JP2018500037A - 高効率なインビボゲノム編集のための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いた高効率ゲノム編集用の細胞株と、そのような細胞株の生成方法と、そのような細胞株を用いた、生物ゲノムにおける変異の作製方法とを提供する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）の下、２０１４年１２月３１日に提出された米国仮特許出願第６２／０９９，０１４号に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮出願の内容の全体は、参照により、本明細書に援用される。
配列表
本願には、２０１５年１２月３０日に作成した配列表テキストファイル「SGI1850_1WO_Sequence_Listing_ST25.txt」（ファイルサイズ２３７キロバイト（ｋｂ））として、本明細書と同時に提出した核酸配列とアミノ酸配列への言及が含まれ、このテキストファイルは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．５２（ｅ）（ｉｉｉ）（５）に従って、その全体が、参照により援用される。
本発明は、真核生物の遺伝子操作、具体的には、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムを用いるゲノム編集に関する。
ＣＲＩＳＰＲシステムのゲノム編集能は、最近開発されたに過ぎないが、遺伝子操作できる細胞及び生物の範囲を飛躍的に拡大させている（Sander & Joung (2014) Nature Biotechnology（非特許文献１））。US 2014/0068797（特許文献１：参照により、本明細書に援用される）は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムとゲノム編集での使用方法を開示している。
US 2014/0068797
Sander & Joung (2014) Nature Biotechnology
概要
本発明は、Ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲシステムのようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを用いて、高効率ゲノム編集に使用できる細胞株と微生物株の作製方法を提供する。この細胞株と微生物株は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする遺伝子を含み、このＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）であることができ、このＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、この細胞株または微生物株の集団において、完全浸透度での発現を示す。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの完全浸透度での発現は、検出可能マーカー、例えば蛍光タンパク質をコードする連結遺伝子の発現を評価することによって判断する。
本明細書に示されている、完全浸透性のｃａｓ発現細胞株または微生物株の単離方法は、また、検出可能マーカー（好ましくは蛍光マーカー）をコードする遺伝子を含む核酸分子に、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ遺伝子を導入することを含む。Ｃａｓタンパク質のようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする遺伝子と検出可能マーカーの遺伝子を含む核酸分子を含む形質転換細胞株をフローサイトメトリーによってスクリーニングして、その培養物の細胞の基本的に全てが、検出可能マーカー（例えば、蛍光タンパク質であることができる）を発現する株または細胞株を選択する。培養物全体にわたって、検出可能マーカーが発現したものとして選択した株または細胞株を、完全浸透性の株または細胞株として同定する。
すなわち、本発明は、Ｃａｓ遺伝子（例えばＣａｓ９遺伝子）のような異種のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに関して完全浸透性の細胞株と微生物株を提供する。本発明で提供する完全浸透性のＣａｓ株及びＣａｓ細胞株は、高効率ゲノム編集を実現する。例えば、目的の遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡで、完全浸透性の株または細胞株の細胞を形質転換すると、そのガイドＲＮＡ（例えば、キメラガイドＲＮＡ、またはトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と連動して部位特異的なＤＮＡ編集を促すｃｒＲＮＡ）で形質転換した細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％の遺伝子が、その標的遺伝子座において遺伝子的に改変される。例えば、様々な例では、ガイドＲＮＡとドナーフラグメントで形質転換すると、このガイドＲＮＡで形質転換した細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％に、ドナーＤＮＡが標的遺伝子座で組み込まれる。いくつかの例では、ガイドＲＮＡとドナーフラグメントで形質転換した完全浸透性のＣａｓ細胞株の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％超に、ドナーＤＮＡが標的遺伝子座で組み込まれる。
