KR102490870B1 - 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법 - Google Patents
트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 동결 보존 방법에 의하면 상기 미세조류를 안정적으로 장기간 보관할 수 있고, 공정을 단축하여 미세조류 보존 비용을 절감할 수 있다. 또한, 상기 조성물을 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법에 의하면 상온에서 장기간 보관 시에도 균체 활성이 유지되고, 보관 및 운송이 용이한 파우더 형태의 동결건조 바이오매스를 간단한 공정을 통하여 제작할 수 있다.
Description
본 출원은 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법에 관한 것이다.
미세조류는 해양 생태 먹이사슬 단계에서 최하위 계급으로 식물성 플랑크톤이라 일컬어진다. 그 중에서도 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae)에 속하는 미세조류는 일반적인 미세조류와 다르게 광합성 유래의 독립영양이 아닌 종속영양을 특징으로 하며, 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 포함하는 오메가-3 계열의 다중불포화지방산을 고농도로 생산 및 함유하여 해양 생태계에의 공급을 담당하는 중요한 역할을 한다.
일반적인 미생물은 동결 보존 또는 동결건조 보존 방법에 의한 장기 보관이 가능하나, 트라우스토키트리드과 미세조류는 이러한 일반적인 미생물의 보존 방식으로는 유효하게 장기 보관이 어려운 바, 현재까지는 주로 계대 배양의 형태로 보존이 이루어지고 있는 실정이다. 그러나, 트라우스토키트리드과 미세조류는 종속영양을 특징으로 하기 때문에 보관 환경에 따라 일반적인 미생물에 비하여 더욱 빈번한 계대가 필요하고, 그에 따라 오염에 취약하게 되고, 보관 비용이 크게 발생하고 있다. 따라서, 트라우스토키트리드과 미세조류를 장기 보관할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구된다.
본 출원의 목적은 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물을 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법 또는 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법에 의해 제조된 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
일 양상은 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "스킴 밀크(skim milk)"는 우유에서 지방이 제거된 것으로 용어 "탈지 우유" 또는 "탈지유"와 혼용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae)"는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목에 속하는 미세조류로, 예를 들어, 상기 미세조류는 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.), 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.), 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.), 자포노키트리움 속(Japonochytrium sp.), 모놀리조키트리움 속(Monorhizochytrium sp.), 시초이도키트리움 속(Sicyoidochytrium sp.), 울케니아 속(Ulkenia sp.), 파리에티키트리움 속(Parietichytrium sp.), 보트리오키트리움 속(Botryochytrium sp.), 혼대아 속(Hondaea sp.), 및 라비린투로키트리움 속(Labyrinthulochytrium sp.)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 스킴 밀크를 0.5 내지 20 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 스킴 밀크를 0.5 내지 15 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 8 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 15 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 8 중량%, 2 내지 20 중량%, 2 내지 15 중량%, 2 내지 10 중량%, 2 내지 8 중량%, 3 내지 20 중량%, 3 내지 15 중량%, 3 내지 10 중량%, 또는 3 내지 8 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 수크로스를 1 내지 20 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 수크로스를 1 내지 15 중량%, 1 내지 12 중량%, 2 내지 20 중량%, 2 내지 15 중량%, 2 내지 12 중량%, 4 내지 20 중량%, 4 내지 15 중량%, 4 내지 12 중량%, 6 내지 20 중량%, 6 내지 15 중량%, 6 내지 12 중량%, 또는 6 내지 9 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 염화나트륨을 0.1 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 염화나트륨을 0.1 내지 9 중량%, 0.1 내지 8.5 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 0.5 내지 9 중량%, 0.5 내지 8.5 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 9 중량%, 1 내지 8.5 중량%, 2 내지 10 중량%, 2 내지 9 중량%, 2 내지 8.5 중량%, 3 내지 10 중량%, 3 내지 9 중량%, 3 내지 8.5 중량%, 5 내지 8.5 중량%, 또는 6 내지 8.5 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 스킴 밀크 및 수크로스를 1:0.5 내지 1:10의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 스킴 밀크 및 수크로스를 1:0.5 내지 1:8, 1:0.5 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:3, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:3, 1:1.2 내지 1:10, 1:1.2 내지 1:8, 1:1.2 내지 1:5, 또는 1:1.2 내지 1:3의 중량비로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 스킴 밀크 및 염화나트륨을 1:0.5 내지 1:10의 중량비로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 스킴 밀크 및 염화나트륨을 1:0.5 내지 1:8, 1:0.5 내지 1:5, 1:0.5 내지 1:3, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:3, 1:1.2 내지 1:10, 1:1.2 내지 1:8, 1:1.2 내지 1:5, 또는 1:1.2 내지 1:3의 중량비로 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "동결 보존"은 액체 상태의 물질을 고체 상태로 동결시켜 보존하는 것을 의미하며, "동결건조 보존"을 포함하는 의미일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 보존용 조성물일 수 있다. 