行生长的能力，在所述培养基中没有添加显著量的钠离子和氯离子，并且没有添加渗透压调节试剂，例如甘露糖醇、山梨糖醇或聚乙二醇.根据最近的系统发生分类，它们为红树橙壶菌和蛞蝓橙壶菌类型的破囊壶菌类菌株，其已知产生DHA[Yokoyama R等人，(2007).Taxonomicrearrangement of the genus Ulkenia sensu lato based on morphology，chemotaxonomical characteristics，and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation for Ulkenia and erectionof Botryochytrium，Parietichytrium.Mycoscience.48(6)p.329-341；Yokoyama，R.，Honda，D.(2007)Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensulatobased on morphology，chemotaxonomical characteristics and 18S rRNA genephylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes，stramenopiles)：emendationfor Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytriumgen.nov.Mycoscience 48，199-211；Tsui CK等人，(2009)Labyrinthulomycetesphylogeny and its implications for the evolutionary loss of chloroplasts andgain of ectoplasmic gliding.Mol Phylogenet Evol.50(1)：p.129-40].
应当注意，按照常规，这些类别的微观藻类的以异养方式的培养用基于海水的培养基来进行，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)所使用的那种，即培养基ATCC 790By+(1.0g酵母提取物、1.0g蛋白胨、5.0g D(+)-葡萄糖和1升海水).
所述菌株在遗传方面以及通过其脂质谱来进行表征.
本发明所涉及的菌株通过其基因中的四个基因即18s、肌动蛋白、微管蛋白和EF1-α与本发明菌株的代表性菌株即菌株FCC 1324的基因的遗传一致性来进行表征.菌株FCC1324是如此分离和选择出的新的橙壶菌属菌株的代表，并且于2013年6月21日以登录号CCAP 4062/1保藏于CCAP(藻类和原生动物保藏中心(Culture Collection of Algae andProtozoa)，Scottish Association for Marine Science，Dunstaffnage MarineLaboratory，Oban，Argyll PA371QA，苏格兰，英国).
表1(a)为在红树橙壶菌这一类别与在遗传上最接近的裂殖壶菌属物种这一类别以及其他在遗传上接近的菌株之间的四种基因的序列的比较.所有有着与菌株CCAP 4062-1的基因具有91％至100％的一致性(根据所比较的基因)的序列的菌株可以被认为属于橙壶菌属.与所考虑的CCAP 4062-1的18s基因的至少92％的遗传一致性表征了根据本发明的菌株.
对于18s基因(SEQ NO.1)具有至少92％的遗传一致性的菌株是本发明所涉及的，并因此可以在减少钠和氯化物的培养基中生长.申请人还观察到，如此通过对于18s基因的其遗传一致性来定义的这些菌株对于肌动蛋白基因(SEQ NO.2)具有至少96％的遗传一致性，对于微管蛋白基因(SEQ NO.3)具有至少91％的遗传一致性，和对于EF1-α基因(SEQNO.4)具有至少95％的遗传一致性.这些一致性百分比复述在表1(b)中.
表1(b)
图1显示了系统发生分析，其导致本发明所涉及的菌株的该定义.
在该研究中所使用的破囊壶菌类菌株属于红树橙壶菌、裂殖壶菌属物种和聚生裂殖壶菌类别.
所述序列用Mega 5.1的CLUSTAL W进行比对.在该图中，位于分枝处的数字为自展值.
70％的自展值被视为界限，不应当跌落至低于该界限，以便使得两个群之间的分枝保持显著.根据Hillis D.M.和Bull J.J.在其文章“An empirical test ofbootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis”[(1993)Systematic Biology Vol.42，pp.182-192]中的描述，大于70％的自展(bootstrap)比例通常相应于有至少95％的可能性出现相应的进化枝(群)是真实的。
在图1中，这意味着，红树橙壶菌这一群与裂殖壶菌属物种这一群之间的差异是显著的，因为分开这两个群的结点具有100％的值；并且因此存在两个不同的类别.这两个群本身非常远离聚生裂殖壶菌这一群，正如已经由Yokoyama和Honda[(2007)，Taxonomicrearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology，chemotaxonomic characteristics，and 18S rRNA gene phylogeny(Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycetes)：emendation for Schizochytrium anderection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.，Mycoscience Vol.48，pp.99-211]所证明的.