一態様では、本発明においては、外因性のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを発現する高効率ゲノム編集用細胞株の生成方法を提供し、この方法は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸配列と、検出可能マーカーをコードする核酸配列とを含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、その非天然の核酸分子を少なくとも１つ含む１つ以上のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ形質転換細胞株を得る工程；そのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ形質転換細胞株の少なくとも１つを個別に培養する工程；フローサイトメトリーを用いて、そのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物における、検出可能マーカーの発現を評価する工程；ならびに、高効率ゲノム編集用細胞株を同定するために、培養物において、検出可能マーカーの完全浸透度での発現を示したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ形質転換細胞株を同定する工程；を含む。検出可能マーカーは、蛍光タンパク質であることができる。「完全浸透度での発現」とは、フローサイトメトリーによって解析したときに、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ形質転換細胞株が、単一の蛍光強度ピークを示し、その形質転換細胞の蛍光強度ピークが、非形質転換細胞の示す蛍光ピークよりも強度が高いこと、すなわち、バックグラウンド強度よりも高いことを意味する。本発明の実施例に示されているように、非天然のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼタンパク質遺伝子に物理的に結合している検出可能マーカー遺伝子の浸透度が完全である細胞株は、ゲノム標的化ガイドＲＮＡで形質転換すると、高効率ゲノム編集を示す。高効率ゲノム編集は、ドナーＤＮＡで形質転換した細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７０％において、変異（標的部位の改変）をうまく起こすことができる。
この方法は、原核細胞（細菌及び古細菌）、ならびに真核細胞（限定されないが、メソミセトゾア、真菌、不等毛類及び藻類を含め、植物細胞、動物細胞及び原生動物が挙げられるが）を含め、培養できるいずれかの細胞で行うことができる。
このＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、例えば、Ｃａｓ９タンパク質のようなＣａｓタンパク質（多数、同定されている）であることができるとともに、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質であることができる。対象となる他のＣａｓタンパク質としては、限定されないが、Ｃｐｆ１ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３：１−１３）と、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３ ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ６０：１−１３が挙げられる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列は、目的の宿主細胞用にコドン最適化できる。いくつかのケースでは、宿主細胞に導入された核酸分子によってコードされるＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対する変異を少なくとも１つ含むことができ、例えば、このＣａｓ９タンパク質は、そのタンパク質の切断ドメインの１つにおいて不活性化でき、それにより、「ニッカーゼ」バリアントが得られる。変異の非限定例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが挙げられる。
本発明の方法を用いて、ｃａｓタンパク質以外のタンパク質の完全浸透度についてスクリーニングでき、その結果、目的の遺伝子の発現に関して完全浸透性の細胞株の生成方法が提供され、この方法は、目的の遺伝子と、検出可能マーカーをコードする核酸配列とを含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、その非天然の核酸分子を少なくとも１つ含む形質転換細胞株を１つ以上得る工程；その形質転換細胞株の少なくとも１つを個別に培養する工程；フローサイトメトリーを用いて、その形質転換細胞株の培養物における検出可能マーカーの発現を評価する工程；ならびに、目的の遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株を同定するために、培養物において、検出可能マーカーの完全浸透度での発現を示した形質転換細胞株を同定する工程；を含む。この検出可能マーカーは、蛍光タンパク質であることができる。「完全浸透度での発現」とは、フローサイトメトリーによって解析したときに、形質転換細胞株が、単一の蛍光強度ピークを示し、その形質転換細胞の蛍光強度ピークが、非形質転換細胞の示す蛍光ピークよりも強度が高い側にシフトすること、すなわち、バックグラウンド強度よりも高いことを意味する。
