KR101898773B1 - 테트라셀미스의 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법 - Google Patents

테트라셀미스의 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테트라셀미스 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주의 배양에서 있어서, 상기 배양을 위한 배지에 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 투여해주는 단계를 포함하는 테트라셀미스의 배양방법, 이러한 균주를 포함하는 배지 조성물 및 상기 공생관계에 있는 균주를 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 빠른 성장과 높은 지방산 함량 때문에 잠재적인 미래 바이오에너지로 각광을 받고 있을 뿐만 아니라, 인공양식 산업, 피부미용 조성물 등과 같은 다양한 분야에 활용이 가능하여 산업적 이용가치가 탁월한 테트라셀미스 바이오매스의 대량생산, 안정적 균주 배양 및 경제성 있는 산업적 생산을 가능하게 하는 테트라셀미스 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법을 제공할 수 있다.

Description

테트라셀미스의 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법 {Method for incuabting tetraselmis species, medium composition for incubating tetraselmis species and method for identification of strains promoting growth of tetraselmis species}
본 발명은 테트라셀미스 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법에 관한 것이다.
화석에너지의 무절제한 사용으로 인한 환경파괴, 그로 인한 지구온난화 및 에너지원 고갈로 인해서, 대체가능한 친환경에너지로서 바이오에너지의 개발이 주목을 받고 있다. 이러한 바이오에너지 중 바이오디젤은 내연기관인 디젤기관을 이용가능하다는 장점으로 인해서, 친환경 에너지원으로서 각광받고 있는 연료이다. 그러나, 바이오디젤의 주된 원료로서 지방산 글리세롤에스터, 지방산 또는 식물과 동물 유래의 지질이 사용되고 있지만, 상기 지질들은 대부분 식량자원으로도 사용되기 때문에 바이오디젤의 대량 생산이 식량의 부족을 유도하여, 다른 사회, 재배지역 확보와 경제적 문제를 야기할 가능성이 매우 높다. 뿐만 아니라, 식물의 경우, 경작지를 요구하기 때문에, 경제성에 심각한 문제를 유발한다.
따라서, 상기 단점들을 보완할 수 있는 새로운 바이오디젤로서, 새로운 지질자원이 필수적으로 요구된다. 이를 해결할 수 있는 자원으로서, 미세조류는 태양광과 이산화탄소 및 물을 사용하여 광합성을 수행함으로써, 유기물, 특히 지질을 생산하는 능력이 매우 우수하기 때문에, 미래 바이오디젤의 생산원으로 기대되고 있으며, 현재 많은 연구가 진행되고 있다. 게다가 미세조류는 산업적 가치가 높아, 건강보조식품, 수산양식용 사료, 의료 원료물질, 생화학물질 등으로도 그 응용분야가 넓어지고 있다.
미세조류 중 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.)는 20 시간 마다 4 내지 8배로 매우 빠른 성장률을 나타낼 뿐만 아니라, 20% 이상의 높은 지방 함량, 더 나아가 0~30 ℃의 온도 변화에 대해서 강한 내성을 나타내기 때문에 잠재적인 미래 바이오에너지로 각광을 받고 있을 뿐만 아니라, 테트라셀미스 속인 테트라셀미스 수에시카 (Tetraselmis suecica)는 어류, 새우, 조개와 같은 인공양식 산업에서 주로 쓰이는 먹이로서 높은 시장 가치가 있다. 또한, 테트라셀미스 수에시카 (Tetraselmis suecica)를 이용한 피부주름살 감소 및 자외선 차단효능을 가지는 추출물에 관한 특허문헌도 존재한다 (특허문헌 1). 따라서, 산업적으로 이용가치가 매우 높은 테트라셀미스 바이오매스의 대량 생산, 안정적인 균주 배양, 그 수확 및 산업화 공정에 따른 경제적 비용 절감 등의 문제는 그 산업적 파급효과가 지대하다고 할 수 있다.
전술한 바와 같이, 테트라셀미스가 가지는 다방면의 잠재적 가치와 활용도를 생각해 볼 때, 이들의 많은 개체수 확보를 위해서 그 신속대량 증식 기술은 매우 큰 중요도를 갖는다. 현재까지 테트라셀미스를 포함하는 다양한 미세조류를 에너지원으로 사용하기 위해서, 이산화탄소 및 영양 공급, 빛 조건과 pH 최적화 등을 포함하는 물리화학적 조건 최적화를 통한 성장 증진 기술들이 다수 보고된 바 있지만, 상기 기술들은 지속적으로 인위적 환경을 조성해야 하기 때문에 실질적인 바이오매스 생산을 위한 대량배양을 할 때에는 많은 경제적 비용이 발생된다는 문제점이 있었다.
