CN113015791A

CN113015791A - 淡水微藻的培养方法

Info

Publication number: CN113015791A
Application number: CN201980064319.1A
Authority: CN
Inventors: 宫城岛进也; 广冈俊亮
Original assignee: National Research And Development Corp Science And Technology Promotion Agency
Current assignee: National Research And Development Corp Science And Technology Promotion Agency; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-06-22
Also published as: AU2019355498A1; AU2019355498B2; WO2020071444A1; JPWO2020071444A1; JP7455386B2

Abstract

本发明涉及一种淡水微藻的培养方法，其包括培养工序，所述培养工序在培养温度15℃～60℃下在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1M～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻。

Description

淡水微藻的培养方法

技术领域

本发明涉及一种淡水微藻的培养方法。另外，本发明还涉及一种被赋予耐盐性的淡水微藻的生产方法以及通过该生产方法得到的耐盐性的淡水微藻。更具体而言，本发明涉及适合在室外大量培养尤其适合在海水中的室外大量培养的淡水微藻及其生产方法。

本申请基于2018年10月2日向日本申请的特愿2018-187763号而要求优先权，在此将它们的内容援引到本申请中。

背景技术

对于微藻(微藻类)而言，由于其与陆生植物相比较具有更高的二氧化碳固定能力以及不与农产品竞争生长场所的特点，因此一些品种得到了大量培养并在工业上利用为饲料、功能性食品、化妆品材料等。

对于微藻在工业上的利用，由于成本方面等原因，限于高价的功能性食品等利用方式。为了抑制微藻的生产成本并促进工业利用，优选在室外的大量培养。室外大量培养虽然具有管理简易等特征，但是存在污染的风险，另外除了直接受到外部环境的影响以外，藻类捕食者等的入侵也成为问题。为了避免这样的风险，作为进行室外大量培养的微藻，要求对环境变化(光、温度等)具有抗性、能够在其它生物无法生存的条件下培养以及能够增殖到高密度等条件。

因此，迄今为止在工业上实用化的微藻仅限于小球藻(Chlorella)、裸藻(Euglena)、杜氏藻(Dunaliella)、螺旋藻(Spirulina)等几种。这些藻类的种类已在室外大量培养成功并且被利用为功能性食品、营养辅助食品的原料。

作为其它生物无法生存的环境，例如可以举出海水这样的高盐浓度环境。关于用高盐浓度培养基培养有用的微藻，例如有专利文献1～3的报告。

在专利文献1中记载了特征为利用阶段性地增加盐浓度的培养基培养耐盐性藻类的生产油脂成分的方法。在专利文献1中记载的方法中，其特征在于，当在220nm的波长下测定了培养基中的硝酸盐含量的情况下，当该含量达到10mg/L以下时，增加第二阶段的盐浓度。

在专利文献2中公开有如下内容：在淡水中生长且具有产生碳氢化合物类能力的藻类微细绿藻·小球藻(Pseudochoricystis ellipsoidea)的培养中，为了提高其碳氢化合物产生能力的生产率，在从开始培养起直至培养基的光学浓度达到表示饱和状态的光学浓度的二分之一的光学浓度为止的期间，向培养基投入盐。

在专利文献3中公开有如下内容：在生产二十二碳六烯酸的隐甲藻(Crypthecodinium)属的培养中，为了在藻体内积蓄二十二碳六烯酸，把培养液的食盐浓度设定为比适合所述藻类生长的食盐浓度高0.1～10重量％的值来进行培养的方法。

对于专利文献1至3中记载的方法的目的而言，在于对微藻施加盐胁迫从而提高碳氢化合物产生能力以及二十二碳六烯酸产生能力，并不在于抑制室外培养的污染风险。

另一方面，作为单细胞原始红藻的属于温泉红藻纲(Cyanidiophyceae)的微藻在硫酸酸性温泉中优先增殖。在温泉红藻纲中有Cyanidioschyzon属、Cyanidium属以及Galdieria属。属于Cyanidioschyzon属的Cyanidioschyzon merolae不具有坚固的细胞壁。Cyanidioschyzon merolae由极其单纯的细胞器组件来构成，基因组序列的解读已经完成。因此，在作为光合成生物的基础研究所用的模式生物(model organism)方面得到应用，并且基因修饰技术的开发也正在推进中(非专利文献1、2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/25552号

专利文献2：日本特开2013-102748号公报

专利文献3：日本特开平07-075557号公报

非专利文献

非专利文献1：Fujiwara T et al.(2013)Gene targeting in the red algaCyanidioschyzon merolae：single-and multi-copy insertion using authentic andchimeric selection markers.PLOS ONE.Sep 5；8(9)：e73608.

非专利文献2：Fujiwara T et al.(2015)A nitrogen source-dependentinducible and repressible gene expression system in the red algaCyanidioschyzon merolae.Front Plant Sci.Aug 26；6：657.

发明内容

发明要解决的问题

属于温泉红藻纲的淡水嗜酸性微藻在其它生物无法生长这样的酸性环境下也能够生长，适合室外培养。若对这些微藻赋予高盐浓度抗性，则在酸性且高盐浓度的环境下也能够培养，并能够进一步降低室外培养时的污染风险。另外，若能够将海水用于培养，则能够抑制培养成本。

于是，本发明的目的在于提供一种在低pH且高钠离子浓度环境下也能够使淡水微藻良好地增殖的淡水微藻的培养方法、一种在低pH且高钠离子浓度环境下能够良好地增殖的淡水微藻以及该淡水微藻的生产方法。

用于解决问题的手段

本发明包括以下各项技术方案。

项1.一种淡水微藻的培养方法，其包括在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中在培养温度15～60℃下培养淡水微藻的培养工序。

项2.根据项1所述的淡水微藻的培养方法，所述淡水微藻的培养方法包括：前培养工序，在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻；以及主培养工序，在以使钠离子浓度为所述前培养工序的所述钠离子浓度的1.2～5倍且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养所述前培养工序后的淡水微藻。

项3.根据项1或项2所述的淡水微藻的培养方法，所述主培养工序的所述培养基是以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.5M以上的方式制备的培养基。

项4.根据项1或项2所述的淡水微藻的培养方法，所述主培养工序的所述培养基是以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.4M以上的方式制备的培养基。

项5.根据项1至项4中任一项所述的淡水微藻的培养方法，所述主培养工序的所述培养基是以向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基。

项6.根据项1至项5中任一项所述的淡水微藻的培养方法，所述淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻。

项7.一种淡水微藻的生产方法，所述淡水微藻在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度为0.5M以上的方式制备的培养基中能够增殖，所述淡水微藻的生产方法包括：在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中培养在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中无法增殖的淡水微藻的工序。

项8.根据项7所述的淡水微藻的生产方法，所述淡水微藻是属于Cyanidium属的微藻的单倍体。

项9.根据项7所述的淡水微藻的生产方法，所述淡水微藻是属于Galdieria属的微藻的单倍体。

项10.一种属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值为2以上，在以使氢离子浓度成为pH2.0的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的的值小于2。

(培养开始7天后的OD₇₅₀值-培养开始时的OD₇₅₀值)/(7×培养开始时OD₇₅₀值)(1)

项11.根据项10所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在氢离子浓度pH7的等渗溶液或蒸馏水中细胞破裂。

项12.根据项10或项11所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，进行藻类细胞的干燥处理，当使所述干燥处理后的细胞悬浮在pH7的等渗溶液中时，所述细胞破裂。

项13.一种属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的培养方法，其包括在以向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养所述项10至项12中任一项所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体。

项14.一种属于温泉红藻纲的微藻单倍体的培养方法，其包括在室外培养所述项10至项12中任一项所述的属于温泉红藻纲的微藻。

项15.一种淡水微藻的培养方法，作为所述淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值为2以上，在以使氢离子浓度成为pH2.0的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值小于2，所述淡水微藻的培养方法包括：在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.4M以上的方式制备的培养基中培养所述属于温泉红藻纲的微藻的单倍体。

项16.一种淡水微藻的生产方法，作为淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值为2以上，在以使氢离子浓度成为pH2.0的方式制备的M-Allen培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值小于2，所述淡水微藻的生产方法包括：在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.4M以上的方式制备的培养基中培养所述属于温泉红藻纲的微藻的单倍体。

发明效果

基于本发明，能够提供在低pH且高钠离子浓度环境下能够使淡水微藻良好地增殖的淡水微藻的培养方法、在低pH且高钠离子浓度环境下能够良好地增殖的淡水微藻、以及该淡水微藻的生产方法。

附图说明

图1是示出用M-Allen培养基(MA培养基)对Cyanidium sp.HKN1(单倍体)进行前培养后用MA培养基、向MA培养基中添加0.3M的NaCl得到的培养基(MA+0.3M NaCl培养基)、或向MA培养基添加0.5M的NaCl得到的培养基(MA+0.5M NaCl培养基)进行主培养时的增殖曲线；以及用MA+0.3M NaCl培养基进行前培养后用MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线(OD₇₅₀的经时变化)的图。

图2是示出用MA+0.3M NaCl培养基对Cyanidium sp.HKN1(单倍体)进行前培养后用海水培养基或MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线的图。

图3是示出用MA+0.3M NaCl培养基对Cyanidium sp.HKN1(单倍体)进行前培养后用pH2～7的海水培养基进行了7天的主培养后的OD₇₅₀的图。

图4是用MA培养基对Cyanidium sp.HKN1(二倍体)进行前培养后用MA培养基、MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线；以及用MA+0.3M NaCl培养基进行前培养后用MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线的图。