Ｃａｓポリペプチドをコードする遺伝子は、ｃａｓ酵素をコードする配列に加えて、組み換えｃａｓタンパク質の一部としての核局在化配列（ＮＬＳ）を少なくとも１つコードする配列を含むことができる。ＮＬＳは、任意で、ｃａｓ酵素のＮ末端部分またはＣ末端部分に位置することができ、あるいは、ｃａｓ酵素は、そのタンパク質のＮ末端またはＮ末端の近くにＮＬＳを少なくとも１つと、そのタンパク質のＣ末端またはＣ末端の近くにＮＬＳを少なくとも１つ有することができる。この代わりにまたはこれに加えて、上記の核酸分子は、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグまたはＭｙｃタグなど（しかしこれらに限らない）のエピトープタグを含むｃａｓタンパク質をコードできる。
ｃａｓタンパク質をコードする配列を含む非天然の核酸分子は、選択可能マーカー遺伝子を更に含むことができる。この選択可能マーカーは、栄養要求性マーカーであることも、抗生物質または毒素に対する耐性を付与することもでき、この選択可能マーカー遺伝子は、意図する宿主細胞用にコドン最適化することができる。
ｃａｓタンパク質をコードする配列も含む核酸分子によってコードされる検出可能マーカーは好ましくは、蛍光タンパク質であり、その蛍光タンパク質は、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、「フルーツバスケット」蛍光タンパク質または「ペイントボックス」（ＤＮＡ２．０）蛍光タンパク質を含むいずれかの蛍光タンパク質であることができる。非限定例として、ｃａｓタンパク質もコードする核酸分子によってコードされる蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、Ｔｏｍａｔｏ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ蛍光タンパク質、またはこれらのいずれかのバリアント（蛍光タンパク質の単量体バリアントが挙げられるが、これに限らない）であることができる。
Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子は、検出可能マーカータンパク質、例えば蛍光タンパク質をコードして、そのｃａｓタンパク質と検出可能マーカータンパク質が、同じプロモーターによって調節され、１つのＲＮＡとして転写されるようにできる。例えば、このｃａｓ酵素と検出可能マーカーは、融合タンパク質として産生させることができる。あるいは、このＣａｓ酵素と検出可能マーカーは、一緒に翻訳できるが、別々のｃａｓと検出可能マーカータンパク質が得られるように、その翻訳産物は、それらの２つのポリペプチド部分を切断させるＦＭＤＶ ２Ａ配列のような切断配列を含むことができる。更に、この代わりに、コンストラクト内に、ＩＲＥＳをそれらの２つのコード領域の間に設けて、それらのコード領域が１つの転写産物として転写されるが、別々のポリペプチドとして翻訳されるようにできる。更に別の構成では、ｃａｓタンパク質と検出可能マーカーは、別々のプロモーターに機能的に連結させることができる。これらのプロモーターは、任意で、宿主細胞種に由来する（「相同である」）ことができるとともに、任意で、構成的プロモーターであることができる。
本発明の更なる態様は、高効率のゲノム編集用細胞株である。この高効率ゲノム編集用組み換え細胞株は、ＲＥＮ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする外因性遺伝子を含み、異種の（導入された）そのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ遺伝子に関して完全浸透性である。連結された蛍光タンパク質に関して完全浸透性の株での高効率なＣａｓ９ゲノム編集を示す、本明細書に記載の結果に基づき、その高効率なＣａｓ９ゲノム編集用細胞株は、コード遺伝子がＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする遺伝子に物理的に連結している蛍光タンパク質の完全浸透性の（培養物全体にわたる）発現に関するスクリーニングによる細胞株の同定に基づき、「完全浸透性のＣａｓ９細胞株」であるといわれる。本発明を特定の機構に限定することなく、連結された蛍光マーカーを用いて、浸透度に関して選択した細胞株は、培養物の細胞全体にわたって、Ｃａｓ９遺伝子の発現も示し、その結果、高効率の標的変異が観察されるものとみなす。本発明で提供する完全浸透性のＣａｓ９細胞株または微生物株は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とドナーフラグメントを用いると、標的変異率が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％であることができ、この効率は、ドナーフラグメントを受け取ったとともに、標的変異も有する細胞の割合である。
この高効率ゲノム編集用細胞株は、蛍光タンパク質をコードする外因性遺伝子を含むことができ、あるいは、蛍光タンパク質をコードする外因性遺伝子を含まなくてもよい。本明細書に開示されている方法を用いて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子などの、連結された導入遺伝子の完全浸透度についてスクリーニングする目的で用いる検出可能マーカー遺伝子、例えば蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、ｃｒｅリコンビナーゼのような部位特異的リコンビナーゼを用いて、後で、高効率ゲノム編集用細胞株のゲノムから切除することができる。