반면에, 현장에서 분리한 박테리아를 이용하여 테트라셀미스의 성장을 증진하는 기술은 보다 친환경적이며, 테트라셀미스와 공생하면서 반영구적인 성장 촉진을 유도할 수 있다는 효과를 갖는다. 관련하여, 생태계에서 미세조류는 박테리아로부터 인, 비타민, 성장 촉진 호르몬 등을 공급받아 성장하고, 박테리아는 죽은 미세조류로부터 탄소를 얻고 다시 건강한 조류의 성장을 촉진시키는 생태적 순환을 한다. 현재까지 박테리아가 미세조류의 성장을 촉진시키는 정확한 메커니즘은 규명이 되어있지 않지만 호르몬과 같은 박테리아만이 가지고 있는 대사산물을 생산하기 때문에, 기존의 물리화학적 증진기술에 추가적인 증진 효과를 불러올 수 있고 그 시너지 효과가 크다고 할 수 있다.
최근 박테리아를 이용한 미세조류 성장 증진 유사 연구로는 미세조류 모델종인 클로렐라 불가리스 (Chlorella vulgaris)를 2배 증진시킬 수 있는 세균 테리모나스 페루기니아 (Terrimonas ferruginea)가 보고된 바 있지만 (비특허문헌 1), 세균과 미세조류의 공생관계는 종마다 특이적이기 때문에 테트라셀미스와 밀접한 공생관계를 갖는 새로운 세균을 검색하는 것은 종래기술이 해결해야 할 중요한 문제이다.
특허문헌 1: 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0044494호 특허문헌 2: 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0006923호 특허문헌 3: 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0019616호
비특허문헌 1: Bioresource Technology 131 (2013) 195-201
이에, 본 발명에서는 미세조류 테트라셀미스의 배양에 있어서 인위적인 물리화학적 조건의 최적화 과정 없이도, 테트라셀미스가 서식하는 생태환경으로부터 분리된 소정 균주를 이용하여 테트라셀미스의 성장 속도 및 증식량을 효과적으로 증가시킬 수 있는 테트라셀미스 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법을 제공하고자 한다.
이에, 본 발명에서는 상기 과제를 해결하기 위해서,
테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주의 배양에서 있어서, 상기 배양을 위한 배지에 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 투여해주는 단계를 포함하는 테트라셀미스의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 펠라지바카 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 테트라셀미스 균주는 미생물 기탁번호 KCTC12432BP 또는 KCTC12236BP의 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 펠라지바카 버뮤덴시스 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13073BP의 균주이고, 상기 스테피아종 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13072BP의 균주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주 배양용 배지 조성물로서, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 포함하는 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 펠라지바카 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은,
테트라셀미스 현장 배양수로부터 단일 세균종들을 분리해내는 단계;
상기 분리된 단일 세균종들을 무균 상태의 테트라셀미스 배양 배지 중에 접종하는 단계; 및
상기 단일 세균종들 중 테트라셀미스의 성장 증진 효과를 나타내는 단일 세균종들을 선별하고 이를 동정하는 단계를 포함하는 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동정 단계는 상기 선별된 세균종들의 16S RNA 염기서열을 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 빠른 성장과 높은 지방산 함량 때문에 잠재적인 미래 바이오에너지로 각광을 받고 있을 뿐만 아니라, 인공양식 산업, 피부미용 조성물 등과 같은 다양한 분야에 활용이 가능하여 산업적 이용가치가 탁월한 테트라셀미스 바이오매스의 대량생산, 안정적 균주 배양 및 경제성 있는 산업적 생산을 가능하게 하는 테트라셀미스 배양방법, 테트라셀미스 배양용 배지 조성물 및 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법을 제공할 수 있다.
도 1a 및 1b는 각각 영흥도로부터의 테트라셀미스 (1a) 및 강화도로부터의 테트라셀미스 (1b)에 대해서 성장 증진 효과를 나타내는 7종 세균들에 대해서, 접종 후 0, 3, 6, 10, 20 및 30일째에 성장 증진 효과를 관찰한 그래프이다.
