KR20180070937A

KR20180070937A - 미세조류 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 미세조류 동결 보존 방법

Info

Publication number: KR20180070937A
Application number: KR1020160173542A
Authority: KR
Inventors: 김지환; 이창수; 김향미; 권현진; 정유진; 최아영; 황정문; 남승원; 임경준
Original assignee: 국립낙동강생물자원관
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2018-06-27

Abstract

본 발명은 동결보존제로서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미세조류 동결 보존용 조성물 및 상기 조성물에 미세조류를 첨가하여 동결시키는 단계를 포함하는 미세조류 동결 보존 방법에 관한 것으로, 본 발명의 혼합 동결보존제를 이용하면 -70℃ 조건에서 미세조류를 안정적으로 동결보존할 수 있다.

Description

미세조류 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 미세조류 동결 보존 방법{Composition for cryopreservation of microalgae and method for cryopreservation of microalgae using the same}

본 발명은 미세조류 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 미세조류 동결 보존 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동결보존제로서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미세조류 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.

우리나라의 담수 수계환경은 인간 활동의 구심점이며 생태학적으로 다양한 동식물과 미생물의 서식지이며 생물자원의 보고이다. 특히 담수에 서식하는 조류(藻類)는 원생생물계에 속하는 진핵생물군으로 대부분 광합성을 수행하여 수생태계의 1차 생산자로서의 중요한 역할을 수행한다. 최근 이러한 조류자원은 기능성 식품 및 사료 원료 등 활용성이 높은 바이오산업의 원천소재로 부각되고 있는데, 생물산업계의 요구에 대응하기 위하여 조류자원의 확보, 자원관리, 분양서비스 등 관련연구가 순차적으로 급증하고 있다. 산학연에서는 이러한 조류자원을 자체적으로 확보하기도 하지만, 국내외 생물자원은행을 통해 분양을 받아 기초 및 응용연구를 수행하기도 한다.

다양한 국내외 생물자원은행은 이러한 수요자의 요구에 대응하기 위하여 생물자원을 효과적으로 보존하며 유용활성을 지속적으로 유지하기위해 노력하는데, 특히 세균과 곰팡이와 같은 타 미생물자원에 비해 조류자원의 보존 및 관리는 노동 집약적이며 비효율적인 활성배양체의 계대배양에 의존하는 실정이다. 최근 이러한 기술적 문제를 해결하기 위하여, 미국, 독일, 일본 등의 선진국을 중심으로 조류자원의 동결보존에 의한 중장기 보존 기술이 개발되고 있으나, 상대적으로 국내 조류자원에 최적화된 보존기술의 개발은 미흡한 실정이다. 국내 조류자원을 대상으로 진행된 연구를 살펴보면, 해양담수조류인 테트라셀미스(Tetraselmis)의 보존과 남조류인 미크로시스티스(Microcystis)의 보존이 보고된 바 있다.

기존의 중장기 동결보존은 -190℃ 이하의 액체질소를 이용하는데, 이때 액체질소의 구입, 보관시설의 설치, 초저온화상 등의 안전상 문제 등으로 취급이 비교적 까다로운 편이다. 이에 본 발명에서는 -70℃의 범용성이 넓고 비교적 용이한 환경에서 조류자원을 보존하기 위해 서로 다른 3종의 동결보존제를 사용하여, 각 동결보존제의 단독 또는 조합에 따른 조류의 동결보존 효과를 확인하여, 조류자원의 동결보존 재생 조건을 최적화하였다.

한편, 한국공개특허 제2015-0151667호에는 소의 혈청알부민을 이용한 동결보존용 조성물 개발로 저온(-70℃)에서 미세조류를 높은 생존율로 보존하는 방법에 관한 '세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 DMSO와 자당의 혼합물을 동결보존제로 사용한 미세조류 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 미세조류 동결 보존 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 국내 담수수계에서 분리된 3종의 조류를 대상으로, 서로 다른 3종의 동결보존제(DMSO, 글리세롤 및 자당)의 단독 또는 조합 사용에 의한 조류 세포의 동결보존 효과를 확인하여, DMSO 및 자당의 혼합물이 가장 우수한 동결보존제로서의 효과를 보임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 동결보존제로서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미세조류 동결 보존용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물에 미세조류를 첨가하여 동결시키는 단계를 포함하는 미세조류 동결 보존 방법을 제공한다.

