ES2762618T3 - Microorganismos que producen ácido docosahexaenoico y utilización de los mismos - Google Patents
Microorganismos que producen ácido docosahexaenoico y utilización de los mismos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2762618T3 ES2762618T3 ES14741072T ES14741072T ES2762618T3 ES 2762618 T3 ES2762618 T3 ES 2762618T3 ES 14741072 T ES14741072 T ES 14741072T ES 14741072 T ES14741072 T ES 14741072T ES 2762618 T3 ES2762618 T3 ES 2762618T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- dha
- strain
- microorganism
- aurantiochytrium
- microorganisms
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 102
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 title description 232
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 title description 123
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 title description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 241001306132 Aurantiochytrium Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 241001130339 Aurantiochytrium sp. Species 0.000 claims description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 17
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 17
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 17
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 6
- 241000003595 Aurantiochytrium limacinum Species 0.000 description 5
- 241000598397 Schizochytrium sp. Species 0.000 description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 240000002044 Rhizophora apiculata Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940013317 fish oils Drugs 0.000 description 4
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 2
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 2
- 241001466451 Stramenopiles Species 0.000 description 2
- 241001467333 Thraustochytriaceae Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ITNKVODZACVXDS-YNUSHXQLSA-N ethyl (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-docosahexaenoate Chemical compound CCOC(=O)CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CC ITNKVODZACVXDS-YNUSHXQLSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004808 supercritical fluid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000575029 Bacillus subtilis (strain 168) 50S ribosomal protein L11 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 229910005390 FeSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910005444 FeSO4—7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 1
- 241001491670 Labyrinthula Species 0.000 description 1
- 241001491666 Labyrinthulomycetes Species 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910017621 MgSO4-7H2O Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910004619 Na2MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 1
- 241001298230 Thraustochytrium sp. Species 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000006136 alcoholysis reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O ammonium nitrate Chemical compound [NH4+].[O-][N+]([O-])=O DVARTQFDIMZBAA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004993 binary fission Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- VCDLWFYODNTQOT-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid methyl ester Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCC(=O)OC VCDLWFYODNTQOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012946 outsourcing Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003071 polychlorinated biphenyls Chemical class 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000015393 sodium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011684 sodium molybdate Substances 0.000 description 1
- TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N sodium molybdate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O TVXXNOYZHKPKGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Microorganismo que pertenece al género Aurantiochytrium que presenta un gen de ARNr 18S que consiste en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID nº 1 a 5.
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismos que producen ácido docosahexaenoico y utilización de los mismos.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un nuevo microorganismo que produce ácido docosahexaenoico (en adelante en la presente memoria denominado “DHA”) y a métodos para producir una composición que contiene DHA, DHA y alquil-éster de DHA utilizando el microorganismo.
Antecedentes de la técnica
El DHA es un ácido graso poliinsaturado contenido abundantemente en los fosfolípidos cerebrales y similares de los mamíferos, incluyendo el ser humano, y es conocido que desempeña un papel importante en el mantenimiento o desarrollo de las funciones cerebrales. El ser humano posee la capacidad de sintetizar DHA a partir de ácido linolénico; sin embargo, la cantidad del mismo es mucho menor de la necesaria y es conocido que el DHA debe obtenerse del exterior. Por este motivo, se comercializan muchos alimentos, complementos y leche para bebés que contienen DHA.
Entre los ejemplos de DHA contenido en dichos productos se incluye el DHA obtenido mediante extracción a partir de aceites de pescado. Los aceites de pescado son económicos y ricos en DHA y, por lo tanto, son buenas fuentes de DHA. Sin embargo, considerando el reciente incremento de la demanda de DHA, la acumulación de PCB o metales pesados en peces que acompaña a la contaminación marina, etc., se demanda un suministro más seguro y estable de DHA.
Además del DHA obtenido mediante extracción a partir de aceites de pescado, entre los ejemplos se incluye DHA producido mediante un método de fermentación utilizando un microorganismo. Se ha conocido desde hace mucho tiempo que las microalgas marinas producen un lípido que contiene DHA (documento no de patente n° 1). Sin embargo, existen problemas en que la cantidad de DHA contenida en las microalgas es reducida, el cultivo a alta densidad resulta difícil, etc. y, por lo tanto, no se ha llevado a cabo la producción a un nivel comercial.
Como método para producir DHA mediante fermentación a un nivel comercial, la utilización del dinoflagelado Crypthecodinium cohnii es el primer estudio (documento de patente n° 1 y documentos no de patente n° 2 y n° 3). Posteriormente se han encontrado múltiples microorganismos que poseen la capacidad de producir DHA, y son microorganismos que muestran la máxima capacidad de producir d Ha , microorganismos Labyrinthulea y entre los ejemplos de dichos microorganismos se incluyen Schizochytrium sp. cepa ATCC 20888 y cepas derivadas de la misma (documentos de patente n° 2 y n° 3), Aurantiochytrium limacinum (anteriormente clasificado como Schizochytrium limacinum) cepa SR21 (documentos de patente n° 4 a n° 6 y el documento no de patente n° 4), el microorganismo Labyrinthulea cepa 12B (documento de patente n° 7), Thraustochytrium sp. cepa LEF (documento de patente n° 8) y similares. El documento WO 2007/068997 A2, Yang H.L. et al. ("Isolation and Characterization of Taiwanese Heterotrophic Microalgae: Screening of Strains for Docosahexaenoic Acid (DHA)", Marine Biotechnology, vol. 12, páginas 173-185); documento WO 2011/139040 A2; Won-Kyung Hong et al ("Production of Lipids Containing High Levels of Docosahexaenoic Acid by a Newly Isolated Microalga, sp. KRS101" Applied Biochemistry and Biotechnology; parte A; Enzyme Engineering and Biotechnology, Humana Press Inc, vol. 164, n° 8, páginas 1468-1480) dan a conocer cepas de traustoquítridos que presentan secuencias de ARNr 18S diferentes de SEC ID n° 1 a n° 5.
El documento JP 2004 501603 A da a conocer cepas de Thraustochytrium y Schizochytrium que son capaces de producir DHA.
El documento WO 2012/175027 A1 se refiere a métodos de mutagénesis de Schizochytrium sp y cepas variantes producidas a partir del mismo.