도 2는 테트라셀미스 성장 증진 효과를 나타낸 4-3번과 17-3번 세균들의 단일 콜로니에 대한 유전학적 계통수 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 3a 및 3b는 다양한 농도의 스테피아종 (도 3a) 및 펠라지바카 버뮤덴시스 (도 3b)와 함께 테트라셀미스를 배양한 경우, 접종 후 0, 3, 6, 10, 20 및 30일째에 테트라셀미스의 성장 증진 효과를 관찰한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 각각 전체 박테리아 종 중에서 펠라지바카 버뮤덴시스 (4a) 및 스테피아종 (4b)이 차지하는 백분율을 달리 해가면서 테트라셀미스의 성장 증진에 미치는 효과를 테스트한 결과를 도시한 그래프이다.
도 5a 및 5b는 테트라셀미스 (KCTC12432BP)와 펠라지바카 버뮤덴시스를 함께 배양한 경우 (5a) 및 스테피아종을 함께 배양한 경우 (5b)에 대한 지질량 분석 결과를 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
세균과 미세조류의 공생관계는 종마다 매우 특이적이기 때문에 테트라셀미스의 성장을 촉진하기 위해서는, 이와 밀접한 공생관계를 갖는 새로운 세균 탐색이 필요하다. 그러나, 수계 내에 테트라셀미스는 매우 다양한 박테리아와 함께 존재하는데, 그 관계는 매우 밀접하고 복잡하여 긍정적인 효과만을 갖는 성장증진 박테리아를 찾아내는 것은 매우 어려운 작업이다.
본 발명에서는, 보다 높은 테트라셀미스의 생물량 수확을 위해서 테트라셀미스 현장 배양수로부터 28종 세균의 단일 종 분리를 성공하였고, 각각의 세균과 무균상태의 테트라셀미스를 공동배양함으로써 그 세포 수 변화를 관찰하였다. 이러한 과정에서 테트라셀미스에 대한 성장증진 효과를 나타내는 2종의 세균을 검색해 내였으며, 이를 농도별 실험에 적용하였다.
관련해서, 현장 분리 세균을 이용해서 테트라셀미스의 성장을 증진시키는 기술은 현재까지 수행된 바가 없다. 더 나아가, 현장에서 분리한 세균을 사용하여 테트라셀미스의 성장증진에 활용할 경우, 분리된 세균은 외래종이 아니기 때문에 추후 현장배양에 적용했을 때 생태적인 교란 가능성이 매우 낮아 환경 친화적이라는 장점도 갖는다. 또한, 세균과 미세조류 간의 종 특이적 관계 때문에, 명확한 기준 없이 외부에서 세균을 도입하는 데에는 어려움이 있으며, 따라서 본 발명에서와 같이, 배양액으로부터의 세균 분리를 통한 선별검사 연구 방법은 매우 중요한 의미를 갖는다.
이에, 본 발명에서는, 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주의 배양에서 있어서, 상기 배양을 위한 배지에 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 투여해주는 단계를 포함하는 테트라셀미스의 배양방법을 제공한다.
하기 실시예에 상세히 설명된 균주 선별 방법을 통해서, 본 발명에서는 대한민국 인천 영흥도 주변 해역 해수 및 강화도 주변 해역 해수로부터 각각 미생물 기탁번호 KCTC12432BP 및 KCTC12236BP를 갖는 테트라셀미스 균주에 대해서 이러한 균주들과 공생관계에 있는 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.) 균주를 선별해 내었다. 상기 선별된 균주들을 미생물 기탁기관인 미생물자원센터 (KCTC)에 기탁하였으며, 그 기탁번호는 각각 KCTC13073BP 및 KCTC13072BP이다.