图5是示出用MA+0.3M NaCl培养基对Cyanidium sp.HKN1(二倍体)进行前培养后用海水培养基或MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线的图。

图6是示出用MA培养基对Cyanidioschyzon merolae 10D进行前培养后用MA培养基、MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线；以及用MA+0.3MNaCl培养基进行前培养后用MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线的图。

图7是示出用MA+0.3M NaCl培养基对Cyanidioschyzon merolae10D进行前培养后用海水培养基或MA+0.5M NaCl培养基进行主培养时的增殖曲线的图。

图8是观察用MA培养基、MA培养基+0.5M NaCl培养基以及海水培养基对Cyanidiumsp.HKN1(单倍体)进行培养得到的培养品的聚磷酸以及液泡的荧光显微镜照片。

图9是观察用MA培养基、MA培养基+0.5M NaCl培养基以及海水培养基对Cyanidiumsp.HKN1(二倍体)进行培养得到的培养品的聚磷酸以及液泡的荧光显微镜照片。

图10是示出用10L的海水培养基对Cyanidium sp.HKN1(单倍体)进行培养时的增殖曲线的图。

图11示出了基于叶绿体核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基(rbcL)基因的属于温泉红藻纲的微藻的分子系统树。在各分支的附近示出了基于最大似然法的局域自举值(local bootstrap)(仅记载50以上，左侧)以及基于贝叶斯方法的后验概率(仅记载了0.95以上，右侧)。

具体实施方式

在本说明书中，“MA培养基”的意思是M-Allen培养基。具体而言，“MA培养基”的意思是指具有表1记载的组成的培养基且以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式使用硫酸调节后的培养基。在只记载为“MA培养基”或“M-Allen培养基”的情况下，意思是指未添加NaCl的培养基。“以使氢离子浓度成为pH2.0的方式制备的M-Allen培养基”的意思是指以成为pH2.0的方式进行了调节的未添加NaCl的MA培养基。

在本说明书中，“MA地+0.3M NaCl培养基”的意思是指以使NaCl浓度成为0.3M的方式进行了调节的MA培养基。具体而言，意思是指具有表4记载的组成的培养基且以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式使用硫酸进行了调节的培养基。“以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.3M的方式制备的M-Allen培养基”的意思是指以成为pH2.0的方式进行了调节的MA+0.3M NaCl培养基。

在本说明书中，“MA+0.5M NaCl培养基”的意思是指以使NaCl浓度成为0.5M的方式进行了调节的MA培养基。具体而言，意思是指具有表5记载的组成的培养基且以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式使用硫酸进行了调节的培养基。“以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的M-Allen培养基”的意思是指以成为pH2.0的方式进行了调节的MA+0.5M NaCl培养基。

在MA培养基、MA+0.3M NaCl培养基以及MA+0.5M NaCl培养基中，除非另有说明，氢离子浓度(pH)可以是pH1.0～6.0的范围的任意的值。

在本说明书中，关于培养基中的成分浓度所使用的“M”表示“mol/L”。

＜淡水微藻的培养方法＞

在一个实施方式中，本发明提供淡水微藻的培养方法。本实施方式的培养方法包括：在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中在培养温度15～60℃下培养淡水微藻的培养工序。优选为，所述培养方法包括：前培养工序，在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻；以及主培养工序，在以使钠离子浓度为所述前培养工序的所述钠离子浓度的1.2～5倍且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养所述前培养工序后的淡水微藻。

在一个实施方式中，其特征在于，本实施方式的培养方法在用高盐浓度的酸性培养基进行主培养前，用0.1～0.4M的钠离子浓度的酸性培养基进行前培养。通过进行所述的前培养，即使是不具有耐盐性的淡水微藻，也变成能够在与海水相同程度的高盐浓度培养基中良好地增殖。

在本说明书中，前培养工序的培养基的钠离子浓度以及氢离子浓度(pH)的意思分别指前培养工序的培养开始时的钠离子浓度以及pH。前培养工序的培养开始时的培养基只要钠离子浓度为0.1～0.4M且pH为1.0～6.0，则在前培养期间中钠离子浓度或pH发生变动而脱离了所述范围的情况也包含在本实施方式的培养方法的前培养工序中。

主培养工序的培养基的钠离子浓度以及pH的意思分别指主培养工序的培养开始时的钠离子浓度以及pH。主培养工序的培养开始时的培养基只要是“钠离子浓度为前培养工序的钠离子浓度的1.2～5倍”且“pH为1.0～6.0”，则即使在主培养期间中钠离子浓度或pH发生变动而脱离了所述范围的情况也包含在本实施方式的培养方法的主培养工序中。

(淡水微藻)

本实施方式的培养方法能够应用于在pH1.0～6.0的酸性条件下可增殖的淡水微藻。“淡水微藻”的意思是指在淡水环境中生长的微藻(微藻类)。淡水的钠离子浓度通常小于0.05质量％。淡水环境没有特别的限定，可以举出河川、湖沼、温泉、地下水等，优选为pH1.0～6.0的酸性条件的淡水环境。作为这样的酸性条件的淡水环境，优选例示为酸性温泉(硫酸酸性温泉等)。在本说明书中，“微藻”的意思是指单细胞的藻类。

作为在pH1.0～6.0的酸性条件下可增殖的淡水微藻，例如可以举出属于温泉红藻纲(Cyanidiophyceae)的微藻。温泉红藻纲在分类学上分类为红藻门(Rhodophyta)、温泉红藻纲(Cyanidiophyceae)。在温泉红藻纲中在当前分类有Cyanidioschyzon属、Cyanidium属以及Galdieria属的三个属。作为属于温泉红藻纲的微藻，迄今为止已知有很多种类的微藻，在此虽然不列举，但是在图11中示出了使用了属于温泉红藻纲的微藻的叶绿体rbcL基因的核苷酸序列的系统树。

本实施方式的培养方法优选为应用于在淡水微藻中不具有耐盐性的淡水微藻。在此“不具有耐盐性”的意思是指当在海水或与海水同等的钠离子浓度(约0.5M)的培养基中进行了培养的情况下，与在淡水微藻用培养基(钠离子浓度0.05M以下)中进行了培养的情况进行比较，增殖受到抑制(包括无法增殖)。与淡水微藻用培养基的增殖速度相比较，所述增殖的抑制优选为增殖速度降低了60％以上，更优选为降低了80％以上。作为在pH1.0～6.0的酸性条件下可增殖且不具有耐盐性的淡水微藻，可以举出图11所示的属于温泉红藻纲的微藻。例如，可以举出属于Cyanidium属的微藻的单倍体、属于Cyanidioschyzonmerolae、Galdieria属的微藻的单倍体等。

属于温泉红藻纲的微藻存在有能够取单倍体的细胞形态或二倍体的细胞形态的微藻。本发明人提供了从取二倍体的细胞形态的细胞群得到取单倍体的细胞形态的细胞群的方法、反之从取单倍体的细胞形态的细胞群得到取二倍体的细胞形态的细胞群的方法(国际公开第WO2019/107385号)。

如在后述的实施例中所示地，属于Cyanidium属的微藻的二倍体具有耐盐性，但是单倍体不具有耐盐性。作为具有单倍体以及二倍体的细胞形态的属于Cyanidium属的微藻的具体例子，例如可以举出Cyanidium sp.YFU3株(FERM P-22334)(以下称为“YFU3株”)、以及Cyanidium sp.HKN1株(FERM P-22333)(以下称为“HKN1株”)等以及它们的近缘种、变异株及后代。

以下，对于YFU3株，在将二倍体的细胞形态与单倍体的细胞形态区别记载的情况下，将二倍体的细胞形态记载为“YFU3株(二倍体)”，将单倍体的细胞形态记载为“YFU3株(单倍体)”。同样地，对于HKN1株，在将二倍体的细胞形态与单倍体的细胞形态区别记载的情况下，将二倍体的细胞形态记载为“HKN1株(二倍体)”，将单倍体的细胞形态记载为“HKN1株(单倍体)”。在仅记载为“YFU3株”或“HKN1株”的情况下，包含二倍体的细胞形态以及单倍体的细胞形态双方。

藻类是二倍体还是单倍体的判断可以通过确认相同基因座的拷贝数来进行。即，若相同基因座的拷贝数为1，则判断为单倍体。另外，也可以利用下一代序列分析仪等判断藻类是单倍体。例如，利用下一代序列分析仪等取得全部基因的序列读段，将这些序列读段组装后，针对组装得到的序列，对序列读段进行作图定位(mapping)。在二倍体中，在基因组上的各个区域中能够找到各等位基因的碱基的不同，但是在单倍体中，由于只存在一个等位基因，所以无法找到这样的区域。

或者，也可以用DAPI等核染色试剂对细胞进行染色，与已知是单倍体的细胞进行比较，将表示了同等的荧光亮度的细胞判断为单倍体，将表示约2倍的荧光亮度的细胞判断为二倍体。或者，也可以用DAPI等核染色试剂对细胞进行染色，与已知是二倍体的细胞进行比较，将表示同等的荧光亮度的细胞判断为二倍体，将表示约1/2倍的荧光亮度的细胞判断为单倍体。

YFU3株(单倍体)是从日本大分县由布市的温泉的高温酸性水分离出的单细胞红藻。YFU3株在2017年5月30日作为保藏号FERM P-22334保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心(特许微生物保藏中心)(日本千叶县木更津市上总镰足2-5-8)，作为保藏号FERM BP-22334在2018年4月20日移交为国际保藏。

HKN1株是从日本神奈川县足柄下郡箱根町的温泉的高温酸性水分离出的单细胞红藻。HKN1株(单倍体)在2017年5月30日作为保藏号FERM P-22333保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心，作为保藏号FERM BP-22333在2018年4月20日移交为国际保藏。

