CN103025862B - 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有生产生物油能力的新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法。当在含葡萄糖的培养基中培养时，本发明的微藻在菌株中以高比例积累生物油，并因此可生产高产量的生物油。所述微藻还可使用豆粉作为氮源生产生物油，通过用可食用豆粉作为培养基培养所获的产品可用作生产食品和饲料的原料。此外，本发明所述微藻还可使用非食物性纤维素类生物质作为碳源生产生物油，使用非食物性纤维素类生物质作为培养基可以克服诸如食物资源供需失衡、原料成本增加等限制生物油开发的因素，确保微生物发酵油的产业竞争力。

Description

新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法
技术领域
本发明涉及具有生产生物油能力的新型破囊壶菌（thraustochytrid）类微藻及用其生产生物油的方法。
背景技术
从油类植物如油菜籽、大豆和棕榈的油中生产的生物柴油是已商品化的典型生物柴油，并且其生产在全世界迅速增长。然而，由于用于生产生物柴油的原料作物价格昂贵，所以与原油来源的柴油相比，生物柴油在生产成本方面不具优势并且竞争力较低。因此，尽管它在环境和农业经济方面有多种优势，但如果不减税，生物柴油似乎不具有商业竞争力。尽管预期能源枯竭引起的原油价格上升会为生物柴油带来商业竞争力，但生物柴油生产近来增加引起的原料作物价格的突然上升成为降低生物柴油竞争力的新因素。
此外，由于利用日光并循环二氧化碳，来自油类植物和光合微藻的光合油（其是用于生产生物柴油的生物油的主要来源）具有重要的优势，但它受包括时间、空间、季节和气候在内的多种因素的不利影响。而且，产自光合油的生物柴油使用的增加会引起食物短缺和由于大量种植原料作物而产生的新的环境问题，因而存在对来自光合油的生物柴油效能的质疑。
由于这些原因，有机营养微生物的发酵作为用于大量生产生物油的方法已经受到了关注。产油的典型微生物包括原壳小球藻（Chlorellaprotothecoides）、解脂耶罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）、圆红冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）、粘红酵母（Rhodotorula glutinis）等，人们已经积极进行了对其发酵方法的研究。
在这些油类微生物中，属于破囊壶菌家族的微藻是能够产生生物油的油类微生物，其含有含量高达细胞干重70%的多不饱和脂肪酸，如DHA（二十二碳六烯酸）。公知DHA（脑、眼组织和神经组织的必需脂肪酸）在婴儿视力和运动神经的发育中起重要作用。此外，据报道，在痴呆患者的脑中DHA的量显著降低，也有报道DHA具有多种新功能，如抑制与年龄相关的黄斑退行性改变。尽管有此类有益的生理功能，但人体无法自身合成足量的DHA。因此，公认DHA是从外界补充的必需营养成分，许多国际组织包括世界卫生组织建议每日摄入1g或更多的DHA。因此，DHA被商品化为包括健康功能性食品在内的多种产品，并且其作为医药原料的实用性高，这说明DHA具有非常高的商业价值。因此，不同于一般的微生物油或光合油，产自属于破囊壶菌家族的微藻发酵的油能够在利用DHA的高附加值产业和生物柴油产业间提供联系，从而为生物柴油提供了商业竞争力。
然而，保证微生物发酵油作为生物柴油原料的商业竞争力的最重要因素是使用工业废料、废料资源和剩余生物质作为营养源，并最终使用丰富的不可食用的纤维素类生物质。非食物性纤维素类生物质资源的实例包括木质生物质、农业副产品、城市废品等。
已报道了许多种使用破囊壶菌家族的微生物生产DHA（二十二碳六烯酸）的方法。此类方法主要是通过在含葡萄糖作为碳源的培养基中培养破囊壶菌家族的微生物来生产DHA的方法（韩国专利公开号2008-0087820、韩国专利公开号2009-0064603、美国专利公开号20080009045和美国专利公开号20050019880）。然而，还没有关于使用下一代生物质资源的非食物性纤维素类生物质生产生物油的方法的报道。
为此，本发明人付出大量的努力来开发使用微藻生产高产量DHA的方法，由此发现从马来西亚红树林区域的土壤中分离出的新型破囊壶菌类微藻含有高浓度的DHA，并且当使用豆粉或纤维素类生物质作为营养源培养所述新型微藻时会产生含DHA的生物油，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供生产高产量生物油的新型微藻菌株。