在图1中，本发明所涉及的菌株为在该图顶部的第一群的那些，并且具有红树橙壶菌这一名称.
因此，作为本发明所涉及的菌株的例子，在发明人所鉴定出的经分类的系统发生类群中，可以提及橙壶菌属物种SD116(JX863672)、蛞蝓橙壶菌(AB022107)、红树橙壶菌(DQ367049)、蛞蝓橙壶菌SL1101(JN986842)、蛞蝓橙壶菌(JN986842)、橙壶菌属物种LY2012(JX847370)、蛞蝓橙壶菌(HM042909)和橙壶菌属物种BL10(FJ821477)这些菌株。括号内的编号为登录号。
这是因为，这些菌株中的每一个与菌株CCAP 4062/1的序列具有相对于序列SEQNO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3和SEQ NO.4而言分别为至少92％、至少96％、至少91％和至少94％的一致性百分比。
例如，与序列SEQ NO.1具有92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的遗传一致性的橙壶菌属菌株是本发明所涉及的。这些菌株还与序列SEQ NO.2具有96％、97％、98％、99％或100％的遗传一致性，与序列SEQ NO.3具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的遗传一致性，和与序列SEQ NO.4具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的遗传一致性.
表1(a)详细地显示了本发明所涉及或不涉及的菌株与菌株CCAP 4062/1的遗传一致性的比较。
注意到，裂殖壶菌属物种ATCC 20888(DQ367050)这一菌株和FCC1412裂殖壶菌属物种SEK 209(AB290574)这一菌株均不属于本发明所涉及的菌株.对于这些菌株，与SEQNO.1的一致性值为91％.
这些菌株具有在具有非常少量的氯化钠的化学成分确知的(即不存在酵母提取物或其他蛋白质提取物)培养基中以高密度进行生长的能力.该培养基的特征在于，其包含小于3.5g/L，优选地小于1g/L，更优选地小于10mg/L的钠离子，和小于1g/L，优选地小于0.5g/L，更优选地小于0.2g/L的氯离子。
在实施例1中，在这样的培养基(关于主培养基，参见表2(a))中，申请人用根据本发明的菌株以及用本发明不涉及的比较菌株在锥形瓶中进行了生长测试.所述培养在无机氮(NH4)2SO4和作为碳源的葡萄糖存在下并且在不供给有机氮的情况下来进行.因此，图2图解说明了来自这些试验的结果.结果显示，所有的红树橙壶菌菌株均具有在该培养基上生长的能力，这与其他所测试的破囊壶菌类类别(裂殖壶菌属物种和聚生裂殖壶菌)相反.
观察到，关于18s、肌动蛋白、微管蛋白和EF1-α基因，根据本发明的菌株与菌株FCC1324分别具有至少92％、至少96％、至少91％和至少95％的遗传一致性.
本发明所涉及的菌株还通过其脂质谱来进行表征.取菌株CCAP 4062/1作为根据本发明的菌株的例子和代表.
图3(A)和3(B)显示了在两种不同类别的菌株之间的脂肪酸谱的比较.由红树橙壶菌来举例说明的根据本发明的类别(蛞蝓橙壶菌为其成员)(每个图板的前三行)与裂殖壶菌属物种的类别(其包括菌株ATCC 20888)以及橙壶菌属物种SEK 217和SEK 209这些菌株(每个图板的后三行)。在根据在实施例2中所描述的本发明实施方式的培养条件下，红树橙壶菌这一类别的脂质谱呈现出占大多数的DHA(超过总PUFA的80％).