본 발명은 세포의 보존을 위해 종래 사용되어오던 동결보존 방법을 개선하기 위한 것으로서, DMSO와 자당 혼합물의 동결보존제를 이용하여, 종래 액체 질소환경(-196℃)에 비하여 비교적 높은 온도인 -70℃에서도 효과적으로 세포를 동결보존할 수 있도록 하는 동결 보존용 조성물에 관한 것이다. -70℃에서 세포의 동결보존은 구입, 보관 과정이 까다로운 액체 질소의 사용이 필요없으며, -70℃의 온도는 연구자들이 일반적으로 보유하고 있는 냉동고(deep freezer)를 사용하는 것만으로 유지할 수 있는 온도이기 때문에 범용성이 넓고 경제적이다.

도 1은 본 발명에서 사용된 파라클로렐라 종(Parachlorella sp.)의 계통학적 유연관계 분석결과 및 광학현미경으로 관찰된 형태를 보여주는 것이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 세네데스무스 종(Scenedesmus sp.)의 계통학적 유연관계 분석결과 및 광학현미경으로 관찰된 형태를 보여주는 것이다.
도 3은 본 발명에서 사용된 클로렐라 종(Chlorella sp.)의 계통학적 유연관계 분석결과 및 광학현미경으로 관찰된 형태를 보여주는 것이다.
도 4는 세 가지 조류를 1x10⁵ 세포/㎖, 1x10⁶ 세포/㎖, 1x10⁷ 세포/㎖의 각기 다른 초기농도로 준비한 뒤, 동결보존한 후 재생한 세포수를 계수하여 백분율로 나타내었다.
도 5는 세 가지 조류의 동결보존에 대한 다양한 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide)의 첨가효과를 세포 재생률로 분석한 것이다. 이때 첨가한 조류의 초기농도는 1x10⁵ 세포/㎖를 사용하였다.
도 6은 세 가지 조류의 동결보존에 대한 다양한 농도의 글리세롤의 첨가효과를 세포 재생률로 분석한 것이다. 이때 첨가한 조류의 초기농도는 1x10⁵ 세포/㎖를 사용하였다.
도 7은 세 가지 조류의 동결보존에 대한 다양한 농도의 자당(sucrose)의 첨가효과를 세포 재생률로 분석한 것이다. 이때 첨가한 조류의 초기농도는 1x10⁵ 세포/㎖를 사용하였다.
도 8은 10%(v/v) DMSO, 20%(v/v) 글리세롤과 이들의 1:1 혼합액(DMSO+Glycerol)의 세 가지 조류에 대한 동결보존 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 20%(v/v) 글리세롤, 10%(w/v) 자당과 이들의 1:1 혼합액(Glycerol+Sucrose)의 세 가지 조류에 대한 동결보존 효과를 분석한 결과이다.
도 10은 10%(v/v) DMSO, 10%(w/v) 자당과 이들의 1:1 혼합액(DMSO+Sucrose)의 세 가지 조류에 대한 동결보존 효과를 분석한 결과이다.
도 11은 10%(v/v) DMSO, 20%(v/v) 글리세롤, 10%(w/v) 자당과 이들의 1:1:1 혼합액(DMSO+Glycerol+Sucrose)의 세 가지 조류에 대한 동결보존 효과를 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동결보존제로서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미세조류 동결 보존용 조성물을 제공한다.

