CN116249763A - 冷冻保存破囊壶菌科微藻的组合物及使用其冷冻保存破囊壶菌科微藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于冷冻保存属于破囊壶菌科的微藻的组合物，以及使用所述组合物冷冻保存属于破囊壶菌科的微藻的方法。根据一个方面通过用于冷冻保存属于破囊壶菌科的微藻的组合物和使用所述组合物冷冻保存属于破囊壶菌科的微藻的方法，所述微藻可以长期稳定地储存，并且可以通过缩短过程来降低保存微藻的成本。此外，根据使用所述组合物制备属于破囊壶菌科的微藻的冷冻干燥生物质的方法，即使在室温下长期储存期间，也可以通过简单处理制造能够保持细菌活性且易于储存和运输的粉末形式的冷冻干燥生物质。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于深低温保存破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)微藻的组合物及深低温保存破囊壶菌科微藻的方法。
背景技术
微藻是浮游植物，在海洋生态系统食物链中排在最底等级。其中，属于破囊壶菌科的微藻与一般微藻不同，其特征是异养生物而不是光合作用衍生的自养生物，通过产生和含有高浓度的Ω-3多不饱和脂肪酸(包括二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)在向海洋生态系统供应Ω-3多不饱和脂肪酸(包括二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)方面发挥重要作用。
一般微生物可以通过深低温保存或冷冻干燥保存方法长期储存。然而，这些微生物的一般储存方法并不适合于破囊壶菌科微藻的长期有效储存。因此，迄今为止，此类微藻以传代培养的形式保存。然而，由于破囊壶菌科的微藻的特征为异养生物，根据储存环境，它们需要比一般微生物更频繁的传代，因此使它们容易受到污染，并导致高储存成本。因此，需要开发一种长期储存破囊壶菌科微藻的新方法。
现有技术文献
专利文献
(专利文献1)美国专利公开US 2013/0089901 A1
发明内容
技术问题
本申请提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
本申请提供一种使用用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物深低温保存破囊壶菌科微藻的方法，或制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法。
本申请提供一种通过使用制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法制备的破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质。
本申请提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物用于深低温保存破囊壶菌科微藻的用途，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
本申请提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物在制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质中的用途，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
技术方案
本申请中所描述的各个说明和实施方式，也可以适用于其他说明和实施方式。也就是说，本申请中描述的多种要素的所有组合都落入本申请的范围内。此外，不能看出本申请的范围受以下详细说明所描述的限制。此外，本领域的技术人员仅通过使用常规实验就会认识到或能够确定本申请中所描述的关于本申请的特定方面的多个等同物。此外，此类等同物旨在包含在本申请中。
一方面，提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
术语“脱脂牛奶”是指已经去除脂肪的牛奶。