在图3(A)中可见，ATCC 20888以及橙壶菌属物种SEK 217和SEK 209这些菌株具有不同的谱，其中具有相对于根据本发明的菌株而言更多的EPA。
DPA(n-6)占总PUFA的大约20％，其中具有较少量的AA和EPA(参见图3(A))。与菌株CCAP 4062/1具有遗传相似性的其他菌株也呈现出该谱.
图3(B)显示，ATCC 20888以及橙壶菌属物种SEK 217和SEK 209这些菌株具有不同的饱和脂肪酸谱，其中具有较少的棕榈酸和较大量的奇数脂肪酸C15：0和C17：0。
图4(A)显示了以相对于总PUFA(多不饱和脂肪酸)而言的百分比来表示的PUFA.图4(B)显示了以相对于总饱和脂肪酸而言的百分比来表示的饱和脂肪酸.用KOH或NH4OH来调节pH的培养物分别通过缩写(KOH)或(NH4OH)来识别.依照培养条件，该谱几乎保持不变.DHA是占大多数的多不饱和脂肪酸，占总不饱和酸的差不多80％.在根据在实施例3和4中所描述的本发明实施方式的培养条件下，C16：0仍然是占大多数的饱和脂肪酸，占总饱和酸的大于90％.
因此，发明人定义了本发明所涉及的菌株.这些菌株具有在没有添加显著量的钠和氯化物的化学成分确知的培养基中以高密度进行生长的能力.
这些菌株的培养通常以异养方式来进行.
根据本发明的化学成分确知的培养基包含对于微生物的生长来说必需的碳源、氮源和盐.本领域技术人员熟知在发酵过程中对于微生物的生长来说必需的要素.
根据本发明的一个优选的实施方式，碳源为化学成分确知的来源，其选自葡萄糖、甘油，优选地为葡萄糖.
在所述培养基中碳源的含量有利地为10至90g/L，或10至75g/L.
氮源有利地为化学成分确知的无机或有机来源，不包括任何含氮的复杂的有机材料，例如酵母提取物或蛋白质性质的提取物混合物.
优选地，氮源为铵盐，特别是硫酸铵，和/或硝酸盐，特别是硝酸钾.
在所述培养基中氮源的含量有利地为1至10g/L.
主培养基可以包含本领域技术人员已知用于培养根据本发明的微观藻类的任何其他组分。所述培养基通常包含化学成分确知的无机盐，例如碱金属盐和碱土金属，以及其他金属的盐.作为例子，可以提及Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的盐.例如，可以提及硫酸盐，例如硫酸钾、硫酸镁、硫酸铁、硫酸铵、硫酸镁、或硫酸铜、硫酸镍、硫酸锌.还可以提及磷酸盐，例如酸式磷酸钾，或碳酸盐，例如碳酸钙.还可以提及氯化物，例如氯化钴、氯化锰、氯化钙.还可以提及碱金属氧化物.还可以提及亚硒酸盐和钼酸盐，例如钼酸钠和亚硒酸钠。其他可用的无机盐例如为卤化物，例如溴化钾或碘化钾.
在培养基中各种不同盐的含量取决于微生物为了其生长的需要.某些盐仅作为供给微量元素以低的量进行使用，例如锌盐、钴盐、锰盐、钼盐、硒盐、镍盐或铜盐.
如有必要，对于本发明的方法来说特别优选的培养基另外还包含其他组成成分，例如营养组分，至少一种选自硫酸镁、氯化钙、硼酸钾和磷酸钾的盐.在不使得盐的总含量根据本发明是超标的情况下，添加所述盐.特别优选的是，向培养基中添加硫酸镁、氯化钙和磷酸钾.
