WO2022080234A1 - ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法 - Google Patents

ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法 Download PDF

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WO2022080234A1
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garderia
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algae belonging
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PCT/JP2021/037195
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夢 國分
広顕 山崎
進也 宮城島
俊亮 廣岡
崇之 藤原
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Dic株式会社
大学共同利用機関法人情報・システム研究機構
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying the genome of algae belonging to the genus Garderia. It also contains a method for producing algae belonging to the genus Garderia with a genome modification, a method for producing a desired substance using the algae belonging to the genus Garderia with a genome modification produced by the production method, and the desired substance. Regarding the manufacturing method of food. It also relates to algae belonging to the genus Garderia, which have a requirement for nutritional components. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2020-172163 filed in Japan on October 12, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • microalgae Since microalgae have a high carbon dioxide fixation capacity compared to land plants, and because their habitat does not compete with agricultural products, some species are mass-cultured to feed, functional foods, and cosmetic materials. It is used industrially as such. When microalgae are used industrially, it is desirable that they are microalgaes that can be mass-cultured outdoors from the viewpoint of cost. However, in order to be a microalgae that can be mass-cultured outdoors, it must be resistant to environmental changes (light, temperature, etc.), can be cultivated under conditions where other organisms cannot survive, and can grow to high densities. Conditions such as that are required.
  • the genus Galdia is a unicellular red alga that preferentially grows in sulfuric acid-acidic hot springs.
  • the genus Garderia is characterized in that it can be cultivated in an environment where other organisms such as high salt concentration, high temperature, and low pH are difficult to grow. Therefore, it is considered to be suitable for industrial use. Further, if a desired trait can be imparted to a unicellular red alga by a gene modification technique or the like, a cell line more suitable for industrial use can be produced. Furthermore, in addition to the ability to grow by photosynthesis, the genus Garderia also has the ability to assimilate various organic substances and grow heterotrophically. Therefore, it can be efficiently propagated even in a dark place.
  • the genus Garderia belongs to the Cyanidiophyceae class.
  • Cyanidioschyzon genus the entire genome sequence has been decoded in Cyanidioschyzon merolae, which belongs to the genus Cyanidioschyzon, and the development of gene modification technology is underway (non-patent). Documents 1 and 2).
  • the genus Garderia is considered to be a promising alga for industrial use because it can grow in an environment where it is difficult for other organisms to grow and high-density culture is possible.
  • a transformation method capable of stably expressing a foreign gene has not been established. Therefore, it is difficult to produce the genus Garderia having a desired trait, which is a barrier to industrial use.
  • a method for modifying the genome of an alga belonging to the genus Garderia which comprises a step of modifying the genome of a haploid of the alga belonging to the genus Gardenia.
  • [4] The method for modifying the genome of algae belonging to the genus Garderia according to [3], wherein the genome editing system is selected from the group consisting of CRISPR / Cas, ZNF, and TALEN.
  • the genomic modification is at least one genomic modification selected from the group consisting of the following (a) to (c). Genome modification methods for algae belonging to: (a) genome modification to produce a desired substance; (b) genome modification to improve the production amount of the desired substance; and (c) genome modification to promote or reduce cell proliferation.
  • Production method. [7] The method for producing algae belonging to the genome-modified genus Garderia according to [6], further comprising a step (B) of diploidizing the algae after the step (A).
  • a method for producing a desired substance which comprises a step of recovering the desired substance.
  • a method for producing a desired substance including a step of recovering the substance of the substance.
  • a method for modifying the genome of algae belonging to the genus Garderia which can stably impart a desired trait to the algae belonging to the genus Garderia. It also contains a method for producing algae belonging to the genus Galderia whose genome has been modified using the genome modification method, a method for producing a desired substance using the algae belonging to the genus Garderia whose genome has been modified, and the desired substance.
  • a method for producing food is provided. Further provided are algae belonging to the genus Garderia, which have a nutritional requirement and can be used for genome modification.
  • Micrographs of monoploids and diploids of algae belonging to the genus Garderia are shown.
  • the results of culturing a haploid of Galdia partita NBRC102759 (hereinafter, also referred to as “Garderia (polyploid)”) using MA medium adjusted to pH 0.1 to 2.0 are shown.
  • the target sequence of gRNA used for the preparation of the uracil demanding strain is shown.
  • the construct of the plasmid for genome editing used for the preparation of the uracil-requiring strain is shown.
  • the construct of the plasmid for genome editing before the insertion of the target sequence is shown.
  • the primer sequence of the primer designed for inserting the target sequence by the In-Fusion reaction and the design position of the primer are shown.
  • the results of evaluation of the susceptibility of adaptia (polyploid) to Blasticidin S (BS) are shown.
  • the construct of the donor DNA used for the preparation of the BS resistant strain is shown.
  • the NS1 region, which is a neutral site of Galdia partita NBRC102759, and the base sequences of 200 bp upstream and downstream thereof are shown.
  • the result of confirming the BS resistance of the transformant (BSD) prepared by introducing the donor DNA containing the BSD marker set into adaptia (diploid) is shown.
  • WT indicates untransformed gardenia (diploid).
  • the result of confirming the BS resistance of the transformant (BSD) prepared by introducing the donor DNA containing the BSD marker set into adaptia is shown.
  • WT indicates untransformed gardenia (polyploid).
  • the results of PCR amplification of the target region in a transformant (BSD) of Garderia (polyploid) in which BS resistance was confirmed are shown.
  • WT indicates untransformed gardenia (polyploid).
  • the construct of the donor DNA used for the preparation of the mVenus expression strain is shown.
  • FIG. 3 shows a fluorescence microscope image of a transformant (TF) prepared by introducing donor DNA containing the mVenus gene set into adaptia (polyploid).
  • DIC is a differential interference microscope image
  • Chl is a fluorescence microscope image in which autofluorescence of chlorophyll is detected
  • mVenus is a fluorescence microscope image in which mVenus fluorescence is detected
  • merged is a merged image of Chl and mVenus fluorescence microscope images.
  • the proteins, peptides, polynucleotides, vectors, and cells described herein can be isolated.
  • isolated means the native state or the state separated from other components. What is “isolated” can be substantially free of other components. "Substantially free of other components” means that the content of other components contained in the isolated component is negligible.
  • the content of other components contained in the isolated component is, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0. It can be 5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • the proteins, peptides, polynucleotides, vectors, and cells described herein are isolated proteins, isolated peptides, isolated polynucleotides, isolated vectors, and isolated cells. Can be a cell.
  • the first aspect of the present invention is a method for modifying the genome of algae belonging to the genus Garderia, which comprises a step of modifying the genome (genome modification step) of a primal algae belonging to the genus Garderia.
  • the algae belonging to the genus Garderia are algae belonging to the genus Cyanidiophyceae, the genus Cyanidiophyceae, and the genus Cyanidiophyceae.
  • Examples of algae belonging to the genus Garderia include G.I. Partita, G.M. sulphuraria, G.M. phlegrea, G.M. daedala, G.M. Examples include, but are not limited to, maxima and the like.
  • the algae belonging to the genus Garderia are unicellular red algae that preferentially grow in sulfuric acid acidic hot springs, and can preferably grow under conditions of high salt concentration, high temperature, and low pH.
  • Examples of the algae strain of the genus Garderia include G.I. Partita NBRC102759, G.M. sulphuraria CCCryo127-00, G.M. sulphuraria 074W, G.M. sulphuraria MS1, G.M. sulphuraria RT22, G.M. sulphuraria SAG21, G.M. sulphuraria SAG21, G.M. sulphuraria Azora, G.M. sulphuraria YNP, G.M. sulphuraria 5571, G.M. sulphuraria 002, G.M. phlegrea DBV009, G.M. Examples include, but are not limited to, phlegrea Soos, those shown in FIG. 10 of International Publication No. 2019/107385, and mutants thereof.
  • genome modification is performed on a haploid alga belonging to the genus Garderia.
  • the genus Garderia has diploid and ploid cell morphology.
  • FIG. 1 shows micrographs of haploids and diploids of the genus Garderia.
  • the haploid has an irregular or spherical cell morphology and does not have a strong cell wall.
  • the diploid has a spherical cell morphology and has a strong cell wall. Diploid cells form 4-32 endoplasmic spores during cell division, but the method of cell division of diploid cells is not yet known.
  • Whether the algae belonging to the genus Garderia are haploid or diploid can be determined by confirming the number of copies of the same locus. That is, if the number of copies of the same locus is 1, it is determined to be haploid.
  • a next-generation sequencer can also be used to determine that it is haploid. For example, sequence reads of the entire genome are acquired by a next-generation sequencer, the sequence reads are assembled, and then the sequence reads are mapped to the sequence obtained by assembling. In diploidy, differences in bases for each allele can be found in various regions on the genome, but in diploidy, only one allele exists, so such regions cannot be found.
  • the cell is homodiploid, it can be determined whether it is monoploid or diploid by measuring the DNA content of the cell. The DNA content of haploid cells is 1 ⁇ 2 of the DNA content of diploid cells.
  • the haploid does not have a strong cell wall and the diploid has a strong cell wall, it is possible to distinguish between a haploid cell and a diploid cell by observing the cell morphology. For example, in haploid cells, the cell wall is usually not observed when observed with an optical microscope (for example, at a magnification of 600 times). Therefore, if the cell wall is not observed by an optical microscope, it can be determined that the cell is a haploid cell. Since haploid cells do not have a strong cell wall, they can be destroyed by relatively mild treatment (neutralization treatment, hypotonic treatment, freeze-thaw treatment, surfactant treatment, etc.).
  • the cells are suspended in a medium containing 2% by mass of the detergent and the cells are disintegrated within 5 minutes after the addition of the detergent, it is determined that the cells are haploid.
  • the surfactant include sodium dodecyl sulfate. More specifically, sodium dodecyl sulfate is added to the cell suspension of algae belonging to the genus Garderia so as to be 2% by mass, and if the cells are disrupted within 5 minutes after the addition, the polyploid is used. It can be determined that there is. Whether or not the cells have collapsed can be confirmed by observing the cells with an optical microscope.
  • haploid cells When algae belonging to the genus Garderia are cultured in a solid medium, it is also possible to determine whether the cells are haploid cells based on the shape of the colonies. Since haploid cells do not have a strong cell wall, they are flatter and have a shape that spreads on the surface of a solid medium as compared with a colony of diploid cells. When a colony having such a shape appears on a solid medium, it can be determined to be a haploid colony.
  • the diploid of the algae belonging to the genus Garderia can be obtained by culturing the diploid of the algae belonging to the genus Garderia until the quiescent phase, and continuing the culturing in the quiescent phase for an arbitrary period.
  • Examples of the period for culturing in the stationary period include half a day or more, one day or more, two days or more, three days or more, five days or more, and the like.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited, and examples thereof include 60 days or less, 40 days or less, 30 days or less, 20 days or less, or 10 days or less.
  • cells may be recovered from the culture solution in the stationary phase, subcultured, and further cultured for about 1 to 5 days.
  • a diploid of algae belonging to the genus Garderia can be obtained by culturing a diploid of algae belonging to the genus Garderia in a medium containing an osmoregulator of 80 mM or more.
  • concentration of the osmotic pressure adjusting agent is preferably 100 mM or more, more preferably 150 mM or more, further preferably 200 mM or more, and even more preferably 300 mM or more, 350 mM or more, or 400 mM or more.
  • the upper limit concentration of the osmotic pressure adjusting agent is not particularly limited and may be a limit value that can be dissolved in the medium.
  • the upper limit concentration of the osmotic pressure regulator is, for example, 2M or less, 1.5M or less, 1.4M or less, 1.3M or less, 1.2M or less, 1.1M or less, or 1M. It can be as follows.
  • a diploid of algae belonging to the genus Garderia can be obtained by culturing a diploid of algae belonging to the genus Garderia in a medium having an osmotic pressure of 150 mOsm / kg or more.
  • the osmotic pressure is preferably 200 mOsm / kg or more, more preferably 250 mOsm / kg or more, further preferably 300 mOsm / kg or more, still more preferably 350 mOsm / kg or more, or even more preferably 400 mOsm / kg or more.
  • the upper limit of the osmotic pressure is not particularly limited, and may be a limit value at which the osmotic pressure adjusting agent can be dissolved in the medium. From the viewpoint of cell proliferation rate, the upper limit of osmotic pressure can be, for example, 2000 mOsm / kg or less, 1500 mOsm / kg or less, or 1400 mOsm / kg or less.
  • the osmotic pressure adjusting agent is not particularly limited as long as it is a chemical substance whose osmotic pressure can be adjusted by adding it to the medium.
  • examples of the osmotic pressure adjusting agent include sugars (glucose, sucrose, etc.), sugar alcohols (mannitol, sorbitol, etc.), amino acids (glycine, proline, arginine, etc.), metal salts (alkali metal salts, alkaline earth metal salts), and the like. Examples include urea, protein, betaine, inositol, and polysaccharides.
  • the medium used for culturing algae belonging to the genus Garderia is not particularly limited, and a known medium for culturing microalgae can be used.
  • the medium is not particularly limited, and examples thereof include an inorganic salt medium containing a nitrogen source, a phosphorus source, trace elements (zinc, boron, cobalt, copper, manganese, molybdenum, iron, etc.) and the like.
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, nitrites and the like
  • examples of the phosphorus source include phosphates and the like. Examples of such a medium include Gross medium, 2 ⁇ Allen medium (Allen MB. Arch. Microbiol.
  • M-Alllen medium Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.
  • MA2 medium Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan; 49 (1): 117-20.
  • Modified M-Alllen medium etc., but are not limited thereto.
  • Algae belonging to the genus Garderia may be autotrophically cultured under light irradiation, or may be heterotrophically cultured in the dark.
  • a carbon source (glucose or the like) may be added to the above-mentioned inorganic salt medium.
  • the culture conditions are not particularly limited, and the conditions normally used for culturing algae belonging to the genus Garderia can be used.
  • Examples of the pH condition include pH 0.25 to 8.0, preferably pH 0.5 to 6.0, more preferably pH 0.5 to 4.0, further preferably pH 0.5 to 3.0, and pH 0. 5 to 2.0 is particularly preferable.
  • Examples of the temperature condition include 15 to 50 ° C, preferably 30 to 50 ° C, and more preferably 35 to 50 ° C.
  • the light intensity includes 5 to 2000 ⁇ mol / m2s, preferably 5 to 1500 ⁇ mol / m2s. It may be cultured with continuous light, or a light-dark cycle (10L: 14D, etc.) may be provided. When culturing heterotrophically, it can also be cultivated in a dark place.
  • Algae belonging to the genus Garderia may be cultivated in a liquid medium or a solid medium.
  • haploid cells appearing in the culture medium can be collected while observing under a microscope. Since haploid cells do not have a strong cell wall, cells in which no cell wall is observed may be collected.
  • monosomatic cells can be obtained by collecting colonies of cells characteristic of monosomatic cells (for example, colonies that are flat and have a shape that spreads on the surface of the solid medium). ..
  • Genome modification means inducing a mutation at an arbitrary position on the genome.
  • the genome modification method is not particularly limited, and any modification method can be used. Genome modification may be performed sequence-specifically or non-sequence-specifically for the genomic DNA sequence.
  • sequence-specific genome modification method include a method using a genome editing system containing a sequence-specific endonuclease, a homologous recombination method, and the like.
  • sequence non-specific genome modification method include introduction of DNA fragments by microinjection method, particle gun method, transposon method, etc .; induction of mutation by ultraviolet irradiation, irradiation, chemical treatment with nitrite, etc. ..
  • the genome modification method according to this embodiment is preferably a sequence-specific genome modification method. By performing sequence-specific genome modification, a variant having the desired properties can be rapidly obtained.
  • the "genome editing system containing a sequence-specific endonuclease” means a system capable of sequence-specific cleavage of genomic DNA by a sequence-specific endonuclease and inducing mutation in the cleavage region.
  • Genomic DNA cleaved by a sequence-specific endonuclease is subsequently endogenous to the cell, such as homologous directed repair (HDR) or non-homologous end-joining repair (NHEJ).
  • HDR homologous directed repair
  • NHEJ non-homologous end-joining repair
  • HDR is a repair mechanism using donor DNA, and it is also possible to introduce a desired mutation into a target region.
  • a targeting vector used in the homologous recombination method described later can be used.
  • a sequence-specific endonuclease is an enzyme that can cleave a nucleic acid with a predetermined sequence.
  • the sequence-specific endonuclease is preferably a sequence-specific endodeoxyribonuclease capable of cleaving double-stranded DNA at a predetermined sequence.
  • the sequence-specific endonuclease is not particularly limited, and examples thereof include, but are not limited to, zinc finger nucleases (Zinc finger nucleoses (ZFNs)), TALENs (Transaction activator-like effector nucleoses), and Cas proteins. .. In the present specification, the genome editing system containing these sequence-specific endonucleases is described as ZFN, TALEN, and CRISPR (Crustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) / Cas, respectively.
  • ZFN means a genome editing system using an artificial nuclease containing a nucleic acid cleavage domain conjugated to a binding domain containing a zinc finger array.
  • cleavage domain of ZFN include the cleavage domain of the type II restriction enzyme FokI.
  • FokI restriction enzyme
  • TALEN means a genome editing system using an artificial nuclease containing a DNA binding domain of a transcriptional activator-like (TAL) effector in addition to a DNA cleavage domain (eg, FokI domain).
  • TAL transcriptional activator-like
  • the design of the TALE construct capable of cleaving the target sequence can be performed by a known method (for example, Zhang, Feng et. Al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)).
  • CRISPR / Cas means a genome editing system using Cas protein and guide RNA.
  • Cas protein is a general term for sequence-specific endonucleases used for genome editing by the CRISPR / Cas system, and refers to CRISPR-associated proteins.
  • the Cas protein preferably forms a complex with a guide RNA and exhibits endonuclease activity or nickase activity.
  • the Cas protein is not particularly limited, and examples thereof include Cas9 protein, Cpf1 protein, C2c1 protein, C2c2 protein, and C2c3 protein.
  • the Cas protein is not particularly limited as long as it exhibits endonuclease activity or nickase activity in cooperation with the guide RNA.
  • Cas protein includes wild-type Cas protein and its homologs (paralogs and orthologs), as well as variants thereof.
  • the Cas protein is preferably involved in a class 2 CRISPR / Cas system, more preferably a type II CRISPR / Cas system.
  • Preferred examples of Cas protein include Cas9 protein.
  • the Cas9 protein is a Cas protein involved in the type II CRISPR / Cas system, which forms a complex with a guide RNA and exhibits an activity of cleaving DNA in a target region in cooperation with the guide RNA.
  • the Cas9 protein is not particularly limited as long as it has the above-mentioned activity.
  • Cas9 protein includes wild-type Cas9 protein and its homologs (paralogs and orthologs), as well as variants thereof.
  • the wild-type Cas9 protein has a RuvC domain and an HNH domain as nuclease domains, but the Cas9 protein herein may be one in which either the RuvC domain or the HNH domain is inactivated.
  • the species from which the Cas9 protein is derived is not particularly limited, but bacteria belonging to the genus Streptococcus, Staphylococcus, Neisseria, Treponema and the like are preferably exemplified. More specifically, S. pyogenes, S. streptococcus. thermophilus, S.A. aureus, N. et al. Meningitidis, or T.I. Cas9 protein derived from dentalcola and the like is preferably exemplified. A preferred example of the Cas9 protein is S. cerevisiae. Cas9 protein derived from pyogenes can be mentioned.