本发明的另一目的是提供使用所述新型微藻菌株生产生物油的方法。
为了实现上述目的，本发明提供具有生产生物油能力的破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）。
本发明还提供一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）培养破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
本发明还提供一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）在含豆粉的培养基中培养破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
本发明还提供一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）在含纤维素类生物质的培养基中培养破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
本发明的其它特征和实施方式从以下详细说明和所附权利要求书中将会更为显而易见。
附图说明
图1为新型破囊壶菌类微藻KRS101的显微照片。
图2显示了新型破囊壶菌类微藻KRS101的系统发育图。
图3显示了新型破囊壶菌类微藻KRS101在5L发酵罐中分批培养的结果。
图4显示了新型破囊壶菌类微藻KRS101在5L发酵罐中补料分批培养的结果。
图5为显示通过新型破囊壶菌类微藻KRS101用纤维素类生物质作为营养源生产生物油及其用途的示意图。
图6为显示新型破囊壶菌类微藻KRS101用纤维素类生物质作为营养源时增殖的图。
图7为显示通过使用纤维素类生物质作为营养源培养新型破囊壶菌类微藻KRS101所生产的油和DHA的量的图。
图8为显示使用纤维素类生物质作为营养源培养的新型破囊壶菌类微藻KRS 101培养物的羧甲基纤维素酶活性的图。
图9为显示使用纤维素类生物质作为营养源培养的新型破囊壶菌类微藻KRS 101培养物的纤维二糖糖苷酶活性的图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。通常，本文所用的命名法是公知的并在本领域普遍使用。
一方面，本发明涉及具有生产生物油能力的破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）。
本发明的破囊壶菌类微藻KRS101分离自马来西亚红树林区域的树叶/土壤样品，通过在B1培养基（在1L含300mg/L青霉素G和500mg/L硫酸链霉素的天然海水中的1g/L酵母提取物、1g/L蛋白胨和10g/L琼脂的溶液）中培养所述样品来分离破囊壶菌微藻、分离所述培养物并分离形成破囊壶菌微藻典型特征性游动孢子的菌株而获得。
对破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）进行生物学鉴定的18SrRNA测序结果显示所述微藻具有SEQ ID NO:1的18S rRNA核苷酸序列。
在本发明中，由微藻KRS101生产的生物油可包含不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸（DHA）。
微藻KRS101中含有的二十二碳六烯酸（DHA）的含量占其中脂肪酸总含量的比例可以为40%或更高，优选为45%或更高，更优选为49%或更高。
在本发明的一个实施例中，显示本发明的微藻菌株KRS101含有高浓度的高度不饱和脂肪酸，尤其是DHA含量达到总脂肪酸含量的49.5%。
在本发明的另一实施例中，在含多种浓度的葡萄糖作为单一碳源的基础培养基中培养本发明的微藻菌株KRS101。结果，显示微藻细胞的生长在60g/L的葡萄糖浓度中为最高（细胞干重：9.09g/L），并且油含量为细胞干重的45%，DHA含量为总脂肪酸含量的41.22%。
在本发明的又一实施例中，在含多种浓度的酵母提取物作为单一氮源的基础培养基中培养本发明的微藻菌株KRS101。结果，显示微藻细胞的生长随酵母提取物浓度的升高而变得更高，但油含量随酵母提取物浓度的降低而升高。此外，DHA含量随酵母提取物浓度的降低而略微降低。检测了海水盐浓度的作用，结果显示微藻细胞的生长和油及DHA的含量随海水盐浓度的降低而升高。
在本发明的又一实施例中，在含60g/L的果糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油或粗甘油代替葡萄糖作为碳源的培养基中培养本发明的微藻菌株KRS101。结果，显示微藻细胞的生长略微降低但仍然可以生长，尤其是使用生物柴油废料粗甘油作为碳源与使用纯甘油相比显示出微藻细胞生长的增加。