有利地，离子含量处于在表2(a)(参见下表)中所详细说明的范围内。
表2(a)：培养基的一般组成
在所有情况下，对在培养基中的这些盐的性质和比例进行选择，从而使得钠离子的含量小于3.5g/L，优选地小于1g/L，更优选地小于10mg/L，并且氯离子的含量小于1g/L，优选地小于500mg/L，更优选地大约200mg/L。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述培养基还包含额外的常量或微量营养素，例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素，其是化学成分确知的，即不包括由复杂的来源(例如酵母)携带入培养基中的常量或微量营养素.通常，所述培养基包含本领域技术人员已知的其他介质组分.如果需要，可以添加消泡剂.然而，所述培养基不包含无法是化学成分确知的复杂组分.
所述维生素有利地选自硫胺素、维生素B12、泛酸盐及其混合物.
在所述培养基中维生素的含量有利地处于在表2(a)中所描述的值之间.
根据本发明的一个优选的实施方式，所述化学成分确知的培养基的构成为：化学成分确知的碳源、化学成分确知的氮源、盐和化学成分确知的维生素的混合物.
将会注意到，该培养基特别适合用于在发酵罐中，有利地在至少1000升的发酵罐中进行培养，尤其是以所谓“分批”的不连续方式、以所谓“补料分批”的半连续方式或以连续方式.
根据本发明的一个实施方式的培养基的一个实例如在下面的表2(b)中那样进行了定义.
表2(b)：培养基的实例
根据本发明的一个实施方式的培养基的一个实例如在下面的表2(c)中那样进行了定义。该称为FCC-M的培养基包含0.00038g/l的钠(Na+)和0.437g/l的氯化物(Cl-)。所述培养基不含添加的NaCl.
表2(c)：FCC-M培养基
常规地，在异养或兼养条件下在生物反应器或发酵罐中培养根据本发明的菌株期间，用增补溶液对基础培养基进行补充，以维持微观藻类的生长.还可以添加含碳底物，例如葡萄糖(增补溶液2).本领域技术人员知道确定增补溶液的每种组成成分的浓度.例如，在下面的表3(a)中指明了作为例子的组成成分的含量.
表3(a)：用于在发酵罐或生物反应器中进行的培养的增补溶液1和2的实例
在表3(b)中给出了这样的增补溶液的实例.
表3(b)：用于在发酵罐或生物反应器中进行的培养的增补溶液1和2的实例
根据本发明的一个实施方式，典型地，当在发酵罐或生物反应器中进行培养时，在添加增补溶液以维持细胞的生长之后，Na+的最终浓度为大约10mg/L，优选地小于6mg/L，和Cl-的最终浓度为大约250mg/L，优选地小于200mg/L。
根据本发明的另一个实施方式，当在锥形瓶中进行培养时，Na+的浓度小于5mg/L，优选地小于2mg/L，和更优选地小于1mg/L，和Cl-的浓度为大约1g/L，优选地小于0.750g/L，和更优选地小于0.5g/L.
通常，在培养过程中，进行有机含碳底物的添加(参见例如表3(a或b)的增补溶液2)，以便允许细胞积累高浓度的脂质.在培养过程期间向培养基中添加另外的底物(增补溶液2)，以维持足够的浓度.该有机含碳底物优选地包含(以纯的形式或以混合物形式)：葡萄糖、纤维素衍生物、蔗糖和/或甘油.有机底物的浓度通常在200mM和500mM之间.
在所述培养基中所包含的有机含碳底物可以由复杂的分子或底物的混合物构成.例如，由小分子构成的来自淀粉生物转化(例如以玉米、小麦或马铃薯为原料)的产物，尤其是淀粉水解产物，是适合于以异养或兼养方式培养根据本发明的原生生物的有机含碳底物.
在培养期间，pH位于4和8之间，温度位于20℃和30℃之间，和溶解氧的浓度典型地被调节在5％和30％之间.
该方法的优点在于提高从培养中获得的生物质的产率.该方法的优点还在于使得如此培养的原生生物富含多不饱和脂肪酸，更特别地二十二碳六烯酸(DHA).