El documento JP H10 72590 A da a conocer Aurantiochytrium limacinum cepa SR21, que produce ácido docosahexaenoico (DHA).
Entre estos microorganismos Labyrinthulea, un microorganismo que muestra la máxima capacidad de producción de DHA es Schizochytrium cepa S31 (cepa ATCC n° 20888) (documento de patente n° 9). La capacidad de producir DHA del microorganismo es mucho más elevada que en otros informes, y el método de fermentación para DHA que utiliza el microorganismo puede afirmarse que es el procedimiento de producción mediante fermentación de menor coste.
Sin embargo, ni siquiera con el procedimiento de producción mediante fermentación, el coste es superior al del método de extracción a partir de aceites de pescado y, por lo tanto, se han requerido mejoras adicionales de la productividad.
Documentos de la técnica relacionada
Documentos de patente
Documento de patente n° 1 JP-T-5-503425
Documento de patente n° 2 JP-T-8-502405
Documento de patente n° 3 JP-T-8-509355
Documento de patente n° 4 JP-A-9-000284
Documento de patente n° 5 JP-A-10-072590
Documento de patente n° 6 JP-A-10-310556
Documento de patente n° 7 JP-A-2006-230403
Documento de patente n° 8 JP-A-2005-102680
Documento de patente n° 9 JP-T-2004-501603
Documentos no de patente
Documento no de patente n° 1: J. Protozoal (1970), Vol. 17, pp. 213-219
Documento no de patente n° 2: Single Cell Oils a Oc S Press (2005), vol.6, páginas 86-98
Documento no de patente n° 3: Single Cell Oils AOCS Press (2005), vol. 8, páginas 107-123 Documento no de patente n° 4: APL. Microbiol. Biotechnol. (1998), vol. 49, páginas 72-76
Sumario de la invención
Problemas que debe resolver la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un microorganismo que presente una capacidad más elevada de producir DHA que anteriormente y asimismo proporcionar métodos eficientes para producir una composición que contiene DHA, y alquil-éster de DHA utilizando el microorganismo.
Medios para resolver los problemas
La presente invención se refiere a formas de realización según definen en las reivindicaciones y en [1] a [5], a continuación.
[1] Un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium que presenta un gen de ARNr 18S consistente en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID n° 1 a n° 5.
[2] Aurantiochytrium sp. cepa OH4 (número de acceso: FERM BP-11524).
[3] Un método para producir una composición que contiene DHA, que comprende cultivar el microorganismo indicado en cualquiera de [1] a [2], anteriormente, en un medio que permite producir la composición que contiene DHA y acumularla en un cultivo, y recolectar la composición que contiene DHA a partir del cultivo.
[4] Un método para producir DHA, que comprende separar y recolectar DHA a partir de la composición que contiene DHA recolectada en [3], anteriormente.
[5] Un método para producir alquil-éster de DHA, que comprende separar y recolectar alquil-éster de DHA a partir de la composición que contiene DHA recolectada en [3], anteriormente.
La exposición se refiere a:
[3] Un microorganismo que es un mutante obtenido a partir del microorganismo indicado en [1] o [2], anteriormente, como cepa parental y que presenta una capacidad más elevada de producir DHA que la cepa parental.
[4] Aurantiochytrium sp. cepa LTR23.
Efectos de la invención
Según la presente invención, se proporciona un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium que presenta un gen de ARNr 18S consistente en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID n° 1 a n° 5, y un método para producir la composición que contiene DHA, DHA y alquil-éster de DHA, mediante un procedimiento de fermentación utilizando el microorganismo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una vista que representa las cantidades producidas de DHA y las proporciones de DHA a ácidos grasos totales en microorganismos productores de DHA recogidos de una zona costera de Okinawa.
La figura 2 es una fotomicrografía de Aurantiochytrium sp. cepa OH4.
La figura 3 es una vista en que se añade a la figura 1 la cantidad producida de DHA y las proporciones de DHA a ácidos grasos totales en Aurantiochytrium sp. cepa LTR23.
Formas de realización para poner en práctica la invención
1. Microorganismo de la invención
El microorganismo de la presente invención es un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium que presenta uno o más, preferentemente dos o más, más preferentemente tres o más, todavía más preferentemente cuatro o más genes de ARNr 18S, consistiendo cada uno en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID n° 1 a n° 5, y es más preferentemente un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium que presenta la totalidad de los genes de ARNr 18S consistente en la secuencia de bases representada mediante las SEC ID n° 1 a n° 5, respectivamente. Basándose en las características morfológicas y las características biológicas moleculares, tal como se mencionan posteriormente, el microorganismo de la presente invención se considera que pertenece al filo Heterokonta del reino Chromista y pertenece además al orden Labyrinthulida de la clase Labyrinthulea. Con respecto a los rangos taxonómicos de familia y posteriormente, considerando las características fisiomorfológicas y las secuencias de bases de los genes de ARNr 18S, se considera que pertenece al género Aurantiochytrium de la familia Thraustochytriaceae.
Entre los ejemplos del microorganismo de la presente invención se incluyen Aurantiochytrium sp. cepa OH4 (número de acceso: FERM BP-11524) y similares. Además, los microorganismos que son mutantes obtenidos mediante la utilización del microorganismo de la presente invención como cepa parental y que presentan una capacidad más elevada de producir DHA que la cepa parental asimismo pueden producirse de acuerdo con la presente exposición. Entre los ejemplos de dicho microorganismo se incluyen Aurantiochytrium sp. cepa LTR23, y similares.
El anteriormente mencionado Aurantiochytrium sp. cepa OH4 se ha depositado en el depósito de microorganismos de patente del National Institute of Technology and Evaluation (NITE), situado en Central 6, 1-1, Higashi, Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japón (código postal 305-8566). La fecha de recepción (fecha de depósito) es 11 de enero de 2013, y el número de acceso es FERM BP-11524.
La cepa parental tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una cepa original que debe someterse a la introducción de una mutación, sustitución génica mediante una técnica de recombinación de ADN o similar. La cepa original que debe someterse a sustitución génica mediante una técnica de recombinación de ADN o similar asimismo se denomina cepa huésped.
El mutante tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un microorganismo que puede obtenerse mediante la utilización de un método convencional de introducción de mutaciones, un método de sustitución génica mediante una técnica de recombinación de ADN, o similar, a partir del microorganismo de la presente invención como cepa parental.