本発明には更に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする外因性遺伝子と、ｃｒｅリコンビナーゼのような部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子とを含む高効率ゲノム編集用細胞株が含まれる。部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子は、任意で、誘導性及び／または抑制性プロモーターに機能的に連結できる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする外因性遺伝子と、部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子とを含む高効率ゲノム編集用細胞株は、蛍光タンパク質をコードする外因性遺伝子を含んでも含まなくてもよい。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする外因性遺伝子と、部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子を含む高効率ゲノム編集用細胞株は、蛍光タンパク質をコードする外因性遺伝子であって、部位特異的リコンビナーゼの作用によって後で切除される外因性遺伝子も含んでよい。更に、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする外因性遺伝子と、部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子とを含む高効率ゲノム編集用細胞株は、「マーカーレス」であってよく、すなわち、選択可能マーカーが欠損していてよい。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び／または部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子を含むコンストラクトで株を形質転換するのに用いる選択可能マーカーは、部位特異的リコンビナーゼの作用によって後で切除することができる。
本発明では、インビボでの細胞ゲノムの改変方法も提供し、この方法は、完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株に、ガイドＲＮＡを少なくとも１つ導入することであって、そのガイドＲＮＡが、その細胞ゲノム内の部位を標的とすることと、そのガイドＲＮＡで形質転換した細胞を、ゲノム内の標的部位の改変についてスクリーニングすることとを含む。標的ゲノム部位の改変は、例えば、ＰＣＲまたは表現型スクリーニングによって検出できる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質のようなＣａｓタンパク質であることができる。
任意で、ガイドＲＮＡとともに、ドナーフラグメントも宿主細胞に形質転換し、このドナーフラグメントは、任意で、ただし好ましくは、選択可能マーカー遺伝子を含む。ドナーフラグメントの選択可能マーカー遺伝子は、形質転換体の選択のために用いる。ドナーフラグメントは、任意で、相同組み換えによって標的部位への挿入を仲介する相同領域を含むことができる。
完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または株は、いずれかのタイプの細胞、例えば、植物または動物、後生動物または原生動物の細胞であることができる。例えば、ｃａｓタンパク質をコードするコンストラクトで、植物、哺乳動物、両生動物、魚類、鳥類、有袋動物、爬虫類、線虫類、甲殻類、クモ形類または昆虫に由来する細胞を形質転換でき、このコンストラクトは、好ましくは、ただし任意で、ｃａｓコード配列に機能的に連結したプロモーターのような遺伝子調節配列を含む。微細藻類、不等毛類（ラビリンチュラ及び卵菌など）、メソミセトゾアならびに真菌など（しかしこれらに限らない）の原生動物種の細胞株及び株も考えられる。古細菌と細菌も、ゲノム編集のためにｃａｓ９を発現する宿主であることができる。
本発明では、宿主細胞のゲノムの編集方法であって、宿主細胞のゲノム内の部位を標的とする少なくとも１つのガイドＲＮＡと、少なくとも１つのドナーＤＮＡとで、完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現宿主菌株を形質転換して、宿主細胞ゲノムの標的部位において少なくとも１つの変異を起こすことを含む方法も提供する。この方法は汎用的であり、標的遺伝子座へ組み込むためのホモロジーアームをドナーＤＮＡが含むことができるようにしたり、または宿主ゲノムに相同である配列をドナーＤＮＡが含まないようにしたりできる。例えば、ドナーＤＮＡは、環状または直鎖状であることができ、選択可能マーカー遺伝子及び／もしくは調節因子、代謝酵素、トランスポーター、ＲＮＡｉコンストラクト、アンチセンスＲＮＡコンストラクトなどをコードする１つ以上の遺伝子を含むことができ、または、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子などが結合する配列を含むことができる。