在本发明的又一实施例中，在含10g/L的玉米浆、牛肉膏、麦芽提取物、蛋白胨或胰蛋白胨代替酵母提取物作为有机氮源的培养基中培养本发明的微藻菌株KRS 101。结果，显示微藻细胞的生长是可以进行的，尤其是使用玉米浆显示出与使用酵母提取物相似的微藻细胞生长。此外，使用含乙酸铵（2.34g/L）、硝酸铵（1.22g/L）、硫酸铵（2.0g/L）、硝酸钠（2.58g/L）或尿素（0.9g/L）的培养基检测了多种无机氮盐的作用，结果，显示微藻细胞的生长在含乙酸铵或尿素的培养基中为最高。同时，使用含乙酸钠(15.48g/L)、碳酸氢钠（15.86g/L）、碳酸钠（10.0g/L）、柠檬酸钠（27.8g/L）、硝酸钠（16.0g/L）和硫酸钠（13.4g/L）的培养基检测了非氯盐的作用，结果，显示KRS101菌株在所有培养基中均表现出良好的细胞生长。
另一方面，本发明涉及一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）培养破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
在本发明中，培养可以是分批培养或补料分批培养。
在本发明的一个实施例中，在含60g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、5g/L乙酸铵、3g/L KH2PO4和15g/L海水盐的培养基中分批培养微藻菌株KRS101。结果，显示所述菌株在培养72小时时完全消耗了葡萄糖，此时，细胞干重、油含量和DHA含量分别为24.8g/L、31.2%和36.7%，并且油和DHA的产量分别为7.8g/L和2.9g/L。同时，在如上相同条件下补料分批培养微藻菌株KRS101，结果，显示最高细胞生长出现在培养60小时时，此时，细胞干重、油含量和DHA含量分别为50.2g/L、43.5%和40.3%，并且油和DHA的产量分别为21.9g/L和8.8g/L。
又一方面，本发明涉及一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）在含豆粉的培养基中培养破囊壶菌类微藻KRS101(KCTC11686BP)以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
在本发明中，可使用豆粉作为单一氮源。
在本发明中，由KRS101菌株生产的生物油可以是不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸（DHA）。
此外，培养可以是补料分批培养或分批培养。
在本发明的一个实施例中，微藻菌株KRS101在含豆粉作为氮源的培养基中显示出高细胞生长率，并且含DHA的生物油的生产率在所述培养基中也很高。
又一方面，本发明涉及一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：（a）在含纤维素类生物质的培养基中培养破囊壶菌类微藻KRS101（KCTC11686BP）以产生生物油；及（b）回收所产生的生物油。
在本发明中，培养基可包含纤维素类生物质作为单一碳源，所述纤维素类生物质可选自羧甲基纤维素、纤维二糖和棕榈油副产品。
所述破囊壶菌类微藻可以是KRS101（KCTC11686BP）。
此外，由破囊壶菌类微藻生产的生物油可含有不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸可以是二十二碳六烯酸（DHA）。
在本发明中，培养可以是分批培养或补料分批培养。
在本发明的一个实施例中，使用纤维素类生物质羧甲基纤维素、纤维二糖或棕榈油副产品作为碳源培养微藻菌株KRS101，结果，显示KRS101菌株可以增殖。此外，使用改良的Bligh-Dyer方法测定油和DHA的含量，结果，显示在培养72小时时，当使用羧甲基纤维素时，油和DHA的产量分别为0.3g/L和0.18g/L（(60.7%TFA）；当使用纤维二糖时，油和DHA的产量分别为0.4g/L和0.24g/L（59.8%TFA）。当使用棕榈油副产品时，油和DHA的产量为0.3g/L和0.16g/L（54.3%TFA）。
在本发明的另一实施例中，检测了微藻KRS101培养液中被认为与利用纤维素类生物质相关的羧甲基纤维素酶和纤维二糖糖苷酶酶活性。结果，显示在微藻KRS101培养液中检测到了羧甲基纤维素酶和纤维二糖糖苷酶酶活性，尽管这些活性随纤维素类营养源的种类而变化。