El microorganismo que presente una capacidad más elevada de producir DHA que la cepa parental tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un microorganismo en el que la cantidad de composición que contiene DHA o DHA que puede obtenerse a partir del cultivo completo es elevada al cultivar la cepa parental y el mutante bajo las mismas condiciones de cultivo.
Entre los ejemplos de la composición que contiene DHA pueden incluirse aceites y grasas que contienen DHA o fosfolípidos que contienen DHA, preferentemente aceites y grasas que contienen DHA.
Hasta ahora se han encontrado muchos tipos de microorganismos pertenecientes al género Aurantiochytrium; sin embargo, el microorganismo de la presente invención presenta una secuencia de bases diferente del gen de ARNr 18S que dichos microorganismos y, además, tal como se muestra en los ejemplos indicados posteriormente, el peso celular seco y el contenido de DHA al cultivar el microorganismo son significativamente más elevados que en los microorganismos convencionalmente conocidos de los que se informa como microorganismos de elevada producción de DHA y, por lo tanto, el microorganismo de la presente invención puede distinguirse claramente de los microorganismos convencionalmente conocidos pertenecientes al género Aurantiochytrium.
2. Método para la obtención del microorganismo de la invención
El microorganismo de la presente invención puede obtenerse mediante el método siguiente.
Se recoge una muestra del océano, preferentemente de agua salobre, más preferentemente de hojas caídas recogidas del suelo de un manglar.
La muestra se sumerge en agua marina artificial que contiene un antibiótico, preferentemente penicilina G y estreptomicina, y después, el sobrenadante del agua marina artificial se aplica sobre un medio de agar que contiene el antibiótico y se incuba durante varios días a una temperatura de 20°C a 40°C, preferentemente a 25°C. De esta manera, muchos procariotas presentes en el medio ambiente no pueden crecer y, por lo tanto, el microorganismo de la presente invención, que es un eucariota, puede concentrarse.
Se aísla una colonia y a partir del cultivo obtenido mediante cultivo utilizando un medio líquido, se extrae el ADN genómico siguiendo un procedimiento común. Mediante la utilización del ADN genómico como molde, se lleva a cabo una reacción de p Cr utilizando oligo-ADN con las secuencias de bases representadas mediante SEC ID n° 6 y n° 7, respectivamente, que pueden amplificar un gen de ARNr 18S, como conjunto de cebadores.
A uno de los cebadores del conjunto se le añade una etiqueta compuesta de 3 a 6 bases, preferentemente 4 a 5 bases, más preferentemente 4 bases para el análisis simultáneo de múltiples muestras de acuerdo con "Highspeed sequence analysis outsourcing service, Application No. 01, Analysis of 16S rRNA PCR sample" (tríptico de Takara Bio, Inc.). Además, a ambos cebadores se añade un oligonucleótido necesario para el análisis con un secueciador GS FLX (Roche Diagnostics K.K.).
Mediante la determinación de la secuencia con el secuenciador GS FLX utilizando el producto de reacción de PCR anteriormente mencionado, por ejemplo, en el caso de que se fije el tamaño de la etiqueta anteriormente mencionada en 4 bases, y hasta 256 tipos de secuencias de etiqueta, pueden secuenciarse 256 tipos de genes de ARNr 18S mediante una operación de secuenciación sin requerir una operación de clonación. Específicamente, mediante la mezcla de 256 tipos de productos de PCR, se determinan las secuencias de bases con el secuenciador GS FLX y las secuencias de bases tras la determinación se clasifican en 256 tipos mediante la utilización de las secuencias de la etiqueta como índice.
El ADN genómico que debe utilizarse como el molde para la reacción de PCR puede ser un ADN genómico extraído de una sola cepa o puede ser una mezcla de ADN genómicos extraídos de múltiples cepas. Sin embargo, en el caso de que se utilice una mezcla de ADN genómicos extraídos de múltiples cepas, el cribado de muchas cepas puede llevarse a cabo más convenientemente mediante la combinación del método indicado posteriormente.
Por ejemplo, se amplifica una región génica de ARNr 18S mediante la mezcla de los ADN genómicos extraídos de 100 tipos de cepas y se utiliza la mezcla resultante como un molde para una reacción de PCR y asimismo utilizando el conjunto de cebadores anteriormente indicado.
Los productos de PCR se secuencian con el secuenciador GS FLX y, en el caso de que se encuentre presente el gen de ARNr 18S que consiste en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID n° 1 a n° 5, se observa que se encuentra presente por lo menos una cepa del microorganismo de la presente invención entre los 100 tipos de cepas. Por otra parte, en el caso de que no se encuentre presente el gen de ARNr 18S, se observa que el microorganismo de la presente invención no se encuentra presente entre los 100 tipos de cepas.
En el caso de que se encuentre presente el microorganismo de la presente invención entre los 100 tipos de cepas, puede especificarse el microorganismo utilizando un método con el secuenciador GS FLX anteriormente indicado mediante una operación de secuenciación.
Es decir, mediante la utilización del método anteriormente indicado, en el caso en que se fije el tamaño de la secuencia de etiqueta en 4 bases, pueden analizarse hasta 256 tipos de ADN genómicos mixtos mediante la primera operación de secuenciación, y el microorganismo de la presente invención puede determinarse de entre un máximo de 256 tipos de microorganismos mediante la segunda operación de secuenciación y, por lo tanto, con respecto a un máximo de 65,536 tipos de microorganismo, puede determinarse si un microorganismo es o no el microrganismo de la presente invención mediante únicamente dos operaciones de secuenciación sin requerir una operación de clonación.
Por otra parte, en el caso de que se fije el tamaño de la secuencia de etiqueta en 5 bases, pueden analizarse hasta 1.024 tipos de ADN genómicos mixtos mediante la primera operación de secuenciación, y el microorganismo de la presente invención puede determinarse de entre un máximo de 1.024 tipos de microorganismos mediante la segunda operación de secuenciación y, por lo tanto, con respecto a un máximo de 1,048,576 tipos de microorganismo, puede determinarse si un microorganismo es o no el microorganismo de la presente invención mediante únicamente dos operaciones de secuenciación sin requerir una operación de clonación.