  • Guide RNA means RNA that can form a complex with Cas protein and induce Cas protein to a target region.
  • Guide RNAs include, for example, CRISPR RNA (crRNA) and transactivated CRISPR RNA (tracrRNA).
  • the crRNA is involved in binding to a target region on the genome, and the tracrRNA is involved in binding to the Cas protein.
  • the crRNA comprises a spacer sequence and a repeat sequence, in which the spacer sequence binds to the complementary strand of the target sequence in the target region.
  • the tracrRNA comprises an anti-repeat sequence and a 3'tail sequence.
  • the anti-repeat sequence has a sequence complementary to the repeat sequence of crRNA and forms a base pair with the repeat sequence, and the 3'tail sequence usually forms three stem loops.
  • the guide RNA may be a single guide RNA (sgRNA) in which the 3'end of the crRNA is linked to the 5'end of the tracrRNA, and the crRNA and the tracrRNA are separate RNA molecules, and base pairs are used in repeat sequences and anti-repeat sequences. May be formed.
  • sgRNA single guide RNA
  • the repeat sequence of crRNA and the sequence of tracrRNA can be appropriately selected according to the type of Cas protein, and those derived from the same bacterial species as Cas protein can be used.
  • the length of sgRNA can be about 50 to 220 nucleotides (nt), preferably about 60 to 180 nt, and more preferably about 80 to 120 nt.
  • the length of crRNA can be about 25 to 70 bases including the spacer sequence, and is preferably about 25 to 50 nt.
  • the length of the tracrRNA can be about 10 to 130 nt, preferably about 30 to 80 nt.
  • the repeat sequence of crRNA may be the same as that in the bacterial species from which the Cas protein is derived, or may be the one in which a part of the 3'end is deleted.
  • the tracrRNA may have the same sequence as the mature tracrRNA in the bacterial species from which the Cas protein is derived, or may be a terminal-cleaving type in which the 5'end and / or the 3'end of the mature tracrRNA is cleaved.
  • the tracrRNA can be a terminal-cleaving type in which about 1 to 40 nucleotide residues are removed from the 3'end of the mature tracrRNA.
  • the tracrRNA can be a terminal-cleaving type in which about 1 to 80 nucleotide residues are removed from the 5'end of the mature tracrRNA. Further, the tracrRNA can be, for example, a terminal-cleaving type in which about 1 to 20 nucleotide residues are removed from the 5'end and about 1 to 40 nucleotide residues are removed from the 3'end.
  • Various crRNA repeat sequences and tracrRNA sequences for sgRNA design have been proposed, and those skilled in the art can design sgRNAs based on known techniques (eg, Jinek et al. (2012) Science, 337, 337, 816-21; Mali et al.
  • PAM Proto-spacer Adjacent Motif
  • the sequence and position of PAM depends on the type of Cas protein. For example, in the case of Cas9 protein, the PAM needs to be adjacent immediately after the 3'side of the target sequence.
  • the sequence of PAM corresponding to the Cas9 protein depends on the bacterial species from which the Cas9 protein is derived. For example, S.
  • the PAM corresponding to the Cas9 protein of pyogenes is "NGG” and S. streptococcus.
  • the PAM corresponding to the Cas9 protein of thermophilus is "NNAGAA", and S.I.
  • the PAM corresponding to the Cas9 protein of aureus is "NNGRRT” or “NNGRR (N)".
  • the PAM corresponding to the Cas9 protein of meningitidis is "NNNNGATT", which is T.I. It is "NAAAAC” corresponding to the Cas9 protein of detentola ("R” is A or G; “N” is A, T, G or C).
  • the target sequence targeted for cleavage by the Cas protein can be designed using a known method.
  • the PAM can be searched in the target region, and the sequence adjacent to the 5'side of the PAM can be used as the target sequence.
  • the target sequence For example, G.
  • the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33 can be used as the target sequence.
  • amino acid sequence information and gene sequence information of the above sequence-specific endonuclease can be obtained from various databases such as GenBank, UniProt, and DDBJ.
  • sequence-specific endonuclease may be introduced into cells as a protein or may be introduced into cells as a polynucleotide encoding a sequence-specific endonuclease.
  • a sequence-specific endonuclease mRNA may be introduced into a cell, or a sequence-specific endonuclease expression vector may be introduced into a cell.
  • the "expression vector” refers to a vector containing a target polynucleotide, which is provided with a system for making the target polynucleotide expressible in the cell into which the vector has been introduced.
  • the "expressible state” means that the polynucleotide is in a state in which it can be transcribed in the cell into which the polynucleotide has been introduced.
  • sequence-specific endonuclease sequence-specific endonuclease gene
  • “Functionally linked” means that the first base sequence is located sufficiently close to the second base sequence and the first base sequence is the second base sequence or a region under the control of the second base sequence. Means that it can affect.
  • functionally ligating a polynucleotide to a promoter means that the polynucleotide is ligated to be expressed under the control of the promoter.
  • the promoter is not particularly limited, and for example, various pol II promoters can be used.
  • the pol II promoter is not particularly limited, and examples thereof include a CMV promoter, an EF1 promoter, an SV40 promoter, an MSCV promoter, an hTERT promoter, a ⁇ -actin promoter, a CAG promoter, and a CBh promoter.
  • the promoter of the sequence-specific endonuclease the EF1 promoter of algae belonging to the genus Garderia can be used.
  • Examples of the EF1 promoter for algae belonging to the genus Garderia include G.I. Partita's EF1 ⁇ promoter (SEQ ID NO: 18) can be mentioned.
  • the expression vector a known one can be used without particular limitation.
  • the expression vector include a plasmid vector, a viral vector, a linear DNA fragment and the like.
  • the sequence-specific endonuclease is a Cas protein
  • the expression vector may contain a guide RNA coding sequence (guide RNA gene) in addition to the Cas protein coding sequence (Cas protein gene).
  • the guide RNA coding sequence (guide RNA gene) is preferably functionalized by the pol III promoter.
  • the pol III promoter include U6-snRNA promoters of algae belonging to the genus Garderia, H1-RNase P RNA promoters, valine-tRNA promoters and the like.
  • the U6-snRNA promoter of algae belonging to the genus Garderia include G.I. Partita's U6 promoter (SEQ ID NO: 16) can be mentioned.
  • the homologous recombination method is a genome modification method utilizing a phenomenon in which recombination occurs between two DNA double strands having a homologous sequence.
  • a targeting vector can be used, and the targeting vector usually contains a sequence homologous to a region adjacent to a target region of interest for genomic modification.
  • the targeting vector can include a 5'homology arm adjacent to the 5'side of the target region and a 3'homology arm adjacent to the 3'side of the target region.
  • the targeting vector can include between the 5'homology arm and the 3'homology arm any sequence intended to be introduced into the target region (hereinafter referred to as "introduction sequence").
  • the sizes of the 5'homology arm and the 3'homology arm are not particularly limited as long as they are large enough to cause homologous recombination with genomic DNA.
  • the 5'homology arm and the 3'homology arm can be, for example, about 500 to 3000 bp.
  • the targeting vector for example, a plasmid vector, a linear DNA fragment, or the like can be used.
  • the introduction sequence is not particularly limited and can be any sequence.
  • Examples of the introduction sequence include (A) a sequence involved in the production of a desired substance, (B) a sequence involved in improving the production amount of the desired substance, (C) a sequence involved in cell proliferation, and the like. ..
  • the desired substances in the above (A) and (B) include, for example, various physiologically active substances such as various nutritional components (amino acids, vitamins, proteins, fatty acids, dietary fiber, etc.), enzymes, hormones, active ingredients of pharmaceutical products, and the like. , Hydrocarbons and the like, but are not limited thereto.
  • sequences related to the production of a desired substance include gene sequences of proteins involved in the synthesis of a desired substance.
  • proteins involved in the synthesis of a desired substance include, but are limited to, a synthase of a desired substance, a synthase of a precursor of a desired substance, a degrading enzyme of a substance that inhibits the synthesis of a desired substance, and the like. Not done.
  • sequences involved in improving the production amount of a desired substance include gene sequences of proteins involved in improving the production amount of a desired substance.
  • the proteins involved in improving the production of the desired substance include proteins involved in improving the expression of the synthase of the desired substance and synthase of the precursor of the desired substance. Examples include, but are not limited to, proteins involved in improving the expression of a desired substance, proteins involved in suppressing the expression of a degrading enzyme of a desired substance, and proteins involved in suppressing the expression of a degrading enzyme of a precursor of a desired substance.
  • Examples of the protein involved in improving the expression of the synthase of a desired substance include, but are not limited to, a protein that inhibits the binding of a transcriptional repressor to the promoter of the synthase gene, a transcriptional promoter of the synthase, and the like. ..
  • Examples of the protein involved in improving the expression of the precursor synthase of a desired substance include a protein that inhibits the binding of a transcriptional repressor to the promoter of the precursor synthase gene, a transcription promoting factor of the precursor synthase, and the like. However, it is not limited to these.
  • Examples of the protein involved in suppressing the expression of the degrading enzyme of a desired substance include, but are not limited to, a transcription inhibitor of the degrading enzyme, a protein that inhibits the binding of the transcription promoting factor to the promoter of the degrading enzyme gene, and the like. ..
  • Examples of proteins involved in suppressing the expression of a precursor-degrading enzyme of a desired substance include a transcription-suppressing factor of the precursor-degrading enzyme, a protein that inhibits the binding of a transcription-promoting factor to the promoter of the precursor-degrading enzyme gene, and the like. However, it is not limited to these.
  • the sequence involved in improving the production of the desired substance may be a highly expressed promoter sequence functionally linked to the endogenous synthase gene of the desired substance or the endogenous synthase gene of the precursor of the desired substance. good.
  • the sequence involved in improving the production of the desired substance may be a low expression promoter sequence that functionally links to the endogenous degrading enzyme gene of the desired substance or the endogenous degrading enzyme gene of the precursor of the desired substance. good.
  • sequences involved in cell proliferation include gene sequences of proteins that control cell division.
  • the protein may be a protein that promotes cell proliferation or a protein that suppresses cell proliferation.
  • the introduction sequence may contain, in addition to the gene sequence, a sequence that controls the expression of the gene sequence.
  • the expression control sequence include, but are not limited to, promoters, enhancers, polyA addition signals, terminators, and the like.
  • the gene sequence is preferably functionally linked to any promoter.
  • the promoter is not particularly limited as long as it can function in the cells of algae belonging to the genus Garderia.
  • the promoter may be a promoter of the gene or a promoter of another gene. Examples of promoters of other genes include, but are not limited to, promoters of APCC, promoters of CPCC, promoters of Catalase, and the like.
  • the promoter may be a promoter of an alga belonging to the genus Garderia, or may be a promoter of a gene of another organism (for example, another alga). Suitable promoters include, for example, G.I. Examples include, but are not limited to, the Partita EF1 ⁇ promoter (SEQ ID NO: 18), the Catalase promoter (SEQ ID NO: 19), and the like. It is preferable that an arbitrary terminator is linked to the 3'end of the gene sequence. The terminator is not particularly limited as long as it can function in the cells of algae belonging to the genus Garderia. The terminator may be the terminator of the gene, or may be the terminator of another gene.
  • Examples of the terminator of other genes include a ⁇ -tubulin terminator, a ubiquitin terminator, and the like, in addition to the gene terminator exemplified as the above promoter.
  • Suitable terminators include, for example, G.I. Examples thereof include, but are not limited to, a partita ubiquitin terminator (SEQ ID NO: 20) and a ⁇ -tubulin terminator (SEQ ID NO: 21).
  • the introduction sequence may contain a selectable marker gene in addition to the gene sequence of any protein.
  • the selectable marker include an antibiotic resistance gene, a gene related to auxotrophy, a fluorescent protein gene, and the like.
  • antibiotic resistance gene include a resistance gene to an antibiotic to which algae belonging to the genus Garderia are susceptible.
  • Blasticidin S resistance gene for example, Blasticidin S deaminase (BSD) gene; SEQ ID NO: 25
  • BSD Blasticidin S deaminase
  • chloramphenicol resistance gene and the like.
  • the gene related to auxotrophy include the URA5.3 gene and the like.
  • the fluorescent protein gene examples include the mVenus gene (SEQ ID NO: 27), the GFP gene, the mCherry gene and the like. These selectable marker genes may also have expression control sequences such as promoters, enhancers, polyA addition signals, and terminators.
  • the selectable marker gene is preferably functionally linked to a promoter that functions in algae belonging to the genus Garderia. Examples of the promoter and terminator include the same as above.
  • the protein coding sequence may be codon-optimized based on the codon usage frequency of algae belonging to the genus Garderia. By codon optimization, the translation efficiency of the protein coding sequence can be improved.
  • the region targeted for genome modification can be appropriately set according to the purpose of genome modification.
  • the target region can be set within the coding region of the particular gene or in the promoter region of the particular gene.
  • the purpose of genome modification is to introduce a gene of an arbitrary protein, it is preferable to set the target region to a region other than the gene endogenously present in the genome and the peripheral region thereof.
  • the target area can be set to, for example, a safe harbor area (neutral area).
  • Safe harbor region (neutral region) means a genomic region that has been demonstrated to be capable of inserting foreign DNA without exerting any detrimental effects on cells.
  • Examples of the safe harbor region of algae belonging to the genus Garderia include a region consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 (NS1 region) and the like.
  • the 5'homology arm may include, for example, part or all of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29.
  • the 3'homology arm may include, for example, part or all of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 30.
  • the purpose of the genome modification is not particularly limited, and examples thereof include any of the following genome modifications (a) to (c).
  • Genome modification to produce a desired substance can be performed, for example, using a targeting vector containing the sequence involved in the production of the desired substance (A).
  • Genome modification may be performed by a genome editing system containing a sequence-specific endonuclease, or by a homologous recombination method.
  • the target region is preferably set in a genomic region other than the endogenous gene and its peripheral region, and more preferably set in a safe harbor region.
  • Genome modification to improve the production amount of the desired substance is, for example, a targeting vector containing the sequence involved in the improvement of the production amount of the desired substance (B). Can be done using. Genome modification may be performed by a genome editing system containing a sequence-specific endonuclease, or by a homologous recombination method.
  • the target region is preferably set in a genomic region other than the endogenous gene and its peripheral region, and more preferably set in a safe harbor region.
  • a genomic modification that improves the production of a desired substance may be a genomic modification that changes the endogenous promoter of the endogenous synthase gene of the desired substance or its precursor or its endogenous expression-promoting factor to a highly expressed promoter. good.
  • the target region can be set within the endogenous promoter region of the endogenous synthase gene.
  • a genomic modification that improves the production of a desired substance may be a genomic modification that changes the endogenous promoter of the endogenous degrading enzyme gene of the desired substance or its precursor or its endogenous expression-promoting factor to a low-expression promoter. good.
  • the target region can be set within the endogenous promoter region of the endogenous degrading enzyme gene.
  • the genomic modification that improves the production of the desired substance may be a genomic modification that disrupts the endogenous degrading enzyme gene of the desired substance or its precursor or an endogenous expression-promoting factor thereof.
  • the target region can be set in the coding region of the endogenous degrading enzyme gene or in the endogenous promoter region thereof.
  • Genome modification that promotes or decreases cell proliferation can be performed using, for example, a targeting vector containing the sequence involved in (C) cell proliferation.
  • Genome modification may be performed by a genome editing system containing a sequence-specific endonuclease, or by a homologous recombination method.
  • the target region is preferably set in a genomic region other than the endogenous gene and its peripheral region, and more preferably set in a safe harbor region.
  • Genome modification that promotes or reduces cell proliferation changes the endogenous gene of the protein that controls cell division or the endogenous promoter of the endogenous expression regulator (expression promoter or expression suppressor) into a high expression promoter or a low expression promoter. It may be a genomic modification to be modified.
  • the target region can be set within the endogenous promoter region of the endogenous gene or its endogenous expression regulator.
  • the genomic modification that promotes or reduces cell proliferation may be a genomic modification that disrupts an endogenous gene of a protein that controls cell division or an endogenous expression regulator (expression promoter or expression suppressor) thereof.
  • the target region can be set within the coding region of the endogenous gene or within the endogenous promoter region thereof.
  • the sequence-specific endonuclease may be introduced as a protein, may be introduced as an mRNA encoding the protein, or encodes the protein. It may be introduced as DNA to be used.
  • a Cas protein or an mRNA or DNA encoding a Cas protein and a guide RNA containing a sequence homologous to the target region can be used.
  • donor DNA can be used if desired.
  • the targeting vector as described above can be used.
  • the method for introducing a component necessary for genome modification into a haploid alga belonging to the genus Garderia is not particularly limited, and a known method can be used.
  • the genome-modifying component is nucleic acid
  • examples of the nucleic acid introduction method include a polyethylene glycol method, a lipofection method, a microinjection method, a DEAE dextran method, a particle gun method, an electroporation method, and a calcium phosphate method.
  • the genome-modifying component is a protein, for example, a method using a protein-introducing reagent, a method using a protein-introduced domain (PTD) fusion protein, a microinjection method, and the like can be mentioned.
  • PTD protein-introduced domain
  • the sequence-specific endonuclease is preferably introduced into cells as mRNA or DNA from the viewpoint of introduction efficiency.
  • the guide RNA in the CRISPR / Cas system may be introduced into the cell as RNA or may be introduced into the cell as DNA to express RNA in the cell.
  • the Cas protein is introduced into cells as DNA, the Cas protein and the guide RNA may be cloned on the same expression vector.
  • the genome modification method according to this embodiment may include an arbitrary step in addition to the above-mentioned genome modification step.
  • the optional step include a step of selecting genome-modified cells (selection step), a step of culturing genome-modified cells (culture step), and the like.
  • the genome modification method may include a step of selecting genome-modified cells after the genome modification step.
  • a selectable marker is introduced in the genome modification step
  • genome-modified cells can be selected using the expression of the selectable marker as an index.
  • genome-modified cells can be selected by culturing the genome-modified cells in a medium containing the antibiotic.
  • the genome-modified cells can be selected by culturing the genome-modified cells in a medium containing Blasticidin S.
  • the genome-modified cells are selected by culturing the cells after the genome modification in a medium containing no such nutritional component. can do.
  • genome-modified cells can be selected by culturing the cells after the genome modification in a medium containing the specific component.
  • the genome is modified using the URA5.3 gene as a target region and the URA5.3 gene is disrupted, the cells after the genome modification are cultured in a medium containing uracil and 5-fluoroorotic acid (5-FOA).
  • Genome-modified cells can be selected. This is because in cells that normally express the URA5.3 gene, the gene product of the URA5.3 gene converts uracil and 5-FOA to the toxic 5-fluorouracil. When genome modification is performed on monoploid cells that do not have the normal URA5.3 gene using the URA5.3 gene as a selection marker, the cells after the genome modification are cultured in a medium containing no uracil. Genome-modified cells can be selected.
  • genome-modified cells can be selected by selecting cells after genome modification by flow cytometry or the like based on the fluorescence of the fluorescent protein. ..
  • the medium and culture conditions used in the selection step the same media and culture conditions as those mentioned above (algae belonging to the genus Garderia) can be used.