세포의 장기간 보존을 위한 동결 및 재이용을 위한 해동 과정에서 세포는 온도 변화에 따른 손상을 입게된다. 동결이 진행되면 세포 외부의 수분이 먼저 동결 되고 그 결과 세포 외부의 환경은 세포 내부보다 고염의 상태를 형성하게 되는데, 평형상태를 유지하기 위해 세포 내부의 수분의 이동이 발생하고, 그 결과 원형질분리(plasmolysis)가 발생한다. 이를 방지하게 위해 동결보존제를 사용하게 되는데, 동결보존제는 세포보호형 속일성 동결보존제(colligative cryoprotectants)와 세포침투형 동결보존제 두가지로 구분된다. 세포보호형 속일성 동결보존제는 세포 밖의 얼음결정 형성을 억제하는 작용을 하고, 세포침투형 동결보존제는 세포막을 침투하여 세포 내 수분을 치환하고 냉동 시 얼음 결정이 형성되는 것을 억제하는 역할을 한다. 특히 미세조류 세포의 냉동보존에는 세포보호형 속일성 동결보존제는 그 특성상 이용되지 않고, 세포침투형 동결보존제, 구체적으로 예를 들면, DMSO, 글리세롤이 종래 이용되어 왔다. 하지만, 세포침투형 동결보존제의 경우에는 농도가 높은 경우 세포에 치명적인 단점이 있다. 이에 본 발명자들은 동결보존제로서 DMSO와 자당의 혼합물을 사용하는 경우, 세포 침투형 동결보존제에서의 유해한 효과 없이도 동결보존된 세포, 특히 미세조류 세포의 생존율을 높일 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에 있어서, 상기 DMSO는 동결 보존용 조성물의 5 내지 15 %(v/v)로, 자당은 동결 보존용 조성물의 5 내지 15 %(w/v)로 포함되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 DMSO는 동결 보존용 조성물의 8 내지 12 %(v/v)로, 자당은 동결 보존용 조성물의 8 내지 12 %(w/v)로 포함되는 것일 수 있고, 더 더욱 바람직하게는 DMSO는 동결 보존용 조성물의 10 %(v/v)로, 자당은 동결 보존용 조성물의 10 %(w/v)로 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 DMSO를 5%(v/v) 보다 낮은 농도로 포함되는 경우 또는 15%(v/v) 보다 높은 농도로 포함되는 경우에는 동결보존제로서의 효과를 유의하게 발휘할 수 없어 미세조류 생존율이 감소한다. 자당 또한 DMSO와 마찬가지로 상기 농도보다 낮은 농도 또는 높은 농도로 포함되는 경우 미세조류에 대한 동결보존 효과가 감소한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에 있어서, 상기 미세조류는 이에 한정되지는 않으나, 일반적인 담수 조류로, 녹조류(Chlorophyta), 크립토조류(Cryptophyta), 황금색조류(Chrysophyta), 유글레나조류(Euglenophyta), 규조류(Bacillariophyta), 갈조류(Phaeophyta), 홍조류(Rholophyta) 및 차축조류(Charophyta)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 녹조류일 수 있으며, 구체적으로는 클로렐라(Chlorella), 파라클로렐라(Parachlorella) 또는 세네데스무스(Scenedesmus) 등의 녹조류일 수 있다.

본 발명의 상기 미세조류 동결 보존용 조성물은 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물의 동결보존제를 포함하여 -70℃ 환경에서 미세조류의 동결보존 생존율을 각각의 동결보존제만 단독으로 포함하는 동결 보존용 조성물을 사용한 경우의 생존율보다 각각 1.5배 내지 3배 이상 생존율을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물에 미세조류를 첨가하여 동결시키는 단계를 포함하는 미세조류 동결 보존 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 -70℃의 환경으로 미세조류를 동결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 미세조류는 조성물 1㎖ 기준으로 0.5 내지 3x10⁵ 세포의 농도로 첨가되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 조성물 1mL 기준으로 1x10⁵ 세포의 농도로 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미세조류의 종류는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 미세조류 동정 및 배양

세 종의 조류를 낙동강 상류지역의 표층수로부터 분리하였다. 순수한 상태의 단일 조류종의 분리를 위하여 표층수 100㎕를 BG11 고체배지에 도말한 후 200μmol/m²/s의 광도에서 약 20일간 배양하였다. 배양온도는 25℃이며 배양기간은 21일이었다. 순수 분리된 담수조류는 종 동정을 위하여 18S rRNA와 ITS 유전자 염기서열을 분석하여 다른 조류종과 계통학적 유연관계를 분석하였고, 광학현미경으로 형태를 관찰하였다. 분석결과 세 종의 담수 조류는 각각 파라클로렐라 종(Parachlorella sp.), 세네데스무스 종(Scenedesmus sp.) 및 클로렐라 종(Chlorella sp.)으로 판명되었다(각각 도 1, 도 2, 도 3).