상기 용어, "동결건조"는 액체 상태의 시료를 동결하여 감압 하에 방치함으로써 시료 중의 수분을 승화시켜 제거하는 건조 방법으로, 미생물의 장기 보존을 위해 사용될 수 있으나, 동결건조 과정에서의 세포 손상을 보호하기 위해서는 적절한 동결보호제를 사용해야 한다.
상기 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물은 다른 동결보호제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 염화나트륨, DMSO(dimethylsulfoxide), 덱스트란(dextran), 자당(sucrose), 글리세롤(glycerol), 만니톨(mannitol), 솔비톨(sorbitol), 과당(fructose), 라피노스(raffinose), 혈청알부민(serum albumin) 등을 목적에 따라 조합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 양상은 1) 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물을 포함하는 배지에서 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 배양물을 회수하는 단계; 및 3) 상기 배양물을 동결건조하여 바이오매스를 제조하는 단계를 포함하는, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법을 제공한다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배양"은 상기 미세조류를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미세조류에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 트라우스토키트리드과 미세조류의 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종속영양"은 에너지원 또는 영양원을 체외에서 얻어낸 유기물에 의존하는 영양 방식으로, 독립영양에 대응되는 용어이며, 용어 "암배양"과 혼용될 수 있다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원의 미세조류의 배양에 사용되는 배지는 트라우스토키트리드과 미세조류가 생장할 수 있는 배양 배지라면 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미세조류를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지를 사용할 수 있다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 상기 미세조류를 배양하는데 사용되는 탄소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원일 수 있으나, 상기 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에, 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계의 배양 조건은 트라우스토키트리드과 미세조류를 생장시킬 수 있는 조건이라면 제한 없이 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 배양은 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 수행되는 것일 수 있다.
구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 배양물의 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다.
또한, 배양 온도는 20 내지 45℃, 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안, 약 10 내지 120 시간 동안, 약 10 내지 80 시간 동안, 약 10 내지 50 시간 동안, 또는 약 10 내지 40 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양물을 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 배양물을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 트라우스토키트리드과 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 "배양물"은 상기 미세조류를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 미세조류를 포함하는 배양액 또는 상기 배양액에서 미세조류가 제거된 배양여액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 배양물은 미세조류 배양 배지에 상기 미세조류를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 배양물을 동결건조하여 바이오매스를 제조하는 단계는 당업계에 공지된 동결건조 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 미세조류 배양물을 회수하여 동결건조 바이알(FD vial)에 넣고, 진공 상태를 유지하면서 동결건조 기기에 연결한 후, 일정한 온도 및 압력 조건을 유지하면서 수분을 제거하는 방법으로 수행되는 것일 수 있다. 상기 일정한 온도 조건은 예를 들어 -50℃ 이하의 온도일 수 있고, 일정한 압력 조건은 0.133 mbar 이하의 압력일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법은 단계 3)의 이전 및 이후에 상기 미세조류를 동결하는 단계를 더 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단계 3) 이전에 예비 동결 과정을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 방법은 예비 동결 과정을 포함하지 않고 동결건조 바이오매스를 제조함으로써 보다 간단한 방법으로 비용을 절감하여 미세조류를 보존할 수 있다.