  • the culture time in the selection step is not particularly limited as long as the cells whose genome has not been modified die. Examples of the culture time in the selection step include 1 to 5 days or more, 2 to 5 days or more, 3 to 5 days or more, and the like.
  • the genome modification method may include a step of culturing genome-modified cells after the genome modification step.
  • the culturing step may be performed before the selection step or after the selection step.
  • the medium and culture conditions used in the culture step the same culture medium and culture conditions as those mentioned above (algae belonging to the genus Garderia) can be used.
  • the culture step By performing the culture step, the number of genome-modified cells can be increased to an arbitrary amount.
  • the culturing step is performed after the selection step, the same medium as the selection step may be used as the medium.
  • the genome modification method since the genome is modified for the haploid of algae belonging to the genus Garderia, it is not necessary to modify the two alleles. Therefore, genome-modified cells having a desired trait can be easily obtained. Since the haploid does not have a strong cell wall, the efficiency of introducing the genome-modifying component is improved as compared with the diploid. Therefore, it is possible to efficiently modify the genome.
  • the second aspect of the present invention belongs to the genome-modified genus Garderia, which comprises a step (A; genome modification step) of modifying the genome of algae belonging to the genus Garderia by the genome modification method according to the first aspect. It is a method for producing algae.
  • the genome modification step can be performed in the same manner as the genome modification method according to the first aspect.
  • the production method according to this embodiment may include an arbitrary step in addition to the genome modification step.
  • the optional steps include, for example, a step of diploidizing genome-modified cells (B; diploidization step), a step of culturing the diploid (C; diploid culture step), and the diploid. (D; re-haploidization step) and the like.
  • the production method according to this embodiment may include a step of diploidizing the genome-modified cells after the genome-modifying step (step (A)).
  • step (A) genome modification is performed on the haploids of algae belonging to the genus Garderia. Therefore, the obtained genome-modified cells are haploid.
  • Polyploid cells do not have a strong cell wall and are more fragile and more susceptible to culture conditions than diploid cells. Therefore, it is considered that by making the genome-modified cells diploid, the genome-modified cells can be efficiently proliferated without being affected by the culture conditions.
  • Examples of the method of diploidizing the genome-modified cells include a method of culturing the monoploid genome-modified cells for an arbitrary period. By continuing the culture while substituting in a timely manner, diploid cells appear. By collecting the diploid cells that have appeared, diploid cells can be obtained.
  • Examples of the medium used for culturing include the same medium as the medium mentioned above (algae belonging to the genus Garderia).
  • the content of the osmotic pressure adjusting agent is preferably less than 80 mM, more preferably 70 mM or less, and even more preferably 60 mM or less.
  • the osmotic pressure of the medium is preferably less than 150 mOsm / kg, preferably 140 mOsm / kg or less, and even more preferably 120 mOsm / kg or less.
  • the culture conditions are not particularly limited, and the same culture conditions as those mentioned above (algae belonging to the genus Garderia) can be used.
  • Examples of the pH condition include pH 0.25 to 8.0, preferably pH 0.5 to 6.0, more preferably pH 0.5 to 4.0, further preferably pH 0.5 to 3.0, and pH 0. 5 to 2.0 is particularly preferable.
  • Examples of the temperature condition include 15 to 50 ° C, preferably 30 to 50 ° C, and more preferably 35 to 50 ° C.
  • the light intensity includes 5 to 2000 ⁇ mol / m2s, preferably 5 to 1500 ⁇ mol / m2s. It may be cultured with continuous light, or a light-dark cycle (10L: 14D, etc.) may be provided. When culturing heterotrophically, it can also be cultivated in a dark place.
  • the cells may be cultured in a liquid medium or a solid medium.
  • diploid cells appearing in the culture medium can be collected while observing under a microscope. Since diploid cells have a strong cell wall, cells in which the cell wall is observed may be collected. Further, when cultured in a solid medium, the colonies of diploid cells do not spread and have a raised shape as compared with the colonies of diploid cells. Therefore, diploid cells can be obtained by collecting colonies of cells characteristic of diploid cells.
  • the acquired cells are diploid by the same method as the method mentioned above (algae belonging to the genus Garderia).
  • the production method according to this embodiment may further include a step of culturing the diploid after the diploidization step (step (B)).
  • step (B) By culturing diploid genome-modified cells, it is considered that the genome-modified cells can be efficiently proliferated without being affected by the culture conditions.
  • Examples of the medium and culture conditions used in the diploid culture step include the same medium and culture conditions as those mentioned in the diploidization step. It is preferable that the cultured cells are appropriately subcultured before the quiescent phase.
  • the subculture interval can be appropriately adjusted according to the growth state of the diploid, and examples thereof include 3 to 10 days, 4 to 8 days, or 5 to 6 days.
  • Culturing is preferably performed in a liquid medium because it is easy to grow.
  • the production method according to this embodiment may further include a step of forming a haploid after the diploid culture step (step (C)).
  • the genome may be modified again, or the substance produced by the genome variant may be recovered. Since haploids do not have a strong cell wall, they can be destroyed by relatively mild treatment. Therefore, the intracellular components can be easily and efficiently recovered. Further, the haploid may be contained in foods and the like. Since the monoploid does not have a strong cell wall, it is considered that the digestion and absorption rate is higher than that of the diploid.
  • the production method it is possible to efficiently produce a genome-modified product having a desired trait by modifying the genome of a haploid cell.
  • the diploid is formed and the diploid is cultured, so that the genome variant having a desired trait can be efficiently propagated.
  • the genome can be efficiently modified again.
  • the substance produced by the genome variant can be efficiently recovered.
  • a third aspect of the present invention is a step of obtaining an alga belonging to the genome-modified Garderia genus (genome-modified product manufacturing step) by the production method according to the second aspect, and belonging to the genome-modified Garderia genus.
  • a method for producing a desired substance (hereinafter, “manufacturing a desired substance”, which comprises a step of causing algae to produce a desired substance (desired substance production step) and a step of recovering the desired substance (desired substance recovery step). Method ").
  • the desired substance produced by the method for producing a desired substance according to this embodiment is not particularly limited and may be any substance.
  • the desired substance may be a substance produced endogenously by algae belonging to the genus Garderia, or may be a substance produced by introducing a foreign gene. Examples of the desired substance include substances similar to those mentioned above (genome modification method).
  • the genome variant production step can be performed in the same manner as the production method according to the second aspect.
  • the genome modification performed in this step may be any of the genome modifications (a) to (c) mentioned in the above (genome modification method), and two or more genome modifications (a) to (c) may be combined. You may.
  • the genome modification of (c) is preferably a genome modification that promotes cell proliferation.
  • the genome variant By performing a genome modification that produces a desired substance, the genome variant can be made to produce a substance that is not produced by a wild strain.
  • B By performing genome modification to improve the production amount of a desired substance, it is possible to improve the production amount of the substance endogenously produced by algae belonging to the genus Garderia in the genome modification.
  • C Genome modification that promotes or reduces cell proliferation By performing genome modification that promotes cell proliferation, a genomic variant that produces a desired substance can be efficiently propagated.
  • the desired substance production step is a step of causing the genome variant obtained in the genome variant manufacturing step to produce a desired substance. This step can be performed by culturing the genomic variant.
  • the genomic variant to be cultured in this step may be diploid or diploid.
  • the haploid cells after genome modification may be cultured as they are. Alternatively, the haploid cells after the genome modification may be made into diploids and proliferated, and then returned to the haploids and cultured.
  • the medium and culture conditions the same medium and culture conditions as those mentioned above (algae belonging to the genus Garderia) can be used.
  • the genomic variant can be made diploid by the method described in the above (diploidization step).
  • the diploid culture can be carried out in the same manner as described above (diploid culture step).
  • This step is preferably performed by culturing diploid cells.
  • the genome variant By culturing the genome variant as a diploid, the genome variant can be efficiently propagated and a desired substance can be efficiently produced.
  • the desired substance recovery step is a step of recovering the desired substance produced by the genomic variant in the desired substance production step.
  • This step may be carried out using a haploid of a genomic variant, or may be carried out using a diploid, but it is preferable to use a haploid. Since haploids do not have a strong cell wall, they can destroy cells under relatively mild conditions. Therefore, the desired substance can be recovered easily and efficiently.
  • the haploid may be one obtained by culturing the haploid after genome modification as it is to produce a desired substance. Alternatively, the haploid may be cultivated as a diploid after the genome is modified to produce a desired substance, and then made into a haploid again.
  • a method of forming a haploid the same method as described above (algae belonging to the genus Garderia) can be mentioned.
  • the desired substance recovered in this step does not have to be a completely purified product of the desired substance, and may contain other components other than the desired substance.
  • the desired substance recovered in this step may be a haploid cell or a diploid cell containing the desired substance as a cell content, or may be a cell disruptor of these cells, or may be a cell disruption. It may be the one obtained by removing the solid content from the substance.
  • the desired substance can be recovered, for example, by recovering these cells from a haploid or diploid culture medium.
  • the cells can be recovered from the culture solution by, for example, centrifugation, filtration, or the like.
  • the recovered cells may be used as they are, or the cells may be destroyed and used.
  • Cell destruction can be performed using known methods.
  • Cells can be destroyed, for example, by physical treatment. Examples of the physical treatment method include cell destruction by glass beads, a mortar, ultrasonic treatment, a French press, a homogenizer, and the like.
  • Cells can be destroyed, for example, by chemical treatment. Examples of the method of chemical treatment include cell destruction by neutralization treatment, hypotonic treatment, freeze-thaw treatment, dry swelling treatment, enzyme treatment, surfactant treatment and the like. Since diploid cells have a strong cell wall, it is preferable to destroy the cells by physical treatment or a combination of physical treatment and chemical treatment. Since haploid cells do not have a strong cell wall, they can be destroyed by relatively mild chemical treatment.
  • Examples of the neutralization treatment method include a method of immersing monoploid cells in a neutralizing solution having a pH of about 7 to 10.
  • the composition of the neutralizing solution is not particularly limited, but for example, a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a Tris buffer solution can be used.
  • the time for immersing the cells in the neutralizing solution may be such that the cells are destroyed, and examples thereof include about one week.
  • Examples of the hypotonic treatment method include a method of immersing monoploid cells in a hypotonic solution such as water.
  • the composition of the hypotonic liquid is not particularly limited as long as it is a hypotonic liquid to the extent that monoploid cells rupture.
  • hypotonic solution examples include water, a buffer solution having a low salt concentration, and the like.
  • the time for immersing the cells in the hypotonic solution may be such that the cells rupture, and examples thereof include about 1 to 30 minutes.
  • the algae cells may be collected by centrifugation or the like and resuspended in the hypotonic solution, which may be repeated.
  • the number of resuspensions is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 5 times.
  • the method of freeze-thaw treatment include a method in which a cycle of freezing and thawing is performed once or more for haploid cells. The number of freezing and thawing cycles may be, for example, about 1 to 5 times.
  • Each time of freezing and thawing is not particularly limited, and for example, about 10 to 30 minutes each is exemplified.
  • Examples of the dry swelling treatment method include a method in which haploid cells are subjected to one or more cycles of drying and resuspension in a buffer solution. The number of drying and resuspending cycles may be, for example, about 1 to 5 times.
  • Examples of the enzyme treatment method include a method using an enzyme such as cellulase, pectinase, and lysozyme.
  • Examples of the method using a surfactant include a method using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate.
  • the solid content may be removed by centrifugation, filtration, or the like.
  • the crude extract after removing the solid content may be subjected to an appropriate combination of methods generally used for separation / purification of biochemical substances, and further separation / purification of desired substances may be carried out.
  • Separation / purification includes, for example, salting, dialysis, recrystallization, reprecipitation, solvent extraction, adsorption, concentration, filtration, gel filtration, ultrafiltration, various types of chromatography (thin layer chromatography, column chromatography, ion exchange chromatography, high speed). (Liquid chromatography, adsorption chromatography, etc.), etc., but are not limited thereto.
  • the desired substance when the desired substance is a substance secreted extracellularly, the desired substance can be recovered by recovering the culture supernatant from the haploid or diploid culture solution.
  • the culture supernatant can be collected by centrifugation, filtration, or the like of the culture solution.
  • a method generally used for separation / purification of biochemical substances may be appropriately combined with the collected culture supernatant to further separate / purify the desired substance.
  • the desired substance production method in order to obtain a genome variant by the production method according to the second aspect and produce a desired substance, the production of the desired substance or the recovery of the desired substance is efficient. You can do it well.
  • the desired substance obtained by the method for producing a desired substance according to this embodiment can be appropriately used in foods, cosmetics, feeds or pet foods, feeds, industrial products, etc., depending on the type of desired substance.
  • a fourth aspect of the present invention is a step of producing a desired substance (desired substance manufacturing step) and a step of producing a food containing the desired substance (a step of producing a desired substance by the desired substance manufacturing method according to the third aspect).
  • a food manufacturing process) and a food manufacturing method (hereinafter referred to as “food manufacturing method”) including.
  • the food produced by the food production method according to this embodiment is not particularly limited and may be any food.
  • Foods include, for example, various noodles such as buckwheat, udon, harusame, Chinese noodles, instant noodles, cup noodles; carbohydrates such as bread, wheat flour, rice flour, hot cakes, mashed potatoes; green juice, soft drinks, carbonated drinks, etc.
  • Beverages such as nutritional drinks, fruit drinks, vegetable drinks, lactic acid drinks, milk drinks, sports drinks, tea and coffee; bean products such as tofu, okara and natto; various soups such as curry roux, stew roux and instant soup; ice cream Cold confectionery such as cream, ice sherbet, shaved ice; confectionery such as candy, cookies, candy, gum, chocolate, tablet confectionery, snack confectionery, biscuits, jelly, jam, cream, and other baked confectionery; Fisheries and processed livestock foods such as; processed milk, fermented milk, butter, cheese, yogurt and other dairy products; salad oil, tempura oil, margarine, mayonnaise, shortening, whipped cream, dressing and other fats and oils and fat processed foods; sauces, dressings , Miso, soy sauce, seasonings such as sauce; various retort foods, other processed foods such as sprinkles, pickles, etc., but are not limited thereto.
  • the food may be a functional food or a dietary supplement.
  • the functional food or dietary supplement may be in the form of a general food as described above, or may be in the form of a dry powder, granules, tablets, jelly or drink.
  • the desired substance production step can be performed by the desired substance production method according to the third aspect.
  • the food manufacturing process is a step of manufacturing a food containing a desired substance.
  • the food can be produced according to a known method according to the type of food by adding a desired substance to the food raw material and appropriately adding other food additives.
  • a nutritionally fortified food can be obtained by adding a desired substance.
  • a fifth aspect of the present invention is an alga belonging to the genus Garderia, which has a mutation in a gene involved in the synthesis of a nutritional component and has a requirement for the nutritional component.
  • Genes involved in the synthesis of nutritional components means genes encoding proteins involved in the synthesis of arbitrary nutritional components.
  • Examples of the gene involved in the synthesis of the nutritional component include a synthase gene of the nutritional component, a synthase gene of a precursor of the nutritional component, a gene encoding an activated protein of the synthase gene, and a transcription of the synthase gene. Examples include, but are not limited to, genes that regulate.
  • the nutritional component is not particularly limited and may be any nutritional component. Examples of nutritional components include, but are not limited to, bases, amino acids, vitamins and the like. Specific examples of nutritional components include uracil. Specific examples of genes involved in the synthesis of nutritional components include the URA5.3 gene.
  • Having a mutation in a gene involved in the synthesis of nutritional components means at least one selected from the group consisting of substitutions, deletions, insertions, and additions in the base sequence of genes involved in the synthesis of nutritional components. It means that a mutation has occurred.
  • the number of bases substituted, deleted, inserted, and / or added is not particularly limited. Whether or not a gene involved in the synthesis of a nutritional component has a mutation is evaluated based on, for example, the base sequence of the gene possessed by a wild strain (WT) that does not show the requirement of any nutritional component.
  • WT wild strain
  • the target algae strain is involved in the synthesis of the nutritional component. It is evaluated as having a mutation in the gene.
  • Wild strains of algae belonging to the genus Garderia can be obtained from, for example, ATCC, NIES collection and other algae culture collections.
  • the mutation is preferably not a silent mutation, and is preferably a mutation that impairs the function of the protein expressed from the gene.
  • the mutation can be, for example, a mutation that causes a frameshift. Mutations in genes involved in the synthesis of nutrient components are preferably introduced by genomic modification.
  • the algae belonging to the genus Garderia according to this embodiment are preferably genomic variants.
  • all of the two or more copies of the genes have mutations. It is more preferred that all of the two or more copies of the gene are mutated and all of the two or more copies of the gene are unable to express a functional protein.
  • Having the requirement of nutritional components means that it cannot grow in the absence of any nutritional components. Algae having the requirement of any nutritional component cannot grow in the absence of the nutritional component, but can grow in the presence of the nutritional component. It is preferable that the algae belonging to the genus Garderia according to this embodiment have a mutation in a gene involved in the synthesis of the nutritional component and cannot express a functional protein from the gene, and thus have a requirement for the nutritional component.
  • the algae belonging to the genus Garderia according to this embodiment may be diploid or diploid.
  • the genes involved in the synthesis of nutritional components have mutations in both alleles. If the algae belonging to the genus Garderia are diploid and there are two or more copies of the gene involved in the synthesis of nutritional components, then all of the genes in both alleles have mutations and all of the genes in both alleles are functional. It is more preferable that a typical protein cannot be expressed.
  • the mutation of the gene involved in the synthesis of the nutritional component may be the same mutation in both alleles or may be a different mutation, but it is preferable that the mutation is the same.
  • homodiploid having a homozygous mutation in a gene involved in the synthesis of nutritional components.
  • Such homodiploid induces diploid cells after introducing a mutation into a gene involved in the synthesis of nutritional components in monoploid cells by the genome modification method according to the first aspect. By doing so, it can be produced.
  • Examples of the algae belonging to the genus Garderia according to this embodiment include those having a mutation in the URA5.3 gene and being uracil-requiring (hereinafter, also referred to as "uracil-requiring strain").
  • the URA5.3 gene is a gene encoding orotidine 5'-phosphate decarboxylase.
  • Orotidine 5'-phosphate decarboxylase is an enzyme that catalyzes the reaction of converting orotidine 5'-phosphate to uridine 5'-phosphate (UMP; uracil precursor).
  • the URA5.3 gene is mutated and the functional orotidin-5'-decarboxylase is not expressed, the cells will not be able to synthesize UMP and uracil, resulting in uracil requirement.
  • Oroticin 5'-phosphate decarboxylase also catalyzes the reaction of converting 5-fluoroorotic acid (5-FOA) to the cytotoxic 5-fluorouridine (5-FU). Therefore, if the URA5.3 gene is not mutated and functional orotidin 5'-phosphate decarboxylase is expressed, the cells cannot survive in the presence of 5-FOA. On the other hand, if the URA5.3 gene is mutated and the functional orotidine 5'-phosphate decarboxylase is not expressed, the cells can survive in the presence of 5-FOA and uracil.
  • the uracil-requiring strain may be diploid or diploid. Since algae belonging to the genus Garderia usually have two copies of the URA5.3 gene, they have mutations in any of the two copies of the URA5.3 gene and cannot express the functional orotidine 5'-phosphate decarboxylase. Is preferable.