根据本发明的一个实施方式，在具有少量NaCl的培养基例如FCC-M培养基(表2(c))中进行预培养，所述培养基包含例如作为氮源的酵母提取物和例如作为碳源的葡萄糖.在温育时间(例如48小时)后，将细胞离心，并且将细胞粒状沉淀在具有少量NaCl的培养基例如FCC-M中进行漂洗，所述培养基例如既不包含酵母提取物，也不包含任何其他无机或有机氮源.该操作的目的在于避免经由在预培养物中酵母提取物的存在(其通常相应于主溶液的培养体积的1/100(v/v))而在主培养物中出现Na+的任何供给。
根据本发明的分离的橙壶菌属菌株使得能够产生显著量的生物质以及脂质，其中所述脂质富含DHA.这是因为，在异养或兼养条件下的本发明的方法使得能够获得大于100g/L，优选地大于120g/L的生物质产率，该生物质具有相对于干物质的重量而言50％至60％的脂质.DHA可以占在所述原生生物中所包含的总脂肪酸的大于15％，或大于20％，或大于30％.根据本发明的一个实施方式，所述原生生物因此可以具有至少0.1g/L/小时，优选地至少0.2g/L/小时，和更优选地至少0.3g/L/小时的DHA生产率(每小时在每升培养物中所产生的目的产物的量).
根据本发明的方法另外还包括下列步骤：
a)在具有小于1g/L，优选地小于10mg/L的钠(Na+)和小于1g/L，优选地小于200mg/L的氯化物(Cl-)的化学成分确知的培养基中，在异养条件下培养一种或多种与序列SEQNO.1具有至少92％的遗传一致性的网粘菌纲(Labyrinthulomycete)(特别是橙壶菌属)菌株，
b)维持所述培养物经过数代的步骤，
c)回收如此培养出的生物质的步骤.
所述“回收步骤”更特别地是指分离出其细胞数目在所述代过程中增长最大的菌株.
所述方法还可以包括下列另外的步骤：
d)回收所述菌株的脂质的步骤，和任选地，
e)从所回收的脂质中提取DHA(二十二碳六烯酸).
步骤(a)的菌株还可以与序列SEQ NO.2具有至少96％的遗传一致性，和/或与序列SEQ NO.3具有至少91％的遗传一致性，和/或与序列SEQ NO.4具有至少95％的遗传一致性.
根据本发明的培养方法使得能够实施在具有低水平的钠和氯化物的培养基中培养这些橙壶菌属菌株，其中不丧失生物质和脂质(特别是DHA)的生产率和高产率.因此，避免了用于培养细胞和处理所得生物质的由不锈钢制成的发酵罐和其他设备的坏损，以及生物质的生产和处理(下游加工(Down-Stream Processing)”或“DSP”)器具因腐蚀而造成的过早坏损.
本发明还涉及调制出一种培养基，其使得能够以高细胞密度产生富含DHA的根据本发明的菌株.所述培养基是化学成分确知的，其中具有低含量的钠离子(Na+)和氯离子(Cl-)。Na+的浓度通常小于100mg/L，优选地小于50mg/L，和更优选地小于6mg/L，并且Cl-的浓度优选地小于0.5g/L，和更优选地小于200mg/L.根据本发明的一个实施方式，在具有小于0.5g/L的NaCl、小于6mg/L的钠离子和小于200mg/L的氯离子的培养基中进行本发明所涉及的菌株的培养。
根据一个实施方式，所述培养基为FCC-M(表2(c))。如果在发酵罐或生物反应器中进行培养，那么增补溶液将会是所希望的，如在上面所描述的(参见例如表3(a或b)).