实施例
在下文中，将通过实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅为说明目的而不应解释为限制本发明的范围，这对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
实施例1：分离和鉴定含DHA的新型油类微藻
用50ml的falcon管在马来西亚的红树林区域收集树叶/土壤样品并悬浮于10ml盐水中，随后将悬浮液适当稀释并接种于B1培养基（在1L含300mg/L青霉素G和500mg/L硫酸链霉素的天然海水中的1g/L酵母提取物、1g/L蛋白胨和10g/L琼脂的溶液）（Burja等，2006）中用于分离破囊壶菌微藻。将培养基在28℃以200rpm温育2－4天，并将所获的菌落再次接种于B1培养基中。随后，用显微镜观察菌落，并分离30个菌落，这些菌落均形成了破囊壶菌微藻典型特征性游动孢子（见图1）。
将30个分离出的菌落在50mL海生菌肉汤（marine broth，Sigma-Aldrich）（250mL三角瓶）中在28℃以200rpm培养3天，并随后收集细胞并在真空离心机中在60℃干燥12小时。在3ml的5%甲醇硫酸中悬浮干燥后的细胞并在90℃温育1小时，随后用0.6mL的己烷萃取所产生的脂肪酸酯并经气相色谱分析。
分析结果显示在下文的表1中。如其中所示，微藻细胞含高浓度的高度不饱和脂肪酸，尤其是细胞中DHA含量达到总脂肪酸含量的49.5%。此外，所分析的30个菌落均显示出相似的脂肪酸组成。
[表1]新型破囊壶菌类微藻KRS101的脂肪酸组成
对于分离到的菌落的分子生物学鉴定，进行了18S rRNA测序。
使用常规酚-氯仿方法从一个菌落中分离染色体DNA，并使用用于扩增破囊壶菌微藻的18S rRNA基因的引物5'-ATGAACATCAAAAA-3'（P1，SEQ ID NO:2）和5'-ATGAACATCAAAAA-3'（P2，SEQ ID NO:3）通过PCR扩增其中的18S rRNA基因。具体而言，对于PCR扩增，制备含EFTaq聚合酶（Takara）（2.5U）、聚合酶缓冲液、dNTP（每种1mM）、1μl的各引物（100pmol）和500ng模板DNA的PCR反应溶液（50μl）并使用PCR系统（Takara，日本）进行PCR反应30个循环，每一循环由96℃30秒、43℃1分钟和72℃3分钟组成。在1%的琼脂糖凝胶上对PCR产物进行电泳以确定具有期望大小的DNA片段得到了扩增，并使用pGEM-TEasy载体（Promega,USA）将其转化入大肠杆菌（E.coli）DH5α中。从转化后重组的大肠杆菌细胞（Qiagen,美国）中提取质粒DNA并用限制性内切酶EcoRI消化以确定具有所需大小的DNA片段得到了克隆，并对其测序（SEQ ID NO:1，GenBank登录号HM126528）。序列同源性分析结果显示该菌株为分别与Aurantiochytrium mangrovei和Aurantiochytrium sp.BL1具有99.3%和98.9%同源性的新型破囊壶菌类微藻菌株。由此，将该微藻菌株命名为“KRS101”并在2010年4月22日以登录号KCTC11686BP保藏于韩国生命工学研究院韩国典型培养物保藏中心（KCTC）。
图2显示了新型破囊壶菌类微藻KRS 101的系统发育图。
实施例2：新型破囊壶菌类微藻KRS101的细胞生长和所述微藻产含DHA 油的能力的分析
在多种营养源条件下检测实施例1中分离的新型破囊壶菌类微藻KRS 101的细胞生长和所述微藻产含DHA油的能力。
使用含60g/L的碳源葡萄糖、1g/L的氮源酵母提取物和6g/L的人工海水盐的培养基作为基础培养基。将单一菌落在15ml的基础培养基中在28℃以120rpm预培养3天，随后将1ml的培养液接种至含多种浓度的碳源、氮源和海水盐的培养基中并在28℃以120rpm培养3天。用PBS缓冲液（磷酸盐缓冲盐溶液,pH 7.2）将经离心收集的细胞洗涤三次，在60℃干燥12小时，并测定细胞干重（DCW）。
使用改良的Bligh-Dyer方法（Burja等，2007）分析含DHA油的含量。具体而言，向125mg的干细胞中加入6.25mL氯仿、12.5mL甲醇和5mL 50mM K2HPO4缓冲液（pH 7.4），之后在28℃以200rpm温育1小时，随后加入6.25mL氯仿和6.25mL K2HPO4缓冲液，将细胞溶液振荡约30次并将其静置30分钟，使其分为水层和含油的有机溶剂层。小心地将氯仿层转移至已预先称重的铝皿中，之后在80℃干燥30分钟，随后测定油重。总油含量用以下公式计算：