다른 양상은 1) 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물을 포함하는 배지에서 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 배양물을 회수하는 단계; 및 3) 상기 배양물을 동결건조하여 바이오매스를 제조하는 단계를 포함하는, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물, 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계, 배양물을 회수하는 단계, 동결건조 바이오매스를 제조하는 단계는 상기한 바와 같다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법은 단계 3)의 이전 및 이후에 상기 미세조류를 동결하는 단계를 더 포함하지 않는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 단계 3) 이전에 예비 동결 과정을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 방법은 예비 동결 과정을 포함하지 않고 동결건조 바이오매스를 제조함으로써 보다 간단한 방법으로 비용을 절감하여 동결건조 바이오매스를 제조할 수 있다.
다른 양상은 a) 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물; 및 b) 트라우스토키트리드과 미세조류를 포함하고, 및 상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법에 의해 제조된 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제공한다.
상기 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법은 상기한 바와 같다.
상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 가능한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 동결건조 바이오매스는 상온에서 3개월 내지 5년, 3개월 내지 3년, 3개월 내지 2년, 3개월 내지 1년, 3개월 내지 10개월, 3개월 내지 8개월, 3개월 내지 6개월 동안 보관 가능한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "상온(room temperature)"은 약 15 내지 25℃의 온도를 의미할 수 있고, 용어 "실온(room temperature)"과 혼용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "보관 가능한 것"은 동결건조 바이오매스를 보관 후 다시 배지에 배양하였을 때 균체가 성장 가능한 것을 의미할 수 있고, 또는 동결건조하지 않은 생균에 비하여 균체 활성이 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 유지되는 것을 의미할 수 있다.
상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 후 바이오매스 1 mL 당 1.0 X 107개 내지 1.0 X 1012개의 생균을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 후 바이오매스 1 mL 당 1.0 X 107개 내지 1.0 X 1011개, 1.0 X 107개 내지 1.0 X 1010개, 1.0 X 108개 내지 1.0 X 1012개, 1.0 X 108개 내지 1.0 X 1011개, 1.0 X 108개 내지 1.0 X 1010개, 1.0 X 109개 내지 1.0 X 1012개, 1.0 X 109개 내지 1.0 X 1011개, 또는 1.0 X 109개 내지 1.0 X 1010개의 생균을 포함하는 것일 수 있다.
상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 후 1.0 X 107 내지 1.0 X 1012 CFU (colony forming unit)/mL의 생균을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 후 1.0 X 107 내지 1.0 X 1011, 1.0 X 107 내지 1.0 X 1010, 1.0 X 108 내지 1.0 X 1012, 1.0 X 108 내지 1.0 X 1011, 1.0 X 108 내지 1.0 X 1010, 1.0 X 109 내지 1.0 X 1012, 1.0 X 109 내지 1.0 X 1011, 또는 1.0 X 109 내지 1.0 X 1010 CFU/mL의 생균을 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 동결 보존 방법에 의하면 상기 미세조류를 안정적으로 장기간 보관할 수 있고, 공정을 단축하여 미세조류 보존 비용을 절감할 수 있다. 또한, 상기 조성물을 이용한 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법에 의하면 상온에서 장기간 보관 시에도 균체 활성이 유지되고, 보관 및 운송이 용이한 파우더 형태의 동결건조 바이오매스를 간단한 공정을 통하여 제작할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따라 제작한 동결건조 바이알(A 내지 D), 및 이들을 아가 플레이트에 접종 후 콜로니 형성 여부를 확인한 사진(E 내지 F)이다(A 및 E: 조건구 1-1; B 및 F: 조건구 1-2; C 및 G: 조건구 1-3; 및 D 및 H: 조건구 1-4).
도 2는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 아가 플레이트에 접종 후 콜로니 형성 여부를 확인한 사진이다.