由于根据本发明的培养基是化学成分确知的，因而其既不包含生长试剂，例如酵母提取物或蛋白胨(其本身也包含一定量的氯化钠)，也不包含渗透压调节试剂，例如甘露糖醇或山梨糖醇.因此，在不存在这些试剂的情况下，来自所述培养物的生物质和脂质可以用于食品(或药品)，而无需众多的对于表征最终产物的内含物或者去除在最终产物中不希望的所添加的这些试剂来说必需的DSP步骤.因此，避免了与这些额外的步骤相关联的超额成本.同样地，在提取油后获得的联产物可以用于动物膳食，例如以油饼的形式.
本发明的方法和本发明的培养基的另一优点是，来自所述培养的排放物不包含需要额外的处理步骤的试剂，所述额外的处理步骤导致额外的成本并且因此降低生产收益.
本发明的方法和培养基不仅使得能够优化从培养中获得的生物质的生产，同时避免使用钠离子和氯离子以及相关的超额成本的问题，而且还使得能够使如此培养的生物富含多不饱和脂肪酸.
优选地，所述菌株根据前面所述及的方法来进行培养，然后回收以便从中提取脂质内含物，特别是脂质(包括DHA).脂质(包括DHA)的选择性提取方法是本领域技术人员已知的，并且例如由Bligh，E.G.和Dyer，W.J.(1959)[A rapid method of total lipidextraction and purification，Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917]进行了描述.
因此，根据本发明的一个实施方式，所述菌株可以具有至少0.1g/L/小时，优选地至少0.2g/L/小时，和更优选地至少0.3g/L/小时的DHA生产率.
本发明还涉及从本发明的方法中获得的生物质和/或联产物的全部或部分的用途，所述用途为作为用于人类膳食的产品、用于人类膳食的产品中的成分，或者作为用于动物膳食尤其是水产养殖的原料.
本发明还涉及根据在本文中所描述的实施方式的培养基，特别是称为FCC-M的培养基，用于培养原生生物以产生脂质和色素的用途。
实施例1
在锥形瓶中的生长测试：
将在图2中所列的菌株预先在包含15g/l的重构海盐(Instant)的培养基中培养两天，然后离心并用FCC-M溶液(表2(c))洗涤一次，随后接种在包含50ml FCC-M培养基的锥形瓶中(1/1000v/v)。在26℃和搅拌(220rpm)下温育三天后，测量细胞培养物的光密度.
实施例2
在锥形瓶中生长之前的脂肪酸谱：
将在图2中所列的菌株预先在包含15g/l的重构海盐(Instant)的培养基中培养两天，然后离心并用FCC-M溶液(表2(c))洗涤一次，随后接种在包含50ml FCC-M培养基(其中将硫酸铵替换为酵母提取物(4g/L))的锥形瓶中(1/1000v/v).从在26℃和搅拌(220rpm)下温育3天的细胞培养物中测定脂肪酸谱(FAME)。
实施例3
在生物反应器中的生长和DHA产生测试：
在具有专用的自动装置和经由信息处理站的监管的、有用的、1至2L的发酵罐(生物反应器)中进行橙壶菌属物种的培养.通过添加碱(NaOH或KOH)和/或酸(硫酸溶液)来调节该系统的pH.将培养基温度固定在26℃.借助于根据Rushton结构安置在枢轴上的3个搅拌活动体(下行式泵送的三桨叶螺旋桨)来进行搅拌.通过搅拌速度(250-1200rpm)、空气流量(0.25-1vvm)或甚至氧气流量(0.1-0.5vvm)，在整个培养过程中在培养基中调节溶解氧的压力.整合在监管自动装置中的调节参数使得能够维持5％至30％的恒定的pO2.培养时间为50至200小时，优选地65至96小时，例如72小时.