另外，应用本实施方式的培养方法的淡水微藻可以从酸性温泉等淡水环境分离，也可以从菌种保藏等取得。例如，Cyanidioschyzon merolae可以从国立研究开发法人国立环境研究所微生物系统保存设施(日本茨城县筑波市小野川16-2)、American TypeCulture Collection(ATCC：美国菌种保藏中心；10801University Boulevard Manassas,VA 20110，美国)等得到。

另外，应用本实施方式的培养方法的淡水微藻不限于从自然界分离得到的，也可以是天然的淡水微藻产生变异得到的。变异可以是以自然发生的方式产生的，也可以是以人为的方式产生的。例如，Cyanidioschyzon merolae由于基因组尺寸小(约16Mbp)，并且完成了基因组序列的解读(Matsuzaki M et al.,Nature.2004Apr 8；428(6983)：653-7.)，所以容易进行基因修饰。因此，例如，也可以将本实施方式的培养方法应用于通过基因修饰制备的Cyanidioschyzon merolae的转化体(例如营养成分得到了强化的转化体)。另外，只要能够进行基因修饰，则也可以将本实施方式的培养方法应用于其它淡水微藻的转化体。

另外，在属于Galdieria属的微藻中，也存在能够取单倍体的细胞形态以及二倍体的细胞形态的微藻。例如，通过将属于Galdieria属的微藻的二倍体培养一定期间(例如1～3周程度)，能够得到单倍体的细胞形态。作为用于得到单倍体的细胞的、培养二倍体的细胞的培养基，例如可以适当地利用酸性温泉排水培养基、塚原矿泉培养基(Hirooka etal.2016Front in Microbiology)等。也可以将本实施方式的培养方法应用于属于Galdieria属的微藻的单倍体或其转化体。作为属于Galdieria属的微藻，例如可以举出G.partita(NBRC 102759)以及G.sulphuraria(SAG108.79等)等。属于Galdieria属的微藻可以从酸性温泉等淡水环境分离，也可以从菌种保藏等取得。作为菌种保藏，除了在所述Cyanidioschyzon merolae中举出的菌种保藏以外，还可以举出NITE BiologicalResource Center(NRBC：日本东京都涩谷区西原2-49-10)，GEORG-AUGUST-UNIVERSITYGOTTINGEN ulture Collection of Algae(SAG)等。

即使在属于温泉红藻纲的微藻中，单倍体的藻类细胞大多不具有坚固的细胞壁。这样的不具有坚固的细胞壁的单倍体的细胞形态的藻类细胞通过中和处理、低渗处理、冻融处理等比较温和的处理，能够破坏细胞。另外，在本说明书中，“不具有坚固的细胞壁”的意思是指通过下述(A)～(C)的细胞破裂处理中的任一项处理产生细胞破裂。

(A)将藻类细胞悬浮在pH7的等渗溶液中，放置1周以上。

(B)将藻类细胞悬浮于蒸馏水中，放置1分钟以上。

(C)进行藻类细胞的干燥处理，悬浮在pH7的等渗溶液中。

在上述(A)～(C)中，在藻类细胞是培养细胞的情况下，可以在进行各处理之前，通过离心分离等去除培养基，用等渗溶液等清洗藻类细胞。

在上述(A)以及(C)中，作为等渗溶液，可以举出包含10％蔗糖以及20mM的HEPES的pH7的缓冲液。

在上述(C)中，作为干燥处理，可以举出冰箱内(4℃)的干燥、冻结干燥等。在干燥处理中，使用通过离心分离回收的藻类细胞的沉淀。当在冰箱内进行干燥的情况下，干燥处理时间基于藻类细胞的量，可以例示3天以上。

另外，将上述(A)～(C)的细胞破裂处理后的藻类细胞悬浮液离心分离(1500×g，3分钟)，求出离心上清中的蛋白质质量与藻类细胞悬浮液中的总蛋白质质量的比率，由此能够判断是否产生了细胞破裂。具体而言，在通过下列算式求出的破裂率为20％以上的情况下，可以判断为产生了细胞破裂。

或者，也可以用光学显微镜(例如倍率600倍)观察藻类细胞悬浮液中的藻类细胞，在产生了细胞破裂的细胞的比率为藻类细胞整体的10％程度以上优选为20％程度以上的情况下，判断为产生了细胞破裂。

在上述(A)～(C)的细胞破裂处理中，由于可以使用pH7的等渗溶液，所以可以说在上述(A)～(C)中任一项的细胞破裂处理中产生了细胞破裂的细胞是在pH7的条件下产生细胞破裂的细胞。

在pH7的条件下，若是其细胞破裂的微藻，则在向培养槽外流出了的情况下，在外部环境中难以生长，能够抑制对环境的污染。

在藻类细胞不具有坚固的细胞壁情况下，在利用光学显微镜的观察(例如倍率600倍)中，通常观察不到细胞壁。另外，通过在pH6以下的条件下的温和的低渗处理是否产生细胞破裂不影响是否是不具有坚固的细胞壁微藻的判断。

[前培养工序]

前培养工序是在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻的工序。

只要是钠离子浓度为0.1～0.4M且pH为1.0～6.0的培养基，则在前培养工序中使用的培养基就没有特别的限定。例如可以优选使用向通常的淡水微藻用培养基中添加0.1～0.4M的钠离子并调节为pH 1.0～6.0而得到的培养基。

淡水微藻用培养基没有特别的限定，可以根据培养的淡水微藻的种类选择适当的培养基。作为淡水微藻用培养基，可以例示例如包含氮源、磷源、铁源、微量元素(锌、硼、钴、铜、锰、钼等)等的无机盐培养基。例如，作为氮源，可以举出铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素、氨类等，作为磷源，可以举出磷酸盐、亚磷酸盐等，作为铁源，可以举出氯化铁、硫酸铁、柠檬酸铁等。作为淡水微藻用培养基的具体例子，例如可以举出2×Allen培养基(AllenMB.Arch.Microbiol.1959 32：270-277.)，M-Allen培养基(Minoda A et al.Plant CellPhysiol.2004 45：667-71.)，MA2培养基(Ohnuma M et al.Plant Cell Physiol.2008Jan；49(1)：117-20.)等。另外，在本说明书中有时将M-Allen培养基记载为“MA培养基”。

钠离子浓度只要在0.1～0.4M的范围内根据后述的主培养工序的钠离子浓度适当选择即可。更具体而言，可以选择在主培养工序中预定的钠离子浓度的0.2～0.8倍的钠离子浓度。钠离子浓度优选为主培养工序的钠离子浓度的0.5倍以上，更优选为0.5～0.7倍，进一步优选为0.5～0.6倍。

例如，在使主培养工序的钠离子浓度为与海水同程度(约0.5M)的情况下，前培养工序的钠离子浓度优选为0.25M以上，更优选为0.25～0.35M，进一步优选为0.25～0.3M。

培养基的钠离子浓度的调节可以使用市售的钠离子试剂，也可以使用食盐。另外，也可以以使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式将天然海水、浓缩海水、人工海水等稀释并适当地添加氮源、磷源、铁源以及微量元素等使用。作为天然海水，除了可以使用将表层水或海洋深层水过滤得到的海水以外，也可以使用市售品。作为天然海水的市售品，例如可以举出NAJIIMU 10(ナジーム10：伊豆10m的表层海水)以及NAJIIMU 800(ナジーム800：伊豆赤泽800m海洋深层水)(都是日本QCE bluelab事业部)等。作为人工海水的市售品，例如可以举出Daigo’s IMK培养基、Daigo’s人工海水SP(都是日本制药株式会社)等。

作为天然海水尤其是海水表层中包含的主要的离子的浓度，例如已知有下述的组成。该组成被认为是海洋表层的通常的组成，另外，在地域中盐分浓度不同是众所周知的。因此，定义海水的盐分浓度是困难的，但是在金属离子中钠是主要的金属是毫无疑问的。于是，发明人大体将作为钠离子浓度超过了0.4M的情况设为海水条件。作为更接近海水条件的钠离子浓度优选为0.45M以上，进一步优选为0.5M以上。

钠离子1.0556质量％

镁离子0.1272质量％

钙离子0.0400质量％

钾离子0.0380质量％

锶离子0.0008质量％

氯化物离子1.8980质量％

硫酸离子0.2649质量％

溴化物离子0.0065质量％

碳酸氢离子0.0140质量％

氟化物离子0.0001质量％

硼酸0.0026质量％

氢离子浓度只要在pH1.0～6.0的范围内根据淡水微藻的种类适当选择即可。例如，在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，优选为pH1.0～5.0，更优选为pH1.0～3.0。

例如可以使用硫酸、盐酸等无机酸、氢氧化钾等无机碱等进行培养基的pH调节。另外，为了抑制培养中的pH变动，可以向培养基中任意地添加pH缓冲剂。

前培养工序可以通过将淡水微藻的细胞接种到培养基中来开始。培养开始时的藻类浓度没有特别的限定，例如可以为OD₇₅₀＝0.05～0.5的细胞浊度。“OD₇₅₀”的意思是指750nm下的吸光度。培养开始时的细胞浊度优选为OD₇₅₀＝0.05～0.3。

前培养工序的温度条件只要根据淡水微藻的种类适当选择即可。通常，培养温度可以例示为15～60℃，优选为15～50℃，进一步优选为30～50℃。在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，培养温度优选为30～50℃。