상기 세 종의 담수조류의 배양체를 확보하기 위하여 250㎖의 유리 삼각플라스크에서 농화하였다. 교반배양기를 사용하였으며 200rpm의 교반속도로 광조건 하에서 배양하였다. 광도, 온도 조건은 전술한 고체배지 배양조건과 동일하였다. 배양된 조류의 농도를 확인하기 위하여 혈구계수기(haematocytometer)에 순차적으로 희석된 시료를 넣고 도립현미경을 사용하여 계수하였다. 희석된 배수를 반영하여 배양액에 존재하는 조류의 농도를 결정하였다. 배양액의 조류 농도를 확인한 후 현탁하여 10⁵ 세포/㎖, 10⁶ 세포/㎖ 및 10⁷ 세포/㎖의 세 가지 농도의 조류 시료를 준비하였고 이를 추후 분석에 사용하였다.

2. 동결보존 조건 최적화 실험

본 발명에서는 가장 빈번하게 사용되는 동결보존제 3종(DMSO(dimethyl sulfoxide), 글리세롤(glycerol) 및 자당(sucrose))의 동결보존 효과를 분석하였다.

동결보존 실험은 3종의 조류가 각기 배양된 BG11 액체배지에 각각의 동결보존제 또는 상기 동결보존제를 혼합하여 첨가한 후, 자동동결기(controlled rate freezer)를 이용하여 -70℃까지 초저온동결을 수행하였다. 냉각조건은 다음과 같다: 4℃까지 2℃/분의 감소율로 냉각한 후 15분간 유지; 그 후 -5℃까지 1℃/분의 감소율로 냉각; 그 후 -12℃까지 3℃/분의 감소율로 냉각; 그 후 -14℃까지 5℃/분의 감소율로 냉각; 그 후 -20℃까지 7.5℃/분의 감소율로 냉각; 그 후 -25℃까지 6.5℃/분의 감소율로 냉각한 후 2분간 유지; 그 후 -20℃까지 3℃/분의 증가율로 가열한 후 2분간 유지; 마지막으로 -70℃까지 1℃/분의 감소율로 냉각.

상기와 같은 조건으로 냉각시킨 후, 충분한 동결시간을 주기위하여 동결보존용 튜브(cryogenic vial tube)에 각각의 시료를 분주하여, -70℃ 초저온냉동고(deep freezer)에 1달간 보관하였다. 이후 동결보존된 세포의 재생률을 분석하기 위하여, 동결보존용 튜브를 꺼내 37℃ 수조에서 5분 동안 급속 해동시켰다. 이후 해동된 세포를 BG11 액체배지에 100배, 1,000배, 10,000배의 순으로 희석하여 BG11 고체배지에 100㎕씩 도말하였다. 동결보존하지 않은 세포 역시 BG11 액체배지에 상기와 동일한 비율로 희석하여 준비하고 BG11 고체배지에 동일 양 도말하여 준비한 후, 동일한 광배양조건(광도: 200μmol/m²/s, 온도: 25℃)에서 배양하며 자라난 콜로니의 수를 측정하였다. 동결보존/해동 조건의 세포를 배양한 배지에서 측정된 콜로니 수를, 동결보존하지 않은 세포를 배양한 조건에서 자라난 콜로니 수와 비교하여 재생률을 분석하였다.

실시예 1. 동결보존제의 최적화 농도 분석

본 발명에서는 먼저 아무런 동결보존제를 사용하지 않은 BG11 액체배지 상태에서 3종의 담수조류를 10⁵ 세포/㎖, 10⁶ 세포/㎖ 및 10⁷ 세포/㎖의 세 가지 농도조건으로 초저온동결을 수행하고 재생시켜 세포 재생률을 확인하였다. 그 결과, 3종의 담수조류 모두 초기농도가 10⁵ 세포/㎖ 농도일 때 가장 재생률이 높게 관측되었다. 따라서 특별한 동결보존제 조성물의 부가적인 추가가 없는 경우, 담수조류의 최적 초기농도는 10만 세포/㎖로 확인되었다(도 4).