本文所用术语“破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)”是属于破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微藻，所述微藻可包含选自破囊壶菌属(Thraustochytriumsp.)、裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)、澄黄壶菌属(Aurantiochytrium sp.)、破囊壶菌科属(Thraustochytriidae sp.)、日本壶菌属(Japonochytrium sp.)、单根壶菌属(Monorhizochytrium sp.)、葫芦状壶菌属(Sicyoidochytrium sp.)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia sp.)、帕里蒂氏壶菌属(Parietichytrium sp.)、葡萄串状壶菌属(Botryochytrium sp.)、洪达亚菌属(Hondaea sp.)和类网黏菌属(Labyrinthulochytriumsp.)的至少一种。然而，本公开的实施方式不限于此。
基于所述组合物的总重量，所述组合物包含0.5重量％至20重量％的脱脂牛奶。例如，基于所述组合物的总重量，所述组合物中包含的脱脂牛奶的量可以是0.5重量％至15重量％、0.5重量％至10重量％、0.5重量％至8重量％、1重量％至20重量％、1重量％至15重量％、1重量％至10重量％、1重量％至8重量％、2重量％至20重量％、2重量％至15重量％、2重量％至10重量％、2重量％至8重量％、3重量％至20重量％、3重量％至15重量％、3重量％至10重量％或3重量％至8重量％。
基于所述组合物的总重量，所述组合物包含1重量％至20重量％的量的蔗糖。例如，基于所述组合物的总重量，所述组合物中包含的蔗糖的量可以是1重量％至15重量％、1重量％至12重量％、2重量％至20重量％、2重量％至15重量％、2重量％至12重量％、4重量％至20重量％、4重量％至15重量％、4重量％至12重量％、6重量％至20重量％、6重量％至15重量％、6重量％至12重量％或6重量％至9重量％。
基于所述组合物的总重量，所述组合物可以包含0.1重量％至10重量％的量的氯化钠。例如，基于所述组合的总重量，所述组合物中包含的氯化钠的量可以是0.1重量％至9重量％、0.1重量％至8.5重量％、0.5重量％至10重量％、0.5重量％至9重量％、0.5重量％至8.5重量％、1重量％至10重量％、1重量％至9重量％、1重量％至8.5重量％、2重量％至10重量％、2重量％至9重量％、2重量％至8.5重量％、3重量％至10重量％、3重量％至9重量％、3重量％至8.5重量％、5重量％至8.5重量％或6重量％至8.5重量％。
所述组合物包含重量比为1:0.5至1:10的脱脂牛奶和蔗糖。例如，所述组合物可以包含重量比为1:0.5至1:8、1:0.5至1:5、1:0.5至1:3、1:1至1:10、1:1至1:8、1:1至1:5、1:1至1:3、1:1.2至1:10、1:1.2至1:8、1:1.2至1:5或1:1.2至1:3的脱脂牛奶和蔗糖。
所述组合物包含重量比为1:0.5至1:10的脱脂牛奶和氯化钠。例如，所述组合物可以包含重量比为1:0.5至1:8、1:0.5至1:5、1:0.5至1:3、1:1至1:10、1:1至1:8、1:1至1:5、1:1至1:3、1:1.2至1:10、1:1.2至1:8、1:1.2至1:5或者1:1.2至1:3的脱脂牛奶和氯化钠。
本文使用的术语“深低温保存”是指将液态的材料冷冻后以固态保存，并且可以包含“冷冻干燥保存”。例如，所述组合物可以是一种用于冷冻干燥保存破囊壶菌科微藻的组合物。本文使用的术语“冷冻干燥”是指通过冷冻液态的样品并将其放置在减压下，使样品中的水分升华并从中除去水分的干燥方法。冷冻干燥可以用于微生物的长期保存。然而，应使用合适的冷冻保护剂，以防止细胞在冷冻干燥处理中受到损伤。
包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠的、用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物可以与其他冷冻保护剂一起使用。例如，氯化钠、二甲亚砜(DMSO)、葡聚糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨糖醇、果糖、棉子糖、血清白蛋白等可以根据目的来组合使用，但本公开的实施方式不限于此。
另一方面，提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的方法，所述方法包括：1)在包含含有脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠的、用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物的培养基中，培养破囊壶菌科微藻；2)回收处理1)的培养产物；以及3)冷冻干燥所述培养产物来生产生物质。
用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物与上述相同。