  • the uracil-requiring strain is diploid, it is preferably a homodiploid having a mutation in the URA5.3 gene.
  • Such a uracil-requiring strain can be obtained by introducing a mutation into the URA5.3 gene in a haploid cell by the genome modification method according to the first aspect, and then inducing the diploid cell. Can be made.
  • a mutation can be introduced into the URA5.3 gene by designing a target sequence in the coding region of URA5.3 and performing genome editing by the CRISPR / Cas system using a gRNA containing the target sequence. .. G.
  • the target sequence in the URA5.3 coding region includes the target sequence shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 33).
  • the mutation of the uracil-requiring strain in the URA5.3 gene is not particularly limited as long as it cannot express the functional orotidine 5'-phosphate decarboxylase.
  • the type of mutated base and the number of mutated bases are also not particularly limited.
  • specific examples of mutations in the URA5.3 gene include mutations (deletion, insertion, and / or substitution) in the range of positions 194 to 195 of the URA5.3 gene shown in SEQ ID NO: 22. Those having the above are mentioned.
  • Examples of the mutation include a deletion of the thymine residue (T) at position 194, a deletion of the adenine residue (A) at position 195, and a thymine residue at position 194 in the URA5.3 gene represented by SEQ ID NO: 22. Insertion of one to several (for example, 2, 3, 4 or 5) nucleotide residues between the group and the adenine residue (A) at position 195, a combination thereof and the like can be mentioned. Specific examples include mutations of # 1_1, # 1_2, # 2_1, # 2_2, # 3_1, and # 3_2 in FIG. That is, G.
  • Examples of the uracil-requiring strain of partita include those containing a base sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 7 to 12 at the URA5.3 locus. Mutations in the URA5.3 gene are not limited to these and may have other mutations in place of or in addition to these mutations.
  • the auxotrophic algae belonging to the genus Garderia make it possible to use the auxotrophic algae as a selectable marker for genome modification in the algae belonging to the genus Garderia. This provides a technique for realizing self-cloning in algae belonging to the genus Garderia.
  • the present invention provides algae belonging to the genus Garderia, which has been genomically modified, produced by the production method according to the second aspect.
  • the algae may be haploid or diploid. When it is diploid, it is preferably homodiploid having a genome-modified sequence homozygous.
  • the present invention provides algae belonging to the genus Garderia containing an antibiotic resistance gene.
  • the algae may be haploid or diploid. When it is diploid, it is preferably homodiploid having an antibiotic resistance gene homozygous. Examples of the antibiotic resistance gene include the BSD gene.
  • the present invention provides a desired substance produced by the method for producing a desired substance according to the third aspect.
  • the desired substance include the same substances as those exemplified above.
  • the present invention provides a food containing algae belonging to the genus Garderia, which has been genomically modified, produced by the production method according to the second aspect.
  • the algae may be haploid or diploid. When it is diploid, it is preferably homodiploid having a genome-modified sequence homozygous. From the viewpoint of digestion and absorption, it is preferable that the food according to this embodiment contains haploids of algae belonging to the genus Garderia whose genome has been modified.
  • Table 4 shows the composition of the MA2 medium (Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan; 49 (1): 117-20.) Used in the test.
  • Garderia (polyploid) was cultured in MA medium adjusted to pH 0.1-2.0. Seven days after the start of the culture, the OD 750 of the culture solution was measured to confirm the growth status.
  • gRNA guide RNA
  • dsDNA double-stranded DNA
  • FIG. 3 shows the target sequence of gRNA (SEQ ID NO: 33) used in the preparation of the uracil auxotrophic strain.
  • a target sequence was designed within the coding sequence of the URA5.3 gene (SEQ ID NO: 22).
  • P URA 5.3 represents the promoter of the URA 5.3 gene and T URA 5.3 represents the terminator of the URA 5.3 gene.
  • a DNA fragment having a target sequence was commissioned to Eurofins and synthesized by the phosphoramidite method.
  • the CDS of the URA5.3 gene is shown in SEQ ID NO: 23.
  • FIG. 4 shows the construct of the plasmid for genome editing used in the preparation of the uracil auxotrophy strain.
  • Pu6 is the U6 promoter (SEQ ID NO: 16)
  • PEF1 -a is the promoter of the EF1-a gene (SEQ ID NO: 18)
  • TUBQ is the ubiquitin gene terminator (SEQ ID NO: 20)
  • NLS is the nuclear localization signal. (Nuclear localization signal) is shown.
  • the gRNA scaffold (SEQ ID NO: 17) indicates an sgRNA that does not contain a target sequence.
  • a 20 bp target sequence is inserted between Pu6 and the gRNA scaffold.
  • a plasmid containing the construct shown in FIG. 5 was prepared.
  • PCR was performed using the plasmid as a template using the primers shown in FIG.
  • the obtained PCR product was subjected to an In-Fusion reaction using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara Bio).
  • Escherichia coli was transformed with the obtained plasmid, propagated, and then the plasmid was extracted.
  • PCR amplification was performed using the obtained plasmid as a template using the following primers (puc19_F, puc19_R), and the obtained DNA fragment was used as a genome editing DNA for producing a uracil-requiring strain.
  • the DNA for genome editing was introduced into Garderia (polyploid) by the PEG method.
  • Incubation was performed in a light-dark cycle (12 L / 12D) at 42 ° C. for 4 to 5 days (aeration culture, 2% CO 2 , 300 mL / min).
  • the transformant prepared as described above can be used as an MA medium (pH 1.0), a uracil-containing MA medium (pH 1.0, uracil 0.5 mg / mL), or a 5-FOA / uracil-containing MA medium (pH 1.0, Uracil (0.5 mg / mL, 5-FOA 0.4 mg / mL) was planted and cultured for 10 days under the same conditions as above.
  • untransformed gardenia (polyploid) (WT) was also cultured in the same manner.
  • Genome analysis Three strains of uracil-requiring strains were cloned (# 1, # 2, # 3), and the target region targeted for genome editing was analyzed. PCR was performed using DNA extracted from untransformed WT or uracil-requiring strains (# 1, # 2, # 3) as a template to amplify the target region. Sequence analysis was performed using the amplified DNA fragment, and the sequence of the target region was confirmed. The sequences of the primers used for PCR are shown below.
  • BS is converted to non-toxic deaminhohydroxy-blastidin (d-BS) by Blasticidin S deaminase (EC 3.5.4.23; BSD). Therefore, we introduced BSD into Garderia (polyploid) and tried to establish a drug selection system by BS.
  • FIG. 10 shows the construct of the donor DNA.
  • Neutral site (NS1) was selected as the area for introducing the BSD.
  • P catalase indicates a promoter of a catalase gene
  • TUBQ indicates a terminator of a ubiquitin gene.
  • the obtained DNA fragment was cloned and the BSD marker set of P- catalase (SEQ ID NO: 19) -BSD (SEQ ID NO: 25) -TUBQ (SEQ ID NO: 20) was inserted.
  • Escherichia coli was transformed with the obtained plasmid, propagated, and then the plasmid was extracted.
  • PCR amplification was performed using the obtained plasmid as a template using puc19_F and puc19_R, and the obtained DNA fragment was used as a donor DNA for a BSD marker.
  • the sequence of the NS1 region and its upstream and downstream 200 bp is shown in FIG.
  • the sequence of the NS1 region is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the sequence of the NS1 region used as the 5'homology arm in the donor DNA is shown in SEQ ID NO: 29.
  • the sequence of the NS1 region used as the 3'homology arm in the donor DNA is shown in SEQ ID NO: 30.
  • NS1_F cggtacccggggatcTTTATGGAGAGCATCGTGAATAACGGC (SEQ ID NO: 13)
  • NS1_R cgactctagaggatcTGCAGAATAACCGGTGAAATTTATGAAC (SEQ ID NO: 14)
  • the transformant (BSD) prepared as described above is planted in MA medium (pH 1.0) or BS-containing MA medium (pH 1.0, BS 100 ⁇ g / mL) and cultured for 21 days under the same conditions as above. bottom.
  • MA medium pH 1.0
  • BS-containing MA medium pH 1.0, BS 100 ⁇ g / mL
  • WT gardenia
  • FIG. 12 is the result of Garderia (diploid)
  • FIG. 13 is the result of Garderia (polyploid).
  • Neither the untransformed WT nor the transformant (BSD) could grow Garderia (diploid) in BS-containing MA medium.
  • WT could not grow in BS-containing MA medium
  • transformant (BSD) could grow in BS-containing MA medium. From this result, it was confirmed that in Garderia (polyploid), a BS-resistant transformant can be obtained by homologous recombination.
  • Garderia (diploid) BS-resistant transformants could not be obtained. It was considered that this is because gardenia (diploid) has a strong cell wall, so that donor DNA is difficult to be introduced into cells.
  • PS1_F TCCCAAGATAATAGACAGTGCTCGG (SEQ ID NO: 31)
  • PS1_R TTGTTACCTACTCATACCCCTACTCC (SEQ ID NO: 32)
  • FIG. 15 shows the construct of the donor DNA for introducing mVenus.
  • the mVenus gene set (PEF1 - ⁇ -mVenus-T ⁇ -tubulin ) was inserted upstream of the BSD marker set.
  • the obtained plasmid was used as a donor DNA for introducing mVenus.
  • P EF1- ⁇ indicates the promoter of the EF1- ⁇ gene
  • T ⁇ -tubulin indicates the terminator of the ⁇ -tubulin gene.
  • the transformant (TF) or WT obtained above was immunobloted using Anti-GFP antibody (JL-8, Clontech). The result is shown in FIG. In the transformant (TF), a band of mVenus was confirmed. From this result, it was confirmed that the transformant (TF) expressed the mVenus protein.
  • DIC is a differential interference microscope image
  • Chl is a fluorescence microscope image in which autofluorescence of chlorophyll is detected
  • mVenus is a fluorescence microscope image in which mVenus fluorescence is detected
  • merged is Chl and mVenus. It is a merged fluorescence microscope image.
  • fluorescence of mVens could be confirmed in the transformant (TF), and it was confirmed that functional mVenus was produced.

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Abstract

ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う工程を含む、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。また、前記ゲノム改変方法により、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変を行う工程を含む、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。また、前記製造方法により得られたガルデリア属に属する藻類を利用した、所望の物質又は食品の製造方法。また、栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有し、前記栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類。

Description

ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法
　本発明は、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法に関する。また、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法、並びに前記製造方法により製造されたゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を用いた所望の物質の製造方法、及び前記所望の物質を含有する食品の製造方法に関する。また、栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類に関する。
　本願は、２０２０年１０月１２日に、日本に出願された特願２０２０－１７２１６３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　微細藻類は、陸上植物と比較して、高い二酸化炭素固定能力を有すること、及び農産物と生育場所が競合しないことから、いくつかの種は、大量培養されて、飼料、機能性食品、化粧品材料等として産業的に利用されている。
　微細藻類を産業利用する場合には、コスト面等から、屋外で大量培養可能な微細藻類であることが望ましい。しかしながら、屋外で大量培養可能な微細藻類であるためには、環境変動（光、温度等）に耐性を有すること、他の生物が生存できないような条件で培養できること、高密度まで増殖可能であること、等の条件が求められる。
　ガルデリア属（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）は、硫酸酸性温泉において優先増殖する単細胞性紅藻である。ガルデリア属は、高塩濃度、高温、低ｐＨ等の他の生物が生育困難な環境で培養可能である点に特徴がある。そのため、産業利用に適していると考えられる。また、遺伝子改変技術等により、単細胞性紅藻に所望の形質を付与することができれば、より産業利用に適した細胞株の作出が可能となる。さらに、ガルデリア属は、光合成により増殖する能力に加え、多様な有機物を資化して従属栄養的に増殖する能力も有する。そのため、暗所でも、効率的に増殖させることができる。
　ガルデリア属は、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）に属する。イデユコゴメ綱の中では、シアニディオシゾン属（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ）に属するシアニディオシゾン・メロラエ（Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ　ｍｅｒｏｌａｅ）において、全ゲノム配列が解読されており、遺伝子改変技術の開発が進められている（非特許文献１、２）。
Fujiwara T et al.(2013) Gene targeting in the red alga Cyanidioschyzon merolae: single- and multi-copy insertion using authentic and chimeric selection markers. PLOS ONE. Sep 5;8(9):e73608. Fujiwara T et al.(2015) A nitrogen source-dependent inducible and repressible gene expression system in the red alga Cyanidioschyzon merolae. Front Plant Sci. Aug 26;6:657.