한편, 본 발명에서는 상기 선별된 균주들을 사용하여 테트라셀미스 배양에 적용할 경우, 그 최적 접종 농도에 관한 실험을 수행하였는 바, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 투여될 경우 최적의 테트라셀미스 성장 증진 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명은 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주 배양용 배지 조성물로서, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 포함하는 배지 조성물을 제공하는 바, 본 발명에 따른 배지 조성물은 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주로서 펠라지바카 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주를, 바람직하게는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명에서는,
테트라셀미스 현장 배양수로부터 단일 세균종들을 분리해내는 단계;
상기 분리된 단일 세균종들을 무균 상태의 테트라셀미스 배양 배지 중에 접종하는 단계; 및
상기 단일 세균종들 중 테트라셀미스의 성장 증진 효과를 나타내는 단일 세균종들을 선별하고 이를 동정하는 단계를 포함하는 테트라셀미스 성장 증진 특성을 나타내는 미생물 균주의 동정 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미생물 균주의 동정 방법에 있어서, 상기 동정 단계는, 진화적으로 매우 안정되어 있어서 종의 진화적 유연관계를 분석하는데 사용되는 16S RNA 염기서열을 분석하고, 그 유전학적 계통수를 분석함으로써 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
테트라셀미스 배양 해수로부터 다양한 세균의 분리
테트라셀미스의 성장을 증진시키는 세균을 분리하기 위해서, 대한민국 인천 영흥도 주변 해역 해수 및 강화도 주변 해역 해수를 채수하였다. 채수된 해수 시료 0.5 mL을 MB (Marine Broth 2216, BD Difco™ Dehydrated Culture Media) 아가 플레이트에 도말한 후, 48 시간 동안 30 ℃ 암조건에서 배양하였다. 그 후, 아가 플레이트에서 단일 콜로니에 대한 분리 및 배양을 반복하였다. 그 결과, 28종의 세균을 순수 분리하는데 성공하였다.
분리된 세균을 이용한 테트라셀미스 증진 세균 선별
순수 분리된 28종의 세균을 각각 무균 상태의 테트라셀미스 (영흥도 주변 해역 테트라셀미스인 KCTC12432BP 및 강화도 주변 해역 테트라셀미스인 KCTC12236BP)에 접종한 후, 테트라셀미스의 성장 변화를 관찰하였다.
이를 위해서, 각 테트라셀미스의 초기 농도를 mL당 2000 세포수로 O3 배지 (NaCl 20.40g, MgSO4·7H2O 5g, MgCl2·6H2O 4.25g, CaCl2·2H2O 1.13g, KNO3 0.76g, KH2PO4 0.05g, NaHCO3 0.03g, 1M Tris buffer 1.90ml, Stock A 0.76ml, Stock B 0.76ml, B12 vitamin 0.38 ml/L)에 접종하였다. 그리고, 세균을 접종하기 위해서, MB 배지에서 4일 동안 30 ℃ 진탕 배양기에서 배양하고, 접종 전 세균 배양 배지를 제거하기 위해서, 원심분리기 3800 g에서 10분간 세포를 내리고 상등액을 제거하였다. 상기 방법으로 3회 세척하고, O3 배지로 순치하여 mL당 106의 밀도가 되도록 테트라셀미스 배양액에 접종하였다. 혼합 배양액의 배양 조건은 25 ℃, 50 μmol/m2s, 12 hr light : 12 hr dark cycle의 배양조건으로 0일, 3일, 6일, 10일, 20일, 30일 마다 광학 현미경 하에서 테트라셀미스의 개체 수 변화를 직접 관찰하였다.
하기 표 1에는 두 가지 테트라셀미스로에 대한 28종 세균에 대한 스크리닝 테스트 결과를 도시하였다. 하기 표 1에서 성장 증진 효과는 +/-로 표시하였으며, 이는 접종 후 10일째에 관찰된 결과들이다.
Figure 112016079355606-pat00001
상기 표 1을 참조하면, 4-3, 16-2, 17-1, 17-3, 18-3, 28 및 39번 세균에서 두 가지 테트라셀미스 모두에 대한 성장 증진 효과가 관찰되었다.
더 나아가, 상기 성장 증진 효과를 나타내는 7종 세균들에 대해서, 접종 후 0, 3, 6, 10, 20 및 30일째에 성장 증진 효과를 관찰하였으며, 그 결과를 도 1a (영흥도로부터의 테트라셀미스) 및 도 1b (강화도로부터의 테트라셀미스)에 도시하였다. 도 1a 및 1b를 참조하면, 4-3번 및 17-3번 세균이 전 배양기간에 걸쳐서 테트라셀미스에 대한 성장 증진 효과를 나타냄을 알 수 있으며, 특히, 17-3번 세균을 접종한 실험구에서는 10 일째에 무균상태인 대조구보다 400% 정도 성장 증진 효과가 관찰되었다. 또한, 30일 후에는 세균이 없었던 테트라셀미스의 세포 농도는 약 mL당 1.5 X 106인 반면, 4-3번 세균과 17-3번 세균 접종구에서의 테트라셀미스 세포 농도가 약 2.5 X 106로 약 170% 증진된 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 상기 결과들을 통해서, 본 실험에서 분리된 세균들 중 2종의 세균이 테트라셀미스의 성장 촉진에 우수한 효과를 나타낸다는 점을 알 수 있었다.