El microorganismo que debe someterse al análisis de secuenciación anteriormente indicado puede confirmarse que produce DHA previamente. De esta manera, en el caso de que el número de cepas que debe analizarse sea pequeño, asimismo puede determinarse si el microorganismo es o no el microorganismo de la presente invención mediante determinación de la secuencia utilizando el método de Sanger convencional.
El mutante de la presente exposición con una mayor capacidad de producir DHA que la cepa parental puede obtenerse mediante la utilización del microorganismo de la presente invención como cepa parental y utilizando un método convencional de tratamiento de mutación, por ejemplo se lleva a cabo un tratamiento de mutación de manera que la tasa de mortalidad del microorganismo sea de 98%, preferentemente de 99%, lo más preferentemente de 99.9%, con un tratamiento con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o un tratamiento de radiación UV y se aísla una colonia superviviente y se examina la productividad de DHA.
La productividad de DHA puede examinarse mediante un método en el que se extrae un lípido a partir de una solución de cultivo utilizando el método de Bligh y Dyer (Bligh E.G. Y Dyer W.J., Can. J. Biochem. Physiol. 37911 (1959)) y se seca bajo presión reducida y después el lípido seco se somete a metilación de los ácidos grasos utilizando el kit de metilación de ácidos grasos (Nacalai Tesque, Inc.) y el metil-éster de ácido graso obtenido se extrae con n-hexano y se analiza mediante cromatografía de gases.
3. Método para producir la composición que contiene DHA de la invención
Puede producirse una composición que contiene DHA mediante el cultivo del microorganismo de la presente invención en un medio que permite producir y acumular en el cultivo la composición que contiene DHA y recolectar la composición que contiene DHA a partir del cultivo.
El cultivo del microorganismo de la presente invención puede obtenerse mediante inoculación del microorganismo en un medio apropiado y cultivo del microorganismo según un procedimiento común.
Respecto al medio, puede utilizarse cualquier medio conocido que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica y similares. Entre los ejemplos de la fuente de carbono se incluyen un carbohidrato, tal como glucosa, fructosa o galactosa, y aparte de ellos, un aceite o un lípido, tal como ácido oleico o aceite de soja, glicerol, acetato sódico o similares. Dichas fuentes de carbono pueden utilizarse, por ejemplo, a una concentración de 20 a 300 g por litro de medio. Según una forma de realización particularmente preferida, mediante la alimentación de una fuente de carbono después de consumir la fuente inicial de carbono, puede llevarse a cabo en continuo el cultivo. Mediante la realización del cultivo bajo dichas condiciones, puede incrementarse la cantidad de la fuente de carbono y, de esta manera, puede incrementarse la cantidad producida de la composición que contiene DHA.
Además, como fuente de nitrógeno, puede utilizarse nitrógeno orgánico, tal como extracto de levadura, licor de maceración del maíz, polipeptona, glutamato sódico o urea, o nitrógeno inorgánico, tal como acetato amónico, sulfato amónico, cloruro amónico, nitrato sódico, nitrato amónico o amonio.
Como la sal inorgánica, puede combinarse convenientemente y utilizarse fosfato potásico o similar.
Resulta preferido que el medio que contiene los componentes respectivos anteriormente indicados se utilice mediante esterilización en una autoclave tras ajustar el pH a un intervalo de 4,0 a 9,5 mediante la adición de un ácido o base apropiado.
La temperatura de cultivo es generalmente de 10°C a 45°C, preferentemente de 20°C a 37°C. La temperatura de cultivo preferentemente se controla para que sea una temperatura de cultivo a la que pueda producirse una composición que contiene DHA. El pH durante el cultivo es generalmente de 3,5 a 9,5, preferentemente de 4,5 a 9,5. Un pH particularmente preferido varía dependiendo del propósito deseado y para producir una gran cantidad de un aceite o grasa, el pH es de 5,0 a 8,0.
El periodo de cultivo puede fijarse en, por ejemplo, 2 a 7 días, y el cultivo puede llevarse a cabo mediante cultivo bajo agitación por aireación o similar.
Mediante el cultivo del microorganismo de la presente invención tal como como se ha indicado anteriormente, puede obtenerse un cultivo que contiene el microorganismo en una cantidad de generalmente 50 a 200 g, preferentemente de 100 a 200 g en términos de peso celular seco por litro de medio.
Como método para separar la solución de cultivo y los microorganismos del cultivo, puede llevarse a cabo un método convencional conocido por el experto en la materia y, por ejemplo, la separación puede llevarse a cabo mediante un método de centrifugación, filtración o similar.
Los microorganismos separados del cultivo se homogeneizan mediante, por ejemplo, ultrasonidos, un molino DYNO-MILL o similar, y después, por ejemplo, se lleva a cabo una extracción con solvente, con cloroformo, hexano,
hexano, butanol o similar, de manera que puede obtenerse una composición que contiene DHA.
Mediante el método para producir una composición que contiene DHA de la presente invención, puede obtenerse la composición que contiene DHA en una cantidad de 5 a 100 g, preferentemente de 10 a 80 g por cada 100 g de peso celular seco.
La composición que contiene DHA que debe producirse mediante el método de producción anteriormente indicado se somete a, por ejemplo, un método tal como un método de fraccionamiento con solvente a baja temperatura [Koretaro Takahashi, Journal of Japan Oil Chemist's Society, 40: 931-941 (1991)] o mediante un método de liberación y eliminación de ácidos grasos de cadena corta con una hidrolasa, tal como una lipasa [Koretaro Takahashi, Journal of Japan Oil Chemist's Society, 40: 931-941 (1991)], para concentrar la composición que contiene DHA, de manera que puede obtenerse una composición que contiene DHA que presenta un elevado contenido de DHA.
4. Método para producir DHA de la invención
El método para producir DHA de la presente invención se caracteriza por la separación y recolección de DHA a partir de la composición que contiene DHA obtenida mediante el método de producción indicado en 3, anteriormente.
La separación y recolección de DHA a partir de la composición que contiene DHA puede llevarse a cabo mediante la preparación de ácidos grasos mixtos que contienen DHA a partir de la composición que contiene DHA mediante, por ejemplo, un método de hidrólisis, seguido de la separación y recolección de DHA mediante, por ejemplo, un método de adición de urea, un método de separación mediante enfriamiento, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de fluidos supercríticos o similares.