　ガルデリア属は、他の生物が生育困難な環境で生育することができ、高密度培養が可能なことから、産業利用に有望な藻類と考えられる。しかしながら、ガルデリア属では、安定的に外来遺伝子を発現可能な形質転換方法は確立されていない。そのため、所望の形質を備えるガルデリア属の作出が困難であり、産業利用の障壁となっている。
　そこで、本発明は、ガルデリア属に属する藻類に所望の形質を安定して付与することが可能な、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法を提供することを課題とする。また、前記ゲノム改変方法を用いたゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を用いた所望の物質の製造方法、及び前記所望の物質を含有する食品の製造方法を提供することを課題とする。また、ゲノム改変に利用可能な、栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う工程を含む、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
［２］前記ゲノム改変を配列特異的に行う、［１］に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
［３］前記ゲノム改変を、相同組換え法、又は配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムを用いて行う、［２］に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
［４］前記ゲノム編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＺＮＦ、及びＴＡＬＥＮからなる群より選択される、［３］に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
［５］前記ゲノム改変が、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のゲノム改変である、［１］～［４］のいずれか１つに記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法：（ａ）所望の物質を産生させるゲノム改変；（ｂ）所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変；及び（ｃ）細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変。
［６］［１］～［５］のいずれか１つに記載のゲノム改変方法により、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変を行う工程（Ａ）を含む、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
［７］前記工程（Ａ）後、前記藻類を２倍体にする工程（Ｂ）をさらに含む、［６］に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
［８］前記工程（Ｂ）後、前記藻類の２倍体を培養する工程（Ｃ）をさらに含む、［７］に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
［９］前記工程（Ｃ）後、前記藻類を１倍体にする工程（Ｄ）をさらに含む、［８］に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
［１０］［６］に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、前記所望の物質を回収する工程と、を含む、所望の物質の製造方法。
［１１］［７］又は［８］に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、前記所望の物質を回収する工程と、を含む、所望の物質の製造方法。
［１２］［９］に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、前記所望の物質を回収する工程と、を含む、所望の物質の製造方法。
［１３］［１０］～［１２］のいずれか１つに記載の所望の物質の製造方法により、所望の物質を製造する工程と、前記所望の物質を含有する食品を製造する工程と、を含む、食品の製造方法。
［１４］栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有し、前記栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類。
　本発明によれば、ガルデリア属に属する藻類に所望の形質を安定して付与することが可能な、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法が提供される。また、前記ゲノム改変方法を用いたゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を用いた所望の物質の製造方法、及び前記所望の物質を含有する食品の製造方法が提供される。また、ゲノム改変に利用可能な、栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類が提供される。
ガルデリア属に属する藻類の１倍体と２倍体の顕微鏡写真を示す。 Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ　ＮＢＲＣ１０２７５９の１倍体（以下、「ガルデリア（１倍体）」ともいう）を、ｐＨ０．１～２．０に調整したＭＡ培地を用いて培養した結果を示す。 ウラシル要求性株の作製に用いたｇＲＮＡの標的配列を示す。 ウラシル要求性株の作製に用いたゲノム編集用プラスミドのコンストラクトを示す。 標的配列挿入前の、ゲノム編集用プラスミドのコンストラクトを示す。 Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応により標的配列を挿入するために設計したプライマーのプライマー配列と、プライマーの設計位置を示す。 ウラシル要求性株作製用のゲノム編集用プラスミドを用いて作製した形質転換体（ΔＵＲＡ５．３）のウラシル要求性を確認した結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。 ウラシル要求性株作製用のゲノム編集用プラスミドを用いて作製した形質転換体のクローン３株（＃１、＃２、＃３）において、標的領域の配列解析を行った結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。＃１－１及び＃１－２は、形質転換体（＃１）のゲノムに存在する２コピーのＵＲＡ５．３遺伝子の標的領域をそれぞれ示す。＃２、＃３についても同様である。 ガルデリア（１倍体）のブラストサイジンＳ（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ　Ｓ；ＢＳ）に対する感受性を評価した結果を示す。 ＢＳ耐性株の作製に用いたドナーＤＮＡのコンストラクトを示す。 Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ　ＮＢＲＣ１０２７５９のニュートラルサイトであるＮＳ１領域、並びにその上流及び下流２００ｂｐの塩基配列を示す。 ガルデリア（２倍体）に、ＢＳＤマーカーセットを含むドナーＤＮＡを導入して作製した形質転換体（ＢＳＤ）のＢＳ耐性を確認した結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（２倍体）を示す。 ガルデリア（１倍体）に、ＢＳＤマーカーセットを含むドナーＤＮＡを導入して作製した形質転換体（ＢＳＤ）のＢＳ耐性を確認した結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。 ＢＳ耐性が確認されたガルデリア（１倍体）の形質転換体（ＢＳＤ）において、標的領域をＰＣＲで増幅した結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。 ｍＶｅｎｕｓ発現株の作製に用いたドナーＤＮＡのコンストラクトを示す。 ガルデリア（１倍体）に、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子セットを含むドナーＤＮＡを導入して作製した形質転換体（ＴＦ）において、標的領域をＰＣＲで増幅した結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。 ガルデリア（１倍体）に、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子セットを含むドナーＤＮＡを導入して作製した形質転換体（ＴＦ）において、イムノブロットを行った結果を示す。図中、ＷＴは、形質転換していないガルデリア（１倍体）を示す。 ガルデリア（１倍体）に、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子セットを含むドナーＤＮＡを導入して作製した形質転換体（ＴＦ）の蛍光顕微鏡画像を示す。ＤＩＣは微分干渉顕微鏡画像、Ｃｈｌは葉緑体の自家蛍光を検出した蛍光顕微鏡画像、ｍＶｅｎｕｓはｍＶｅｎｕｓの蛍光を検出した蛍光顕微鏡画像、ｍｅｒｇｅｄはＣｈｌとｍＶｅｎｕｓの蛍光顕微鏡画像のマージ画像である。
　本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞は、単離されたものであり得る。「単離された」とは、天然状態又は他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、及び細胞は、単離されたタンパク質、単離されたペプチド、単離されたポリヌクレオチド、単離されたベクター、及び単離された細胞であり得る。
＜ゲノム改変方法＞
　本発明の第１の態様は、ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う工程（ゲノム改変工程）を含む、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法である。
［ゲノム改変工程］
（ガルデリア属に属する藻類）
　ガルデリア属に属する藻類とは、紅色植物門（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、イデユコゴメ綱（Ｃｙａｎｉｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ガルデリア属（Ｇａｌｄｉｅｒｉａ）に属する藻類である。ガルデリア属に属する藻類としては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａ、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ、Ｇ．ｐｈｌｅｇｒｅａ、Ｇ．ｄａｅｄａｌａ、Ｇ．ｍａｘｉｍａ等が挙げられるが、これらに限定されない。ガルデリア属に属する藻類は、硫酸酸性温泉において優先増殖する単細胞性紅藻であり、高塩濃度、高温、低ｐＨの条件下で好適に増殖することができる。
　ガルデリア属の藻類株としては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａ　ＮＢＲＣ１０２７５９、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＣＣＣｒｙｏ１２７－００、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　０７４Ｗ、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＭＳ１、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＲＴ２２、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＳＡＧ２１、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＳＡＧ２１、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　Ａｚｏｒａ、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　ＹＮＰ、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　５５７２、Ｇ．ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ　００２、Ｇ．ｐｈｌｅｇｒｅａ　ＤＢＶ００９、Ｇ．ｐｈｌｅｇｒｅａ　Ｓｏｏｓ、及び国際公開第２０１９／１０７３８５号の図１０に記載されるもの等、並びにこれらの変異株が挙げられるが、これらに限定されない。
　本態様にかかるゲノム改変方法では、ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う。ガルデリア属は、２倍体と１倍体の細胞形態を有する。図１に、ガルデリア属の１倍体と２倍体の顕微鏡写真を示す。１倍体は、不規則又は球状の細胞形態をしており、強固な細胞壁は有しない。２倍体は、球状の細胞形態をしており、強固な細胞壁を有する。２倍体の細胞は細胞分裂の際に４～３２個の内生胞子を形成するが、１倍体の細胞の細胞分裂の方法はまだわかっていない。
　ガルデリア属に属する藻類が１倍体であるか２倍体であるかの判定は、同一遺伝子座のコピー数を確認することにより行うことができる。すなわち、同一遺伝子座のコピー数が１であれば、１倍体であると判定される。
　１倍体であることの判定には、次世代シーケンサーを用いることもできる。例えば、次世代シーケンサーで全ゲノムのシーケンスリードを取得し、それらのシーケンスリードをアセンブルした後、アセンブルして得られた配列に対して、シーケンスリードをマッピングする。２倍体ではアレルごとの塩基の違いがゲノム上の様々な領域で見つかるが、１倍体では１アレルしか存在しないため、その様な領域は見つからない。
　細胞がホモ２倍体である場合には、細胞のＤＮＡ含有量を測定することにより、１倍体であるか、２倍体であるかを判定することができる。１倍体の細胞のＤＮＡ含有量は、２倍体の細胞のＤＮＡ含有量の１／２倍である。
　１倍体は強固な細胞壁を有さず、２倍体は強固な細胞壁を有するため、細胞の形態を観察することにより、１倍体の細胞と２倍体の細胞とを見分けることができる。例えば、１倍体の細胞は、光学顕微鏡による観察（例えば、倍率６００倍）において、通常、細胞壁が観察されない。そのため、光学顕微鏡により細胞壁が観察されない場合、１倍体の細胞であると判定することができる。
　１倍体の細胞は、強固な細胞壁を有さないため、比較的温和な処理（中和処理、低張処理、凍結融解処理、界面活性剤処理など）により、細胞を破壊することができる。例えば、２質量％の界面活性剤を含む培地に細胞を懸濁し、界面活性剤の添加直後から５分経過後までに細胞が崩壊した場合には、１倍体の細胞であると判定することができる。前記界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウムが挙げられる。より具体的には、ガルデリア属に属する藻類の細胞懸濁液に、２質量％となるようにドデシル硫酸ナトリウムを添加し、添加後５分以内に細胞が崩壊した場合には、１倍体であると判定することができる。細胞が崩壊したか否かは、光学顕微鏡で細胞を観察することにより確認することができる。
　ガルデリア属に属する藻類を固体培地で培養している場合、コロニーの形状により１倍体の細胞であるかを判定することもできる。１倍体の細胞は、強固な細胞壁を有さないため、２倍体の細胞のコロニーと比較して、扁平で、固体培地の表面に広がる形状となる。固体培地上で、このような形状のコロニーが出現した場合には、１倍体のコロニーであると判定することができる。
　ガルデリア属に属する藻類の１倍体は、ガルデリア属に属する藻類の２倍体を静止期になるまで培養し、静止期のまま培養を任意の期間継続することにより、得ることができる。静止期のまま培養する期間としては、例えば、半日以上、１日以上、２日以上、３日以上、又は５日以上等が挙げられる。培養期間の上限は、特に限定されないが、例えば、６０日以下、４０日以下、３０日以下、２０日以下、又は１０日以下等が挙げられる。また、静止期の培養液から細胞を回収して植え継ぎを行い、さらに１～５日程度培養を行ってもよい。
　あるいは、ガルデリア属に属する藻類の１倍体は、ガルデリア属に属する藻類の２倍体を、浸透圧調整剤を８０ｍＭ以上含有する培地で培養することにより、得ることができる。浸透圧調整剤の濃度は、１００ｍＭ以上が好ましく、１５０ｍＭ以上がより好ましく、２００ｍＭ以上がさらに好ましく、３００ｍＭ以上、３５０ｍＭ以上、又は４００ｍＭ以上がさらにより好ましい。浸透圧調整剤の上限濃度は、特に限定されず、培地中に溶解可能な限界値であってもよい。細胞の増殖速度の観点からは、浸透圧調整剤の上限濃度は、例えば、２Ｍ以下、１．５Ｍ以下、１．４Ｍ以下、１．３Ｍ以下、１．２Ｍ以下、１．１Ｍ以下、又は１Ｍ以下とすることができる。あるいは、ガルデリア属に属する藻類の１倍体は、ガルデリア属に属する藻類の２倍体を、浸透圧が１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上の培地で培養することにより、得ることができる。浸透圧は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上が好ましく、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上がより好ましく、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上がさらに好ましく、３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、又は４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以上がさらにより好ましい。浸透圧の上限値は、特に限定されず、浸透圧調整剤を培地中に溶解可能な限界値であってもよい。細胞の増殖速度の観点からは、浸透圧の上限値は、例えば、２０００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、１５００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、又は１４００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下とすることができる。
　浸透圧調整剤は、培地に添加することにより浸透圧を調整可能な化学物質であれば、特に限定されない。浸透圧調整剤としては、例えば、糖（グルコース、スクロース等）、糖アルコール（マンニトール、ソルビトール等）、アミノ酸（グリシン、プロリン、アルギニン等）、金属塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩）、尿素、タンパク質、ベタイン、イノシトール、多糖等が挙げられる。
　ガルデリア属に属する藻類の培養に用いる培地は、特に限定されず、公知の微細藻類培養用の培地を用いることができる。培地としては、特に限定されないが、窒素源、リン源、微量元素（亜鉛、ホウ素、コバルト、銅、マンガン、モリブデン、鉄など）等を含む無機塩培地が例示される。例えば、窒素源としては、アンモニウム塩、硝酸塩、亜硝酸塩等が挙げられ、リン源としては、リン酸塩等が挙げられる。そのような培地としては、例えば、Ｇｒｏｓｓ培地、２×Ａｌｌｅｎ培地（Allen MB. Arch. Microbiol. 1959 32: 270-277.）、Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）、ＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）、改変Ｍ－Ａｌｌｅｎ培地等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ガルデリア属に属する藻類は、光照射下で、独立栄養的に培養してもよく、暗所で、従属栄養的に培養してもよい。従属栄養的に培養する場合には、上記のような無機塩培地に、炭素源（グルコース等）を添加してもよい。
　培養条件は、特に限定されず、ガルデリア属に属する藻類の培養条件として通常用いられる条件を使用することができる。ｐＨ条件としては、ｐＨ０．２５～８．０が挙げられ、ｐＨ０．５～６．０が好ましく、ｐＨ０．５～４．０がより好ましく、ｐＨ０．５～３．０がさらに好ましく、ｐＨ０．５～２．０が特に好ましい。温度条件としては、１５～５０℃が挙げられ、３０～５０℃が好ましく、３５～５０℃がより好ましい。光照射下で培養する場合、光強度としては、５～２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓが挙げられ、５～１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。連続光で培養してもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けてもよい。従属栄養的に培養する場合には、暗所で培養することもできる。
　ガルデリア属に属する藻類は、液体培地で培養してもよく、固体培地で培養してもよい。液体培地で培養した場合、顕微鏡下で観察しながら、培養液に出現した１倍体細胞を採取することができる。１倍体細胞は、強固な細胞壁を有さないため、細胞壁が観察されない細胞を採取すればよい。固体培地で培養した場合、１倍体細胞に特徴的な細胞のコロニー（例えば、扁平で、固体培地の表面に広がる形状を有するコロニー）を採取することにより、１倍体細胞を得ることができる。
（ゲノム改変方法）
　「ゲノム改変」とは、ゲノム上の任意の位置に変異を誘導することを意味する。ゲノム改変方法は、特に限定されず、任意の改変方法を用いることができる。ゲノム改変は、ゲノムＤＮＡ配列の配列特異的に行ってもよく、配列非特異的に行ってもよい。配列特異的なゲノム改変方法としては、例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムを用いる方法、及び相同組換え法等が挙げられる。配列非特異的なゲノム改変方法としては、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、トランスポゾン法等によるＤＮＡ断片の導入；紫外線照射、放射線照射、亜硝酸などによる化学的処理等による変異の誘導等が挙げられる。
　本態様にかかるゲノム改変方法は、配列特異的なゲノム改変方法が好ましい。配列特異的なゲノム改変を行うことにより、迅速に目的の性質を有する改変体を得ることができる。
≪配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システム≫
　「配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システム」とは、配列特異的エンドヌクレアーゼにより配列特異的にゲノムＤＮＡを切断し、当該切断領域に変異を誘導することができるシステムを意味する。配列特異的エンドヌクレアーゼにより切断されたゲノムＤＮＡは、その後、相同組み換え修復（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）又は非相同末端再結合（Ｎｏｎ－Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｅｎｄ－Ｊｏｉｎｉｎｇ　Ｒｅｐａｉｒ：ＮＨＥＪ）のような、細胞の内因性プロセスによってゲノムが修復される。ＮＨＥＪは、ドナーＤＮＡを用いずに二本鎖切断された末端を連結する修復方法であり、修復の際に挿入及び／又は欠失（ｉｎｄｅｌ）が高頻度で誘導される。ＨＤＲは、ドナーＤＮＡを用いた修復機構であり、標的領域に所望の変異を導入することも可能である。ドナーＤＮＡとしては、後述の相同組換え法で用いるターゲティングベクターを用いることができる。
　配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で核酸を切断可能な酵素である。配列特異的エンドヌクレアーゼは、所定の配列で２本鎖ＤＮＡを切断可能な配列特異的エンドデオキシリボヌクレアーゼが好ましい。配列特異的エンドヌクレアーゼとしては、特に限定されないが、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ））、ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＣａｓタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書では、これらの配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムを、それぞれＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔ）／Ｃａｓと記載する。
　「ＺＦＮ」は、ジンクフィンガーアレイを含む結合ドメインにコンジュゲートした核酸切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼを用いるゲノム編集システムを意味する。ＺＦＮの切断ドメインとしては、ＩＩ型制限酵素ＦｏｋＩの切断ドメインが挙げられる。所望の標的配列を切断可能なＺＦＮの設計は、公知の方法で行うことができる。
　「ＴＡＬＥＮ」は、ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＦｏｋＩドメイン）に加えて転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターのＤＮＡ結合ドメインを含む人工ヌクレアーゼを用いるゲノム編集システムを意味する。標的配列を切断可能なＴＡＬＥ構築物の設計は、公知の方法で行うことができる（例えば、Zhang, Feng et. al. (2011) Nature Biotechnology 29 (2)）。
　「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡを用いるゲノム編集システムを意味する。
　「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるゲノム編集に用いられる配列特異的エンドヌクレアーゼの総称であり、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質を指す。Ｃａｓタンパク質は、好ましくは、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、エンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す。Ｃａｓタンパク質としては、特に限定されないが、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、Ｃ２ｃ２タンパク質、及びＣ２ｃ３タンパク質等が挙げられる。Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと協働してエンドヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を示す限り、特に限定されない。Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。Ｃａｓタンパク質は、好ましくはクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものであり、より好ましくはＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するものである。Ｃａｓタンパク質の好ましい例としては、Ｃａｓ９タンパク質が挙げられる。
　Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関与するＣａｓタンパク質であり、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡと協働して標的領域のＤＮＡを切断する活性を示す。Ｃａｓ９タンパク質は、前記の活性を有する限り、特に限定されない。Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質及びそのホモログ（パラログ及びオーソログ）、並びにそれらの変異体を包含する。野生型Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメインとしてＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するが、本明細書におけるＣａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインのいずれか一方が不活性化されたものであってもよい。
　Ｃａｓ９タンパク質が由来する生物種は特に限定されないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、又はトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属に属する細菌等が好ましく例示される。より具体的には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、又はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ等に由来するＣａｓ９タンパク質が好ましく例示される。Ｃａｓ９タンパク質の好ましい例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質が挙げられる。
　「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質を標的領域に誘導することができるＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。ｃｒＲＮＡは、ゲノム上の標的領域への結合に関与し、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質との結合に関与する。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列とリピート配列とを含み、スペーサー配列が標的領域において標的配列の相補鎖と結合する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、アンチリピート配列と３’テイル配列とを含む。アンチリピート配列はｃｒＲＮＡのリピート配列と相補的な配列を有し、リピート配列と塩基対を形成し、３’テイル配列は通常３つのステムループを形成する。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端にｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端を連結した単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを別々のＲＮＡ分子とし、リピート配列及びアンチリピート配列で塩基対を形成させたものであってもよい。
　ｃｒＲＮＡのリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、Ｃａｓタンパク質の種類に応じて適宜選択することができ、Ｃａｓタンパク質と同じ細菌種に由来するものを用いることができる。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を用いる場合、ｓｇＲＮＡの長さは、５０～２２０ヌクレオチド（ｎｔ）程度とすることができ、６０～１８０ｎｔ程度が好ましく、８０～１２０ｎｔ程度がより好ましい。ｃｒＲＮＡの長さは、スペーサー配列を含めて約２５～７０塩基長とすることができ、２５～５０ｎｔ程度が好ましい。ｔｒａｃｒＲＮＡの長さは１０～１３０ｎｔ程度とすることができ、３０～８０ｎｔ程度が好ましい。
　ｃｒＲＮＡのリピート配列は、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌種におけるものと同じであってもよく、３’末端の一部を削除したものであってもよい。ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質が由来する細菌種における成熟ｔｒａｃｒＲＮＡと同じで配列を有していてもよく、当該成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端を切断した末端切断型であってもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡは、成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの３’末端から１～４０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、ｔｒａｃｒＲＮＡは、成熟ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端から１～８０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。また、ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、５’末端から１～２０程度のヌクレオチド残基を除去し、かつ３’末端から１～４０個程度のヌクレオチド残基を除去した末端切断型であり得る。
　ｓｇＲＮＡ設計のためのｃｒＲＮＡリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列は、種々提案されており、当業者は、公知技術に基づいてｓｇＲＮＡを設計することができる（例えば、Jinek et al. (2012) Science, 337, 816-21; Mali et al. (2013) Science, 339: 6121, 823-6; Cong et al. (2013) Science, 339: 6121, 819-23; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 3, 227-9; Jinek et al. (2013) eLife, 2, e00471）。
　「プロトスペーサー隣接モチーフ」（Ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ　Ａｄｊａｃｅｎｔ　Ｍｏｔｉｆ；ＰＡＭ）は、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断の際に、Ｃａｓタンパク質に認識される配列である。ＰＡＭの配列及び位置は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭは標的配列の３’側直後に隣接する必要がある。Ｃａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭの配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌種によって異なっている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＣａｓ９タンパク質に対応する「ＮＡＡＡＡＣ」である（「Ｒ」はＡ又はＧ；「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）。
　Ｃａｓタンパク質による切断の標的となる標的配列の設計は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、標的領域においてＰＡＭを検索し、ＰＡＭの５’側に隣接する配列を標的配列とすることができる。例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａにおいて、ＵＲＡ５．３を標的とする場合、配列番号３３に記載の塩基配列を標的配列として用いることができる。
　上記の配列特異的エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＤＤＢＪ等の各種データベースから得ることができる。
　配列特異的エンドヌクレアーゼは、タンパク質として細胞に導入してもよく、配列特異的エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして細胞に導入してもよい。例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼのｍＲＮＡを細胞に導入してもよく、配列特異的エンドヌクレアーゼの発現ベクターを細胞に導入してもよい。「発現ベクター」とは、対象ポリヌクレオチドを含むベクターであって、該ベクターを導入した細胞内で、対象ポリヌクレオチドを発現可能な状態にするシステムを備えたベクターを指す。「発現可能な状態」とは、ポリヌクレオチドが導入された細胞内で、該ポリヌクレオチドが転写され得る状態にあることを意味する。
　発現ベクターにおいて、配列特異的エンドヌクレアーゼのコード配列（配列特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子）は、プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。「機能的に連結」とは、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチドが、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。プロモーターは、特に限定されず、例えば、ｐｏｌ　ＩＩ系プロモーターを各種使用することができる。ｐｏｌ　ＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢｈプロモーター等が挙げられる。例えば、配列特異的エンドヌクレアーゼのプロモーターとしては、ガルデリア属に属する藻類のＥＦ１プロモーターを用いることができる。ガルデリア属に属する藻類のＥＦ１プロモーターとしては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａのＥＦ１αプロモーター（配列番号１８）が挙げられる。
　発現ベクターは、公知のものを特に制限なく用いることができる。発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ断片等が挙げられる。配列特異的エンドヌクレアーゼがＣａｓタンパク質である場合、発現ベクターは、Ｃａｓタンパク質のコード配列（Ｃａｓタンパク質遺伝子）に加えて、ガイドＲＮＡコード配列（ガイドＲＮＡ遺伝子）を含んでいてもよい。この場合、ガイドＲＮＡコード配列（ガイドＲＮＡ遺伝子）は、ｐｏｌ　ＩＩＩ系プロモーターに機能的にされていることが好ましい。ｐｏｌ　ＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、ガルデリア属に属する藻類のＵ６－ｓｎＲＮＡプロモーター、Ｈ１－ＲＮａｓｅ　Ｐ　ＲＮＡプロモーター、バリン－ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。ガルデリア属に属する藻類のＵ６－ｓｎＲＮＡプロモーターとしては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａのＵ６プロモーター（配列番号１６）が挙げられる。
　上記の配列特異的エンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集システムは、各種製品が市販されている。そのため、それらのゲノム編集システムの市販品を用いて、ガルデリア属に属する藻類のゲノム編集を行うことができる。
≪相同組換え法≫
　相同組換え法は、相同な配列を有する２つのＤＮＡ二本鎖の間で組換えが起こる現象を利用したゲノム改変法である。相同組換え法では、ターゲティングベクターを用いることができ、ターゲティングベクターは、通常、ゲノム改変の対象となる標的領域に隣接する領域に対して相同な配列を含む。ターゲティングベクターは、標的領域の５’側に隣接する５’ホモロジーアームと、標的領域の３’側に隣接する３’ホモロジーアームとを含むことができる。ターゲティングベクターは、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの間に、標的領域に導入することを企図する任意の配列（以下、「導入配列」という）を含むことができる。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの大きさは、ゲノムＤＮＡとの間で相同組換えが起こる大きさであればよく、特に限定されない。５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームは、例えば、５００～３０００ｂｐ程度とすることができる。ターゲティングベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、及び線状ＤＮＡ断片等を用いることができる。
　導入配列は、特に限定されず、任意の配列とすることができる。導入配列としては、例えば、（Ａ）所望の物質の産生に関与する配列、（Ｂ）所望の物質の産生量の向上に関与する配列、（Ｃ）細胞増殖に関与する配列、等が挙げられる。前記（Ａ）及び（Ｂ）における所望の物質としては、例えば、各種栄養成分（アミノ酸類、ビタミン類、タンパク質、脂肪酸、食物繊維等）、酵素、ホルモン、医薬品の活性成分等の各種生理活性物質、炭化水素等が挙げられるが、これらに限定されない。
（Ａ）所望の物質の産生に関与する配列
　所望の物質の産生に関連する配列としては、例えば、所望の物質の合成に関与するタンパク質の遺伝子配列が挙げられる。所望の物質の合成に関与するタンパク質としては、所望の物質の合成酵素、所望の物質の前駆体の合成酵素、所望の物質の合成を阻害する物質の分解酵素等が挙げられるが、これらに限定されない。
（Ｂ）所望の物質の産生量の向上に関与する配列
　所望の物質の産生量の向上に関与する配列としては、所望の物質の産生量の向上に関与するタンパク質の遺伝子配列が挙げられる。所望の物質の産生量の向上に関与するタンパク質としては、上記（Ａ）で挙げたタンパク質に加えて、所望の物質の合成酵素の発現向上に関与するタンパク質、所望の物質の前駆体の合成酵素の発現向上に関与するタンパク質、所望の物質の分解酵素の発現抑制に関与するタンパク質、所望の物質の前駆体の分解酵素の発現抑制に関与するタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質の合成酵素の発現向上に関与するタンパク質としては、前記合成酵素遺伝子のプロモーターに対する転写抑制因子の結合を阻害するタンパク質、前記合成酵素の転写促進因子等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質の前駆体の合成酵素の発現向上に関与するタンパク質としては、前記前駆体合成酵素遺伝子のプロモーターに対する転写抑制因子の結合を阻害するタンパク質、前記前駆体合成酵素の転写促進因子等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質の分解酵素の発現抑制に関与するタンパク質としては、前記分解酵素の転写抑制因子、前記分解酵素遺伝子のプロモーターに対する転写促進因子の結合を阻害するタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質の前駆体の分解酵素の発現抑制に関与するタンパク質としては、前記前駆体分解酵素の転写抑制因子、前記前駆体分解酵素遺伝子のプロモーターに対する転写促進因子の結合を阻害するタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質の産生量の向上に関与する配列は、所望の物質の内在性合成酵素遺伝子又は所望の物質の前駆体の内在性合成酵素遺伝子に機能的に連結させる高発現プロモーター配列であってもよい。所望の物質の産生量の向上に関与する配列は、所望の物質の内在性分解酵素遺伝子又は所望の物質の前駆体の内在性分解酵素遺伝子に機能的に連結させる低発現プロモーター配列であってもよい。
（Ｃ）細胞増殖に関与する配列
　細胞増殖に関与する配列としては、細胞分裂を制御するタンパク質の遺伝子配列が挙げられる。前記タンパク質は、細胞増殖を促進するタンパク質であってもよく、細胞増殖を抑制するタンパク質であってもよい。
　導入配列が任意のタンパク質の遺伝子配列を含む場合、導入配列は、前記遺伝子配列に加えて、前記遺伝子配列の発現を制御する配列を含んでいてもよい。前記発現制御配列としては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
　遺伝子配列は、任意のプロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。プロモーターは、ガルデリア属に属する藻類の細胞で機能し得るものであれば特に限定されない。プロモーターは、前記遺伝子のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。他の遺伝子のプロモーターとしては、例えば、ＡＰＣＣのプロモーター、ＣＰＣＣのプロモーター、Ｃａｔａｌａｓｅのプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、ガルデリア属に属する藻類のプロモーターであってもよく、他の生物（例えば、他の藻類）の遺伝子のプロモーターであってもよい。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａのＥＦ１αプロモーター（配列番号１８）、Ｃａｔａｌａｓｅプロモーター（配列番号１９）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　遺伝子配列の３’末端には任意のターミネーターが連結されていることが好ましい。ターミネーターは、ガルデリア属に属する藻類の細胞で機能し得るものであれば特に限定されない。ターミネーターは、前記遺伝子のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。他の遺伝子のターミネーターとしては、上記プロモーターとして例示した遺伝子のターミネーターに加えて、β－チューブリンのターミネーター、ユビキチンのターミネーター等が挙げられる。好適なターミネーターとしては、例えば、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａのユビキチンターミネーター（配列番号２０）、β－チューブリンターミネーター（配列番号２１）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　導入配列は、任意のタンパク質の遺伝子配列に加えて、選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性に関連する遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等が挙げられる。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ガルデリア属に属する藻類が感受性を示す抗生物質に対する耐性遺伝子が挙げられる。そのような遺伝子としては、例えば、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子（例えば、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子；配列番号２５）、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。栄養要求性に関連する遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ５．３遺伝子等が挙げられる。蛍光タンパク質遺伝子としては、例えば、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子（配列番号２７）、ＧＦＰ遺伝子、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子等が挙げられる。これらの選択マーカー遺伝子も、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列を有していてもよい。選択マーカー遺伝子は、ガルデリア属に属する藻類で機能するプロモーターに、機能的に連結されていることが好ましい。プロモーター及びターミネーターとしては、上記と同様のものが挙げられる。
　導入配列がタンパク質コード配列である場合、当該タンパク質コード配列は、ガルデリア属に属する藻類のコドン使用頻度に基づきコドン最適化されていてもよい。コドン最適化することにより、前記タンパク質コード配列の翻訳効率を向上させることができる。
≪標的領域≫
　ゲノム改変の標的となる領域は、ゲノム改変の目的に応じて、適宜設定することができる。例えば、ゲノム改変の目的が特定の遺伝子の破壊にある場合、標的領域は、前記特定の遺伝子のコード領域内、又は前記特定の遺伝子のプロモーター領域に設定することができる。ゲノム改変の目的が、任意のタンパク質の遺伝子の導入にある場合、標的領域は、内生的にゲノムに存在する遺伝子及びその周辺領域以外の領域に設定することが好ましい。標的領域は、例えば、セーフ・ハーバー領域（ニュートラル領域）に設定することができる。「セーフ・ハーバー領域（ニュートラル領域）」とは、細胞に対して有害な効果を示すことなく外来ＤＮＡの挿入が可能であることが実証されているゲノム領域を意味する。ガルデリア属に属する藻類のセーフ・ハーバー領域としては、例えば、配列番号１５に記載の塩基配列からなる領域（ＮＳ１領域）等が挙げられる。ＮＳ１領域を標的とする場合、５’ホモロジーアームは、例えば、配列番号２９に記載の塩基配列の一部又は全部を含んでいてもよい。ＮＳ１領域を標的とする場合、３’ホモロジーアームは、例えば、配列番号３０に記載の塩基配列の一部又は全部を含んでいてもよい。
　ゲノム改変の目的は、特に限定されないが、例えば、下記（ａ）～（ｃ）のいずれかのゲノム改変が挙げられる。
　（ａ）所望の物質を産生させるゲノム改変。
　（ｂ）所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変。
　（ｃ）細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変。
（ａ）所望の物質を産生させるゲノム改変
　所望の物質を産生させるゲノム改変は、例えば、前記（Ａ）所望の物質の産生に関与する配列を含むターゲティングベクターを用いて行うことができる。ゲノム改変は、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムにより行ってもよく、相同組換え法により行ってもよい。標的領域は、内在性遺伝子及びその周辺領域以外のゲノム領域に設定することが好ましく、セーフ・ハーバー領域に設定することがより好ましい。
（ｂ）所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変
　所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変は、例えば、前記（Ｂ）所望の物質の産生量の向上に関与する配列を含むターゲティングベクターを用いて行うことができる。ゲノム改変は、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムにより行ってもよく、相同組換え法により行ってもよい。標的領域は、内在性遺伝子及びその周辺領域以外のゲノム領域に設定することが好ましく、セーフ・ハーバー領域に設定することがより好ましい。
　所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変は、所望の物質又はその前駆体の内在性合成酵素遺伝子又はその内在性発現促進因子の内在性プロモーターを高発現プロモーターに変更するゲノム改変であってもよい。この場合、標的領域は、前記内在性合成酵素遺伝子の内在性プロモーター領域内に設定することができる。
　所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変は、所望の物質又はその前駆体の内在性分解酵素遺伝子又はその内在性発現促進因子の内在性プロモーターを低発現プロモーターに変更するゲノム改変であってもよい。この場合、標的領域は、前記内在性分解酵素遺伝子の内在性プロモーター領域内に設定することができる。
　所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変は、所望の物質又はその前駆体の内在性分解酵素遺伝子又はその内在性発現促進因子を破壊するゲノム改変であってもよい。この場合、標的領域は、前記内在性分解酵素遺伝子のコード領域内又はその内在性プロモーター領域内に設定することができる。
（ｃ）細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変
　細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変は、例えば、前記（Ｃ）細胞増殖に関与する配列を含むターゲティングベクターを用いて行うことができる。ゲノム改変は、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムにより行ってもよく、相同組換え法により行ってもよい。標的領域は、内在性遺伝子及びその周辺領域以外のゲノム領域に設定することが好ましく、セーフ・ハーバー領域に設定することがより好ましい。
　細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変は、細胞分裂を制御するタンパク質の内在性遺伝子又はその内在性発現制御因子（発現促進因子若しくは発現抑制因子）の内在性プロモーターを高発現プロモーター又は低発現プロモーターに変更するゲノム改変であってもよい。この場合、標的領域は、前記内在性遺伝子又はその内在性発現制御因子の内在性プロモーター領域内に設定することができる。
　細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変は、細胞分裂を制御するタンパク質の内在性遺伝子又はその内在性発現制御因子（発現促進因子若しくは発現抑制因子）を破壊するゲノム改変であってもよい。この場合、標的領域は、前記内在性遺伝子のコード領域内又はその内在性プロモーター領域内に設定することができる。
≪ゲノム改変成分の導入方法≫
　ゲノム改変を、配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムにより行う場合、配列特異的エンドヌクレアーゼは、タンパク質として導入してもよく、前記タンパク質をコードするｍＲＮＡとして導入してもよく、前記タンパク質をコードするＤＮＡとして導入してもよい。ゲノム改変システムとして、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いる場合、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡと、標的領域に相同な配列を含むガイドＲＮＡとを用いることができる。さらに、必要に応じて、ドナーＤＮＡを用いることができる。
　ゲノム改変を相同組換え法により行う場合、上記のようなターゲティングベクターを用いることができる。
　ガルデリア属に属する藻類の１倍体に、ゲノム改変に必要な成分を導入する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
　ゲノム改変成分が核酸である場合、核酸導入方法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
　ゲノム改変成分がタンパク質である場合、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