总油含量(%)=油(g)/细胞干重(100g)=(WL-WD)x VCx 100/VPx WS
WL：铝皿重量;
WD：铝皿+油脂的重量;
VC：氯仿总体积;
VP：转移至铝皿的氯仿体积;
WS：所用的细胞重量（细胞干重）。
同时，通过气相色谱测定油中的DHA含量。具体而言，在3ml 5%的甲醇硫酸溶液中悬浮合适量的干细胞并在90℃温育1小时以产生脂肪酸酯，随后用0.6ml的己烷萃取并通过气相色谱分析。
分析结果显示于上文表1中。如其中所示，相比于在海生菌肉汤中培养菌株，当在基础培养基中培养新型微藻菌株KRS101时，脂肪酸组成略微变化，但包括DHA的高度不饱和脂肪酸均以高浓度产生。
在含多种浓度的葡萄糖作为单一碳源的基础培养基中培养新型微藻菌株KRS101。结果，如下文表2中可见，该菌株在葡萄糖浓度为60g/L时显示出最高的细胞生长（细胞干重：9.09g/L），在该浓度下，油含量为细胞干重的45%，DHA含量为总脂肪酸含量的41.22%。
[表2]葡萄糖浓度对新型破囊壶菌类微藻KRS101的细胞生长和油及DHA含量的作用
浓度(g L-1) 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
5 4.49 8.50 44.08
20 8.22 35.85 40.13
40 7.38 36.75 41.19
60 9.09 45.00 41.22
100 5.57 28.10 38.76
160 6.19 27.45 40.57
同时，在含多种浓度的酵母提取物作为单一氮源的基础培养基中培养新型微藻菌株KRS101。结果，如下文表3中可见，细胞生长随酵母提取物浓度的升高而升高，而油含量随酵母提取物浓度的降低而升高，升高至最高细胞干重的70%。另一方面，总脂肪酸中DHA的含量随酵母提取物浓度的降低而略微降低。
[表3]酵母提取物浓度对破囊壶菌类微藻KRS101的细胞生长和油及DHA含量的作用
浓度(g L-1) 细胞干重(g L-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
2 6.28 70.00 32.66
4 6.50 53.25 35.15
6 6.12 51.90 39.55
8 7.68 48.00 38.74
随后，检测了海水盐浓度的作用。结果，如下文表4中可见，细胞生长和油及DHA含量随海水盐浓度的降低而降低。
[表4]海水盐浓度对破囊壶菌类微藻KRS101的细胞生长和油及DHA含量的作用
浓度(g L-1) 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
2 7.62 50.80 41.87
6 7.75 45.00 37.77
15 7.87 40.35 35.06
30 6.19 14.65 34.94
40 6.37 14.20 36.17
50 7.27 13.20 35.25
实施例3：破囊壶菌类微藻KRS101利用各种营养源的能力
检测了破囊壶菌类微藻KRS101利用各种营养源的能力。具体而言，在含多种碳源、氮源或非氯盐的基础培养基中以与上述相同的方式培养微藻菌株KRS101，并检测细胞生长和油及DHA的含量。
在含60g/L的果糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘油或粗甘油代替葡萄糖作为碳源的培养基中培养微藻菌株KRS101。结果，如表5中可见，尽管与在含葡萄糖的培养基中相比，微藻菌株KRS101的细胞生长有所降低，但其在所述培养基中仍旧可以生长。尤其是，使用生物柴油废料粗甘油作为碳源比使用纯甘油显示出更高的细胞生长。
[表5]破囊壶菌类微藻KRS101使用多种碳源的细胞生长和含DHA油的产生
碳源 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
果糖 10.15 15.30 37.25
阿拉伯糖 3.00 8.90 43.88
木糖 3.38 8.50 43.90
乳糖 4.41 9.00 46.55
麦芽糖 4.15 6.50 52.36
蔗糖 4.27 21.80 48.25
纯甘油 5.60 9.40 37.56
粗甘油 7.32 8.50 43.38
另外，在含10g/L的玉米浆、牛肉膏、麦芽提取物、蛋白胨或胰蛋白胨代替酵母提取物作为有机氮源的培养基中培养微藻菌株KRS101。结果，如下文表6中可见，新型微藻菌株KRS101的细胞生长是可以在所述培养基中进行的，尤其是在玉米浆中的细胞生长与在酵母提取物中的细胞生长是类似的。此外，使用含乙酸铵（2.34g/L）、硝酸铵（1.22g/L）、硫酸铵（2.0g/L）、硝酸钠（2.58g/L）或尿素（0.9g/L）的培养基检测了多种无机氮盐的作用。结果，如下文表7中可见，在乙酸铵和尿素中细胞生长为最高。