도 3은 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 배양 플라스크에 접종 후 배양 시간 별로 흡광도를 측정한 성장 곡선 그래프이다.
도 4는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 7일 동안 상온에서 보관 후 배양 플라스크에 접종하여 배양 시간 별로 흡광도를 측정한 성장 곡선 그래프이다.
도 5는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 12주 동안 상온에서 보관 후 아가 플레이트에 접종하여 콜로니 형성 여부를 확인한 사진이다.
도 2는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 아가 플레이트에 접종 후 콜로니 형성 여부를 확인한 사진이다.
도 3은 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 배양 플라스크에 접종 후 배양 시간 별로 흡광도를 측정한 성장 곡선 그래프이다.
도 4는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 7일 동안 상온에서 보관 후 배양 플라스크에 접종하여 배양 시간 별로 흡광도를 측정한 성장 곡선 그래프이다.
도 5는 일 양상에 따른 동결건조 바이오매스를 12주 동안 상온에서 보관 후 아가 플레이트에 접종하여 콜로니 형성 여부를 확인한 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세조류의 동결건조 조건에 따른 세포 생존 여부 확인
실시예 1-1. 동결건조 보존제 제작
각각 증류수에 용해된 4% 스킴 밀크 용액 0.8 mL, 20% 수크로스 용액 1.6 mL, 및 20% 염화나트륨 용액 1.6 mL를 혼합하여 총 4 mL의 동결건조 보존제를 제작하였다.
실시예 1-2. 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조
트라우스토키트리드과 미세조류가 생장 가능한 배지인 GYEP 배지(글루코스 10g/L, 효모 추출물 1g/L, 펩톤 1g/L, MgSO4·7H2O 2g/L, 해염 20g/L, H3BO3 5.0mg/L, MnCl2 3.0mg/L, CuSO4 0.2mg/L, NaMo4·2H2O 0.05mg/L, CoSO4 0.05mg/L, 및 ZnSO4·7H2O 0.7mg/L)에 스키조키트리움 속 미세조류 CD01-5004 (수탁번호: KCTC14345BP)를 접종하여 500 mL 플라스크에서 28℃, 180 rpm 조건으로 밤새 배양하였다. 배양물을 회수하여 원심분리하고, 상등액을 제거한 후, 상기 실시예 1-1에서 제작한 동결건조 보존제에 현탁하여 미세조류 바이오매스 현탁액을 제조하였다. 제조한 바이오매스 현탁액을 앰플 형태의 동결건조 바이알(FD vial)에 담은 후, 조건구 1-1 내지 1-3은 하기 표 1에 나타난 바와 같은 조건으로 예비 동결하였고, 조건구 1-4는 예비 동결하지 않은 현탁액으로 준비하였다.
| 실험군 | 예비 동결 조건 | |
| 조건구 1-1 | 한제 사용한 일반 동결 | 바이오매스 현탁액을 99% 에탄올 및 드라이아이스를 혼합한 한제(freezing mixture)를 사용하여 예비 동결함. |
| 조건구 1-2 | 완만동결 | 바이오매스 현탁액을 4℃에서 60 분 동안 방치 후, -20℃에서 60 분 동안 방치하고, 이후 -80℃에서 60 분 동안 방치하여 완만한 조건으로 예비 동결함. |
| 조건구 1-3 | 완만동결 + 상온건조 | 상기 조건구 1-2와 동일한 조건으로 예비 동결 후 상온(25℃)에서 건조시킴. |
| 조건구 1-4 | 예비 동결 없음 | - |
상기 각 조건구의 동결건조 바이알을 동결건조 기기에 연결하고, 진공 상태에서 -50℃ 이하의 온도 및 0.133 mbar 이하의 압력을 유지하는 조건으로 동결건조 하였다. 동결건조 기기에 다량의 앰플을 연결하면 기기의 압력이 높아져 동결건조된 세포의 생육에 영향을 미칠 수 있으므로, 1개의 앰플을 기기에 연결한 후, 기기 압력이 0.133 mbar 이하로 떨어진 후에 다시 다음 앰플을 추가로 연결하는 방법으로 진행하였다. 모든 앰플이 기기에 연결된 후에 3 시간 정도 동결건조 하였고, 동결건조가 완료된 앰플을 진공 상태가 유지될 수 있도록 가스 토치로 용봉하였다.