5. Método para producir alquil-éster de DHA de la invención
El método para producir alquil-éster de DHA de la presente invención se caracteriza por la separación y recolección de DHA a partir de la composición que contiene DHA obtenida mediante el método de producción indicado en 3, anteriormente.
El alquil-éster de DHA no se encuentra particularmente limitado con la condición de que sea alquil-éster de DHA; sin embargo, entre los ejemplos del mismo se incluyen preferentemente metil-éster de DHA o etil-éster de DHA, más preferentemente etil-éster de DHA.
La separación y recolección del alquil-éster de DHA a partir de la composición que contiene DHA puede llevarse a cabo mediante la preparación de alquil-ésteres de ácidos grasos mixtos que contienen DHA a partir de la composición que contiene DHA mediante, por ejemplo, un método de alcoholisis, seguido de la separación y recolección de alquil-éster de DHA mediante, por ejemplo, un método de adición de urea, un método de separación mediante enfriamiento, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de fluidos supercríticos o similares. A continuación en la presente memoria, se muestran ejemplos de la invención de la presente solicitud; sin embargo, la presente invención no se encuentra limitada a estos ejemplos.
Ejemplo 1
Obtención del microorganismo de la invención (1)
1. Aislamiento del microorganismo de la invención
Como muestra, a partir de la que se aísla el microorganismo de la presente invención, se utilizaron hojas caídas recogidas del suelo de un manglar (una zona de aguas salobres) próxima a una zona costera en Okinawa. Las hojas caídas se sumergieron en agua marina artificial que contenía penicilina G y estreptomicina a una concentración de 300 mg/l y después, el sobrenadante del agua marina artificial se aplicó sobre un medio agar para el aislamiento que contenía penicilina G y estreptomicina (cada uno a una concentración de 300 mg/l) y se incubó a 25°C durante varios días.
Como medio agar para el aislamiento, se utilizó un medio agar que presentaba la composición siguiente: 0.2% de glucosa, 0.02% de extracto de levadura, 50% de agua marina artificial, 0.05% de glutamato sódico y 1.5% de agarosa.
Tras confirmar la aparición de muchas colonias sobre la placa de agar, se separaron las colonias y se cultivaron en un medio líquido para la evaluación a 30°C durante 48 horas.
Como medio líquido para la evaluación, se utilizó un medio líquido que presentaba la composición siguiente: 9%
de glucosa, 1% de extracto de levadura, 1% de peptona y 50% de agua marina artificial.
A partir de la solución de cultivo, se extrajo un líquido utilizando el método de Bligh y Dyer (Bligh E.G. y Dyer W.J., Can. J. Biochem. Physiol. 37911 (1959)) y se secó bajo presión reducida. A continuación, el lípido seco se sometió a metilación de los ácidos grasos utilizando un kit de metilación de ácidos grasos (Nacalai Tesque, Inc.) y el metiléster de ácido graso obtenido mediante dicho tratamiento se extrajo con n-hexano. Dicho metil-éster de ácido graso se analizó mediante cromatografía de gases y se examinó la cantidad y composición de los ácidos grasos en la solución de cultivo.
Las condiciones para la cromatografía de gases se fijaron de la manera siguiente.
- Columna: HR-SS-10 (Shinwa Chemical Industries Ltd.), 0.25 mm x 25 m
- Gas portador: He, 30 ml/min
- Temperatura de la columna: 190°C
- Detección: FID
Según el procedimiento anterior, pudieron obtenerse 1239 cepas de microorganismos productores de DHA a partir de 5000 o más cepas de organismos derivados de manglar.
El contenido de DHA y la proporción de DHA a ácidos grasos totales en el cultivo de cada uno de los microorganismos productores de DHA obtenidos en este momento se muestran en la figura 1. A partir de la figura 1 se confirmó que existe una tendencia a que generalmente se incremente la proporción de DHA, se deteriore el crecimiento, de manera que se reduce la cantidad de ácidos grasos totales y se reduce el contenido de DHA, y se confirmó que la proporción de DHA en las cepas que producen una gran cantidad de ácidos grasos se concentraba a aproximadamente 30% a 40%, tal como es conocido. De entre ellas, se seleccionó una cepa que crecía bien y que mostraba una productividad de DHA elevada, y se denominó “cepa OH4”.
2. Características morfológicas de la cepa OH4
La cepa OH4 es unicelular y puede crecer en presencia de penicilina G y estreptomicina y, por lo tanto, se concluye que la cepa OH4 es un eucariota unicelular. Además, basándose en el hecho de que se aisló la cepa OH4 a partir de una muestra derivada del suelo del manglar y de que el contenido de DHA era muy elevado, se presumió que la cepa OH4 era un traustoquítrido perteneciente a los Heterokonta.
En la cepa OH4, pudo observarse una red ectoplásmica que se extendía desde una célula esférica con un diámetro de 10 a 20 pm en el medio agar anteriormente indicado para el aislamiento y, por lo tanto, se confirmó que la cepa OH4 pertenece a la familia Thraustochytriaceae de la clase Labyrinthulea del reino Chromista. Además, se confirmó que las células vegetativas presentan una forma esférica y proliferan mediante fisión binaria de los microorganismos. Dicha historia vital es característica del género Aurantiochytrium (Yokoyama R. et. al., Mycoscience 48: 329-341; Daisuke Honda, Phylogeny and Taxonomy of the Labyrinthula, Kaiyo to Seibutsu (Aquabiology), 23: 7-18, 2001). En la figura 2 se muestra una fotomicrografía de la cepa OH4.
3. Características biológicas moleculares de la cepa OH4
Se recuperó la cepa OH4 cultivada mediante la utilización del medio líquido anteriormente indicado para la evaluación en la etapa de crecimiento logarítmica y se extrajo el ADN genómico total mediante un procedimiento común utilizando perlas de vidrio y fenol-cloroformo. Se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando el ADN genómico obtenido como molde y oligonucleótidos que consistían en las secuencias de bases representadas mediante las SEC ID n° 6 y n° 7, respectivamente, como un conjunto de cebadores, y se amplificó un gen de ARNr 18S. La secuencia de bases del producto de PCR obtenido se determinó mediante el método de Sanger.