[表6]破囊壶菌类微藻KRS 101使用多种有机氮源的细胞生长和含DHA油的产生
有机氮源 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
玉米浆 9.44 15.30 37.25
牛肉膏 3.00 8.90 43.88
麦芽提取物 3.38 8.50 43.90
蛋白胨 4.41 9.00 46.55
胰蛋白胨 7.32 8.50 43.38
[表7]破囊壶菌类微藻KRS 101使用多种无机氮源的细胞生长和含DHA油的产生
无机氮源 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
乙酸铵 9.52 55.40 43.00
硝酸铵 5.99 32.10 47.06
硫酸铵 6.04 19.80 49.34
硝酸钠 6.00 63.50 28.25
尿素 10.28 57.70 29.78
同时，使用含乙酸钠（15.48g/L）、碳酸氢钠（15.86g/L）、碳酸钠（10.0g/L）、柠檬酸钠（27.8g/L）、硝酸钠（16.0g/L）或硫酸钠（13.4g/L）的培养基检测了非氯盐的作用。结果，如下文表8中可见，新型微藻菌株KRS101在所有培养基中均显示出良好的细胞生长。
[表8]新型破囊壶菌类微藻KRS 101使用多种非氯盐的细胞生长和含DHA油的产生
非氯盐 细胞干重(gL-1) 油含量(%DCW) DHA(%TFA)
乙酸钠 6.70 20.30 45.65
碳酸氢钠 6.29 4.30 4.23
碳酸钠 5.15 5.74 7.21
柠檬酸钠 3.20 15.80 39.19
硝酸钠 7.43 29.00 28.25
硫酸钠 7.53 21.30 40.30
实施例4：通过在发酵罐中培养新型破囊壶菌类微藻KRS101来生产含 DHA的生物油
根据上述的营养需求的分析结果，选择了最适的培养基组成，并用所选培养基在5L发酵罐中培养该新型微藻菌株KRS101。
具体而言，在含所选培养基组成（60g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、5g/L乙酸铵、3g/L KH2PO4和15g/L海水盐）的培养基中预培养菌株KRS101，将预培养后的细胞转移至3L的相同培养基中（5L发酵罐），并在28℃、300rpm、3vvm和pH 7的条件下进行分批培养，同时以12小时间隔收集细胞并检测其生长状况和油及DHA的含量。
结果，如图3中可见，培养基中的葡萄糖在培养72小时时完全消耗，此时，细胞干重和油及DHA的含量分别为24.8g/L、31.2%和36.7%，油和DHA的产量分别为7.8g/L和2.9g/L。
同时，在如上相同的条件下进行新型微藻菌株KRS101的补料分批培养。结果，如图4中可见，最高细胞生长出现在培养60小时时，此时，细胞干重和油及DHA的含量分别为50.2g/L、43.5%和40.3%，油和DHA的产量分别为21.9g/L和8.8g/L。
实施例5：在含豆粉的培养基中培养新型破囊壶菌类微藻KRS101
豆作为植物蛋白和脂肪来源，已被用作诸如豆瓣酱、豆腐、酱油等食品的原料。近来，发现豆富含具有包括防癌效果在内的多种生理效应的异黄酮，因此它已作为健康功能性食物而受到大量关注。此外，尽管豆具有高营养含量，但可通过大规模栽培来大量生产，因此其生产成本低。
为了检测具有低生产成本的豆粉是否可用作培养新型微藻菌株KRS101的营养源，使用含多种浓度豆粉的培养基（60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆固体、5g/L乙酸铵、3g/L KH2PO4和15g/L人工海水盐）培养新型微藻菌株KRS101。
具体而言，将所述菌株的单一菌落在15ml的培养基（60g/L葡萄糖、5g/L玉米浆固体、5g/L乙酸铵、3g/L KH2PO4和15g/L人工海水盐）中在28℃以120rpm预培养3天，并将1ml的培养液接种至含多种浓度豆粉（5g/L、10g/L和20g/L）的培养基中并在28℃以120rpm培养3天。随后，收集细胞并分析其生长和油及DHA的含量。分析结果显示于下文表9中。另外，未接种微藻的对照组的分析结果显示于下文表10中。
[表9]在含豆粉的培养基中培养的新型破囊壶菌类微藻KRS101的培养产物分析结果
20:5，EPA；22:6(n6)，DPA；22:6(n3)，DHA；22:5(n3)，DPA。nd，未检测到。