本文使用的术语“培养”是指在适当控制的环境条件下使微藻生长。本申请的培养过程可以根据本领域已知的合适的培养基和培养条件进行。本领域技术人员根据所选择的微藻可以容易地调整和使用所述培养过程。
具体地，本申请的破囊壶菌科微藻的培养可以在异养的条件下进行，但不限于此。
术语“异养的”是依赖于从体外的能量源或营养源获得的有机物质的营养方法，是区别于自养的术语，并且可以与术语“暗培养”互换使用。
培养破囊壶菌科微藻的方法没有特别限制，可以进行本领域公知的分批培养法、连续培养法和补料分批培养法等。可以没有限制地使用任何用于培养本申请的微藻的培养基，只要所述培养基是破囊壶菌科微藻在其中生长的培养基。具体地，可以使用含有适合本申请的微藻的碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基。
用于培养破囊壶菌科微藻的培养基中包含的碳源，可以是选自葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖和甘油中的至少一种。然而，只要是用于培养微藻，可以使用任何碳源。
用于培养破囊壶菌科微藻的培养基中包含的氮源，可以是i)选自酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨和胰蛋白胨的至少一种有机氮源，或ii)选自乙酸铵、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸钠、尿素和谷氨酸钠(MSG)的至少一种无机氮源。然而，本公开的实施方式不限于此，并且任何用于培养微藻的氮源可以在本文使用。
用于培养破囊壶菌科微藻的培养基可以包括，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、其对应的含钠盐或其组合作为磷源。然而，磷源不限于此。
用于培养破囊壶菌科微藻的培养条件可以是任何培养条件，只要破囊壶菌科微藻在其中生长。例如，在有氧条件下培养可以在控制温度、pH等的同时进行。
具体而言，碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)用于调节pH至培养的适当水平(例如，pH 5至pH 9，具体地，pH 6至pH 8)。然而，本公开的实施方式不限于此。
此外，为了维持培养物的需氧状态，可向培养物中注入氧气或含氧气体；或为了维持厌氧和微氧条件，可以不注入气体或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体。然而，本公开的实施方式不限于此。
此外，培养温度可保持在约20℃至约45℃或约25℃至约40℃，持续约10小时至约160小时、约10小时至约120小时、约10小时至约80小时、约10小时至约50小时或约10小时至约40小时。然而，培养条件不限于此。另外，在培养过程中，可以使用消泡剂例如脂肪酸聚乙二醇酯来抑制气泡的产生，但本发明的实施方式不限于此。
回收培养物可以是采用本领域已知的合适方法收集目标培养物。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换层析等，但不限于此。
本文所用的术语“生物质”是指可以用作化学能的生物体，例如植物、动物和微生物，化学能即生物能源的能量源，并且从生态学的角度可以指：在单位时间和空间内存在的有机体的重量或能量。此外，所述生物质包括但不限于，由细胞分泌的化合物，并且可以包含细胞外物质以及细胞和/或细胞内的内容物。在本申请中，所述生物质可以是破囊壶菌科微藻本身、其培养物、或通过培养或发酵所述微藻而生产的产物，或可以是生物质的浓缩物。然而，所述生物质不限于此。
破囊壶菌科微藻的“培养产物”是指由培养所述微藻而生产的产物。具体地，所述培养产物可以是含有微藻的培养基或从培养基中去除微藻的培养物滤液。然而，所述培养产物不限于此。所述破囊壶菌科微藻的培养产物可以通过将微藻接种到微藻培养基中，然后根据本领域已知的培养方法进行培养处理来制备。
通过冷冻干燥培养产物来制备生物质可以根据本领域已知的冷冻干燥方法进行。例如，回收微藻培养产物，放入冷冻干燥小瓶(FD小瓶)中，并且与冷冻干燥装置连接同时保持真空，然后在保持恒温恒压的条件下除去水分。所述恒温条件可以是，例如-50℃以下的温度，恒压条件可以是0.133mbar以下的压力，但温度和压力条件不限于此。
深低温保存破囊壶菌科微藻的方法还可以包括，既不在处理3)之前也不在处理3)之后冷冻微藻。例如，预先冷冻处理可以不在处理3)之前进行。根据所述方法，通过制造冷冻干燥的生物质而不包括预先冷冻处理，可以通过简单的处理以低成本保存微藻。
另一方面，提供一种制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法，所述方法包括：1)在包含含有脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠的用于深低温保存破囊壶菌科微藻的、组合物的培养基中，培养破囊壶菌科微藻；2)回收处理1)的培养产物；以及3)冷冻干燥所述培养产物来生产生物质。