실시예 1-3. 동결건조된 세포의 생존 여부 확인
실시예 1-2에서 제작한 동결건조 세포의 생존 여부를 확인하기 위하여, 가루 형태의 건조 바이오매스 샘플을 증류수에 현탁하여 GYEP 아가 플레이트에 도말한 후, 콜로니 생육 여부를 육안으로 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 예비 동결 과정을 거친 조건구 1-1 내지 1-3의 동결건조 바이오매스는 아가 플레이트에서 콜로니 생육 및 형성이 불가하였으나, 예비 동결 과정을 거치지 않은 조건구 1-4의 동결건조 바이오매스만이 아가 플레이트에서 콜로니 생육 및 형성이 가능함을 확인하였다.
실시예 2. 동결건조 보존제의 성분에 따른 동결건조된 세포의 생존율 확인
동결건조 보존제의 성분에 따른 동결건조 보존 효과를 평가하기 위하여, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 조건구 별로 해당 성분들을 표기된 최종 농도로 포함하는 동결건조 보존제를 4 mL씩 제작하였다.
| 실험군 | 스킴 밀크(%) | 수크로스(%) | 트레할로스(%) | 메탄올(%) | 펩톤(%) | 글리세롤(%) | 염화나트륨(%) |
| 조건구 2-1 | 10 | 10 | - | - | - | - | - |
| 조건구 2-2 | 10 | - | 10 | - | - | - | - |
| 조건구 2-3 | 10 | - | - | 10 | - | - | - |
| 조건구 2-4 | - | - | 10 | - | 5 | - | - |
| 조건구 2-5 | 10 | 4 | 4 | - | - | - | - |
| 조건구 2-6 | 6 | 8 | - | - | - | - | 4 |
| 조건구 2-7 | 10 | - | - | - | - | 10 | - |
스키조키트리움 속 미세조류 CD01-5004 (수탁번호: KCTC14345BP)를 글루코스 30 g/L를 포함하는 GYEP 배지에 접종하고, 상기 표 2의 조성으로 제작한 동결건조 보존제를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 바이오매스 현탁액을 제조하고, 예비 동결 과정 없이 그대로 동결건조 하였다.
가루 형태의 건조 바이오매스 샘플을 증류수에 현탁하여 680 nm에서 흡광도(Optical density: OD)가 0.1이 되도록 희석한 후, 이를 1 mL 씩 GYEP 아가 플레이트에 도말하였고, 각 플레이트 당 형성된 콜로니 수를 계수하였다. 상기 바이오매스 현탁액 제조 전 회수한 세포 배양물의 일부를 동결건조 보존제에 현탁하지 않고, 680 nm에서 OD 값이 0.1이 되도록 희석한 용액 1 mL를 GYEP 아가 플레이트에 도말하고, 형성된 콜로니 수를 계수하여 대조구로 비교하였다. 콜로니 하나 당 1 x 106개의 세포가 존재하므로, 각 실험군 별 형성된 콜로니 수에 106을 곱하여 배양물 1 mL 당 생균 수를 계산하고, 각 조건구의 생존율을 대조구에 대한 백분율로 계산하였다.