前培养工序的光条件只要根据淡水微藻的种类适当选择即可。通常，可以例示为5～2000μmol/m²s。在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，优选为5～1500μmol/m²s。光条件可以是连续光，也可以设置明暗周期(10L：14D等)。前培养工序也可以在自然光下进行。

前培养工序的CO₂条件只要根据淡水微藻的种类适当选择即可。通常，可以例示为0.04～5％CO₂条件。在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，优选为0.04～3％CO₂条件。即使在属于温泉红藻纲的微藻中，Galdieria属的高CO₂浓度抗性高，即使在100％CO₂下也能够生长，因此在淡水微藻是属于Galdieria属的微藻的情况下，可以设为100％CO₂条件。另外，CO₂条件也可以是大气中的CO₂浓度。

前培养工序的培养方法没有特别的限定，只要采用作为微藻的培养方法通常使用的方法即可。作为具体例子，可以举出静置培养、通气培养(200～400mL air/min等)、振动培养(100～200rpm等)等。

前培养工序的培养期间没有特别的限定，从结束诱导期的期间到达到对数期的期间是必要的，通常需要3天以上，优选为5天以上，更优选为7天以上。通过使前培养工序进行所述下限天数以上的期间，能够更良好地保持主培养工序的淡水微藻的增殖。前培养期间的上限没有特别的限定，若从结束对数期直到达到稳定期进行培养，则在主培养中良好地保持微藻的增殖方面是不适当的。作为前培养期间，优选为3～20天，更优选为5～15天，进一步优选为7～10天。

前培养的规模可以根据主培养的规模进行选择。当在主培养中以微藻的育种、变异株的选择等小规模进行培养的情况下，可以以小规模进行前培养，通常以0.1～1000mL进行。另外，当在主培养中进行工业上大量生产的情况下，也存在有以1～10L程度进行前培养的情况。

[主培养工序]

主培养工序是如下的工序：在以使钠离子浓度为前培养工序的钠离子浓度的1.2～5倍且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养所述前培养工序后的淡水微藻。

在主培养工序中使用的培养基可以使用钠离子浓度是在所述前培养工序中使用的培养基的1.2～5倍且按钠离子浓度换算为0.4M以上、优选为0.45M以上、更优选为0.5M以上的培养基。只要是pH1.0～6.0的培养基则氢离子浓度没有特别的限定。例如，可以优选使用向通常的淡水微藻用培养基中添加所述浓度的钠离子并调节为pH 1.0～6.0而得到的培养基。作为淡水微藻用培养基，可以举出与在所述“[前培养工序]”中举出的培养基相同的培养基。

在主培养工序中使用的培养基可以是向海水中适当地添加氮源、磷源、铁源以及微量元素等并将pH调节为1.0～6.0而得到的培养基。海水可以是天然海水，也可以是人工海水，还可以是将浓缩海水稀释后的海水。作为天然海水以及人工海水的市售品，可以举出与在所述“[前培养工序]”中举出的相同的天然海水以及人工海水的市售品。在主培养工序中，在进行大量培养的情况下，通过使用天然海水能够抑制成本。天然海水可以是表层水，也可以是海洋深层水。天然海水优选为进行过滤等除去杂质后的天然海水。向海水中添加的氮源、磷源、铁源以及微量元素等只要根据淡水微藻的种类适当选择即可。

在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，优选为向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐。

作为含氮盐，可以举出铵盐、硝酸盐以及亚硝酸盐等含氮无机盐类等。其中，作为含氮盐，优选为铵盐(硫酸铵等)。作为铵盐向海水添加的添加量，作为铵离子浓度，可以例示20～100mM。

作为含磷盐，可以举出磷酸盐以及亚磷酸盐等含磷无机盐类等。其中，作为含磷盐，优选为磷酸盐(磷酸二氢钾等)。作为磷酸盐向海水添加的添加量，作为磷酸离子浓度，可以例示2～10mM。

作为含铁盐，可以举出氯化铁、硫酸亚铁、柠檬酸亚铁以及它们的水合物等。其中，作为含铁盐，优选为氯化铁。作为含铁盐向海水添加的添加量，作为铁离子浓度，可以例示0.1～2mM。

另外，优选为向海水中添加硼酸、锰、锌、钼、钴、铜等微量元素。

在淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻的情况下，作为在主培养工序中使用的培养基的具体例子，优选例示后述的表9中记载的“海水培养基”。

在主培养工序中使用的培养基的钠离子浓度没有特别的限定，其是所述前培养工序的所述钠离子浓度的1.1～5倍，优选为1.2～5倍，更优选为1.4～2倍，进一步优选为1.5～2倍。当在主培养工序中利用海水的情况下，钠离子浓度为约0.4M以上，根据使用的微藻种，可以使用1M以下的培养基。

另外，当在室外进行主培养工序的情况下，为了抑制其它生物的污染，可以使用0.5M以上的钠离子浓度。例如，可以使钠离子浓度为0.5～1M。

培养基的钠离子浓度的调节可以与所述前培养工序的培养基同样地进行。

另外，当在室外进行主培养工序的情况下，为了抑制其它生物的污染，可以采用更低的pH(pH1.0～2.0等)。

培养基的pH调节可以与所述前培养工序的培养基同样地进行。

可以通过将前培养工序的培养液接种在主培养工序的培养基中来开始主培养工序。培养开始时的藻类浓度没有特别的限定，例如可以为OD₇₅₀＝0.05～0.5的细胞浊度。“OD₇₅₀”的意思是指750nm处的吸光度。培养开始时的细胞浊度优选为OD₇₅₀＝0.05～0.3。

主培养工序的培养规模可以根据目的适当选择。例如，在进行微藻的育种、变异株的选择等的情况下，可以小规模地进行主培养，通常以10mL～10L程度进行主培养。另外，在利用主培养进行工业上的大量生产的情况下，可以以20～5000L程度进行培养。在进行500L的大量培养的情况下，可以进行室外培养。

主培养工序的温度条件、光条件、CO₂条件以及培养方法可以设为与上述的前培养条件相同。

另外，主培养工序也可以在室外进行培养。在该情况下，温度条件、光条件以及CO₂条件可以设为设置有培养槽的外部环境的条件。即使在将主培养工序设为室外培养的情况下，由于也是pH1.0～6.0的酸性条件下的培养，所以能够抑制其它生物的混入。另外，在使用属于温泉红藻纲的微藻的单倍体作为淡水微藻的情况下，由于在pH7的环境下的生存是困难的，所以即使在从室外的培养槽向外部环境放出的情况下，也能够抑制污染该环境。

主培养工序的培养期间没有特别的限定，可以持续培养至得到希望的生物量为止。或者，也可以确认微藻的生长状况并进行培养至变成稳定期为止。

根据本实施方式的培养方法，能够在低pH以及高钠离子浓度的培养基中从培养开始时起以很短的诱导期良好地使淡水微藻增殖。因此，即使在室外培养的情况下，也能够有效地抑制其它生物的入侵。另外，由于属于温泉红藻纲的微藻(尤其是单倍体)在中性条件下会死灭，所以假设即使存在属于温泉红藻纲的微藻(尤其是单倍体)从大量培养系统向环境中放出的情况，也能够进行生物学屏障(biological containment，生物防范)。因此，能够适合用于生产有用物质的淡水微藻的室外大量培养。

＜淡水微藻的生产方法＞

在一个实施方式中，本发明提供在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.5M以上的方式制备的培养基中可增殖的淡水微藻的生产方法。本实施方式的淡水微藻的生产方法包括如下的工序：在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1～0.4M的方式制备的培养基中培养在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中无法增殖的淡水微藻。

在本实施方式的方法中使用的淡水微藻是在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中无法增殖的淡水微藻。

通过将对象的淡水微藻在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中进行培养，经时地测定细胞浊度(OD₇₅₀)，由此能够确认淡水微藻在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中是否能够增殖。在从开始培养时起OD₇₅₀不上升的情况下，可以判断为该淡水微藻是在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中无法增殖的淡水微藻。

另外，淡水微藻优选在pH1.0～6.0下能够增殖。

作为这样的淡水微藻，例如可以举出属于Cyanidium属的微藻的单倍体。作为属于Cyanidium属的微藻的单倍体的具体例子，可以举出HKN1株(单倍体)以及YFU3株(单倍体)。

本实施方式的方法包括在钠离子浓度为0.1～0.4M的pH1.0～6.0的培养基中培养所述的这种淡水微藻的工序。该工序可以与所述“＜淡水微藻的培养方法＞”的“[前培养工序]”同样地进行。

基于本实施方式的方法，对不具有耐盐性淡水微藻赋予耐盐性，能够得到在氯化钠浓度为0.5M以上的pH1.0～6.0的培养基中可增殖的淡水微藻。在该淡水微藻能够生长的高盐浓度以及低pH的环境中，其它生物的入侵得到抑制。另外，由于属于温泉红藻纲的微藻(尤其是单倍体)在中性条件下死灭，所以假设即使在属于温泉红藻纲的微藻(尤其是单倍体)从大量培养系统向环境中放出的情况下，也能够进行生物学屏障。因此，该淡水微藻能够适合用于室外大量培养。

＜具有耐盐性的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体＞

本发明的一个实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在钠离子浓度为0.5M这样的高盐浓度的培养基中生长，但是天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体无法生长。但是，通过本发明的一个实施方式的培养方法，若在前培养期间中获得耐盐性，则变成即使在0.5M的钠离子浓度的培养基中也能够生长。此时具有在比前培养期间中更短期间的诱导期之后开始对数增殖的特征，该特征进而在培养基中继代培养也是同样的。而且，获得了耐盐性的本发明的单倍体藻类具有如下这样的特征，若在未添加NaCl的MA培养基中继代培养，则变成不生长或生长不良。