En este método, en el procedimiento de determinación de la secuencia de bases del gen de ARNr 18S de la cepa OH4, se encontró que la molécula era polimórfica. Es un fenómeno convencionalmente conocido que la secuencia del gen de ARNr 18S de un microorganismo Labyrinthulea es polimórfica (documento de patente n° 7). Las secuencias de bases de los genes de ARNr 18S de la cepa OH4 se representan mediante las SEC ID n° 1 a n° 5, respectivamente.
Además, las diferencias en las secuencias polimórficas respectivas se muestran en la tabla 1. Se muestran los números de bases basados en la SEC ID n° 4, que es la secuencia más larga.
Tabla 1 Comparación de las secuencias génicas de ARNr 18S de la cepa OH4
Las secuencias de bases representadas mediante las SEC ID n° 1 a n° 5 se buscaron utilizando el algoritmo BLAST de Karlin y Altschul [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)]. Como resultado, dichas secuencias de bases mostraron una identidad de 99% respecto a las secuencias de bases de los genes de ARNr 18S de Aurantiochytrium sp. cepa KRS101 y de Aurantiochytrium sp. cepa BL11.
Por otra parte, no se encontraron secuencias que se correspondiesen por completo con ninguna de las secuencias de bases representadas mediante las SEC ID n° 1 a n° 5 en la base de datos NCBI.
Basándose en las características morfológicas y características biológicas moleculares anteriormente indicadas, se concluyó que la cepa OH4 es un microorganismo nuevo perteneciente al género Aurantiochytrium y denominado "Aurantiochytrium sp. cepa OH4", y depositado en el depósito de microorganismos de patentes del National Institute of Technology and Evaluation (NlTE) (Central 6, 1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón) el 11 de enero de 2013 bajo el número de acceso Fe RM BP-11524.
Por otra parte, la clasificación podría cambiar por el avance de la investigación en el futuro; sin embargo, el microorganismo de la presente invención todavía es un nuevo microorganismo.
Ejemplo 2
Obtención de microorganismos mutantes utilizando el microorganismo de la invención (2)
1. Adquisición de mutante obtenido mediante la utilización de Aurantiochytrium sp. cepa OH4 como cepa parental Se sometió la cepa OH4 de Aurantiochytrium sp. A un tratamiento de mutación con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) de manera que la tasa de mortalidad fuese de 99.9%. A continuación, se aisló una colonia superviviente y se cultivó en un medio líquido para la evaluación a 30°C durante 48 horas. Como resultado, pudo obtenerse una cepa en la que la proporción de DHA se había incrementado en aproximadamente 1,6 veces, y junto a ello, se había incrementado el contenido de DHA en aproximadamente 3 veces. Esta cepa se denominó "Aurantiochytrium sp. cepa LTR23”.
La figura 3 es una vista en la que el contenido de DHA y la proporción de DHA a ácidos grasos totales en el cultivo de Aurantiochytrium sp. cepa LTR23 se ha añadido a la figura 1. A partir de la figura 3 pudo confirmarse que Aurantiochytrium sp. cepa LTR23 presenta una proporción de DHA más elevada y asimismo un contenido de DHA más elevado que un aislado espontáneo.
Ejemplo 3
Producción industrial de composición que contiene DHA de la invención
1. Cultivo de Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y cepa LTR23
Se cultivó cada una de Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y cepa LTR23 en un fermentador de tanque. Además, para la comparación, se cultivaron bajo las mismas condiciones Aurantiochytrium limacinum cepa SR21 (documentos de patente n° 4 a n° 6 y documento no de patente n° 4) y Schizochytrium sp. cepa S31 (documento de patente n° 9), los cuales se ha informado que son microorganismos de producción elevada de DHA.
Aurantiochytrium limacinum cepa SR21 (ATCC n° MYA-1381) y Schizochytrium sp. cepa S31 (ATCC n° 20888) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC).
Cada una de las cepas microbianas criopreservadas anteriormente indicadas se inoculó en el medio agar para el aislamiento utilizado en el ejemplo 1. Tras confirmar que los microorganismos crecían suficientemente, se desprendieron del medio mediante raspado y se inocularon en el medio líquido para la evaluación utilizado en el ejemplo 1 para llevar a cabo el cultivo de siembra. Tras confirmar que los microorganismos crecían suficientemente mediante el cultivo de siembra, se inocularon los microorganismos en un fermentador de tanque de 3 l. La composición del medio en el fermentador de tanque de 3 l estaba de acuerdo con la del documento de patente n° 9.
Es decir, se preparó un medio compuesto de sulfato sódico (12 g/L), KCl (0.5 g/l), MgSO4-7H2O (2 g/l), antiespumante Hodag K-60 (0.35 g/l), K2SO4 (0.65 g/l), KH2PO4 (1 g/l), (NH4)2SO4 (1 g/l), C a C h ^^ O (0.17 g/l), MnCl2-4H2O (3 mg/l), ZnSO4-7H2O (3 mg/l), C o C h ^ ^ O (0.04 mg/l), Na2MoO4'2H2O (0.04 mg/l), CuSO4'5H2O (2 mg/l), MSO46H2O (2 mg/l), FeSO4-7H2O (10 mg/l), tiamina (9.5 mg/l), vitamina B12 (0.15 mg/l) y pantotenato cálcico (3.2 mg/l).
Los cambios fueron los siguientes: debido a que el consumo de azúcar de Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y cepa LTR23 es elevado, se fijó la concentración de glucosa en 120 g/l y, además, como fuente de nitrógeno, se utilizó una solución de NH4OH al 28%. En el estadio en que los 120 g/l de glucosa en el medio se habían consumido por completo, se alimentó adicionalmente al medio una solución de glucosa a una concentración de 65% y se llevó a cabo el cultivo en continuo durante un máximo de 85 horas.
A partir del cultivo obtenido, de la misma manera que en el ejemplo 1, se extrajo un lípido mediante el método de Bligh y Dyer, seguido de metilación, y el lípido se analizó mediante cromatografía de gases.
Los microorganismos obtenidos se congelaron a -80°C, seguido de liofilización, obteniendo de esta manera microorganismos secos. El peso de los microorganismos secos obtenidos de esta manera se midió y se convirtió en la cantidad original de la solución de cultivo, calculando de esta manera el peso celular seco (PCS) en el cultivo.
Se resumen los resultados del cultivo en la tabla 2 a continuación.