用于深低温保存破囊壶菌科微藻、培养破囊壶菌科微藻、回收培养产物并且制备冷冻干燥生物质的组合物如上所述。
制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法还可以包括既不在处理3)之前也不在处理3)之后冷冻所述微藻的。例如，所述预先冷冻过程可以不在处理3)之前进行。根据所述方法，冷冻干燥的生物质可以通过由制造冷冻干燥生物质而不包括预先冷冻处理的简单处理以低成本制备。
另一方面，提供一种破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质，包含：a)用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠；以及b)破囊壶菌科微藻，其中，所述冷冻干燥生物质是通过制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法来制备的。
用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物以及制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法如上所述。
冷冻干燥生物质可以在15℃至25℃下储存12周或更长。例如，冷冻干燥生物质可以在室温下储存3个月至5年、3个月至3年、3个月至2年、3个月至1年、3个月至10个月、3个月至8个月、3个月至6个月。
本文使用的术语“室温”可以指约15℃至25℃的温度，并且可以与术语“常温”互换使用。
本文所用的术语“可储存”可以指当储存冷冻干燥生物质，然后在培养基中培养时细胞可以生长，或者与未冷冻干燥的活细胞相比，细胞活性保持在60％或更高、70％或更高、80％或更多或90％或更多的特征。
在15℃至25℃下储存至少12周后，所述冷冻干燥生物质可以包含1.0×107至1.0×1012个活细胞/1mL生物质。例如，在15℃至25℃下储存至少12周后，每1mL所述冷冻干燥生物质可以包含1.0×107至1.0×1011、1.0×107至1.0×1010、1.0×108至1.0×1012、1.0×108至1.0×1011、1.0×108至1.0×1010、1.0×109至1.0×1012、1.0×109至1.0×1011或1.0×109至1.0×1010个活细胞。
在15℃至25℃下储存至少12周后，所述冷冻干燥生物质可以包含1.0×107至1.0×1012CFU(菌落形成单位)/mL活细胞。例如，在15℃至25℃下储存至少12周后，所述冷冻干燥生物质可以包含1.0×107至1.0×1011、1.0×107至1.0×1010、1.0×108至1.0×1012、1.0×108至1.0×1011、1.0×108至1.0×1010、1.0×109至1.0×1012、1.0×109至1.0×1011或1.0×109至1.0×1010CFU/mL活细胞。
另一方面，提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物用于深低温保存破囊壶菌科微藻的用途，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
另一方面，提供一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物用于制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的用途，所述组合物包含脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物、用于深低温保存破囊壶菌科微藻的方法和用于制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法如上所述。
有益效果
根据本发明的用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物和使用所述组合物的深低温保存方法，可以使微藻长期稳定地保存，并通过缩短过程可以降低微藻保存的成本。此外，根据使用所述组合物制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法，即使在室温下长时间储存时也能保持微生物活性，并且冷冻干燥生物质呈粉末形式易于储存和运输，通过简单的处理制备。
附图说明