| 실험군 | 형성된 콜로니 수 | 생균 수 | 생존율 |
| 대조구 | 1500 | 1.5 X 109 | 100% |
| 조건구 2-1 | 20 | 2.0 X 107 | 1.33% |
| 조건구 2-2 | 0 | 0 | 0% |
| 조건구 2-3 | 0 | 0 | 0% |
| 조건구 2-4 | 0 | 0 | 0% |
| 조건구 2-5 | 2 | 2.0 X 106 | 0.13% |
| 조건구 2-6 | 250 | 2.5 X 108 | 16.67% |
| 조건구 2-7 | 0 | 0 | 0% |
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 조건구 2-1, 2-5 및 2-6에서 플레이트에 도말 후 72 시간 내에 콜로니가 형성됨을 확인하였다. 이들 조건구에서 사용된 동결건조 보존제는 공통적으로 스킴 밀크 6 내지 10% 및 수크로스 4 내지 10%를 포함하는 것이었으며, 특히 스킴 밀크, 수크로스 및 염화나트륨을 포함하는 동결건조 보존제를 사용한 조건구 2-6에서 생존율이 16.67%로 현저히 높게 나타남을 확인하였다.
실시예 3. 동결건조 보존제의 성분 비율에 따른 동결건조된 세포의 성장 정도 확인
실시예 3-1. 아가 플레이트에서의 콜로니 형성 확인
실시예 2에서 도출된 가장 유효한 보존제 성분인 스킴 밀크, 수크로스 및 염화나트륨의 농도 비율에 따른 동결건조 보존 효과를 평가하기 위하여, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 조건구 별로 해당 성분들을 표기된 최종 농도로 포함하는 동결건조 보존제를 4 mL씩 제작하였다. 각 조건구 별 동결건조 보존제를 사용하여 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 트라우스토키트리드과 미세조류를 동결건조한 후, 다시 증류수에 현탁 및 GYEP 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니 수를 계수하였다. 콜로니가 형성된 조건구들에서는 도말 후 24 시간부터 콜로니 형성이 육안으로 확인되었고, 40 시간부터 세포의 생존 유무 및 콜로니 형성 정도를 확연하게 구분할 수 있었다.
| 실험군 | 스킴 밀크(%) | 수크로스(%) | 염화나트륨(%) | 콜로니 수 |
| 조건구 3-1 | 6 | 8 | 4 | 30개 |
| 조건구 3-2 | - | 10 | 5 | 32개 |
| 조건구 3-3 | 4 | 8 | 8 | 34개 |
| 조건구 3-4 | 10 | - | - | 0개 |
| 조건구 3-5 | 5 | - | 5 | 0개 |
그 결과, 도 2 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 10% 스킴 밀크만을 포함하는 보존제를 사용한 조건구 3-4와, 5% 스킴 밀크 및 5% 염화나트륨만을 포함하는 보존제를 사용한 조건구 3-5에서는 콜로니가 관찰되지 않았고, 이를 제외한 나머지 조건구들에서 30개 이상의 콜로니가 형성되었음을 확인하였다.
실시예 3-2. 배양 플라스크에서의 세포 성장 정도 확인
실시예 3-1에서 콜로니 형성이 확인된 조건구 3-1 내지 3-3의 동결건조 세포에 대하여 배양 플라스크에서의 세포 성장 정도를 측정하였다.
구체적으로, 500 mL 플라스크에 글루코스 30 g/L를 포함하는 GYEP 배지를 넣고, 여기에 조건구 3-1 내지 3-3의 동결건조된 바이오매스를 접종하여 28℃, 180 rpm 조건에서 배양하였다. 배양 시간 별로 각 조건구의 배양물을 취하여 분광광도계(spectrophotometer)로 680 nm에서 OD 값을 측정하여 균체의 성장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 조건구 3-1 내지 3-3의 동결건조 세포는 배양 후 약 12 시간부터 본격적인 세포의 성장을 통한 OD 값의 상승을 나타냈고, 모든 조건구에서 유사한 성장 곡선을 나타냈다.
실시예 4. 동결건조 보존제의 성분 비율에 따른 동결건조 시료의 보관 안정성 확인
실시예 3-1에서 제작한 조건구 3-1 내지 3-3의 동결건조 바이오매스를 동결건조 바이알에 담긴 채로 상온에서 7일 동안 보관한 후, 실시예 3-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 플라스크에서 배양하고, 배양 시간 별 흡광도를 측정하여 균체의 성장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 조건구 별로 세포의 성장 정도에 차이가 있음을 확인하였고, 구체적으로 조건구 3-3이 가장 빠른 성장 속도를 보였고, 조건구 3-1에서 다소 느리지만 성장이 나타난 반면, 조건구 3-2는 배양 후 40 시간까지 세포 성장이 나타나지 않았다.