테트라셀미스 증진 세균의 동정
테트라셀미스의 성장을 증진시킨 2종의 세균을 동정하기 위해서, 진화적으로 매우 안정되어 있어서 종의 진화적 유연관계를 분석하는데 사용되는 16S RNA 염기서열을 분석하였으며, 이들의 유전학적 계통수를 분석하였다.
구체적으로는, 4-3번과 17-3번 세균들의 단일 콜로니를 DNeas Plant Mini Kit (퀴아젠, 독일)을 사용하여 DNA를 추출하고, PCR (30 cycles of denaturation at 95˚C for 1 min, annealing at 55 24F/1525R primer) 기법을 사용하여 각 세균의 16S rRNA 염기서열만을 증폭시켰다. 증폭된 DNA의 염기서열에 대해서 플라스미드 DNA 양방향 염기서열 분석을 수행하였고 ((주) 바이오닉), 이들의 진화적 유연관계 분석을 위해서, MEGA 6.0 (Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S (2013)) Neighbor-Joining (Tamura-nei) 방법으로 계통수 분석을 수행하였다.
도 2에는 상기 유전학적 계통수 분석 결과를 도시하였다. 도 2를 참조하면, 4-3번과 17-3번 세균들은 로도박터 (Rhodobacterales)에 속하며, 4-3번 세균은 펠라지바카 버뮤덴시스와 100%의 상동성을 나타내었으며, 17-3번 세균은 100% 상동성을 나타내는 종은 없었지만, 스테피아 속에 속하는 종임을 알 수 있었다.
테트라셀미스 증진 세균 펠라지바카 버뮤덴시스 ( Pelagibaca bermudensis ) 및 스테피아종 ( Stappia sp.)의 최적 접종 농도
테트라셀미스를 가장 효율적으로 증진시키기 위한 펠라지바카 버뮤덴시스 및 스테피아종의 최적 접종밀도를 찾기 위해서, 3가지 다른 조건의 접종밀도 (106, 107, 108 Cells / mL- 1)로 실험을 실시하였다.
무균 처리된 테트라셀미스를 초기 농도로 2000 cells / mL-1로 O3 배지에 접종하였다. 증진 세균은 4일 동안 전술한 바와 동일한 방법으로 세척하고, 1.0 × 106, 107, 108 cells/mL-1 농도로 각각 테트라셀미스 배양액에 접종하였다. 혼합 배양액의 배양 조건은 25 ℃, 50 μmol/m2s, 12hr light : 12hr dark cycle로, 0일, 1일, 3일, 5일, 10일, 20일, 및 30일 마다 광학 현미경 하에서 테트라셀미스의 개체 수 변화를 직접 관찰하였다.
도 3a 및 3b에는 다양한 농도의 스테피아종 (도 3a) 및 펠라지바카 버뮤덴시스 (도 3b)와 함께 테트라셀미스를 배양한 경우, 접종 후 0, 3, 6, 10, 20 및 30일째에 테트라셀미스의 성장 증진 효과를 관찰한 그래프를 도시하였다.
도 3a 및 3b를 참조하면, 두 세균 모두 108 cells/mL-1의 고농도에서는 테트라셀미스에 대한 성장 증진 효과를 그다지 나타내지 않았고, 펠라지바카 버뮤덴시스는 106 cells/mL-1 농도에서, 스테피아종 (Stappia sp.)은 107 cells/mL-1 농도에서 최적의 효과를 나타내었다. 따라서, 두 실험군 모두 106 ~ 107 cells/mL-1 범위에서 가장 높은 성장 증진 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
한편, 전체 박테리아 종 중에서 펠라지바카 버뮤덴시스 및 스테피아종이 차지하는 백분율을 달리 해가면서 테트라셀미스의 성장 증진에 미치는 효과를 테스트하였으며, 그 결과를 도 4a (펠라지바카 버뮤덴시스) 및 4b (스테피아종)에 도시하였다.
도 4a 및 4b를 참조하면, 전체 박테리아 종 중에서 펠라지바카 버뮤덴시스 및 스테피아종이 차지하는 백분율이 높아질수록 테트라셀미스의 성장 증진 효과도 높아진다는 것을 파악할 수 있으며, 이러한 결과로부터, 테트라셀미스의 성장 증진에 가장 결정적인 기여를 하는 박테리아 종들은 펠라지바카 버뮤덴시스 및 스테피아종이라는 사실을 알 수 있다.