Tabla 2 Resultados del cultivo en fermentador de tanque
Como resultado del cultivo, en el caso de Aurantiochytrium sp. cepa OH4, el peso celular seco era de 145.3 g/l de cultivo, y el contenido de DHA era de 26 g/l de cultivo, que resultó ser significativamente más elevado que en los microorganismos de los que se ha informado como microorganismos de elevada producción de DHA. Debido a que el DHA se acumula en los microorganismos, un peso celular seco elevado presenta la ventaja de que la cantidad de DHA que puede recolectarse finalmente es elevada.
Además, en el caso de Aurantiochytrium sp. cepa lTR23, el contenido de DHA era de 44 g/l de cultivo, la composición de DHA en los ácidos grasos totales era de 52% y la productividad de DHA era de 0.505 g/l/h y, de esta manera, se demostró que Aurantiochytrium sp. cepa LTR23 sobrepasa a Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y los microorganismos de los que se ha informado como microorganismos de producción elevada de DHA.
2. Composición de ácidos grasos en Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y cepa LTR23
La composición de ácidos grasos en Aurantiochytrium sp. cepa OH4 y cepa LTR23 cultivadas en el fermentador de tanque se muestran en la tabla 3, a continuación. Los valores para Schizochytrium sp. cepa S31 se han reimpreso del documento no de patente n° 2.
Tabla 3 Composición de ácidos grasos
A partir de los resultados anteriores, se demostró que, en la composición de ácidos grasos de Aurantiochytrium sp. cepa LTR23, se reduce el nivel de ácido palmítico y de los ácidos grasos saturados de cadena corta, y se incrementa el nivel de ácidos grasos poliinsaturados tales como DHA y 22:5 (n-6). Es conocido que los ácidos grasos saturados incrementan el colesterol-LDL y la proporción de colesterol total a colesterol-HDL, y se señala que existe una posibilidad de que se incremente el riesgo de diabetes. Por lo tanto, asimismo desde el punto de vista nutricional, se demuestra la significación de Aurantiochytrium sp. cepa LTR23.
Claims (5)
1. Microorganismo que pertenece al género Aurantiochytrium que presenta un gen de ARNr 18S que consiste en la secuencia de bases representada mediante cualquiera de las SEC ID n° 1 a 5.
2. Aurantiochytrium sp. cepa OH4 (número de acceso: FERM BP-11524).
3. Método para producir una composición que contiene DHA, que comprende cultivar el microorganismo según la reivindicación 1 o 2 en un medio, permitir que la composición que contiene DHA sea producida y acumulada en un cultivo y recoger la composición que contiene DHA a partir del cultivo.
4. Método para producir DHA que comprende separar y recoger DHA a partir de la composición que contiene DHA recogida según la reivindicación 3.
5. Método para producir alquil éster de DHA que comprende separar y recoger alquil éster de DHA a partir de la composición que contiene DHA recogida según la reivindicación 4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013007006 | 2013-01-18 | ||
| PCT/JP2014/050753 WO2014112574A1 (ja) | 2013-01-18 | 2014-01-17 | ドコサヘキサエン酸を生産する微生物及びその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2762618T3 true ES2762618T3 (es) | 2020-05-25 |
Family
ID=51209663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14741072T Active ES2762618T3 (es) | 2013-01-18 | 2014-01-17 | Microorganismos que producen ácido docosahexaenoico y utilización de los mismos |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10023884B2 (es) |
| EP (1) | EP2947141B1 (es) |
| JP (1) | JP6298770B2 (es) |
| CN (1) | CN104995291B (es) |
| DK (1) | DK2947141T3 (es) |
| ES (1) | ES2762618T3 (es) |
| WO (1) | WO2014112574A1 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104263770A (zh) * | 2014-09-04 | 2015-01-07 | 青岛海智源生命科技有限公司 | 裂壶藻半连续阶段式发酵、絮凝板框干法制取dha的方法 |
| CN104312929B (zh) * | 2014-10-27 | 2017-10-17 | 山东百龙创园生物科技股份有限公司 | 一株高产dha裂殖壶菌菌株及其培养方法与应用 |
| JP6486072B2 (ja) * | 2014-11-04 | 2019-03-20 | 株式会社シー・アクト | 微生物由来の奇数脂肪酸又は高度不飽和脂肪酸含有するトリグリセリドの製造方法 |
| JP6667242B2 (ja) * | 2015-09-28 | 2020-03-18 | 株式会社シー・アクト | 培養オーランチオキトリウム属藻類の奇数脂肪酸含有量を増大させる培地 |
| EP3385359A4 (en) * | 2015-12-01 | 2019-07-24 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | DOCOSAHEXAIC ACID-CONTAINING OIL AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| JP6709484B1 (ja) * | 2018-08-01 | 2020-06-17 | ＭｏＢｉｏｌ株式会社 | パームオイル工場排出液（ｐｏｍｅ）をつかった従属栄養性微細藻類の培養方法及びｄｈａ製造方法 |
| US11613728B2 (en) * | 2018-08-10 | 2023-03-28 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Microorganism producing eicosapentaenoic acid and method for producing eicosapentaenoic acid |
| FR3085962B1 (fr) * | 2018-09-14 | 2021-06-18 | Fermentalg | Procede d'extracton d'une huile riche en pufa |
| CN111235035A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-06-05 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种裂殖壶菌突变株及其用于制备二十二碳六烯酸油脂的方法和应用 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5130242A (en) | 1988-09-07 | 1992-07-14 | Phycotech, Inc. | Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids |
| US5340742A (en) | 1988-09-07 | 1994-08-23 | Omegatech Inc. | Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids |
| US5407957A (en) | 1990-02-13 | 1995-04-18 | Martek Corporation | Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates |
| JP2764572B2 (ja) | 1995-04-17 | 1998-06-11 | 工業技術院長 | ドコサヘキサエン酸生産能を有する新規微生物及びそれを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法 |