ガイドＲＮＡは、キメラガイドＲＮＡであることができ、または、宿主細胞ゲノム内の遺伝子座のうち、ゲノム改変の標的である遺伝子座に対して相同性を有するｃｒＲＮＡと、好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに相同である配列（「ｔｒａｃｒメイト配列」）とを含むガイドＲＮＡであることができる。ｔｒａｃｒＲＮＡは、別に供給することができる。更に、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び／またはキメラガイドＲＮＡは、宿主細胞に形質転換したコンストラクトによってコードできる。
本発明における細胞株、微生物株及び方法のいずれにおいても、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２またはＣ２ｃ３というＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、それらのいずれかのホモログまたはそれらのいずれかの改変型などのＣａｓヌクレアーゼであることができる。
宿主細胞は、原核細胞、動物細胞、植物細胞または単細胞真核微生物（真菌細胞、不等毛類細胞もしくは藻類細胞など）であることができる。不等毛類細胞は、例えば、ラビリンチュラ（例えば、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属もしくはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属のいずれかの一種）であることができ、または珪藻（例えば、Ａｃｎａｎｔｈｅｓ、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、Ｎｉｔｚｃｈｉａ、Ｐｈａｅｄａｃｔｙｌｕｍまたはタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属の一種）であることができる。不等毛類は、ユースティグマトファイト（例えば、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属またはヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属の種など）であることもできる。
提供する方法は、「ゲノム編集」に関するものであるが、本明細書で開示されているような「ゲノム編集」には、宿主細胞内で標的になるいずれかのＤＮＡ分子、例えば、天然の染色体、合成的染色体、天然または合成のエピソーム分子、ウイルスコンストラクトなどのインビボ編集（例えば、ミス修復、挿入または標的部位のその他の改変）が含まれることを理解すべきである。限定されないが、ゲノム編集は、遺伝子を「ノックアウトする」か、または破壊されると遺伝子の発現が低下する非コード配列を破壊するドナーフラグメントの挿入によって、遺伝子破壊を行うことができる。この代わりにまたはこれに加えて、ゲノム編集は、遺伝子の発現を増大できるプロモーターのような遺伝子発現エレメントを導入できる。本明細書に開示されているようなゲノム編集は更に、外因性遺伝子のような遺伝子を遺伝子座に導入するのに用いることができる。本発明におけるゲノム編集方法を用いて、多数の遺伝子をドナーフラグメント上でゲノム標的部位に導入できる。このドナーフラグメントは、任意で、検出可能マーカー遺伝子、例えば蛍光タンパク質遺伝子を含むことができ、その検出可能マーカー遺伝子は、本明細書に示されている方法を用いて、その検出可能マーカー遺伝子に物理的に結合している１つまたは複数の導入遺伝子の浸透度を評価するのに用いることができる。
本発明では、導入遺伝子の完全浸透度に関する、組み換え細胞株のスクリーニング方法も提供する。この導入遺伝子は、機能的なＲＮＡまたはポリペプチドをコードできる。本明細書における実施例に開示されているように、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及び部位特異的リコンビナーゼの完全浸透度での発現に関するスクリーニングに加えて、１つの蛍光ピークを有する細胞株であって、その蛍光ピークが、非形質転換細胞で見られるピークの蛍光強度よりも高い細胞株を同定するために、フローサイトメトリーによって形質転換体をスクリーニングする方法を用いて、ＲＮＡｉ分子などの機能的なＲＮＡと、酵素などのポリペプチドとをコードする遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株を単離できる。更に、様々な形質転換細胞株の蛍光強度レベルの比較により、全体的に発現レベルが高いかまたは低い方の細胞株を選択可能にできる。このように培養物全体にわたるスクリーニングは、発現タンパク質のレベルを割り出すなどの他の方法よりも信頼性が高いことができる。
ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属用にコドン最適化したＣａｓ９タンパク質であって、核局在化配列（ＮＬＳ）とＦＬＡＧタグを含むＣａｓ９タンパク質を含むベクターｐＳＧＥ−６１３３の図である。このｐＳＧＥ−６１３３コンストラクトは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を標的とするキメラＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ配列であって、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｕ６プロモーターの制御下にある配列も含む。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子に対するホモロジーアームであって、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属用にコドン最適化されているとともに、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 ＲＰＬ２４プロモーターに機能的に連結されているＧＦＰ遺伝子と、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属用にコドン最適化されているとともに、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 ＥＩＦ３プロモーターに機能的に連結されているハイグロマイシン耐性遺伝子とを含むカセットに隣接しているホモロジーアームを含むＣｈｏｒｄ３−ＫＯベクターの図である。このＧＦＰ遺伝子とＨｙｇＲ遺伝子は、それらの３’末端において、同じ双方向ターミネーターに機能的に連結されている。 ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子を破壊する方策を示している。図２に示されているＣｈｏｒｄ３−ＫＯ（ノックアウト）ベクターは、ゲノム内のＣＨＯＲＤ−３２６６ ＣＲＩＳＰＲ標的配列に隣接する相同領域を用いて二重相同組み換えを行うように設計されている。このノックアウトベクターとともに、ＣＨＯＲＤを標的とするガイドＲＮＡ分子を導入する。ガイドＲＮＡ・Ｃａｓ９複合体は、ハサミとして示されている。ドナーフラグメントは、Ｃｈｏｒｄ３−ＫＯ（ノックアウト）ベクターから放出される相同組み換えフラグメント（ＨＲ ｆｒａｇ）であることができ、または、その完全ベクターを宿主細胞に導入して、組み換え体を生成できる。診断ＰＣＲプライマーは、ドナーフラグメントを含む遺伝子座の上に並べて示されており、この遺伝子座では、約４ｋｂのＰＣＲ産物が生じることになり、ドナーフラグメントが挿入されなかった場合には、天然の遺伝子座では、約１２５ｂｐのフラグメントが生じることになる。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属用にコドン最適化されたＣａｓ９タンパク質であって、核局在化配列（ＮＬＳ）を含むとともに、ＧＦＰ遺伝子も含むＣａｓ９タンパク質を含むベクターｐＳＧＥ−６２０６の図である。 Ａ）は、コンストラクトｐＳＧＥ６２０２で形質転換した宿主細胞株に対して行ったフローサイトメトリーからの測定値であって、完全浸透度を示すデータ情報（対照に対してシフトしている単一のピーク）を示している。Ｂ）は、コンストラクトｐＳＧＥ６２０２で形質転換した宿主細胞株に対して行ったフローサイトメトリーからの測定値であって、完全浸透度を示さないデータ情報（２つのピークが現れており、そのうちの１つが、対照のピークと一致している）を示している。 ＦＬＡＧタグの付いたｃａｓ９タンパク質を認識する抗体によるウエスタンブロットである。「Ｓ」は、浸透度を評価する目的で行ったフローサイトメトリーにおいて、シフトした単一のピークを示した細胞から得たタンパク質を示し、「Ｄ」は、フローサイトメトリー解析において、２つのピークを示した細胞から得たタンパク質を示している。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のＣＨＯＲＤ遺伝子に対するホモロジーアームであって、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むカセットに隣接しているホモロジーアームを含むベクター（ｐＳＧＥ−６２８１）の図である。 高効率なＣａｓ９ゲノム編集株を作製する方策を示しており、この方策では、選択可能マーカー（形質転換体を単離する目的で使用する）と、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、蛍光タンパク質のそれぞれの発現カセットを含むコンストラクトでコロニーを形質転換する。個々の形質転換体（１つのコロニーに起因する）の培養物をフローサイトメトリーによって、Ｃａｓ９の完全浸透度での発現を示す１つのシフトピークについてスクリーニングする。この方法では、ウエスタン工程を含む必要はない。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子に対するホモロジーアームであって、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むカセットに隣接しているホモロジーアームを含むベクターの図である。 パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属での発現のために最適化したｃａｓ９ポリペプチドをコードする遺伝子を含むベクター（ｐＳＧＥ−６７０９）の図である。このコンストラクトは、ＧＦＰをコードする遺伝子と、ｂｌａｓｔ遺伝子をコードする遺伝子であって、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属での発現のために最適化した遺伝子も含む。ｃａｓ９遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及びｂｌａｓｔ遺伝子はそれぞれ、別々のパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属プロモーターに機能的に連結している。 