총 지질량 분석
전체 박테리아 종 중에서 펠라지바카 버뮤덴시스 및 스테피아종이 차지하는 백분율을 달리 해가면서 테트라셀미스와 함께 배양하였으며, 배양 후 25일 경과 시점에서 테트라셀미스에 의해서 발현된 총 지질량을 분석하였다. 지질량은 건조 중량 1 g 당 발현된 지질의 백분율로서 표시하였다.
도 5a 및 5b에는 테트라셀미스 (KCTC12432BP)와 펠라지바카 버뮤덴시스를 함께 배양한 경우 (5a) 및 스테피아종을 함께 배양한 경우 (5b)에 대한 지질량 분석 결과를 그래프로 도시하였다.
도 5a 및 5b를 참조하면, 도 5a에서 테트라셀미스를 단독배양한 경우가 오히려 펠라지바카 버뮤덴시스와 함께 배양한 경우보다 지질량 백분율이 더 높고, 또한 도 5b의 경우에도 테트라셀미스를 단독배양한 경우가 오히려 95%의 스테피아종과 함께 배양한 경우보다 지질량 백분율이 더 높은 것을 알 수 있다.
이러한 현상에 대해서는 하기와 같은 설명이 가능하다.
즉, 환경적인 조건이 우호적이어서 테트라셀미스의 개체수가 증가하게 되면 지질함량은 적어지게 되는데, 이는 세포들이 신진대사과정에서 대부분의 에너지를 저장하는 것이 아니라 번식에 이용하면서 개체수가 늘어나게 되기 때문이다. 반대로, 환경적인 조건이 우호적이지 않을 때, 특히 가장 잘 알려진 연구로는 질소가 결핍되었을 때에는 세포의 개체수가 거의 증가하지 못하게 되는 바, 실제로 세포 입장에서는 환경이 좋지 않기 때문에 생존을 위해서 번식을 하는 것이 아니라, 최대한 에너지를 세포 내에 축적하기 때문이다. 따라서, 세포의 개체수가 증가하면 지질량은 적어지고, 세포의 개체수가 감소하거나 유지되면 지질량은 상대적으로 증가하게 된다. 이에 따라서, 도 5a 또는 5b에서 단독배양의 경우가 지질량 백분율이 더 높은 것은 예측 가능한 결과라 할 수 있다.
상기 현상을 고려할 때, 본 발명에서 채택하고 있는 공생 박테리아를 이용한 세포 증식방법은 세포의 수를 증가시키기도 하지만, 생산되는 지질량도 다른 물리화학적 기법에 비해 안정적으로 유지할 수 있다는 장점이 있다. 특히, 도 5b를 참조하면, 스테피아종 50%의 경우에는 단독 배양한 테트라셀미스보다 지질량이 증가한 것을 알 수 있으며, 실제 증가된 총 세포수 × 지질량을 계산하게 되면 공생박테리아를 함께 배양했을 때 매우 효율적인 바이오매스의 생산이 가능하다는 사실을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주의 배양에서 있어서, 상기 배양을 위한 배지에 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 투여해주는 단계를 포함하고,
    상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 펠라지바카 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주이며,
    상기 펠라지바카 버뮤덴시스 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13073BP의 균주이고, 상기 스테피아종 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13072BP의 균주이며,
    상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 투여되는 것을 특징으로 하는 테트라셀미스의 배양방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 테트라셀미스 균주는 미생물 기탁번호 KCTC12432BP 또는 KCTC12236BP의 균주인 것을 특징으로 하는 테트라셀미스의 배양방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 테트라셀미스 (Tetraselmis sp.) 균주 배양용 배지 조성물로서, 상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주를 포함하고,
    상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 펠라지바카 버뮤덴시스 (Pelagibaca bermudensis) 및 스테피아종 (Stappia sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 균주이며,
    상기 펠라지바카 버뮤덴시스 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13073BP의 균주이고, 상기 스테피아종 균주는 미생물 기탁번호 KCTC13072BP의 균주이며,
    상기 테트라셀미스 균주와 공생관계에 있는 균주는 106 ~ 107 cells/mL-1의 농도 범위로 상기 배지 중에 포함되는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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