图1显示了根据一个方面制备的冷冻干燥小瓶(A至D)的图像，以及在确认在琼脂平板上接种所述小瓶内容物后菌落形成的图像(E至H)(A-H：A显示根据条件1-1制备的冷冻干燥小瓶的图像，E显示在将所述A的小瓶的内容物接种到琼脂平板上后确认菌落已经形成的图像，B显示根据条件1-2制备的冷冻干燥小瓶的图像，F显示在将所述B的小瓶的内容物接种到琼脂平板上后确认菌落已经形成的图像，C显示根据条件1-3制备的冷冻干燥小瓶的图像，G显示在将所述C的小瓶的内容物接种到琼脂平板上后确认菌落已经形成的图像，D显示根据条件1-4制备的冷冻干燥小瓶的图像，H显示在将所述D的小瓶的内容物接种到琼脂平板上后确认菌落已经形成的图像。)。
图2显示了将根据一个方面的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认(A-E：A显示在将根据条件3-1的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认，B显示在将根据条件3-2的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认，C显示在将根据条件3-3的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认，D显示在将根据条件3-4的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认，E显示在将根据条件3-5的冷冻干燥生物质接种到琼脂平板上后菌落的确认。)。
图3显示了其中在培养瓶中接种根据一个方面的冷冻干燥生物质后针对每个培养时间测量吸光度的生长曲线图。
图4显示了其中在根据一个方面的冷冻干燥生物质在室温下储存7天然后接种到培养瓶中，之后针对每个培养时间测量吸光度的生长曲线图。
图5显示了根据一个方面的冷冻干燥生物质在室温下储存12周后接种到琼脂平板上，之后确认菌落形成的图像。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。然而，出于说明的目的，提供这些实施例来描述一种或多种实施方式，并且本公开的范围不限于这些实施例。
实施例1.根据微藻的冷冻干燥条件确认细胞生活力
实施例1-1.冷冻干燥保护剂的生产
通过混合0.8mL的4％脱脂牛奶溶液、1.6mL的20％蔗糖溶液和1.6mL的20％氯化钠溶液，每种在蒸馏水中溶解，来制备总量为4mL的冷冻干燥保护剂。
实施例1-2.冷冻干燥破囊壶菌科微藻
裂殖壶菌属(Schizochytrium species)微藻CD01-5004(登录号：KCTC14345BP)接种在GYEP培养基(10g/L葡萄糖、1g/L酵母提取物、1g/L蛋白胨、2g/L MgSO4·7H2O、20g/L海盐、5.0mg/L H3BO3、3.0mg/L MnCl2、0.2mg/L CuSO4、0.05mg/L NaMo4·2H2O、0.05mg/LCoSO4和0.7mg/LZnSO4·7H2O)，所述培养基是破囊壶菌科微藻可以生长的培养基，并在28℃和180rpm下于500mL烧瓶中培养过夜。回收培养物并离心，并且从其中除去上清液。将剩余的产物悬浮在实施例1-1中制备的冷冻干燥保护剂中，来制备微藻生物质悬浮液。在将制备的生物质悬浮液置于安瓿型冷冻干燥小瓶(FD小瓶)中之后，在条件1-1至1-3的情况下，在如表1所示的条件下进行预冷冻，并且未预冷冻的悬浮液按照条件1-4制备。
表1
将每种条件下的冻干小瓶连接到冷冻干燥装置上，并在真空状态下保持-50℃以下的温度和0.133mbar以下的压力的条件下，进行冷冻干燥。当大量安瓿瓶连接到冷冻干燥装置时，装置的压力增加，从而影响冷冻干燥细胞的生长。因此，连接一个安瓿瓶，然后，在装置的压力降低至0.133mbar以下后，再连接下一个安瓿瓶。在将所有的安瓿瓶连接到所述装置之后，进行约3小时的冷冻干燥，并且用气炬密封已经冷冻干燥的安瓿瓶，从而可以保持真空。
实施例1-3.确认冷冻干燥细胞的生活力
为了确认实施例1-2中制备的冷冻干燥细胞的存活，将粉末形式的干燥生物质样品在蒸馏水中悬浮，并铺展在GYEP琼脂平板上，然后目测菌落的生长。
结果，如图1所示，在经历预冷冻处理的条件1-1至1-3的冷冻干燥生物质的情况下，琼脂平板上没有生长或形成菌落，并且仅在没有经历预冷冻处理的条件1-4的情况下，确认了冷冻干燥生物质能够在琼脂平板上生长和形成菌落。
实施例2.根据冷冻干燥保护剂的成分确认冷冻干燥细胞的生活力
为了评估根据冷冻干燥保护剂的成分的冷冻干燥保存效果，如表2所示，针对每种条件，制备4mL含有所示最终浓度的相应成分的冷冻干燥保护剂。
表2
使用与实施例1-2中所用相同的方法制备生物质悬浮液，随后进行没有预冷冻处理的冷冻干燥，除了裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)微藻CD01-5004(登录号：KCTC14345BP)接种到含有30g/L葡萄糖的GYEP培养基中，并使用表2的组合物中制备的冷冻干燥保护剂外。