실시예 5. 동결건조 바이오매스 시료의 장기 보존 안정성
동결건조 바이오매스 시료의 장기 보존 안정성을 확인하기 위하여, 실시예 3-1의 조건구 3-3과 동일한 동결보존제 조성의 스킴밀크 4%, 수크로스 8% 및 염화나트륨 8%를 포함하는 동결건조 보존제를 제작한 후, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 트라우스토키트리드과 미세조류를 동결건조하였다. 제작된 동결건조 바이오매스는 12주(84일) 동안 상온에서 보관 후, 증류수에 현탁 및 GYEP 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니 수를 계수하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 10-2 배 희석 샘플에서 약 47개의 콜로니가 형성되었으며, 이로부터 배양물 1 mL 당 생균수는 약 4.7 X 109개임을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 동결건조 보존제를 사용하여 제작한 동결건조 바이오매스는 최소 12주 이상 보존 시에도 일정량 이상의 생균 수가 확보됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 스킴 밀크를 0.5 내지 20 중량%로 포함하는 것인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 수크로스를 1 내지 20 중량%로 포함하는 것인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 염화나트륨을 0.1 내지 10 중량%로 포함하는 것인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 스킴 밀크 및 수크로스를 1:0.5 내지 1:10의 중량비로 포함하는 것인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 스킴 밀크 및 염화나트륨을 1:0.5 내지 1:10의 중량비로 포함하는 것인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 트라우스토키트리드과 미세조류는 트라우스토키트리움 속(Thraustochytrium sp.), 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.), 오란티오키트리움 속(Aurantiochytrium sp.), 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.), 자포노키트리움 속(Japonochytrium sp.), 모놀리조키트리움 속(Monorhizochytrium sp.), 시초이도키트리움 속(Sicyoidochytrium sp.), 울케니아 속(Ulkenia sp.), 파리에티키트리움 속(Parietichytrium sp.), 보트리오키트리움 속(Botryochytrium sp.), 혼대아 속(Hondaea sp.), 및 라비린투로키트리움 속(Labyrinthulochytrium sp.)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 미세조류인, 조성물.
- 1) 청구항 1의 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물을 포함하는 배지에서 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 회수하는 단계; 및
3) 상기 배양물을 동결건조하여 바이오매스를 제조하는 단계를 포함하는, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법. - 청구항 8에 있어서, 상기 단계 3)의 이전 및 이후에 상기 미세조류를 동결하는 단계를 더 포함하지 않는 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결 보존 방법.
- 1) 청구항 1의 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물을 포함하는 배지에서 트라우스토키트리드과 미세조류를 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 배양물을 회수하는 단계; 및
3) 상기 배양물을 동결건조하여 바이오매스를 제조하는 단계를 포함하는, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법. - 청구항 10에 있어서, 상기 단계 3)의 이전 및 이후에 상기 미세조류를 동결하는 단계를 더 포함하지 않는 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법.
- a) 스킴 밀크; 수크로스; 및 염화나트륨을 포함하는 트라우스토키트리드과(Thraustochytriaceae) 미세조류의 동결 보존용 조성물; 및 b) 트라우스토키트리드과 미세조류를 포함하고, 및
청구항 10의 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스를 제조하는 방법에 의해 제조된 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스. - 청구항 12에 있어서, 상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 가능한 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스.
- 청구항 13에 있어서, 상기 동결건조 바이오매스는 15 내지 25℃에서 12주 이상 보관 후 바이오매스 1 mL 당 1.0 X 107개 내지 1.0 X 1012개의 생균을 포함하는 것인, 트라우스토키트리드과 미세조류의 동결건조 바이오매스.
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