在恒温的(26℃)围壳中的摇动台(140rpm)上，在包含4g作为氮源的酵母提取物和30g作为碳源的葡萄糖的FCC-M培养基中进行预培养.在温育48小时后，将细胞以3000g离心5分钟，并且将细胞粒状沉淀用既不包含酵母提取物也不包含任何其他无机或有机氮源的FCC-M培养基进行漂洗。在培养过程中，实施增补溶液1的3次添加，以及溶液2的添加，以将葡萄糖浓度维持在200mM和500mM之间。
培养的监测：
总生物质浓度通过测量干质量(在滤器GF/F，Whatman上进行过滤，然后在称重之前，在105℃下，在烘箱中干燥最少24小时)来进行监测。
根据传统地描述在文献[Folch J.等人，A simple method for the isolationand purification of total lipides from animal tissues.J Biol Chem.1957May，226(1)：497-509]中的方法来进行总脂质含量和FAME的分析.
实施例4
在发酵罐中的培养：
以与在实施例3中所描述的相似的方式，在发酵罐中进行橙壶菌属物种的培养.通过添加氨水(NH4OH)来就pH的调节方式对该程序进行修改，以避免与用NaOH或KOH调节pH相关联的Na+或K+的大量供给，这可能会妨碍用于动物膳食的联产物的再利用.由于通过用氨水(NH4OH)调节pH而提供了一部分对于培养细胞来说必需的氮，因此不再需要在增补溶液1的组成中包括(NH4)2SO4.
表3指出了该实施例的结果：
PCT/RO/134表

Claims (16)

1.一种产生DHA的方法，该方法包括下列步骤：
a)在具有小于3.5g/L的钠离子和小于1g/L的氯离子并且具有200mM至500mM的有机含碳底物的化学成分确知的培养基中，在异养或兼养条件下，培养与序列SEQ NO.1具有至少92％的遗传一致性的一种或多种橙壶菌属(Aurantiochytrium)菌株。
2.根据权利要求1的培养方法，其特征在于，所述一种或多种橙壶菌属菌株还与序列SEQ NO.2具有至少96％的遗传一致性，和/或与序列SEQ NO.3具有至少91％的遗传一致性，和/或与序列SEQ NO.4具有至少95％的遗传一致性。
3.根据权利要求1或2的培养方法，其特征在于，所述培养基具有小于3.5g/L，优选地小于1g/L，更优选地小于6mg/L的钠离子，和小于200mg/L的氯离子。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于，所述培养基不包含渗透压调节剂，例如甘露糖醇、山梨糖醇、聚乙二醇和蔗糖。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，该方法另外还包括下列步骤：
b)维持所述培养物经过数代，
c)回收如此培养出的生物质，
d)回收所述菌株的脂质，和任选地，
e)提取DHA(二十二碳六烯酸)。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，所述培养基的构成如下：
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，来自步骤b)的生物质具有至少100g/L的干物质。
8.根据权利要求6或7的方法，其特征在于，在步骤b)结束时DHA的浓度为至少15g/L。
9.根据权利要求6至8中任一项的方法，其特征在于，在来自步骤b)的生物质中所包含的DHA占总脂质的大于30％。
10.根据权利要求6至9中任一项的方法，其特征在于，所述方法具有至少0.1g/L/小时的DHA生产率。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于，所述橙壶菌属的生物相应于菌株FCC 1324，其以登录号CCAP 4062/1保藏于CCAP(藻类和原生动物保藏中心(CultureCollection of Algae and Protozoa))。
12.从根据权利要求1至11中任一项的方法中获得的生物质和/或联产物的全部或部分的用途，所述用途为作为用于人类膳食的产品、用于人类膳食的产品中的成分，或者作为用于动物膳食尤其是水产养殖的原料。
13.一种培养基，其特征在于，所述培养基的构成如下：
14.根据权利要求13的培养基，其特征在于，所述培养基的构成如下：
15.根据权利要求13或14的培养基用于培养原生生物以产生脂质和色素的用途。
16.根据权利要求13或14的培养基用于实施根据权利要求1至12中任一项的方法的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113766836A (zh) * 2018-09-14 2021-12-07 费尔曼塔格公司 富含二十二碳六烯酸的微生物油

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11213048B2 (en) 2014-07-25 2022-01-04 Smallfood, Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of preparation
US11122817B2 (en) 2014-07-25 2021-09-21 Smallfood Inc. Protein rich food ingredient from biomass and methods of production
FR3045069B1 (fr) * 2015-12-14 2019-01-25 Metabolium Procede d'enrichissement de protistes en lipides riches en acides gras polyinsatures, plus particulierement de classe omega 3, et sa mise en oeuvre pour la production de ces lipides
ES2617081B1 (es) * 2015-12-15 2018-03-23 Interquim, S.A. Procedimiento para la producción de dha