对于生长是否良好，通过与对照的培养条件进行比较也能够得到，但是在本发明的一个实施方式中，基于自己的培养初始状态的细胞数与在经过规定期间的时期中增大的细胞数之比的大小进行研究。具体而言，利用式(1)进行计算。通过测定培养液的750nm下的吸光度OD求出细胞数，将规定期间设定为7天，在式(1)的值为2以上的情况下设定为生长良好，在小于2的情况下设定为生长不良。作为生长不良的原因，可以考虑适应环境条件需要花费时间、属于温泉红藻纲的微藻的单倍体由于不具有坚固的细胞壁所以无法承受高渗液的渗透压从而细胞破坏并死灭。对于确认细胞破坏了，虽然可以考虑用显微镜观察，但是难以确保定量性。因此，在本发明的一个实施方式中，通过测定作为细胞内容物的藻蓝蛋白的量来进行定量的考察。

在一个实施方式中，本发明提供一种属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的MA培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下静置培养了7天时的用下述式(1)计算出的值为2以上，在MA培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下静置培养了7天时的用下述式(1)计算出的值小于2。

用(培养开始7天后的OD₇₅₀值－培养开始时的OD₇₅₀值)/(7×培养开始时OD₇₅₀值)表示的培养速度 (1)

“以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的MA培养基”，是在实施例的表5中记载的培养基(以下也称为“MA+0.5M NaCl培养基”)。本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在MA+0.5M NaCl培养基中能够增殖。此外具有如下的特征：当在MA+0.5M NaCl培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光的条件下静置培养时，用下述式(1)计算出的增殖速度成为2以上。

(培养开始7天后的OD₇₅₀值－培养开始时的OD₇₅₀值)/(7×培养开始时OD₇₅₀值) (1)

在所述式(1)中，“培养开始时的OD₇₅₀值”的意思是指在培养开始时(0小时)时用波长750nm测定到的培养液的吸光度。通常，以使培养开始时的OD₇₅₀值成为0.1的方式将属于温泉红藻纲的微藻的单倍体接种到MA+0.5M NaCl培养基中并开始培养。在所述式(1)中，“培养开始7天后的OD₇₅₀值”的意思是指从培养开始在7天(168小时)后用波长750nm测定到的培养液的吸光度。培养液的吸光度可以用吸光度计测定。

培养在培养温度42、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光的条件下进行7天的静置培养。培养规模没有特别的限定，例如，可以使用24孔板，用1mL的培养液进行培养。

天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在MA+0.5M NaCl培养基中无法增殖。因此，当在MA+0.5M NaCl培养基中培养天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的情况下，用所述式(1)计算出的值小于2。但是，本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体由于对高钠离子浓度具有抗性，所以即使在MA+0.5M NaCl培养基中也能够良好地增殖。因此，当在MA+0.5M NaCl培养基中培养本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的情况下，用所述式(1)计算出的值为2以上。本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在MA+0.5MNaCl培养基中培养时的用所述式(1)计算出的值优选为3以上，更优选为4以上。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体除了上述特征以外还具有如下的特征：在MA培养基中在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下静置培养时，用所述式(1)计算出的值小于2。MA培养基是实施例的表1中记载的培养基。通常，以使培养开始时的OD₇₅₀值成为0.1的方式将属于温泉红藻纲的微藻的单倍体接种到MA培养基中并开始培养。培养在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光的条件进行了7天的静置培养。培养规模没有特别的限定，例如可以使用24孔板用1mL的培养液进行培养。

天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在MA培养基中能够良好地增殖。因此，当在MA培养基中培养天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的情况下，用所述式(1)计算出的值通常为2以上。但是，本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体对高钠离子浓度具有抗性；另一方面，在低钠离子浓度下的增殖能力降低。因此，当在MA培养基中培养本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的情况下，用所述式(1)计算出的值为2以上。本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体在MA培养基中培养时的用所述式(1)计算出的值优选为小于1.8，更优选为小于1.5以上。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体悬浮在MA培养基中时的死灭率优选为30％以上，更优选为40％以上，进一步优选为50％以上。若所述死灭率为30％以上，则即使藻类细胞放出到环境中，在钠离子浓度低的环境中，藻类细胞也难以生存。因此，即使在室外的开放培养系统中培养的情况下，也难以引起对环境的污染。

所述死灭率是以如下方式计算出的死灭率。

在MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养后，回收悬浮在2mL的所述培养基中时变成OD₇₅₀＝1的量的藻类细胞，进行下述的处理1～3。

处理1：悬浮在MA培养基2mL中，用旋涡振荡器振荡10分钟。

处理2：悬浮在MA+0.5M NaCl培养基2mL中，用旋涡振荡器振荡10分钟。

处理3：悬浮在MA+0.5M NaCl培养基0.1mL中后，在-196℃下冻结，利用所述培养基以成为2mL的方式用量筒或量瓶进行稀释，用旋涡振荡器振荡10分钟。

接着，利用下列算式，计算出死灭率。

死灭率(％)＝{(处理2后的PC浓度－处理1后的PC浓度)/(处理2后的PC浓度－处理3后的PC浓度)}×100

在所述式中，“PC浓度”表示藻蓝蛋白浓度。针对进行了处理1～3中的任一项后的悬浮液，使用安装有积分球的分光光度计，测定620nm以及678nm的吸光度，由此可以求出PC浓度。PC浓度可以从620nm以及678nm的吸光度利用下列算式计算出来。

PC浓度(μg/mL)＝138.5×A₆₂₀-35.49×A₆₇₈

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体优选为具有下述(a)～(c)中的任意一个以上的特征，更优选为具有下述(a)～(c)中的任意两个特征，进一步优选为具有下述(a)～(c)的全部特征。

(a)与天然的所述微藻的单倍体比较，在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中的培养开始后7天的增殖速度大。

(b)与天然的所述微藻的单倍体比较，在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基中的培养开始后7天的增殖速度小。

(c)与在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基中的培养开始后7天的增殖速度比较，在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中的培养开始后7天的增殖速度大。

“天然的属于温泉红藻纲的微藻”是指在自然界中生长的属于温泉红藻纲的微藻或与所述微藻具有相同的性质的该种类的微藻。天然的微藻可以是从自然界分离并通过在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基中培养而保持的微藻。

“天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体”是指在自然界中生长的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体或从在自然界中生长的属于温泉红藻纲的微藻的二倍体得到的单倍体。在以使钠离子浓度为0.05M以下且成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中以一定条件并在一定期间(例如，1～3周的程度)培养天然的属于温泉红藻纲的微藻的二倍体，在显微镜下物理性地选择减数分裂后的微藻，能够得到天然的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体。

通过在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中培养该微藻的单倍体以及与该微藻同种的天然的微藻，比较培养开始后7天的增殖速度，由此能够判断属于温泉红藻纲的微藻的单倍体是否具有上述(a)的特征。在所述增殖速度大于天然的微藻的单倍体的情况下，判断为该微藻具有上述(a)的特征。

在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基中培养该微藻的单倍体以及与该微藻同种的天然的微藻，比较培养开始后7天的增殖速度，由此能够判断属于温泉红藻纲的微藻的单倍体是否具有上述(b)的特征。在所述增殖速度小于天然的微藻的单倍体的情况下，判断为该微藻具有上述(b)的特征。

在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基以及钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中培养该微藻的单倍体，比较两种培养基的培养开始后7天的增殖速度，由此能够判断属于温泉红藻纲的微藻的单倍体是否具有上述(c)的特征。当在所述钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中的增殖速度大于在钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基中的增殖速度的情况下，判断为该微藻具有上述(c)的特征。

作为钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基以及钠离子浓度为0.05M以下的pH1.0～6.0的培养基，可以举出与在上述“＜淡水微藻的培养方法＞”中举出的培养基相同的培养基。作为上述(a)～(c)的培养条件，例如可以举出培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光的条件下的静置培养。培养规模没有特别的限定，例如可以使用24孔板用1mL的培养液进行培养。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体可以通过所述实施方式的淡水微藻的生产方法得到。作为属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的具体例子，可以举出属于Cyanidioschyzon merolae、Cyanidium属的微藻的单倍体以及属于Galdieria属的微藻的单倍体。作为属于Cyanidium属的微藻的单倍体的具体例子，可以举出HKN1株(单倍体)以及YFU3株(单倍体)。作为属于Galdieria属的微藻的单倍体的具体例子，可以举出G.partita以及G.sulphuraria等。其中，优选为属于Cyanidium属的微藻或属于Galdieria属的微藻的单倍体，更优选为属于Cyanidium属的微藻的单倍体，进一步优选为HKN1株(单倍体)或YFU3株(单倍体)，特别优选为HKN1株(单倍体)。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻优选为在钠离子浓度为0.6M以上的pH1.0～6.0的培养基中能够增殖，更优选为在钠离子浓度为0.7M以上的pH1.0～6.0的培养基中能够增殖，进一步优选为在钠离子浓度为0.8M以上的pH1.0～6.0的培养基中能够增殖，特别优选为在钠离子浓度为0.9M以上的pH1.0～6.0的培养基中能够增殖。本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻也可以在钠离子浓度为1M以上的pH1.0～6.0的培养基中增殖。

优选为，本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻即使在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中培养后在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的新的培养基中继代培养的情况下，也保持增殖速度。由此，能够在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中继代培养并保持本实施方式的微藻。另外，即使在任意的时期在钠离子浓度为0.5M的pH1.0～6.0的培养基中大量培养以所述的方式保持的本实施方式的微藻的情况下，也能够使本实施方式的微藻良好地增殖。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体由于在与海水同程度的钠离子浓度下能够良好地增殖，所以使用向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐且调节为pH1.0～6.0的培养基能够使本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体良好地增殖。作为这样的培养基的具体例子，可以举出与在所述“＜淡水微藻的培养方法＞”的“[主培养工序]”中举出的培养基相同的培养基。