　ゲノム編集システムにおいて、配列特異的エンドヌクレアーゼは、導入効率の観点から、ｍＲＮＡ又はＤＮＡとして細胞に導入することが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして細胞に導入してもよく、ＤＮＡとして細胞に導入して細胞内でＲＮＡを発現させてもよい。Ｃａｓタンパク質をＤＮＡとして細胞に導入する場合、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとは、同じ発現ベクター上にクローニングされていてもよい。
［任意工程］
　本態様にかかるゲノム改変方法は、上記ゲノム改変工程に加えて、任意工程を含んでいてもよい。前記任意工程としては、例えば、ゲノム改変細胞を選択する工程（選択工程）、ゲノム改変細胞を培養する工程（培養工程）、等が挙げられる。
（選択工程）
　本態様にかかるゲノム改変方法は、前記ゲノム改変工程の後、ゲノム改変細胞を選択する工程を含んでいてもよい。前記ゲノム改変工程で、選択マーカーを導入した場合には、選択マーカーの発現を指標として、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　例えば、選択マーカーとして、抗生物質耐性遺伝子を用いた場合には、ゲノム改変後の細胞を、当該抗生物質を含む培地で培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。例えば、抗生物質耐性遺伝子として、ＢＳＤ遺伝子を用いた場合には、ブラストサイジンＳを含む培地でゲノム改変後の細胞を培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　例えば、選択マーカーとして、ガルデリア属に属する藻類の生存に必要な栄養成分の合成酵素を用いた場合、当該栄養成分を含まない培地でゲノム改変後の細胞を培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　例えば、選択マーカーとして、特定成分を毒性成分に変換する酵素を用いた場合、当該特定成分を含む培地でゲノム改変後の細胞を培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　例えば、ＵＲＡ５．３遺伝子を標的領域としてゲノム改変を行い、ＵＲＡ５．３遺伝子を破壊した場合、ウラシル及び５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を含む培地でゲノム改変後の細胞を培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。ＵＲＡ５．３遺伝子を正常に発現する細胞では、ＵＲＡ５．３遺伝子の遺伝子産物により、ウラシル及び５－ＦＯＡが、毒性のある５-フルオロウラシルに変換されるためである。
　正常なＵＲＡ５．３遺伝子を有さない１倍体細胞に対して、ＵＲＡ５．３遺伝子を選択マーカーとしてゲノム改変を行った場合、ウラシルを含まない培地でゲノム改変後の細胞を培養することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　例えば、選択マーカーとして、蛍光タンパク質遺伝子を用いた場合には、当該蛍光タンパク質の蛍光に基づいて、フローサイトメトリー等によりゲノム改変後の細胞を選別することにより、ゲノム改変細胞を選択することができる。
　選択工程で用いる培地及び培養条件としては、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた培地及び培養条件と同様のものを用いることができる。選択工程における培養時間は、ゲノム改変されていない細胞が死滅する時間であれば、特に限定されない。選択工程における培養時間としては、例えば、１～５日以上、２～５日以上、又は３～５日以上等が挙げられる。
（培養工程）
　本態様にかかるゲノム改変方法は、前記ゲノム改変工程の後、ゲノム改変細胞を培養する工程を含んでいてもよい。培養工程は、前記選択工程の前に行ってもよく、選択工程の後に行ってもよい。培養工程で用いる培地及び培養条件としては、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた培地及び培養条件と同様のものを用いることができる。培養工程を行うことにより、ゲノム改変細胞を任意の量に増やすことができる。
　培養工程を前記選択工程の後に行う場合には、培地として、前記選択工程と同様のものを用いてもよい。
　本態様にかかるゲノム改変方法によれば、ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対してゲノム改変を行うため、２つのアレルが改変される必要がない。そのため、所望の形質を有するゲノム改変細胞を容易に得ることができる。１倍体は、強固な細胞壁を有さないため、ゲノム改変成分の導入効率が、２倍体と比較して向上する。そのため、効率よくゲノム改変を行うことができる。
＜ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法＞
　本発明の第２の態様は、前記第１の態様にかかるゲノム改変方法により、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変を行う工程（Ａ；ゲノム改変工程）を含む、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法である。
［ゲノム改変工程；工程（Ａ）］
　ゲノム改変工程は、前記第１の態様にかかるゲノム改変方法と同様に行うことができる。
［任意工程］
　本態様にかかる製造方法は、前記ゲノム改変工程に加えて、任意工程を含んでいてもよい。前記任意工程としては、例えば、ゲノム改変細胞を２倍体にする工程（Ｂ；２倍体化工程）、前記２倍体を培養する工程（Ｃ；２倍体培養工程）、前記２倍体を１倍体にする工程（Ｄ；再１倍体化工程）等が挙げられる。
（２倍体化工程；工程（Ｂ））
　本態様にかかる製造方法は、前記ゲノム改変工程（工程（Ａ））後、ゲノム改変細胞を２倍体にする工程を含んでいてもよい。前記ゲノム改変工程では、ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う。そのため、得られるゲノム改変細胞は、１倍体である。１倍体の細胞は、強固な細胞壁を有さず、２倍体の細胞と比較して、壊れやすく、培養条件に影響されやすい。そこで、ゲノム改変細胞を２倍体にすることにより、培養条件に影響されず、ゲノム改変細胞を効率よく増殖できると考えられる。
　ゲノム改変細胞を２倍体にする方法としては、１倍体のゲノム改変細胞を、任意の期間培養する方法が挙げられる。適時、植え継ぎながら培養を継続することにより、２倍体細胞が出現する。出現した２倍体細胞を採取することにより、２倍体細胞を得ることができる。
　培養に用いる培地としては、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた培地と同様の培地が挙げられる。浸透圧調整剤の含有量は、８０ｍＭ未満であることが好ましく、７０ｍＭ以下であることがより好ましく、６０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。培地の浸透圧は、１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であることが好ましく、１４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であることが好ましく、１２０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であることがさらに好ましい。
　培養条件は、特に限定されず、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた条件と同様の培養条件を用いることができる。ｐＨ条件としては、ｐＨ０．２５～８．０が挙げられ、ｐＨ０．５～６．０が好ましく、ｐＨ０．５～４．０がより好ましく、ｐＨ０．５～３．０がさらに好ましく、ｐＨ０．５～２．０が特に好ましい。温度条件としては、１５～５０℃が挙げられ、３０～５０℃が好ましく、３５～５０℃がより好ましい。光照射下で培養する場合、光強度としては、５～２０００μｍｏｌ／ｍ２ｓが挙げられ、５～１５００μｍｏｌ／ｍ２ｓが好ましい。連続光で培養してもよく、明暗周期（１０Ｌ：１４Ｄなど）を設けてもよい。従属栄養的に培養する場合には、暗所で培養することもできる。
　細胞は、液体培地で培養してもよく、固体培地で培養してもよい。液体培地で培養した場合、顕微鏡下で観察しながら、培養液に出現した２倍体細胞を採取することができる。２倍体細胞は、強固な細胞壁を有するため、細胞壁が観察される細胞を採取すればよい。また、固体培地で培養した場合、２倍体細胞のコロニーは、１倍体細胞のコロニーと比較して、広がらず、隆起した形状となる。そのため、２倍体細胞に特徴的な細胞のコロニーを採取することにより、２倍体細胞を得ることができる。
　取得した細胞が２倍体であることは、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた方法と同様の方法で確認することができる。
（２倍体培養工程；工程（Ｃ））
　本態様にかかる製造方法は、前記２倍体化工程（工程（Ｂ））後、２倍体を培養にする工程をさらに含んでいてもよい。２倍体のゲノム改変細胞を培養することにより、培養条件に影響されず、ゲノム改変細胞を効率よく増殖できると考えられる。
　２倍体培養工程で用いる培地及び培養条件としては、上記２倍体化工程で挙げた培地及び培養条件と同様のものが挙げられる。培養細胞は、静止期になる前に、適宜、植え継ぎを行うことが好ましい。植え継ぎ間隔は、２倍体の生育状態に応じて適宜調整することができ、例えば、３～１０日、４～８日、又は５～６日等が挙げられる。
　培養は、増殖させやすいことから、液体培地で行うことが好ましい。
（再１倍体化工程；工程（Ｄ））
　本態様にかかる製造方法は、前記２倍体培養工程（工程（Ｃ））の後、１倍体にする工程をさらに含んでいてもよい。１倍体にした後に、再度ゲノム改変を行ってもよく、ゲノム改変体が産生する物質を回収してもよい。１倍体は、強固な細胞壁を有さないため、比較的温和な処理で細胞を破壊することができる。そのため、細胞内成分の回収を簡易に効率よく行うことができる。また、１倍体を、食品等に含有させてもよい。１倍体は、強固な細胞壁を有さないため、２倍体と比較して、消化吸収率が高くなると考えられる。
　２倍体を１倍体にする方法としては、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた方法と同様の方法が挙げられる。
　本態様にかかる製造方法によれば、１倍体の細胞に対してゲノム改変を行うことにより、所望の形質を有するゲノム改変体を効率よく作出することができる。また、ゲノム改変後に、２倍体にし、２倍体を培養することにより、所望の形質を有するゲノム改変体を効率よく増殖させることができる。さらに、２倍体を再度１倍体にすることにより、再度、効率よくゲノム改変を行うことができる。また、２倍体を再度１倍体にすることにより、ゲノム改変体が産生する物質を効率よく回収することができる。
＜所望の物質の製造方法＞
　本発明の第３の態様は、前記第２の態様にかかる製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程（ゲノム改変体製造工程）と、前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程（所望物質産生工程）と、前記所望の物質を回収する工程（所望物質回収工程）と、を含む、所望の物質の製造方法（以下、「所望物質製造方法」という）である。
　本態様にかかる所望物質製造方法で製造する所望の物質は、特に限定されず、任意の物質であってよい。所望の物質は、ガルデリア属に属する藻類が、内生的に産生する物質であってもよく、外来遺伝子を導入して産生させる物質であってもよい。所望の物質としては、上記（ゲノム改変方法）で挙げた物質と同様の物質が挙げられる。
［ゲノム改変体製造工程］
　ゲノム改変体製造工程は、前記第２の態様にかかる製造方法と同様に行うことができる。本工程において行うゲノム改変は、上記（ゲノム改変方法）で挙げた（ａ）～（ｃ）のいずれのゲノム改変であってもよく、（ａ）～（ｃ）の２以上のゲノム改変を組み合わせてもよい。（ｃ）のゲノム改変は、細胞増殖を促進させるゲノム改変であることが好ましい。
　（ａ）所望の物質を産生させるゲノム改変を行うことにより、ゲノム改変体に、野生株が産生しない物質を産生させることができる。（ｂ）所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変を行うことにより、ゲノム改変体において、ガルデリア属に属する藻類が内生的に産生する物質の産生量を向上させることができる。（ｃ）細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変において細胞増殖を促進させるゲノム改変を行うことにより、所望の物質を産生するゲノム改変体を効率よく増殖させることができる。
［所望物質産生工程］
　所望物質産生工程は、前記ゲノム改変体製造工程で得たゲノム改変体に、所望の物質を産生させる工程である。本工程は、ゲノム改変体を培養することにより、行うことができる。本工程で培養するゲノム改変体は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。
　１倍体を培養する場合、ゲノム改変後の１倍体細胞をそのまま培養してもよい。あるいは、ゲノム改変後の１倍体細胞を２倍体にして増殖させた後、再度１倍体に戻して培養してもよい。培地及び培養条件は、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた培地及び培養条件と同様のものを用いることができる。
　２倍体細胞を培養する場合、上記（２倍体化工程）で挙げた方法によりゲノム改変体を２倍体とすることができる。２倍体の培養は、上記（２倍体培養工程）と同様に行うことができる。
　本工程は２倍体細胞の培養により行うことが好ましい。ゲノム改変体を２倍体として培養することにより、ゲノム改変体を効率よく増殖させることができ、所望の物質を効率よく産生させることができる。
［所望物質回収工程］
　所望物質回収工程は、前記所望物質産生工程においてゲノム改変体に産生させた所望の物質を回収する工程である。本工程は、ゲノム改変体の１倍体を用いて行ってもよく、２倍体を用いて行ってもよいが、１倍体を用いることが好ましい。１倍体は強固な細胞壁を有さないため、比較的温和な条件で、細胞を破壊することができる。そのため、簡易且つ効率的に、所望物質を回収することができる。１倍体は、ゲノム改変後の１倍体をそのまま培養し、所望の物質を産生させたものであってもよい。あるいは、１倍体は、ゲノム改変後に２倍体として培養し、所望の物質を産生させた後、再度、１倍体としたものであってもよい。１倍体とする方法としては、上記（ガルデリア属に属する藻類）で挙げた方法と同様のものが挙げられる。
　本工程で回収される所望の物質は、所望の物質のみを完全に精製したものである必要はなく、所望の物質以外の他の成分を含むものであってもよい。本工程で回収される所望の物質は、所望の物質を細胞内容物として含む１倍体細胞又は２倍体細胞であってもよく、これらの細胞の細胞破壊物であってもよく、細胞破壊物から固形分を除去したものであってもよい。
　所望物質の回収は、例えば、１倍体又は２倍体の培養液から、これらの細胞を回収することにより、行うことができる。培養液からの細胞の回収は、例えば、遠心分離、ろ過等により行うことができる。
　回収した細胞は、そのまま用いてもよいし、細胞を破壊して用いてもよい。細胞の破壊は、公知の方法を用いて行うことができる。細胞は、例えば、物理的処理により破壊することができる。物理的処理の方法としては、例えば、ガラスビーズ、乳鉢、超音波処理、フレンチプレス、ホモジナイザー等による細胞破壊が挙げられる。細胞は、例えば、化学的処理により破壊することができる。化学的処理の方法としては、例えば、中和処理、低張処理、凍結融解処理、乾燥膨潤処理、酵素処理、界面活性剤処理等による細胞破壊が挙げられる。２倍体の細胞は、強固な細胞壁を有するため、物理的処理か、物理的処理と化学的処理とを組み合わせて細胞を破壊することが好ましい。１倍体の細胞は、強固な細胞壁を有さないため、比較的温和な化学的処理により、細胞を破壊することができる。
　中和処理の方法としては、ｐＨ７～１０程度の中和液に、１倍体の細胞を浸漬する方法が挙げられる。中和液の組成は、特に限定されないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液等を用いることができる。中和液への細胞の浸漬時間は、細胞が破壊される程度の時間とすればよく、例えば、１週間程度が挙げられる。
　低張処理の方法としては、水などの低張液に、１倍体の細胞を浸漬する方法が挙げられる。低張液の組成は、特に限定されず、１倍体の細胞が破裂する程度の低張な液体であればよい。低張液としては、例えば、水、低塩濃度の緩衝液等が挙げられる。低張液への細胞の浸漬時間は、細胞が破裂する程度の時間とすればよく、例えば、１～３０分程度が挙げられる。低張液への浸漬後、遠心分離等で藻類細胞を回収し、低張液に再懸濁することを、繰り返してもよい。再懸濁回数は、特に限定されないが、例えば、１～５回が挙げられる。
　凍結融解処理の方法としては、１倍体の細胞に対して、凍結と融解のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。凍結と融解のサイクル回数としては、例えば、１～５回程度が挙げられる。凍結及び融解の各時間は、特に限定されず、例えば、各々１０～３０分程度が例示される。
　乾燥膨潤処理の方法としては、１倍体の細胞に対して、乾燥と緩衝液への再懸濁のサイクルを１回以上行う方法が挙げられる。乾燥と再懸濁のサイクル回数としては、例えば、１～５回程度が挙げられる。
　酵素処理の方法としては、例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ、リゾチーム等の酵素を用いる方法が挙げられる。
　界面活性剤を用いる方法としては、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤を用いる方法が挙げられる。
　本工程では、細胞を破壊した後、遠心分離又は濾過等により、固形分を除去してもよい。固形分を除去した後の粗抽出物に対して、生化学物質の分離・精製に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて実施し、所望の物質をさらに分離・精製してもよい。分離・精製としては、例えば、塩析、透析、再結晶、再沈殿、溶媒抽出、吸着、濃縮、ろ過、ゲルろ過、限外ろ過、各種クロマトグラフィ（薄層クロマトグラフィ、カラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィなど）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　所望の物質が、細胞外に分泌される物質である場合、１倍体又は２倍体の培養液から培養上清を回収することにより、所望の物質の回収を行うことができる。培養上清の回収は、培養液の遠心分離又は濾過等により行うことができる。回収した培養上清に対して、生化学物質の分離・精製に一般的に用いられる方法を適宜組み合わせて実施し、所望の物質をさらに分離・精製してもよい。
　本態様にかかる所望物質製造方法によれば、前記第２の態様いかかる製造方法によりゲノム改変体を取得し、所望の物質を産生させるため、所望の物質の産生又は所望の物質の回収を効率よく行うことができる。本態様にかかる所望物質製造方法により得た所望の物質は、所望の物質の種類に応じて、適宜、食品、化粧品、飼料又はペットフード、餌料、工業製品等に利用することができる。
＜食品の製造方法＞
　本発明の第４の態様は、前記第３の態様にかかる所望物質製造方法により、所望の物質を製造する工程（所望物質製造工程）と、前記所望の物質を含有する食品を製造する工程（食品製造工程）と、を含む、食品の製造方法（以下、「食品製造方法」という）である。
　本態様にかかる食品製造方法で製造する食品は、特に限定されず、任意の食品であってよい。食品としては、例えば、そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺などの各種の麺類；パン、小麦粉、米粉、ホットケーキ、マッシュポテトなどの炭水化物類；青汁、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、野菜飲料、乳酸飲料、乳飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒーなどの飲料；豆腐、おから、納豆などの豆製品；カレールー、シチュールー、インスタントスープなどの各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷などの冷菓類；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子などの菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージなどの水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルトなどの乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシングなどの油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれなどの調味料；各種レトルト食品、ふりかけ、漬物などのその他加工食品、等が挙げられるが、これらに限定されない。
　食品は、機能性食品又は栄養補助食品であってもよい。機能性食品又は栄養補助食品は、上述のような一般的な食品の形態であってもよく、乾燥粉末、顆粒剤、錠剤、ゼリー剤、ドリンク剤等の形態であってもよい。
（所望物質製造工程）
　所望物質製造工程は、前記第３の態様にかかる所望物質製造方法により行うことができる。
（食品製造工程）
　食品製造工程は、所望の物質を含有する食品を製造する工程である。本工程において、食品は、所望の物質を食品原料に添加し、適宜他の食品添加物を添加して、食品の種類に応じた公知の方法に従って、製造することができる。
　本態様にかかる食品製造方法によれば、所望の物質の添加により栄養強化された食品を得ることができる。
＜栄養要求性のガルデリア属に属する藻類＞
　本発明の第５の態様は、栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有し、前記栄養成分の要求性を有する、ガルデリア属に属する藻類である。
　「栄養成分の合成に関与する遺伝子」とは、任意の栄養成分の合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。栄養成分の合成に関与する遺伝子としては、例えば、栄養成分の合成酵素遺伝子、栄養成分の前駆体の合成酵素遺伝子、前記合成酵素遺伝子の活性化タンパク質をコードする遺伝子、前記合成酵素遺伝子の転写を制御する遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。栄養成分は、特に限定されず、任意の栄養成分であり得る。栄養成分としては、例えば、塩基、アミノ酸、ビタミン等が挙げられるが、これらに限定されない。栄養成分の具体例としては、例えば、ウラシルが挙げられる。栄養成分の合成に関与する遺伝子の具体例としては、例えば、ＵＲＡ５．３遺伝子が挙げられる。
　「栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有する」とは、栄養成分の合成に関与する遺伝子の塩基配列において、置換、欠失、挿入、及び付加からなる群より選択される少なくとも１種の変異が生じていることを意味する。前記置換、欠失、挿入、及び／又は付加される塩基の数は、特に限定されない。栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有するか否かは、例えば、任意の栄養成分の要求性を示さない野生株（ＷＴ）が有する当該遺伝子の塩基配列を基準として評価される。すなわち、評価対象の藻類株が有する栄養成分の合成に関与する遺伝子の塩基配列が、野生株が有する当該遺伝子の塩基配列と異なっている場合、対象藻類株は、当該栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有すると評価される。ガルデリア属に属する藻類の野生株は、例えば、ＡＴＣＣ、ＮＩＥＳ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ等の藻類カルチャーコレクションから入手することができる。変異は、サイレント変異でないことが好ましく、当該遺伝子から発現するタンパク質の機能を損なわせる変異であることが好ましい。変異は、例えば、フレームシフトを生じさせる変異であり得る。栄養成分の合成に関与する遺伝子における変異は、ゲノム改変により導入されたものであることが好ましい。本態様にかかるガルデリア属に属する藻類は、ゲノム改変体であることが好ましい。
　栄養成分の合成に関与する遺伝子が２コピー以上存在する場合、前記２コピー以上の遺伝子の全てが変異を有することが好ましい。２コピー以上の遺伝子の全てが変異を有し、２コピー以上の遺伝子の全てが機能的なタンパク質を発現できないことがより好ましい。
　「栄養成分の要求性を有する」とは、任意の栄養成分の非存在下では生育できないことを意味する。任意の栄養成分の要求性を有する藻類は、前記栄養成分の非存在下では生育できないが、前記栄養成分の存在下では生育することができる。本態様にかかるガルデリア属に属する藻類は、栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有し、当該遺伝子から機能的なタンパク質を発現できないことにより、当該栄養成分の要求性を有することが好ましい。
　本態様にかかるガルデリア属に属する藻類は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。本態様にかかるガルデリア属に属する藻類が２倍体である場合、栄養成分の合成に関与する遺伝子は、両アレルで変異を有することが好ましい。ガルデリア属に属する藻類が２倍体であり、栄養成分の合成に関与する遺伝子が２コピー以上存在する場合、両アレルの当該遺伝子の全てが変異を有し、両アレルの当該遺伝子の全てが機能的なタンパク質を発現できないことがより好ましい。栄養成分の合成に関与する遺伝子の変異は、両アレルで同じ変異であってもよく、異なる変異でもよいが、同じ変異であることが好ましい。すなわち、栄養成分の合成に関与する遺伝子の変異をホモで有するホモ２倍体であることが好ましい。そのようなホモ２倍体は、前記第１の態様にかかるゲノム改変方法により、１倍体の細胞において、栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を導入した後、２倍体の細胞を誘導することにより、作製することができる。
　本態様にかかるガルデリア属に属する藻類としては、例えば、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有し、ウラシル要求性であるもの（以下、「ウラシル要求性株」ともいう）が挙げられる。ＵＲＡ５．３遺伝子は、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子である。オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼは、オロチジン５’－リン酸をウリジン５’－リン酸（ＵＭＰ；ウラシル前駆体）に変換する反応を触媒する酵素である。ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有し、機能的なオロチジン－５’－デカルボキシラーゼが発現されない場合、細胞は、ＵＭＰ及びウラシルを合成できないため、ウラシル要求性となる。オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼは、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）を、細胞毒性のある５－フルオロウリジン（５－ＦＵ）に変換する反応も触媒する。そのため、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有さず、機能的なオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼが発現される場合、細胞は、５－ＦＯＡの存在下では生存することができない。一方、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有し、機能的なオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼが発現されない場合、細胞は、５－ＦＯＡ及びウラシルの存在下で生存することができる。