将粉末形式的干燥生物质样品悬浮在蒸馏水中并稀释，使得在680nm处的吸光度(光密度：OD)为0.1。将所得溶液以1mL的量铺展在GYEP琼脂平板上，并计数每个平板中形成的菌落数。作为对照，在制备生物质悬浮液之前不将回收的一部分细胞培养物悬浮在冷冻干燥保护剂中，将稀释至680nm处OD值为0.1的1mL溶液铺展在GYEP琼脂平板上，并计数形成的菌落数。因为每个菌落有1×106个细胞，所以每1mL培养物中的活细胞数通过将每个实验组形成的菌落数乘以106来计算，并且每种条件下的生活力计算为对照组的百分比。
表3
| 实验组 | 形成的菌落数 | 活细胞数 | 生活力 |
| 对照 | 1500 | 1.5X 109 | 100％ |
| 条件2-1 | 20 | 2.0X 107 | 1.33％ |
| 条件2-2 | 0 | 0 | 0％ |
| 条件2-3 | 0 | 0 | 0％ |
| 条件2-4 | 0 | 0 | 0％ |
| 条件2-5 | 2 | 2.0X 106 | 0.13％ |
| 条件2-6 | 250 | 2.5X 108 | 16.67％ |
| 条件2-7 | 0 | 0 | 0％ |
结果，如表3所示，确认了在条件2-1、2-5和2-6下在平板上铺展后的72小时内形成菌落。在这些条件下使用的冷冻干燥保护剂通常含有6％至10％的脱脂牛奶和4％至10％的蔗糖，特别是，在条件2-6中使用含有脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠的冷冻干燥保护剂，生活力显著地高至16.67％。
实施例3.根据冷冻干燥保护剂的成分比确认冷冻干燥细胞的生长程度
实施例3-1.确认在琼脂平板上的菌落形成
为了根据脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠的浓度比评估冷冻干燥的保存效果，所述脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠是源于实施例2中的最有效的保护剂成分，如下表4所示，对于每种条件，制备4mL含有所示最终浓度的相应成分的冷冻干燥保护剂。在以实施例2中所述相同的方式，对于每种条件使用冷冻干燥保护剂冷冻干燥破囊壶菌科微藻后，通过在蒸馏水中悬浮并铺展在GYEP琼脂平板上来计数形成的菌落数。在形成菌落的条件组中，从铺展后24小时开始视觉上确认菌落形成，并且从铺展后40小时开始可以清楚地区分细胞存活的存在与否和菌落形成的程度。
表4
| 实验组 | 脱脂牛奶(％) | 蔗糖(％) | 氯化钠(％) | 菌落数 |
| 条件3-1 | 6 | 8 | 4 | 30 |
| 条件3-2 | - | 10 | 5 | 32 |
| 条件3-3 | 4 | 8 | 8 | 34 |
| 条件3-4 | 10 | - | - | 0 |
| 条件3-5 | 5 | - | 5 | 0 |
结果，如图2和表4所示，在使用仅含有10％脱脂牛奶的保护剂的条件3-4，以及使用含有5％脱脂牛奶和5％氯化钠的保护剂的条件3-5中没有形成菌落，并且确认在其它条件下菌落形成。
实施例3-2.确认培养瓶中的细胞生长
关于在实施例3-1中确认其中菌落形成的条件3-1至3-3的冷冻干燥细胞，测量培养瓶中细胞生长的程度。
具体地，将含有30g/L葡萄糖的GYEP培养基置于500mL烧瓶中，并将条件3-1至3-3的冷冻干燥生物质接种到其中，并在28℃和180rpm下培养。针对每个培养时间对每个条件的培养物进行取样，并通过使用分光光度计在680nm处测量OD值以确认细胞的生长程度。
结果，如图3所示，通过从培养后约12小时开始的全面细胞生长，条件3-1至3-3的冷冻干燥细胞显示OD值增加，并且在所有条件组中显示相似的生长。
实施例4.根据冷冻干燥保护剂的成分比确认冷冻干燥样品的储存稳定性
将实施例3-1中制备的条件3-1至3-3的冷冻干燥生物质在冻干小瓶中于室温下储存7天后，使用与实施例3-2中所述的相同方法在烧瓶中培养所述生物质，并且通过测量每个培养时间的吸光度来确认细胞的生长程度。
结果，如图4所示，确认在各条件中细胞生长的程度存在差异。具体地，条件3-3显示最快的生长速率，条件3-1显示稍微缓慢的生长，以及条件3-2直到培养后40小时才显示细胞生长。
实施例5.冷冻干燥生物质样品的长期储存稳定性
为了确认冷冻干燥的生物质样品的长期储存稳定性，制备含有4％的脱脂牛奶、8％的蔗糖和8％的氯化钠的冷冻干燥保护剂，所述冷冻干燥保护剂具有与实施例3-1的条件3-3相同的冷冻干燥保护组合物，然后，以与实施例2所述相同的方式冷冻干燥破囊壶菌科微藻。将制备的冷冻干燥生物质在室温下储存12周(84天)，然后悬浮在蒸馏水中并铺展在GYEP琼脂平板上，以计数形成的菌落数。