本实施方式的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体由于在高钠离子浓度以及低pH的环境中能够良好地增殖，所以能够适合用于室外大量培养。

实施例

下面，通过实施例对本发明进行说明，但是本发明不局限于下面的实施例。

(培养基的制备)

制备了表1所示的组成的M-Allen培养基(MA培养基)。具体而言，对A2 Fe储备液以外的培养基成分进行了混合，用硫酸调节至pH2.0后，利用高压灭菌器进行了灭菌。高压灭菌器灭菌后，添加过滤灭菌后的4mL的A2 Fe储备液，作为MA培养基。

表2以及表3中分别示出了A2微量元素以及A2 Fe储备液的组成。

[表1]

[表2]

[表3]

向MA培养基中添加0.3M NaCl，制备了MA+0.3M NaCl培养基。另外，向MA培养基中添加0.5M NaCl，制备了MA+0.5M NaCl培养基。表4以及表5中分别示出了MA+0.3M NaCl培养基以及MA+0.5M NaCl培养基的组成。表4以及表5中的A2微量元素以及A2 Fe储备液分别是表2以及表3中示出的。

[表4]

[表5]

在以下的实施例中，在将所述培养基用于前培养或主培养的情况下，存在将各培养基以下述方式记载的情况。

在用于前培养的情况下

MA培养基：培养基(A)

MA+0.3M NaCl培养基：培养基(B)

MA+0.5M NaCl培养基：培养基(C)

在用于主培养的情况下

MA培养基：培养基(a)

MA+0.3M NaCl培养基：培养基(b)

MA+0.5M NaCl培养基：培养基(c)

(生长状况的测定)

基于细胞浊度(OD₇₅₀)确认了微藻的生长状况。具体而言，使用吸光度计(BIO-RAD公司的SmartSpec Plus)测定了藻类培养液的750nm下的吸光度，求出了细胞浊度(OD₇₅₀)。

(培养方法)

对于Cyanidium sp.HKN1的培养，除非另有说明，通过在CO₂恒温箱内的静置培养进行了前培养以及主培养。将培养温度设为42℃，使用照度60μmol/m²s的连续光，将CO₂浓度设为2％。除非另有说明，使用24孔板并用1mL的培养液进行了培养。

对于Cyanidioschyzon merolae 10D的培养，除非另有说明，通过通气培养(300mLambient air/min)进行了前培养以及主培养。将培养温度设为42℃，使用了照度60μmol/m²s的连续光。除非另有说明，用24孔板并用1mL的培养液进行了培养。

使Cyanidium sp.HKN1以及Cyanidioschyzon merolae 10D的前培养开始时以及主培养开始时的细胞浊度都成为OD₇₅₀＝0.1。除非另有说明，使用24孔板并用1mL的培养液进行了培养。

(聚磷酸的定性分析)

对于聚磷酸的存在，通过以下面的方式进行DAPI染色进行了观察。

以成为最终浓度1％(w/v)的方式向培养液中添加了戊二醛(glutaraldehyde)后，以使最终浓度成为3μg/mL的方式添加了DAPI，用荧光显微镜进行了观察。

(液泡的定性分析)

对于液泡的存在，通过以下面的方式进行奎吖因染色进行了观察。

以使最终浓度成为100mM的方式向培养液中添加了1M Tris-HCl(pH8.0)缓冲液后，以使最终浓度成为40μg/mL的方式添加了奎吖因，在室温下静置了15分钟。离心后(1500g，5分钟)，弃掉上清，向沉淀中添加了MA培养基，在37℃下静置了30分钟，用荧光显微镜进行了观察。

[实施例1]

使用MA培养基(培养基(A))对Cyanidium sp.HKN1(单倍体)(以下有时略记为“HKN1(单倍体)”)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。

另外，使用MA+0.3M NaCl(培养基(B))对HKN1(单倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。

结果示出在表6以及图1中。图1是将表1所示的OD₇₅₀的变化以图表形式表示的图。

[表6]

如表6以及图1所示，在前培养用培养基(A)的情况下，主培养用培养基(a)以及培养基(b)之时显示了相同的增殖，但是主培养用培养基(c)之时没有增殖。

另一方面，在前培养用培养基(B)的情况下，即使在主培养用培养基(c)之时，也显示了与上述培养基(a)以及培养基(b)的情况相同的增殖。

[实施例2]

使用NAJIIMU 10(表层的海水：日本QCE bluelab事业部)作为天然海水。将MA培养基的成分分别添加到海水(NAJIIMU 10)中，培养了HKN1(单倍体)，确认了MA培养基中的哪个成分有助于HKN1(单倍体)的生长。

表7～8中示出了用于主培养的培养基。向NAJIIMU 10中添加了表7～8所示的MA培养基成分，用硫酸调节至pH2.0，制备了培养基1～17。另外，由于镁以及钙在海水中丰富存在，所以在培养基1～16中没有添加MgSO₄以及CaCl₂。培养基17作为阳性对照添加了相当于MA培养基的MgSO₄以及CaCl₂。

用培养基(B)对HKN1(单倍体)进行了1周的前培养后，用培养基1～17中的任意一种培养基进行了10天的主培养。在10天的主培养后，测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。结果示出在表7～8中。

[表7]

+：添加；－：非添加

[表8]

+：添加；－：非添加

如表7～8所示，培养基16以及培养基17显示了同等的增殖。根据这些结果，确认了通过向海水中添加(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、A2 Fe储备液以及A2微量金属元素，能够作为适合HKN1(单倍体)生长的海水培养基使用。

上述培养基16的组成在表9中示出。在以下的实施例中记载为“海水培养基”的培养基是表9所示的组成的培养基。表9中的A2微量元素以及A2 Fe储备液分别是表2以及表3所示的。

[表9]

[实施例3]

使用MA+0.3M NaCl培养基(培养基(B))对HKN1(单倍体)进行了1周的前培养，使用MA+0.5M NaCl培养基(阳性对照)(培养基(c))或海水培养基进行了7天的主培养。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。

结果在表10以及图2中示出。图2是将表10所示的OD₇₅₀的变化以图表形式示出的图。

[表10]

如表10以及图2所示，即使在使用培养基(c)以及海水培养基中的任意的培养基进行了主培养情况下，HKN1(单倍体)都显示了同等的增殖。

[实施例4]

为了确认pH对HKN1(单倍体)生长的影响，分别准备了使pH在pH2～7之间变化的海水培养基。使用硫酸或氢氧化钾进行pH的调节。

使用MA+0.3M NaCl(培养基(B))对HKN1(单倍体)进行了1周的前培养，使用以如上所述的方式调节了pH的各海水培养基进行了7天的主培养。主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。

结果在表11以及图3中示出。图3是将表11所示的OD₇₅₀以图表形式示出的图。

[表11]

pH(主培养开始时)	2	3	4	5	6	7
							pH(主培养7天后)	1.89	2.42	2.61	2.65	4.83	6.43
培养结果(OD<sub>750</sub>)	2.60	2.59	2.27	2.22	0.834	0.1

如表11以及图3所示，HKN1(单倍体)在pH6以下能够增殖，但是在pH7下无法增殖。另外，通常，若在将氨作为氮源的培养基中使藻类增殖，则pH会伴随藻类的增殖而降低，因此需要添加缓冲剂、碱性物质将pH保持在中性附近。但是，嗜酸性的HKN1(单倍体)无需进行pH调节。

[实施例5]

使用MA培养基(培养基(A))对Cyanidium sp.HKN1(二倍体)(以下有时略记为“HKN1(二倍体)”)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(二倍体)的生长状况。

另外，使用MA+0.3M NaCl(培养基(B))对HKN1(二倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(二倍体)的生长状况。

结果在表12以及图4中示出。图4是将表12所示的OD₇₅₀的变化以图表形式示出的图。

[表12]

如表12以及图4所示，即使在使用培养基(A)以及培养基(B)中的任意的培养基对HKN1(二倍体)进行了前培养的情况下，在培养基(a)，培养基(b)以及培养基(c)的主培养中都显示了同等的增殖速度。

[实施例6]

使用MA+0.3M NaCl培养基(培养基(B))对HKN1(二倍体)进行了1周的前培养，使用MA+0.5M NaCl培养基(阳性对照)(培养基(c))或海水培养基进行了7天的主培养。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(二倍体)的生长状况。

结果在表13以及图5中示出。图5是将表13所示的OD₇₅₀的变化以图表形式示出的图。

[表13]

如表13以及图5所示，在使用培养基(c)以及海水培养基的任意的培养基进行了主培养的情况下，HKN1(二倍体)都显示了同等的增殖速度。

[实施例7]

使用MA培养基(培养基(A))对Cyanidioschyzon merolae 10D(以下有时略记为“10D”)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了10D的生长状况。

另外，使用MA+0.3M NaCl(培养基(B))对10D进行了1周的前培养。所述前培养后，使用培养基(a)、(b)或(c)进行了7天的静置培养(主培养)。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了10D的生长状况。

结果在表14以及图6中示出。图6是将表14所示的OD₇₅₀的变化以图表形式示出的图。

[表14]

如表14以及图6所示，在前培养用培养基(A)的情况下，在主培养用培养基(a)以及培养基(b)之时10D都显示了相同的增殖。另一方面，在主培养用培养基(c)之时，到主培养3天为止OD₇₅₀逐渐地降低，但是第5天恢复了，其后显示了与培养基(a)以及培养基(b)同等的增殖速度。