　ウラシル要求性株は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。ガルデリア属に属する藻類は、通常、ＵＲＡ５．３遺伝子を２コピー有するため、２コピーのＵＲＡ５．３遺伝子のいずれにも変異を有し、機能的なオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼを発現できないことが好ましい。ウラシル要求性株が２倍体である場合、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を有するホモ２倍体であることが好ましい。そのようなウラシル要求性株は、前記第１の態様にかかるゲノム改変方法により、１倍体の細胞において、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を導入した後、２倍体の細胞を誘導することにより、作製することができる。例えば、ＵＲＡ５．３のコード領域内に標的配列を設計し、前記標的配列を含むｇＲＮＡを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによりゲノム編集を行うことにより、ＵＲＡ５．３遺伝子に変異を導入することができる。Ｇ．ｐａｒｔｉｔａの場合、ＵＲＡ５．３コード領域内の標的配列としては、図３に示す標的配列（配列番号３３）が挙げられる。
　ウラシル要求性株が、ＵＲＡ５．３遺伝子に有する変異は、機能的なオロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼを発現できないものであれば、特に限定されない。変異している塩基の種類及び変異している塩基の数も特に限定されない。Ｇ．ｐａｒｔｉｔａの場合、ＵＲＡ５．３遺伝子における変異の具体例としては、例えば、配列番号２２で示されるＵＲＡ５．３遺伝子の１９４位～１９５位の範囲に、変異（欠失、挿入、及び／又は置換）を有するものが挙げられる。前記変異としては、例えば、配列番号２２で示されるＵＲＡ５．３遺伝子において、１９４位のチミン残基（Ｔ）の欠失、１９５位のアデニン残基（Ａ）の欠失、１９４位のチミン残基と１９５位のアデニン残基（Ａ）の間への１～数個（例えば、２、３、４又は５個）のヌクレオチド残基の挿入、これらの組合せ等が挙げられる。具体例としては、図８の＃１＿１、＃１＿２、＃２＿１、＃２＿２、＃３＿１、＃３＿２の変異が挙げられる。すなわち、Ｇ．ｐａｒｔｉｔａのウラシル要求性株としては、ＵＲＡ５．３遺伝子座に配列番号７～１２からなる群より選択される塩基配列を含むものが挙げられる。ＵＲＡ５．３遺伝子における変異は、これらに限定されず、これらの変異に替えて、又はこれらの変異に加えて、他の変異を有してもよい。
　本態様にかかる栄養要求性のガルデリア属に属する藻類により、ガルデリア属に属する藻類において、前記栄養要求性をゲノム改変の選択マーカーとして用いることが可能となる。これにより、ガルデリア属に属する藻類におけるセルフクローニングを実現する技術が提供される。
＜他の態様＞
　他の態様において、本発明は、前記第２の態様にかかる製造方法により製造されたゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を提供する。前記藻類は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。２倍体である場合、ゲノム改変された配列をホモで有するホモ２倍体であることが好ましい。
　他の態様において、本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含むガルデリア属に属する藻類を提供する。前記藻類は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。２倍体である場合、抗生物質耐性遺伝子をホモで有するホモ２倍体であることが好ましい。前記抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、ＢＳＤ遺伝子が挙げられる。
　他の態様において、本発明は、前記第３の態様にかかる所望の物質の製造方法により製造された、所望の物質を提供する。前記所望の物質としては、上記例示した成分と同様のものが挙げられる。
　他の態様において、本発明は、前記第２の態様にかかる製造方法により製造されたゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を含有する食品を提供する。前記藻類は、１倍体であってもよく、２倍体であってもよい。２倍体である場合、ゲノム改変された配列をホモで有するホモ２倍体であることが好ましい。消化吸収の観点から、本態様にかかる食品は、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の１倍体を含有することが好ましい。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜培地＞
　試験に使用したＭＡ培地（Minoda A et al. Plant Cell Physiol. 2004 45: 667-71.）の組成を表１に示す。Ａ２　ｔｒａｃｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ及びＡ２　Ｆｅ　ｓｔｏｃｋの組成を表２及び３にそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　試験に使用したＭＡ２培地（Ohnuma M et al. Plant Cell Physiol. 2008 Jan;49(1):117-20.）の組成を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜ガルデリア（１倍体）の培養条件の検討＞
　ガルデリア属に属する藻類として、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ　ｐａｒｔｉｔａ　ＮＢＲＣ１０２７５９の１倍体（以下、「ガルデリア（１倍体）」ともいう）を用い、培養条件の検討を行った。
　ガルデリア（１倍体）を、ｐＨ０．１～２．０に調整したＭＡ培地を用いて培養した。培養開始から７日後、培養液のＯＤ７５０を測定して、生育状況を確認した。
　結果を図２に示す。ｐＨ０．５～１．２が至適ｐＨであることが確認された。そこで、培養ｐＨとしてｐＨ１．０を選択した。
＜ウラシル要求性株の作製＞
（ゲノム編集用ＤＮＡの作製）
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、ＰＡＭ配列の５’側に隣接する標的配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計し、Ｃａｓ９と共に細胞に導入することで、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を標的配列として切断することができる。
　図３は、ウラシル要求性株の作製に用いたｇＲＮＡの標的配列（配列番号３３）を示す。ＵＲＡ５．３遺伝子（配列番号２２）のコード配列内に標的配列を設計した。図３中、ＰＵＲＡ５．３は、ＵＲＡ５．３遺伝子のプロモーターを表し、ＴＵＲＡ５．３は、ＵＲＡ５．３遺伝子のターミネーターを表す。標的配列を有するＤＮＡ断片を、ユーロフィンに依頼して、ホスホロアミダイト法により合成した。ＵＲＡ５．３遺伝子のＣＤＳを配列番号２３に示す。
　図４は、ウラシル要求性株の作製に用いたゲノム編集用プラスミドのコンストラクトを示す。図４中、Ｐｕ６はＵ６プロモーター（配列番号１６）、ＰＥＦ１－ａはＥＦ１－ａ遺伝子のプロモーター（配列番号１８）、ＴＵＢＱはユビキチン遺伝子のターミネーター（配列番号２０）、ＮＬＳは核移行シグナル（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）を示す。ｇＲＮＡ　ｓｃａｆｏｌｄ（配列番号１７）は、標的配列を含まないｓｇＲＮＡを示す。図４に示すように、ゲノム編集用プラスミドでは、Ｐｕ６とｇＲＮＡ　ｓｃａｆｆｏｌｄとの間に２０ｂｐの標的配列（図３参照）が挿入されている。図４に示すゲノム編集用プラスミドを作製するために、まず、図５に示すコンストラクトを含むプラスミドを作製した。次に、図６に示すプライマーを用いて、前記プラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し、増殖させた後、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドを鋳型として下記プライマー（ｐｕｃ１９＿Ｆ、ｐｕｃ１９＿Ｒ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＤＮＡ断片を、ウラシル要求性株作製用のゲノム編集用ＤＮＡとして用いた。
　puc19_F　gctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttccc（配列番号３４）
　puc19_R　ttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcgg（配列番号３５）
（形質転換）
　ガルデリア（１倍体）へのゲノム編集用ＤＮＡの導入は、ＰＥＧ法により行った。ガルデリア（１倍体）を、ＯＤ７５０＝０．５となるように、５０ｍＬのＭＡ培地（ｐＨ１．０）に植藻した。明暗周期（１２Ｌ／１２Ｄ）、４２℃で、４～５日間培養した（通気培養、２％ＣＯ２、３００ｍＬ／ｍｉｎ）。培養した細胞を回収し、ＯＤ７５０＝５００となるようにＭＡ培地（ｐＨ１．０）に懸濁し、細胞懸濁液を作製した。
　６７．５μＬの３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧを含むＭＡ２培地に、４５μＬのゲノム編集用ＤＮＡ（～５００ｎｇ／μＬ；蒸留水に溶解）を添加して撹拌した。ここに、１２．５μＬの細胞懸濁液を添加し、転倒撹拌した。撹拌後の懸濁液を、１０ｍＬのウラシル含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ウラシル０．５ｍｇ／ｍＬ）に移して、前記と同様の培養条件で２日間培養した。その後、細胞を回収し、５－ＦＯＡ／ウラシル含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ウラシル０．５ｍｇ／ｍＬ、５－ＦＯＡ０．４ｍｇ／ｍＬ）に植藻し、上記と同様の条件で培養した。
（ウラシル要求性の確認）
　上記のように作製した形質転換体を、ＭＡ培地（ｐＨ１．０）、ウラシル含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ウラシル０．５ｍｇ／ｍＬ）、又は５－ＦＯＡ／ウラシル含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ウラシル０．５ｍｇ／ｍＬ、５－ＦＯＡ０．４ｍｇ／ｍＬ）に植藻し、上記と同様の条件で１０日間培養した。また、対照として、形質転換していないガルデリア（１倍体）（ＷＴ）も同様に培養した。
　その結果を図７に示す。形質転換していないＷＴは、ＭＡ培地（ｐＨ１．０）及びウラシル含有ＭＡ培地では生育できたが、５－ＦＯＡ／ウラシル含有ＭＡ培地では生育することができなかった。一方、形質転換体（ΔＵＲＡ５．３）は、ＭＡ培地（ウラシル：－、５－ＦＯＡ：－）では生育できなかったが、ウラシル含有ＭＡ培地及び５－ＦＯＡ／ウラシル含有ＭＡ培地では生育できた。この結果から、形質転換体のウラシル要求性が確認できた。
（ゲノム解析）
　ウラシル要求性株を３株クローン化し（＃１、＃２、＃３）、ゲノム編集の標的とした標的領域の解析を行った。形質転換していないＷＴ、又はウラシル要求性株（＃１、＃２、＃３）から抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、標的領域を増幅した。増幅ＤＮＡ断片を用いて配列解析を行い、標的領域の配列を確認した。ＰＣＲに用いたプライマーの配列を以下に示す。
　フォワードプライマー：
　cggtacccggggatcTGGTTTTCTCTATTTTCGACTATATTGGG（配列番号４）
　リバースプライマー：
　cgactctagaggatcGTGTTTACAAGTTGAGATATTGGATAAATG（配列番号５）
　結果を図８に示す。ＵＲＡ５．３遺伝子はゲノム上に２コピー存在する。ウラシル要求性株（＃１）では、いずれのコピー（＃１－１，＃１－２）においても、非相同性末端結合（Ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｎｄ　ｊｏｉｎｉｎｇ；ＮＨＥＪ）により標的配列に１個のシトシン残基が挿入されていた。ウラシル要求性株（＃２）では、いずれのコピー（＃２－１，＃２－２）においても、ＮＨＥＪにより標的配列に１個のチミン残基が挿入されていた。ウラシル要求性株（＃３）では、ＮＨＥＪにより、一方のコピー（＃３－１）では標的配列で２塩基欠失が生じ、他方のコピー（＃３－２）では標的配列に１個のチミン残基が挿入されていた。ウラシル要求性株（＃１、＃２、＃３）では、これらの変異によるフレームシフトにより、機能的なＵＲＡ５．３を発現できなくなっていると考えられた。
＜薬剤選抜系の開発＞
（薬剤の選択）
　ガルデリア属における薬剤選抜系を開発するため、ガルデリア属が安定して感受性を示す薬剤の検討を行った。
　ガルデリア（１倍体）を１～１００μｇ／ｍＬのブラストサイジンＳ（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ　Ｓ；ＢＳ）を含有するＭＡ培地で培養したところ、ＢＳの濃度依存的にガルデリア（１倍体）の生育が阻害された（図９）。この結果から、ガルデリア（１倍体）は、ＢＳに感受性であることが確認された。
　ＢＳは、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ　Ｓ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＥＣ　３．５．４．２３）；ＢＳＤ）により、無毒なデアミノヒドロキシブラストサイジンＳ（ｄｅａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｘｙ－ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ；ｄ－ＢＳ）に変換される。そこで、ガルデリア（１倍体）にＢＳＤを導入し、ＢＳによる薬剤選抜系を確立することを試みた。
（ドナーＤＮＡの作製）
　図１０に、ドナーＤＮＡのコンストラクトを示す。ＢＳＤを導入する領域として、ニュートラルサイト（ＮＳ１）を選択した。図１０中、Ｐｃａｔａｌａｓｅはカタラーゼ遺伝子のプロモーター、ＴＵＢＱはユビキチン遺伝子のターミネーターを示す。ガルデリア（１倍体）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、下記プライマー（ＮＳ１＿Ｆ、ＮＳ１＿Ｒ；小文字はベクターとの相同配列を示し、大文字はＮＳ１領域の配列を示す。）を用いて、ＮＳ１領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をクローニングし、Ｐｃａｔａｌａｓｅ（配列番号１９）－ＢＳＤ（配列番号２５）－ＴＵＢＱ（配列番号２０）のＢＳＤマーカーセットを挿入した。得られたプラスミドで大腸菌を形質転換し、増殖させた後、プラスミドを抽出した。得られたプラスミドを鋳型としてｐｕｃ１９＿Ｆ及びｐｕｃ１９＿Ｒを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＤＮＡ断片を、ＢＳＤマーカー用ドナーＤＮＡとして用いた。ＮＳ１領域とその上流及び下流２００ｂｐの配列を図１１に示す。ＮＳ１領域の配列を配列番号１５に示す。ドナーＤＮＡにおいて、５’ホモロジーアームとして用いたＮＳ１領域の配列を配列番号２９に示す。ドナーＤＮＡにおいて、３’ホモロジーアームとして用いたＮＳ１領域の配列を配列番号３０に示す。
　NS1_F　cggtacccggggatcTTTATGGAGAGCATCGTGAATAACGGC（配列番号１３）
　NS1_R　cgactctagaggatcTGCAGAATAACCGGTGAAATTTATGAAC（配列番号１４）
（相同組換えによる形質転換）
　ガルデリア（１倍体）へのドナーＤＮＡの導入は、ＰＥＧ法により行った。対照として、ガルデリア（２倍体）についても同様にドナーＤＮＡの導入を行った。ガルデリア（１倍体）又はガルデリア（２倍体）を、ＯＤ７５０＝０．５となるように、５０ｍＬのＭＡ培地（ｐＨ１．０）に植藻した。明暗周期（１２Ｌ／１２Ｄ）、４２℃で、４～５日間培養した（通気培養、２％ＣＯ２、３００ｍＬ／ｍｉｎ）。培養した細胞を回収し、ＯＤ７５０＝５００となるようにＭＡ２培地に懸濁し、細胞懸濁液を作製した。
　６７．５μＬの３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧの含むＭＡ２培地に、４５μＬのドナーＤＮＡ（～５００ｎｇ／μＬ；蒸留水に溶解）を添加して撹拌した。ここに、１２．５μＬの細胞懸濁液を添加し、転倒撹拌した。撹拌後の懸濁液を、１０ｍＬのＭＡ培地（ｐＨ１．０）に移して、前記と同様の培養条件で２日間培養した。その後、細胞を回収し、ＢＳ含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ＢＳ１００μｇ／ｍＬ）に植藻し、上記と同様の条件で培養した。得られた細胞を形質転換体（ＢＳＤ）とした。
（ＢＳ耐性の確認）
　上記のように作製した形質転換体（ＢＳＤ）を、ＭＡ培地（ｐＨ１．０）、又はＢＳ含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ＢＳ１００μｇ／ｍＬ）に植藻し、上記と同様の条件で２１日間培養した。また、対照として、形質転換していないガルデリア（１倍体）又はガルデリア（２倍体）（ＷＴ）も同様に培養した。
　その結果を図１２及び図１３に示す。図１２はガルデリア（２倍体）の結果であり、図１３はガルデリア（１倍体）の結果である。ガルデリア（２倍体）は、形質転換していないＷＴ及び形質転換体（ＢＳＤ）のいずれも、ＢＳ含有ＭＡ培地で生育できなかった。一方、ガルデリア（１倍体）では、ＷＴはＢＳ含有ＭＡ培地で生育できなかったが、形質転換体（ＢＳＤ）はＢＳ含有ＭＡ培地で生育することができた。この結果から、ガルデリア（１倍体）では、相同組換えにより、ＢＳ耐性の形質転換体が得られることが確認できた。一方、ガルデリア（２倍体）では、ＢＳ耐性の形質転換体を得ることはできなかった。これは、ガルデリア（２倍体）は、強固な細胞壁を有するため、ドナーＤＮＡが細胞に導入されにくいためと考えられた。
（ＮＳ１領域におけるＢＳＤマーカーセット挿入の確認）
　ガルデリア（１倍体）の形質転換体（ＢＳＤ）、又は形質転換していないガルデリア（１倍体）（ＷＴ）から抽出したＤＮＡを鋳型として、下記プライマー（ＰＳ１＿Ｆ、ＰＳ１＿Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、ＮＳ１領域を増幅した。次いで、増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動を行った。
　ＰＳ１＿Ｆ：TCCCAAGATAATAGACAGTGCTCGG（配列番号３１）
　ＰＳ１＿Ｒ：TTGTTACCTACTCATACCCCTACTCC（配列番号３２）
　結果を図１４に示す。形質転換体（ＢＳＤ）では、ＷＴのＮＳ１領域増幅断片（２ｋｂ）よりも大きい３．３ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。この結果から、形質転換体（ＢＳＤ）では、ＮＳ１領域にＢＳＤマーカーセットが挿入されていると考えられた。
＜薬剤選抜系を用いた外来遺伝子の導入＞
（ドナーＤＮＡの作製）
　上記で開発した薬剤選抜系を用いて、外来遺伝子の導入を試みた。外来遺伝子としては、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子を用いた。図１５に、ｍＶｅｎｕｓ導入用ドナーＤＮＡのコンストラクトを示す。上記で作製したＢＳＤマーカー用ドナーＤＮＡのプラスミドにおいて、ＢＳＤマーカーセットの上流に、ｍＶｅｎｕｓ遺伝子セット（ＰＥＦ１－α－ｍＶｅｎｕｓ－Ｔβ－ｔｕｂｕｌｉｎ）を挿入した。得られたプラスミドを、ｍＶｅｎｕｓ導入用ドナーＤＮＡとして用いた。図１５中、ＰＥＦ１－αはＥＦ１－α遺伝子のプロモーター、Ｔβ―ｔｕｂｕｌｉｎはβ－チューブリン遺伝子のターミネーターを示す。
（相同組換えによる形質転換）
　ガルデリア（１倍体）へのドナーＤＮＡの導入は、ＰＥＧ法により行った。ガルデリア（１倍体）を、ＯＤ７５０＝０．５となるように、５０ｍＬのＭＡ培地（ｐＨ１．０）に植藻した。明暗周期（１２Ｌ／１２Ｄ）、４２℃で、４～５日間培養した（通気培養、２％ＣＯ２、３００ｍＬ／ｍｉｎ）。培養した細胞を回収し、ＯＤ７５０＝５００となるようにＭＡ２培地に懸濁し、細胞懸濁液を作製した。
　６７．５μＬの３０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧの含むＭＡ２培地に、４５μＬのドナーＤＮＡ（～５００ｎｇ／μＬ；蒸留水に溶解）を添加して撹拌した。ここに、１２．５μＬの細胞懸濁液を添加し、転倒撹拌した。撹拌後の懸濁液を、１０ｍＬのＭＡ培地（ｐＨ１．０）に移して、前記と同様の培養条件で２日間培養した。その後、細胞を回収し、ＢＳ含有ＭＡ培地（ｐＨ１．０、ＢＳ１００μｇ／ｍＬ）に植藻し、上記と同様の条件で培養した。得られた細胞を形質転換体（ＴＦ）とした。
（ＮＳ１領域へのｍＶｅｎｕｓ遺伝子セット挿入の確認）
　上記で得られた形質転換体（ＴＦ）、又は形質転換していないガルデリア（１倍体）（ＷＴ）から抽出したＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（ＰＳ１＿Ｆ、ＰＳ１＿Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、ＮＳ１領域を増幅した。次いで、増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動を行った。
　その結果を図１６に示す。形質転換体（ＴＦ）では、ＷＴのＮＳ１領域増幅断片（２ｋｂ）よりも大きい５ｋｂのＤＮＡ断片が確認された。この結果から、形質転換体（ＴＦ）では、ＮＳ１領域にｍＶｅｎｕｓ遺伝子セット及びＢＳＤマーカーセットが挿入されていると考えられた。
（ｍＶｅｎｕｓ発現の確認）
　上記で得られた形質転換体（ＴＦ）又はＷＴについて、Ａｎｔｉ－ＧＦＰ抗体（ＪＬ－８、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、イムノブロットを行った。
　その結果を図１７に示す。形質転換体（ＴＦ）では、ｍＶｅｎｕｓのバンドが確認された。この結果から、形質転換体（ＴＦ）は、ｍＶｅｎｕｓタンパク質を発現していることが確認された。
　次に、ｍＶｅｎｕｓの蛍光を確認するために、形質転換体（ＴＦ）を蛍光顕微鏡で観察した。
　その結果を図１８に示す。図１８中、ＤＩＣは微分干渉顕微鏡画像であり、Ｃｈｌは葉緑体の自家蛍光を検出した蛍光顕微鏡画像であり、ｍＶｅｎｕｓはｍＶｅｎｕｓの蛍光を検出した蛍光顕微鏡画像であり、ｍｅｒｇｅｄはＣｈｌとｍＶｅｎｕｓの蛍光顕微鏡画像をマージしたものである。図１８に示すように、形質転換体（ＴＦ）ではｍＶｅｕｎｓの蛍光を確認することができ、機能的なｍＶｅｎｕｓが産生されていることが確認された。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。

Claims (14)

  1. 　ガルデリア属に属する藻類の１倍体に対して、ゲノム改変を行う工程を含む、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
  2. 　前記ゲノム改変を配列特異的に行う、請求項１に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
  3. 　前記ゲノム改変を、相同組換え法、又は配列特異的エンドヌクレアーゼを含むゲノム編集システムを用いて行う、請求項２に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
  4. 　前記ゲノム編集システムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＺＮＦ、及びＴＡＬＥＮからなる群より選択される、請求項３に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法。
  5. 　前記ゲノム改変が、以下の（ａ）～（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のゲノム改変である、請求項１～４のいずれか一項に記載のガルデリア属に属する藻類のゲノム改変方法：
    　（ａ）所望の物質を産生させるゲノム改変；
    　（ｂ）所望の物質の産生量を向上させるゲノム改変；及び
    　（ｃ）細胞増殖を促進又は低下させるゲノム改変。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のゲノム改変方法により、ガルデリア属に属する藻類のゲノム改変を行う工程（Ａ）を含む、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
  7. 　前記工程（Ａ）後、前記藻類を２倍体にする工程（Ｂ）をさらに含む、請求項６に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
  8. 　前記工程（Ｂ）後、前記藻類の２倍体を培養する工程（Ｃ）をさらに含む、請求項７に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
  9. 　前記工程（Ｃ）後、前記藻類を１倍体にする工程（Ｄ）をさらに含む、請求項８に記載のゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類の製造方法。
  10. 　請求項６に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、
    　前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、
    　前記所望の物質を回収する工程と、
    　を含む、所望の物質の製造方法。
  11. 　請求項７又は８に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、
    　前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、
    　前記所望の物質を回収する工程と、
    　を含む、所望の物質の製造方法。
  12. 　請求項９に記載の製造方法により、ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類を得る工程と、
    　前記ゲノム改変されたガルデリア属に属する藻類に、所望の物質を産生させる工程と、
    　前記所望の物質を回収する工程と、
    　を含む、所望の物質の製造方法。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか一項に記載の所望の物質の製造方法により、所望の物質を製造する工程と、
    　前記所望の物質を含有する食品を製造する工程と、
    　を含む、食品の製造方法。
  14. 　栄養成分の合成に関与する遺伝子に変異を有し、前記栄養成分の要求性を有するガルデリア属に属する藻類。
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