ｐＳＧＥ−６７０９で形質転換したパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株であって、ｃａｓ９に対する抗体を用いて、フローサイトメトリーによって、完全浸透性であることが確認されているパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株（６７０９−１、６７０９−２、及び６７０９−３）のウエスタンブロットである。ＷＴ１１８５は、野生型パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株である。 完全浸透性のｃａｓ９発現パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株ＧＥ−１５６９９におけるＣＲＩＳＰＲ標的ｃｐＳＲＰ５４遺伝子座へのｂｌｅＲカセットの挿入を検出するために、プライマーセットを用いたＰＣＲ産物のゲルを示している。プライマー５９６及び５９７の産物は、野生型（非改変）遺伝子座であり、プライマー４０５／５９７及び４０６／５９７の産物は、ｂｌｅＲカセットの標的化された挿入に起因するものである。 Ａ）は、プロモーター強化のためのドナーＤＮＡコンストラクトの図である。Ｂ）は、コード領域上流のＡＣＣａｓｅ遺伝子座におけるドナーＤＮＡの挿入部位を示している。 Ａ）は、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属におけるＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子座の概略的なマップを示しており、矢印は、Ｃａｓ９によって仲介される、ＨｙｇＲカセットの挿入の標的部位を示している。遺伝子座１のみ、標的化された挿入が行われなかった。Ｂ）は、様々な標的挿入変異体のＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子のノックダウンのレベルを示している。 ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の減弱発現のためのＲＮＡｉコンストラクトを含んでいたベクターの概略図である。このベクターは、選択用のｂｌａｓｔ遺伝子と、挿入されたＲＮＡｉコンストラクトの遺伝子の浸透度を評価するためのＧＦＰ遺伝子を含んでいた。 ６個の遺伝子を含んでいたとともに、それぞれの遺伝子が、別個のプロモーターを有する２２．３ｋｂのドナーＤＮＡの図を示している。 アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子座を標的とした２２．３ｋｂの組み込みフラグメントの存在について、ＰＣＲ産物を診断した写真を示しており、クローン５、６、７、８、９、２０、２７、３８及び３１で、指向性組み込みイベントが示されている。 Ｃａｓ９遺伝子、ＧＦＰ遺伝子及びＨｙｇＲ遺伝子に加えて、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属での発現のために最適化したｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を含むベクターｐＳＧＥ−６４８３の概略図である。Ｃａｓ９、ＧＦＰ、ＨｙｇＲ及びｃｒｅ遺伝子のそれぞれは、別個のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属プロモーターに機能的に連結されていた。ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、アンモニア抑制性亜硝酸／亜硫酸レダクターゼプロモーターに機能的に連結されていた。 ｐＳＧＥ−６４８３で形質転換した細胞のフローサイトメトリー浸透度スクリーニングの結果と、アンモニア対ナイトレートの増殖した細胞のピーク蛍光強度の差を示している。 ＲＴ／ＰＣＲ産物のゲルの写真であり、異なる窒素条件下でのＧＦＰ転写産物のレベルを評価している。 形質転換体Ａ１１、Ｂ１１、Ｃ１２、Ｄ１２、Ｅ１２及びＦ１２における、異なる窒素条件下でのＣｒｅ転写産物のレベルのグラフ表示を示している。 形質転換体Ａ１１、Ｂ１１、Ｃ１２、Ｄ１２、Ｅ１２及びＦ１２における、異なる窒素条件下でのＣｒｅタンパク質を検出するためのウエスタンブロットを示している。 形質転換体Ａ１１、Ｂ１１、Ｃ１２、Ｄ１２、Ｅ１２及びＦ１２における、異なる窒素条件下でのＣａｓ９タンパク質を検出するためのウエスタンブロットを示している。 フロックスＧＦＰとＢｌａｓｔＲ遺伝子カセットが無傷であるか、Ｃｒｅの仲介による組み換えによって切除されたか判断するための、Ｆ１２及びＣ１２の培養物のＰＣＲ産物のゲルの写真である。 フロックスＧＦＰとＢｌａｓｔＲ遺伝子カセットのインビボ切断を判断するためのＰＣＲの産物のゲルの写真である。 フロックスＧＦＰとＢｌａｓｔＲ遺伝子カセットが無傷であるか、Ｃｒｅの仲介による組み換えによって切除されたか判断するための、Ｆ１２及びＣ１２の培養物のＰＣＲ産物のゲルの写真である。 フロックスＧＦＰとＢｌａｓｔＲ遺伝子カセットの概略図である。 Ｃａｓ９の仲介によってフロックス破壊カセットが挿入され、その挿入の確認後にｃｒｅ発現が誘導され、その結果、レポーター（蛍光タンパク質）及び選択可能マーカーが切断され、それらの成分を、それ以降の操作工程でリサイクル可能にすることを示す図である。 藻類細胞に導入するためのコンストラクトであって、動物種に由来するタイプＩ ＦＡＳをコードするコンストラクトの図を示している。このコンストラクトは、パンテテインホスホトランスフェラーゼ（ＰＰＴ）をコードする遺伝子も含む。