[表10]未接种微藻的豆粉基础培养基的组成分析结果
20:5，EPA；22:6(n6)，DPA；22:6(n3)，DHA；22:5(n3)，DPA。nd，未检测到。
基于上述结果，将新型微藻菌株KRS101在用豆粉代替碳源或氮源的含豆粉培养基中培养。
具体而言，为了检测豆粉是否可用作碳源，在含多种浓度豆粉（5g/L、10g/L和20g/L）的无葡萄糖（碳源）培养基中以与上述相同的方式培养新型微藻菌株KRS101。随后，收集细胞并分析其生长状况和油及DHA的含量。
结果，如下文表11中可见，新型微藻菌株KRS101的细胞生长明显降低，说明豆粉不适合作为碳源。
同时，为了检测豆粉是否可用作有机氮源，在含多种浓度（5g/L、10g/L和20g/L）的无玉米浆固体（有机氮源）培养基中以与上述相同的方式培养新型微藻菌株KRS101。随后，收集细胞并分析其生长和油及DHA的含量。
由此，如下文表12中可见，新型微藻菌株KRS101显示出非常高的细胞生长，说明豆粉可用作有效氮源。表12中的DHA含量以总脂肪酸的DHA含量（%）表示。由于豆粉含量升高，豆粉中非DHA的脂肪酸浓度也升高，因此总脂肪酸的DHA含量（%）逐渐降低。
[表11]在含豆粉代替葡萄糖作为碳源的培养基中培养的新型破囊壶菌类微藻KRS101的培养产物分析结果
20:5，EPA；22:6(n6)，DPA；22:6(n3)，DHA；22:5(n3)，DPA。nd，未检测到。
[表12]在含豆粉作为氮源的培养基中培养的新型破囊壶菌类微藻KRS101的培养产物分析结果
20:5，EPA；22:6(n6)，DPA；22:6(n3)，DHA；22:5(n3)，DPA。nd，未检测到。
实施例6：使用纤维素类生物质作为营养源培养新型破囊壶菌类微藻 KRS101
保证微生物发酵油作为生物柴油原料的商业竞争力的最重要因素是使用工业废料、废料资源和剩余生物质作为营养源，并最终使用丰富的不可食用的纤维素类生物质（见图5）。
因此，为了检测纤维素类生物质是否可用作培养新型微藻菌株KRS101的营养源，将所述菌株的单一菌落接种到含60g/L碳源葡萄糖、1g/L氮源酵母提取物和6g/L人工海水盐的基础培养基中并在28℃以120rpm预培养3天。随后，将1ml的预培养液分别接种到含0.5%（w/v）的羧甲基纤维素（CMC）代替葡萄糖作为碳源的基础培养基、含0.5%(w/v)的纤维二糖作为碳源的基础培养基和含0.5%（w/v）的棕榈油副产品（空壳棕榈果实束（empty fruit bunch,EFB））的基础培养基中，并28℃以120rpm培养，同时通过测定600nm处吸光度（光密度（OD））分析细胞生长。
在将棕榈油副产品用作工业可用的纤维素类生物质资源的情况下，将棕榈油副产品粉碎至约1-2mm大小，在0.5M NaOH溶液中浸泡4小时，在121℃和15psi高压灭菌15分钟，用水洗涤以去除NaOH并干燥。将由此预处理后的棕榈油副产品用于制备培养基。
结果，如图6中可见，使用羧甲基纤维素、纤维二糖和棕榈油副产品作为营养源能够使新型微藻菌株KRS101增殖。此外，如图7中可见，在培养72小时时，当使用羧甲基纤维素时油和DHA的产量分别为0.3g/L和0.18g/L（60.7%TFA），当用纤维二糖时油和DHA的产量分别为0.4g/L和0.24g/L（59.8%TFA）。当用棕榈油副产品时，油和DHA的产量分别为0.3g/L和0.16g/L（54.3%TFA）。
已知破囊壶菌家族的微藻不具有纤维素酶活性(Taoka等，BiosciBiotechnol Biochem.,73:180,2009)，但近来发现非Aurantiochytriumsp.的破囊壶菌微藻（Aplanochytrium、Botryochytrium、Oblongichytrium、Parietichytrium、裂殖壶菌属（Schizochytrium）、Sicyoidochytrium、破囊壶菌属（Thraustochytrium）和Ulkenia（吾肯氏壶菌属））具有羧甲基纤维素酶活性（Nagano等，Mar Biotechnol,2010）。
因此，分析了新型微藻菌株KRS101中被认为与纤维素类生物质利用相关的纤维素酶（羧甲基纤维素酶和纤维二糖糖苷酶）的活性。
为了检测羧甲基纤维素酶活性，将0.2ml的样品（细胞裂解物或培养上清液）与0.8ml含1%（w/v）羧甲基纤维素的10mM Tris-HCl缓冲液（pH6.5）混合，并将混合物在60℃温育2小时。使用DNS（3,5-二硝基水杨酸）方法测定释放出的还原糖的浓度，将一个酶活性单位定义为每mg蛋白质的活性。