WO2017132407A1 (en) * 2016-01-27 2017-08-03 Synthetic Genomics, Inc. Protein containing material biomass and methods of production
JP6865456B2 (ja) * 2016-05-17 2021-04-28 株式会社ＭｏＢｉｏｌ藻類研究所 飼料に好適なアミノ酸組成である海産従属栄養性藻類を飼料のタンパク質成分として利用する方法
CN110168071A (zh) 2016-12-22 2019-08-23 玛拉可再生能源公司 用于使用真核微生物产生富含dha、棕榈酸和蛋白质的生物质的方法
JP7280200B2 (ja) * 2018-01-31 2023-05-23 株式会社ニッスイ 微生物の乾燥粉末及びその製造方法
FR3085962B1 (fr) 2018-09-14 2021-06-18 Fermentalg Procede d'extracton d'une huile riche en pufa
GB201905593D0 (en) * 2019-04-18 2019-06-05 Bavington Charles Compositions and uses thereof
CN114525312A (zh) * 2020-11-06 2022-05-24 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 一种使用裂殖壶菌发酵生产dha的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070054384A1 (en) * 2003-11-10 2007-03-08 Matthias Rusing Method for the cultivation of microorganisms of the genus thraustochytriales by using an optimized low salt medium
CN101886044A (zh) * 2010-07-17 2010-11-17 厦门大学 二十二碳六烯酸的制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
US6410281B1 (en) 1992-07-10 2002-06-25 Omegatech, Inc. Reducing corrosion in a fermentor by providing sodium with a non-chloride sodium salt
KR101180594B1 (ko) * 2003-10-02 2012-09-06 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 변형량의 염소 및 칼륨을 사용하는 미세조류 중에 고농도디에치에이의 생산
US7989195B2 (en) * 2008-02-20 2011-08-02 Washington State University Research Foundation Heterotrophic algal high cell density production method and system
WO2013123032A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Heliae Development Llc Microalgae enriched with trace minerals
FR2988100B1 (fr) * 2012-03-16 2016-02-05 Fermentalg Production d'acide docosahexaenoique et d'astaxanthine en mode mixotrophe par schizochytrium
JPWO2013176261A1 (ja) * 2012-05-25 2016-01-14 味の素株式会社 微細藻類を用いた栄養添加剤の製造法
CN103627640B (zh) * 2013-08-10 2018-03-02 青岛海智源生命科技有限公司 一种培养裂殖壶菌的低氯培养基及用该培养基产生dha的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070054384A1 (en) * 2003-11-10 2007-03-08 Matthias Rusing Method for the cultivation of microorganisms of the genus thraustochytriales by using an optimized low salt medium
CN1977038A (zh) * 2003-11-10 2007-06-06 努特诺瓦营养产品及食品成分有限公司 使用最适化的低盐培养基培养Thraustochytriales属微生物的方法
CN101886044A (zh) * 2010-07-17 2010-11-17 厦门大学 二十二碳六烯酸的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RINKA YOKAYAMA,DAISKE HONDA: "Taxonomic rearrangement of the genus Schizochytrium sensu lato based on morphology,chemotaxonomic characteristics, and 18s rRNA gene phylogeny:emendation for Schizochytrium and erection of Aurantiochytrium and Oblongichytrium gen.nov.", 《MYCOSCIENCE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113766836A (zh) * 2018-09-14 2021-12-07 费尔曼塔格公司 富含二十二碳六烯酸的微生物油

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