结果，如图5所示，在10-2倍稀释的样品中形成约47个菌落，并且发现每毫升培养物中的活细胞数约为4.7×109。因此，确认使用根据本公开的冷冻干燥保护剂生产的冷冻干燥生物质即使保存至少12周，也能确保一定数量或更多的活细胞数。
通过以上描述，本申请所属领域的普通技术人员将能够理解，在不改变本申请的技术精神或本质特征的情况下，本申请可以以其他具体形式实施。在这方面，应当理解，上述实施方式在所有方面仅是为了说明的目的而提供的，并不限制本申请的范围。本申请的范围应被解释为包括由所附权利要求书及其等同概念的含义和范围衍生的所有变更或修改，而不仅限于以上详细描述。
Claims (14)
1.一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物，所述组合物包含：脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含0.5重量％至20重量％的量的脱脂牛奶。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含1重量％至20重量％的量的蔗糖。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，基于所述组合物的总重量，所述组合物包含0.1重量％至10重量％的量的氯化钠。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含重量比为1:0.5至1:10的脱脂牛奶和蔗糖。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物包含重量比为1:0.5至1:10的脱脂牛奶和氯化钠。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述破囊壶菌科微藻包含选自破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)、澄黄壶菌属(Aurantiochytrium sp.)、破囊壶菌科属(Thraustochytriidae sp.)、日本壶菌属(Japonochytrium sp.)、单根壶菌属(Monorhizochytrium sp.)、葫芦状壶菌属(Sicyoidochytrium sp.)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia sp.)、帕里蒂氏壶菌属(Parietichytrium sp.)、葡萄串状壶菌属(Botryochytrium sp.)、洪达亚菌属(Hondaeasp.)和类网黏菌属(Labyrinthulochytrium sp.)中的至少一种。
8.一种用于深低温保存破囊壶菌科微藻的方法，所述方法包括：
1)在包含权利要求1所述的用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物的培养基中，培养破囊壶菌科微藻；
2)回收步骤1)的培养产物；以及
3)冷冻干燥回收的培养产物以制备生物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述微藻的冷冻既不在步骤3)之前也不在步骤3)之后进行。
10.一种制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法，所述方法包括：
1)在包含权利要求1所述的用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物的培养基中，培养破囊壶菌科微藻；
2)回收步骤1)的培养产物；以及
3)冷冻干燥回收的培养产物以制备生物质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述微藻的冷冻既不在步骤3)之前也不在步骤3)之后进行。
12.一种破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质，所述冷冻干燥生物质包含：
a)用于深低温保存破囊壶菌科微藻的组合物，所述组合物包含：脱脂牛奶、蔗糖和氯化钠；以及
b)破囊壶菌科微藻，
其中，所述冷冻干燥生物质通过权利要求10所述的制备破囊壶菌科微藻的冷冻干燥生物质的方法来生产。
13.根据权利要求12所述的冷冻干燥生物质，其中，所述冷冻干燥生物质能够在15℃至25℃下储存至少12周。
14.根据权利要求13所述的冷冻干燥生物质，其中，在15℃至25℃下储存至少12周后，所述冷冻干燥生物质包含1.0×107至1.0×1012个活细胞/1mL冷冻干燥生物质。
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