另一方面，在前培养用培养基(B)的情况下，即使在主培养用培养基(c)之时，从培养开始时起，也显示了与上述培养基(a)以及培养基(b)的情况相同的增殖。

[实施例8]

使用MA+0.3M NaCl培养基(培养基(B))对10D进行了1周的前培养，使用MA+0.5MNaCl培养基(阳性对照)(培养基(c))或海水培养基进行了7天的主培养。在主培养中，经时地测定了培养基的OD₇₅₀，确认了10D的生长状况。

结果在表15以及图7中示出。图7是将表15所示的OD₇₅₀的变化以图表形式示出的图。

[表15]

如表15以及图7所示，即使在使用培养基(c)以及海水培养基的任意的培养基进行了主培养的情况下，10D都显示了同等的增殖速度。

[实施例9]

将使用MA培养基培养了1周的HKN1(单倍体)以成为OD₇₅₀＝0.1的方式移植到MA培养基中，在CO₂恒温箱内(2％CO₂)静置培养了7天，作为HKN1(单倍体)的MA培养基的培养品。将使用MA培养基培养了1周的HKN1(单倍体)在MA培养基+0.3M NaCl中进行了1周的前培养后，移植到MA培养基+0.5M NaCl培养基中，在CO₂恒温箱内(2％CO₂)中静置培养了7天。将其作为MA培养基+0.5M NaCl培养基的培养品。

将使用MA培养基培养了1周的HKN1(单倍体)在MA培养基+0.3M NaCl中进行了1周的前培养后，移植到海水培养基中，在CO₂恒温箱内(2％CO₂)中静置培养了7天。将其作为海水培养基的培养品。

对于各培养基的培养品，利用DAPI进行了聚磷酸的定性分析，利用奎吖因进行了液泡的定性分析。

结果在图8中示出。

当用DAPI对MA培养基的培养品、MA培养基+0.5M NaCl培养基的培养品、海水培养的基培养品进行染色时，仅MA培养基的培养品确认到聚磷酸。当用奎吖因对被认为存在聚磷酸的液泡进行染色时，液泡染色的方式没有不同。

[实施例10]

除了使用HKN1(二倍体)作为藻类以外，与实施例9同样地进行培养，制造了MA培养基的培养品、MA培养基+0.5M NaCl培养基的培养品、以及海水培养基的培养品的三种培养品。对于这些培养品，与实施例9同样地，利用DAPI进行了聚磷酸的定性分析，利用奎吖因进行了液泡的定性分析。

结果在图9中示出。在MA培养基的培养品中未确认到聚磷酸，但是在MA培养基+0.5M NaCl培养基的培养品以及海水培养基的培养品中，以表层附近为中心观察到了聚磷酸。另外，任意的培养品也都同样地观察到了被认为存在聚磷酸的液泡。

[实施例11]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对10D进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了10D的生长状况。结果在表16中示出。

另外，将在用培养基(B)的前培养后用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对10D进行了7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了10D的生长状况。结果在表17中示出。

使主培养开始时以及继代培养时的培养基的OD₇₅₀成为0.1。以下的实施例12～17也是相同的。在表17中，“式(1)－(A)”表示使用培养基(A)进行前培养后在表中所示的NaCl浓度下进行了主培养的微藻的用式(1)计算出的值。“式(1)－(B)”表示在使用培养基(B)进行前培养后在表中所示的NaCl浓度下进行了主培养的微藻的用式(1)计算出的值。以下，即使在实施例12～17中也是相同的。当OD₇₅₀＜0.1时，由于无法用式(1)计算出值，所以表示为“－”。

[表16]

[表17]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	1.211	3.619
式(1)的增值	1.59	5.03

如表16所示，对于使用培养基(B)进行了前培养的情况，与使用培养基(A)进行了前培养的情况进行比较，使用NaCl 0mM的培养基进行主培养的情况下的增殖受到了抑制。另一方面，对于500mM以上的高NaCl浓度，使用培养基(A)进行了前培养的情况，没有确认到增殖；与此相对，使用培养基(B)进行了前培养的情况，即使在500mM的高盐浓度下也确认到了增殖。

如表17所示，在使用培养基(c)进行了主培养后，对于在培养基(a)中进行继代培养的情况，增殖受到了抑制，但是在培养基(c)中进行了继代培养的情况，没有观察到良好的增殖。

另外，对于使用培养基(c)进行主培养得到的藻类细胞，将培养液离心后回收了藻类细胞，当将该藻类细胞投入pH7的蒸馏水中时，确认到细胞破裂。

[实施例12]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对HKN1(单倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。结果在表18中示出。

另外，把在使用培养基(B)的前培养后使用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对HKN1(单倍体)进行了7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5MNaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(单倍体)的生长状况。结果在表19中示出。

[表18]

[表19]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	<0.1	5.258
式(1)的值	－	7.37

如表18所示，对于使用培养基(B)进行了前培养的藻类，未确认到使用NaCl 0mM的培养基进行了主培养的情况的增殖。另一方面，对于400mM以上的高NaCl浓度，使用培养基(A)进行了前培养的藻类未确认到增殖；与此相对，使用培养基(B)进行了前培养的藻类即使在400mM以上的高盐浓度下也确认到增殖。

如表19所示，在使用培养基(c)进行了主培养后，在培养基(a)中进行继代培养的藻类的增殖受到了抑制，但是在培养基(c)中进行继代培养的培养品观察到良好的增殖。

[实施例13]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对HKN1(二倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(二倍体)的生长状况。结果在表20中示出。

另外，把在使用培养基(B)的前培养后使用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对HKN1(二倍体)进行了7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5MNaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了HKN1(二倍体)的生长状况。结果在表21中示出。

[表20]

[表21]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	10.951	7.808
式(1)的值	15.50	11.01

如表20所示，对于使用培养基(B)进行了前培养的藻类，与使用培养基(A)进行了前培养的藻类相比较，存在有在NaCl低浓度的培养基中进行了主培养的情况下的增殖稍微受到抑制的倾向。另一方面，在800mM以上的高NaCl浓度下，在使用培养基(A)进行了前培养的藻类中，未确认到增殖；与此相对，即使在800mM以上的高盐浓度下，在使用培养基(B)进行了前培养的藻类中，也确认到增殖。

如表21所示，在使用培养基(c)进行了主培养后，在培养基(a)中进行了继代培养的藻类以及在培养基(c)中进行了继代培的藻类都观察到良好的增殖。

[实施例14]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对Galdieria partita(NBRC102759)(单倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.partita(单倍体)的生长状况。结果在表22中示出。

另外，把在使用培养基(B)的前培养后使用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对G.partita(单倍体)进行7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5MNaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.partita(单倍体)的生长状况。结果在表23中示出。

[表22]

[表23]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	0.603	3.957
式(1)的值	0.72	5.51

如表22所示，对于在培养基(B)中进行了前培养的微藻，与在培养基(A)中进行了前培养的微藻进行比较，在NaCl 0mM的培养基中进行了主培养的情况下的增殖受到了抑制。另一方面，在700mM以上的高NaCl浓度下，在培养基(B)中进行了前培养的微藻，与在培养基(A)中进行了前培养的微藻进行比较，增殖抑制率低。

如表23所示，对于在培养基(c)中进行了主培养后在培养基(a)中进行了继代培养的微藻，增殖受到了抑制，对于在培养基(c)中进行了继代培养的微藻，观察到良好的增殖。

[实施例15]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对G.partita(二倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，使用使NaCl浓度在0～1000mM之间变化了的MA培养基进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.partita(二倍体)的生长状况。结果在表24中示出。

另外，把在使用培养基(B)的前培养后使用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对G.partita(二倍体)进行7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5MNaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.partita(二倍体)的生长状况。结果在表25中示出。

[表24]

[表25]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	5.417	5.180
式(1)的值	7.60	7.26

如表24所示，对于在培养基(B)中进行了前培养的微藻，与在培养基(A)中进行了前培养的微藻相比较，存在有在高NaCl浓度的培养基中的增殖提高了的倾向。

如表25所示，在培养基(c)中进行了主培养后在培养基(a)中进行了继代培养的微藻以及在培养基(c)中进行了继代培养的微藻都观察到了良好的增殖。

[实施例16]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对Galdieriasulphuraria(SAG108.79)(单倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，在使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基中进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.sulphuraria(单倍体)的生长状况。结果在表26中示出。

另外，把在使用培养基(B)的前培养后使用MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))对G.sulphuraria(单倍体)进行了7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.sulphuraria(单倍体)的生长状况。结果在表27中示出。

[表26]

[表27]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	1.006	4.125
式(1)的值	1.29	5.75

如表26所示，对于在培养基(B)中进行了前培养的微藻细胞，与在培养基(A)中进行了前培养的微藻细胞相比较，使用NaCl 0mM的培养基进行了主培养的情况下的增殖受到了抑制。另一方面，在700mM以上的高NaCl浓度下，对于在培养基(A)中进行了前培养的微藻细胞，未确认到增殖；与此相对，对于在培养基(B)中进行了前培养的微藻细胞，即使在700mM以上的高盐浓度下也确认到了增殖。

如表27所示，在培养基(c)中进行了主培养后，对于在培养基(a)中进行了继代培养的微藻，增殖受到了抑制，但是在培养基(c)中进行了继代培养的微藻，观察到了良好的增殖。

[实施例17]