结果，如图8中可见，在新型微藻菌株KRS101的培养液中检测到了羧甲基纤维素酶活性，尽管羧甲基纤维素酶活性随纤维素类营养源的种类而变化。此外，使用羧甲基纤维素作为底物显示出最高的酶活性。
为了检测纤维二糖糖苷酶的活性，将0.2ml的样品（细胞裂解物或培养上清液）与含纤维二糖（15mM）的50mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）混合，并将混合物在60℃温育2小时。随后，使用DNS（3,5-二硝基水杨酸）方法测定释放出的还原糖的浓度，将一个酶活性单位定义为每mg蛋白质的活性。
结果，如图9中可见，在微藻菌株KRS101的培养液中检测到了纤维二糖糖苷酶活性，尽管纤维二糖糖苷酶活性随纤维素类营养源的种类而变化。此外，使用棕榈油副产品作为底物显示出最高的酶活性。
微生物保藏
保藏机构：韩国生命工学研究院；
登录号：KCTC11686BP；
保藏日期：2010年4月22日。
尽管已通过具体特征详细描述了本发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，本说明书仅为优选的实施方式而不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同项限定。
工业实用性
如上文描述，当在含葡萄糖培养基中培养本发明的微藻时，其在细胞中以高比例积累生物油，并因此可生产高产量的生物油。此外，所述微藻可使用豆粉作为氮源生产生物油，并且通过用可食用豆粉作为培养基培养所获的产品可用作生产食品和饲料的原料。本发明的微藻还可使用非食物性纤维素类生物质作为碳源生产生物油。此外，使用非食物性纤维素类生物质用于生产生物油可以克服包括食物资源供应不稳定及原料成本增加在内限制生物油开发的因素，并可以提高微生物发酵油的商业竞争力。序列表的自由内容
已附电子文档。
申请人韩国生命工学研究院        国际申请号
文档参照号PP-B0961
所保藏的微生物或其它生物学物质的著录项目
（专利协作条约规则第33条第2款）
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)。

Claims (13)

1.具有生产生物油能力的破囊壶菌(thraustochytrid)类微藻KRS101，其保藏编号为KCTC11686BP。
2.一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)培养权利要求1所述的破囊壶菌类微藻KRS101以产生生物油；及
(b)回收所产生的生物油。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物油包含不饱和脂肪酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)。
5.一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在含豆粉的培养基中培养权利要求1所述的破囊壶菌类微藻KRS101以产生生物油；及
(b)回收所产生的生物油。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述培养基包含的豆粉作为单一氮源。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物油包含不饱和脂肪酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)。
9.一种生产生物油的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在含纤维素类生物质的培养基中培养权利要求1所述的破囊壶菌类微藻KRS101以产生生物油；及
(b)回收所产生的生物油。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述培养基包含的纤维素类生物质作为单一碳源或营养源。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述纤维素类生物质选自羧甲基纤维素、纤维二糖和棕榈油副产品。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物油包含不饱和脂肪酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)。
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