이후 DMSO, 글리세롤 및 자당의 동결보존제를 각각 5%, 10%, 15% 및 20%의 농도로 BG11 액체배지에 구배하고, 10⁵세포/㎖의 농도로 조류 3종을 각기 분주하였다. 각각의 조건에서 재생률을 확인한 결과, 동결보존제의 최적 농도는 DMSO가 10%(v/v), 글리세롤이 20%(v/v), 자당은 10%(w/v)였다(도 5, 도 6, 도 7). 클로렐라, 파라클로렐라, 세네데스무스의 조류 3종의 생존율은 종마다 약간의 차이가 있었는데, 10% DMSO 조건에서는 약 20%~30%로, 20% 글리세롤에서는 약 15~20%로, 자당을 첨가한 경우는 약 10%로 관측되었다. 아무런 동결보존제를 첨가하지 않은 경우 동결보존 후 조류의 재생률은 10% 미만으로 확인되었다. 따라서 단일 동결보존제 성분으로 가장 효과가 좋은 첨가물은 DMSO, 글리세롤, 자당의 순서였다. 단일 성분으로 자당이 동결보존제로 사용된 경우 조류 3종의 동결보존 효과는 대조군인 동결보존제를 첨가하지 않은 순수한 배지만의 경우와 통계적으로 유의미한 차이가 없었다.

실시예 2. 혼합 동결보존제의 동결보존 효과 분석

3종의 동결보존제를 동일 함량으로 서로 혼합하여 새로 조성된 혼합 동결보존제의 효과를 확인하였다. 혼합 동결보존제는 DMSO+글리세롤, 글리세롤+자당, DMSO+자당, DMSO+글리세롤+자당의 조합으로 제조하였다. 제조 방법은 일례로, DMSO+글리세롤의 혼합 동결보존제의 경우 각 동결보존제의 최적 농도인 DMSO 10%와 글리세롤 20%가 각기 첨가된 BG11 배지를 동결보존용 튜브(cryogenic vial tube)에 각각 1mL씩(동량씩) 분주하여 제작하였다.

먼저, DMSO와 글리세롤을 혼합한 동결보존제가 첨가된 경우에는, DMSO와 글리세롤을 각각 사용한 경우와 비교하여 조류의 재생률에 개선된 효과가 나타나지 않았다(도 8). 글리세롤과 자당을 혼합한 동결보존제를 사용하여 초저온동결보존 한 경우 또한, 글리세롤과 자당을 각각 사용한 경우와 비교하여 개선된 효과가 나타나지 않았다(도 9). 그러나 DMSO와 자당을 혼합한 동결보존제를 이용한 경우, DMSO와 자당을 단일 성분으로 사용한 경우에 비해 조류의 재생률에 유의미한 개선효과가 나타났다(도 10). DMSO+자당의 혼합 동결보존제를 사용한 경우 재생률이 약 50%로 개선되었다. 마지막으로, 3가지 동결보존제 모두를 혼합한 DMSO+글리세롤+자당 혼합 동결보존제를 이용한 경우에는 DMSO를 단독으로 사용한 경우의 조류 재생률보다 낮은 세포 재생률이 확인되어 동결보존 효과가 좋지 않은 것으로 나타났다(도 11).

상기의 결과들을 토대로, 미세조류 동결보존 조성물 내 DMSO와 자당의 혼합 동결보존제가 미세조류의 동결보존에 우수한 효과가 있음을 알 수 있었으며, 각 동결보존제는 동결보존 조성물 기준 DMSO는 10%(v/v), 자당은 10%(w/v)의 농도로 사용될 때, 미세조류의 안정적인 보존에 적합함을 확인하였고, 상기의 혼합 동결보존제는 실제로 조류 자원을 관리하는 균주은행 또는 관련 산학연에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.

Claims

동결보존제로서 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 자당 혼합물을 유효성분으로 포함하는 미세조류 동결 보존용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 DMSO는 동결 보존용 조성물의 5 내지 15 %(v/v)로, 자당은 동결 보존용 조성물의 5 내지 15 %(w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는 미세조류 동결 보존용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미세조류는 녹조류인 것을 특징으로 하는 미세조류 동결 보존용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물에 미세조류를 첨가하여 동결시키는 단계를 포함하는 미세조류 동결 보존 방법.