使用MA培养基(培养基(A))或MA+0.3M NaCl(培养基(B))对G.sulphuraria(二倍体)进行了1周的前培养。在所述前培养后，在使NaCl浓度在0～1000mM之间变化的MA培养基中进行了7天的主培养。在主培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.sulphuraria(二倍体)的生长状况。结果在表28中示出。

另外，把在培养基(B)中的前培养后在MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))中对G.sulphuraria(二倍体)进行了7天的主培养得到的藻类细胞在MA培养基(培养基(a))或MA+0.5M NaCl培养基(培养基(c))中进行继代培养，进一步进行了7天的培养。在培养结束后，测定了最终的培养基的OD₇₅₀，确认了G.sulphuraria(二倍体)的生长状况。结果在表29中示出。

[表28]

[表29]

继代培养的培养基	培养基(a)	培养基(c)
			OD<sub>750</sub>	6.720	2.517
式(1)的值	9.46	3.45

如表28所示，对于在培养基(B)中进行了前培养的微藻，与在培养基(A)中进行了前培养的微藻相比较，存在有高NaCl浓度的培养基中的增殖得到了提高的倾向。

如表29所示，在培养基(c)中进行了主培养后，在培养基(a)中进行了继代培养的微藻以及在培养基(c)中进行了继代培养的微藻都观察到良好的增殖。

若综合上述的结果，则对于单倍体的淡水微藻，通过在0.3M的NaCl浓度下进行前培养，与在0M的NaCl下进行前培养时进行比较，确认到在0.5M以上的NaCl浓度下进行主培养时的增殖提高了。由此，用所述式(1)计算出的值变成2以上。另外，当在0.3M以上的NaCl浓度下进行了培养后，与在0M的NaCl下进行前培养时进行比较，确认到0M的NaCl浓度下的增殖受到抑制。另外，通过在0.3M的NaCl浓度下进行前培养，存在有0.5M的NaCl浓度的培养基中的增殖速度比0M的NaCl浓度的培养基中的增殖速度上升的倾向。另外也确认到，在0.5M的NaCl浓度中进行了主培养后，能够在0.5M的NaCl浓度的培养基中进行继代培养。

另外确认到，通过在0.3M的NaCl浓度下进行前培养，即使是单倍体的淡水微藻，也能够在500～1000mM的高NaCl浓度的范围内进行增殖。当设想在室外培养的情况下，认为由于水的蒸发、雨水的流入，在培养期间盐浓度会发生变动。基于上述的结果，在0.3M的NaCl浓度下进行了前培养的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体显示了针对盐浓度变动的宽容性，显示了能够充分耐受室外培养。

[实施例18]

把HKN1(单倍体)在MA+0.3M NaCl培养基(培养基(B))中进行了7天前培养后，进一步在海水培养基中进行了1周的前培养。接着，把所述的HKN1(单倍体)在10L的海水培养基中进行继代培养并进行了主培养。主培养在塑料棚中进行，没有进行光、温度以及CO₂浓度的控制。主培养以通气培养的方式进行，培养期间设定为2019年5月13日～2019年7月1日。定期地对培养液进行采样，测定了750nm的吸光度。将该结果在图10中示出。

如图10所示，确认到：即使是10L的规模，在海水培养基中也能够良好地增殖。

[实施例19]

把HKN1(单倍体)在MA培养基、MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5NaCl培养基中进行了7天的培养。当悬浮在2mL的培养基中时，将包含OD₇₅₀＝1的量的藻类细胞的培养液回收到3个微管(microtube)中。进行了培养液的离心分离(1500×g，5分钟)，去除了上清，回收了沉淀物(pellet)。把作为沉淀物回收的各藻类细胞进行了下述处理1～3中任一项的处理。

处理1：将藻类细胞悬浮在MA培养基2mL中，用旋涡振荡器进行了10分钟的振荡。

处理2：将藻类细胞悬浮在与用于所述培养的培养基相同的培养基2mL中，用旋涡振荡器进行了10分钟的振荡。

处理3：将藻类细胞悬浮在与用于所述培养的培养基相同的培养基0.1mL中后，在－196℃进行冻结，利用量筒或量瓶用与用于所述培养的培养基相同的培养基以成为2mL的方式进行了稀释，用旋涡振荡器进行了10分钟的振荡。

若藻类细胞破坏，则细胞内容物会向培养基中放出，藻蓝蛋白(PC)暴露在酸性的培养基中会褪色。通过冻结处理(处理3)，假设藻类细胞100％死灭，通过下列算式，计算出处理1造成的藻类细胞的死灭率。

死灭率(％)＝{(处理2后的PC浓度－处理1后的PC浓度)/(处理2后PC浓度-处理3后的PC浓度)}×100

通过使用安装有积分球(ISR-2600Plus，岛津制作所)的分光光度计(UV-2600，岛津制作所)测定620nm以及678nm的吸光度，测定了PC浓度。PC浓度通过以下的式子计算出来。

PC浓度(μg/mL)＝138.5×A₆₂₀-35.49×A₆₇₈

结果在表30中示出。

[表30]

如表30所示，确认到：在MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞由于向MA培养基的再悬浮，细胞变得容易被破坏。

[实施例20]

除了代替HKN1(单倍体)使用了10D以外，通过与实施例19相同的方法，计算出所述处理1导致的藻类细胞的死灭率。其结果在表31中示出。

[表31]

如表31所示，确认到：在MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞由于向MA培养基的再悬浮，细胞变得容易破坏。另外，与在MA+0.3M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞相比，在MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞一方的死灭率变高。

[实施例21]

除了代替使用HKN1(单倍体)而使用了G.partita(单倍体)以外，通过与实施例19相同的方法，计算出所述处理1造成的藻类细胞的死灭率。其结果在表32中示出。

[表32]

如表32所示，确认到：在MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞由于向MA培养基的再悬浮，细胞变得容易破坏。另外，与在MA+0.3M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞相比，在MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞一方的死灭率变高。

[实施例22]

除了代替HKN1(单倍体)使用了G.sulphuraria(单倍体)以外，通过与实施例19相同的方法，计算出所述处理1造成的藻类细胞的死灭率。其结果在表33中示出。

[表33]

如表33所示，确认到：在MA+0.3M NaCl培养基或MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞由于向MA培养基的再悬浮，细胞变得容易破坏。另外，与在MA+0.3M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞相比，在MA+0.5M NaCl培养基中进行了培养的藻类细胞的一方的死灭率变高。

工业实用性

基于本发明能够提供：一种在低pH且高钠离子浓度环境下也能够使淡水微藻良好地增殖的淡水微藻的培养方法，一种在低pH且高钠离子浓度环境下能够良好地增殖的淡水微藻以及该淡水微藻的生产方法。

基于本发明，由于能够利用能低价取得的海水大量地培养淡水酸微藻，所以对于利用藻类的有用物质的生产是有用的。此外，若大量地培养淡水酸微藻，则也能够期待利用淡水微藻吸收大气中的二氧化碳。

PCT/RO/134表

Claims

1.一种淡水微藻的培养方法，其包括：

培养工序，在培养温度15℃～60℃下在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1M～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻。

2.如权利要求1所述的淡水微藻的培养方法，其包括：

前培养工序，在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1M～0.4M的方式制备的培养基中培养淡水微藻；以及

主培养工序，在以使钠离子浓度为所述前培养工序的所述钠离子浓度的1.2倍～5倍且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养所述前培养工序后的淡水微藻。

3.如权利要求1或2所述的淡水微藻的培养方法，其中，

所述主培养工序的所述培养基是以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.4M以上的方式制备的培养基。

4.如权利要求1至3中任一项所述的淡水微藻的培养方法，其中，

所述主培养工序的所述培养基是以向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基。

5.如权利要求1至4中任一项所述的淡水微藻的培养方法，其中，

所述淡水微藻是属于温泉红藻纲的微藻。

6.一种淡水微藻的生产方法，其中，

所述淡水微藻能够在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.5M以上的方式制备的培养基中增殖，

所述淡水微藻的生产方法包括下述工序：将在钠离子浓度为0.5M以上的培养基中无法增殖的淡水微藻，在以使氢离子浓度成为pH1.0～6.0且使钠离子浓度成为0.1M～0.4M的方式制备的培养基中进行培养。

7.如权利要求6所述的淡水微藻的生产方法，其中，

所述淡水微藻是属于Cyanidium属的微藻的单倍体。

8.一种属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，其中，

所述属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，在以使氢离子浓度成为pH2.0且使钠离子浓度成为0.5M的方式制备的MA培养基中，在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值为2以上，

在以使氢离子浓度成为pH2.0的方式调节的MA培养基中，在培养温度42℃、二氧化碳浓度2％、照度60μmol/m²s的连续光下进行了7天的静置培养时的用下述式(1)计算出的值小于2，

(培养开始7天后的OD₇₅₀值-培养开始时的OD₇₅₀值)/(7×培养开始时OD₇₅₀值) (1)。

9.如权利要求8所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，其中，

细胞在氢离子浓度pH7的等渗溶液或蒸馏水中破裂。

10.如权利要求8或9所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体，其中，

当进行藻类细胞的干燥处理且将所述干燥处理后的细胞悬浮在pH7的等渗溶液中时，所述细胞破裂。

11.一种属于温泉红藻纲的微藻的单倍体的培养方法，其包括：

在以向海水中至少添加含氮盐、含磷盐以及含铁盐且使氢离子浓度成为pH1.0～6.0的方式制备的培养基中培养权利要求8至10中任一项所述的属于温泉红藻纲的微藻的单倍体。

12.一种属于温泉红藻纲的微藻的培养方法，其包括：

在室外培养权利要求8至10中任一项所述的属于温泉红藻纲的微藻。