| EP0823475B1 (en) | 1995-04-17 | 2009-06-17 | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology | Novel microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms |
| JP3985035B2 (ja) * | 1995-09-14 | 2007-10-03 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | （ｎ−６）系ドコサペンタエン酸含有油脂ならびに該油脂の製造方法および用途 |
| JPH10310556A (ja) * | 1997-05-12 | 1998-11-24 | Y M Shii:Kk | 微生物由来の多価不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法 |
| CZ301130B6 (cs) | 2000-01-28 | 2009-11-11 | Martek Biosciences Corporation | Zvýšená produkce lipidu obsahujících polyenové mastné kyseliny ve fermentorech kulturami mikrobu s vysokou hustotou ve fermentorech |
| JP4280158B2 (ja) | 2002-12-27 | 2009-06-17 | 富士フイルム株式会社 | ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用 |
| US20050019880A1 (en) * | 2003-03-31 | 2005-01-27 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method of enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists |
| JP2009519032A (ja) * | 2005-12-16 | 2009-05-14 | アヴェスタゲン リミテッド | ドコサヘキサエン酸（ｄｈａ）産生スラウストキトリウム菌株‐ｓｃ１ |
| DE602006015701D1 (de) * | 2005-12-29 | 2010-09-02 | Abl Biotechnologies Ltd | Neuer schizochytrium-limacinum-stamm, der sich für die produktion von lipiden und extrazellulären polysacchariden eignet, sowie verfahren hierfür |
| US20130217084A1 (en) * | 2009-05-15 | 2013-08-22 | Zhiyou Wen | Production of omega-3 fatty acids from crude glycerol |
| CN103025862B (zh) * | 2010-05-04 | 2015-02-11 | 韩国生命工学研究院 | 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 |
| EP2650356B1 (en) | 2010-12-09 | 2019-06-19 | University of Tsukuba | Aurantiochytrium strains having high squalene-producing ability, and method for producing squalene thereof |
| CN102839129A (zh) * | 2011-06-23 | 2012-12-26 | 法国罗凯特兄弟公司 | 一种裂殖壶菌诱变方法及其产生的变异株 |
| FR2988100B1 (fr) * | 2012-03-16 | 2016-02-05 | Fermentalg | Production d'acide docosahexaenoique et d'astaxanthine en mode mixotrophe par schizochytrium |
-
2014
- 2014-01-17 JP JP2014557505A patent/JP6298770B2/ja active Active
- 2014-01-17 US US14/760,290 patent/US10023884B2/en active Active
- 2014-01-17 EP EP14741072.4A patent/EP2947141B1/en active Active
- 2014-01-17 WO PCT/JP2014/050753 patent/WO2014112574A1/ja active Application Filing
- 2014-01-17 ES ES14741072T patent/ES2762618T3/es active Active
- 2014-01-17 DK DK14741072T patent/DK2947141T3/da active
- 2014-01-17 CN CN201480005397.1A patent/CN104995291B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104995291B (zh) | 2018-03-13 |
| JP6298770B2 (ja) | 2018-03-20 |
| WO2014112574A1 (ja) | 2014-07-24 |
| EP2947141A1 (en) | 2015-11-25 |
| US10023884B2 (en) | 2018-07-17 |
| US20150353972A1 (en) | 2015-12-10 |
| JPWO2014112574A1 (ja) | 2017-01-19 |
| EP2947141A4 (en) | 2016-08-10 |
| CN104995291A (zh) | 2015-10-21 |
| EP2947141B1 (en) | 2019-11-06 |
| DK2947141T3 (da) | 2019-12-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2762618T3 (es) | Microorganismos que producen ácido docosahexaenoico y utilización de los mismos | |
| AU2019200857B2 (en) | Method for culturing microalgae of the Aurantiochytrium genus in a culture medium without chloride and without sodium, for the production of DHA | |
| US20100255541A1 (en) | Advanced Algal Photosynthesis-Driven Bioremediation Coupled with Renewable Biomass and Bioenergy Production | |
| US8227216B2 (en) | Methods of using Nannochloropsis algal strains to produce hydrocarbons and fatty acids | |
| JP5608640B2 (ja) | ナビクラ属に属する微細藻類、該微細藻類の培養による油分の製造方法、該微細藻類の乾燥藻体、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法 | |
| Demura et al. | Biomass productivity of native algal communities in Minamisoma city, Fukushima Prefecture, Japan | |
| CN109385388A (zh) | 嗜盐反硝化菌yl5-2及其应用 | |
| Qu et al. | Nitrogen ion beam implantation for enhanced lipid accumulation of Scenedesmus obliquus in municipal wastewater | |
| Song et al. | Halapricum salinum gen. nov., sp. nov., an extremely halophilic archaeon isolated from non-purified solar salt | |
| CN107164238B (zh) | 一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用 | |
| Sun et al. | Strategies for enhanced lipid production of Desmodesmus sp. mutated by atmospheric and room temperature plasma with a new efficient screening method | |
| Zhang et al. | Reverse osmosis concentrate conditioning for microalgae cultivation and a generalized workflow | |
| Li et al. | Spirosoma pomorum sp. nov., isolated from apple orchard soil | |
| CN112513247B (zh) | 破囊壶菌属的新型微藻菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法 | |
| Ten et al. | Hymenobacter daeguensis sp. nov. isolated from river water | |
| Choi et al. | Lysobacter spongiae sp. nov., isolated from spongin | |
| Okiria et al. | Spirosoma migulaei sp. nov., isolated from soil | |
| KR101499912B1 (ko) | 신규 테트라셀미스 ＭＢＥｙｈ０４Ｇｃ 균주（ＫＣＴＣ １２４３２ＢＰ） 및 이를 이용한 바이오디젤의 제조방법 | |
| Agwa et al. | Influence of various nitrogen sources on biomass and lipid production by Chlorella vulgaris | |
| JP6611715B2 (ja) | オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属藻類の低塩分濃度条件順化方法 | |
| Elderiny et al. | Spirosoma daeguensis sp. nov., isolated from beach soil | |
| Ferreira et al. | Investigation of Desmodesmus sp. growth in photobioreactor using vinasse as a carbon source | |
| Almalki et al. | Density and Composition of Cohabiting Bacteria in Chlorella vulgaris CCAP 211/21A Is Influenced by Changes in Nutrient Supply | |
| KR101499909B1 (ko) | 신규 테트라셀미스 ＭＢＥｙｈ０１Ｌ（ＫＣＴＣ １２４２９ＢＰ）및 이를 이용한 바이오디젤의 제조방법 | |
| CN116083319A (zh) | Ai红假单胞菌新物种及其应用 |