この遺伝子は、藻類プロモーターに機能的に連結されている。このコンストラクトは、外因性のＦＡＳ遺伝子とＰＰＴ遺伝子の培養物全体にわたる発現を評価するための蛍光タンパク質をコードする遺伝子を更に含む。 藻類細胞に導入するためのコンストラクトであって、ラビリンチュラ種に由来するタイプＩ ＦＡＳをコードするコンストラクトの図を示している。この遺伝子は、藻類プロモーターに機能的に連結されている。このコンストラクトは、外因性のＦＡＳ遺伝子の培養物全体にわたる発現を評価するための蛍光タンパク質をコードする遺伝子を更に含む。 フローサイトメトリーの波形（ヒストグラム）を示しており、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）タイプＩ ＦＡＳ遺伝子を含むナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属形質転換体のフローサイトメトリープロファイルが、野生型（非形質転換）藻類細胞培養物のフローサイトメトリープロファイルと重ねられている。この図は、プロファイル化した形質転換体株におけるＦＡＳタンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロットも示している。株６２０１−３８（右端のフローサイトメトリーの波形）では、非形質転換細胞との蛍光プロファイル差は示されておらず、ウエスタンブロット（右から３つ目のレーン）においては、検出可能なＦＡＳタンパク質は示されていない。他の形質転換体株では、完全浸透度での発現が示されており、蛍光ピークは、野生型のピークとは異なる。これらの株は、ウエスタンブロットで証明されたように、検出可能なＦＡＳタンパク質も有する。ＷＥ３７３０は、タイプ１ＦＡＳタンパク質を含まない野生型株である。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属形質転換体のフローサイトメトリーの波形（ヒストグラム）を示しており、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）タイプＩ ＦＡＳ遺伝子を含む形質転換体のフローサイトメトリープロファイルが、野生型（非形質転換）藻類細胞培養物のフローサイトメトリープロファイルと重ねられている。この図は、プロファイル化した形質転換体株におけるＦＡＳタンパク質の発現レベルを比較するウエスタンブロットも示している。ＷＥ３７３０は、タイプ１ＦＡＳタンパク質を含まない野生型株である。 ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属形質転換体のフローサイトメトリーの波形（ヒストグラム）を示しており、ラビリンチュラタイプＩ ＦＡＳ遺伝子を含む形質転換体のフローサイトメトリープロファイルが、野生型（非形質転換）藻類細胞株のフローサイトメトリープロファイルと重ねられている。この図は、プロファイル化した形質転換体株におけるＦＡＳタンパク質の発現レベルを比較するウエスタンブロットも示している。ＷＥ３７３０は、タイプ１ＦＡＳタンパク質を含まない野生型株である。 形質転換体の細胞抽出物からアッセイしたＦＡＳ活性のグラフを示している。ラビリンチュラタイプＩ ＦＡＳ遺伝子を有する藻類形質転換体の活性が最も高い。 光栄養条件（Ａ）と混合栄養条件（Ｂ）で増殖したＣｈｙｔＦＡＳトランスジェニック株に関して、同位体トレーサー（１３Ｃ）の導入を用いて、インビボでＦＡＳの割合を割り出したグラフを示している。光独立栄養条件（Ａ）では、ＣｈｙｔＦＡＳ株６１６７−Ｂの方が、野生型株を上回っていた。株６１６７−Ａは、混合栄養条件で試験し、この場合に、ＦＡＭＥ産生において野生型を上回った（Ｂ）。 光独立栄養条件（Ａ、１３Ｃバイカーボネートで標識）とアセテート強化混合栄養条件（Ｂ、１３Ｃアセテートで標識）で増殖したＤｒＦＡＳ過剰発現株に関して、同位体トレーサーの導入を用いて、インビボでＦＡＳの割合を割り出したグラフを示している。混合栄養条件において、全てのＤｒＦＡＳ形質転換体が、野生型株を上回ることができた。
詳細な説明
別段の定めのない限り、本明細書で用いられている全ての技術用語、表記及びその他の科学用語または専門用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されている意味を有するように意図されている。いくつかのケースでは、明確化のために及び／または参照のしやすさのために、一般に理解されている意味を有する用語が本明細書で定義されており、このような定義が本明細書に含まれていることは、当該技術分野において概ね理解されている意味との実質的な差異を表すものと必ずしも解釈すべきではない。当業者は、本明細書に記載されているかまたは参照されている技法と手順の多くをよく理解しており、従来の方法を用いて、よく利用している。
文脈によって別段に明示されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、複数の言及物が含まれる。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語には、その混合物を含め、１つ以上の細胞が含まれる。本明細書では、「Ａ及び／またはＢ」は、「Ａ」、「Ｂ」、「ＡまたはＢ」、ならびに「Ａ及びＢ」という代替表現の全てを含める目的で用いる。
「約」は、示されている値のプラスマイナス１０％以内、または有効数字一桁となるよう四捨五入した値のいずれかを意味し、いずれのケースにおいても、示されている値が含まれる。範囲が示されている場合、その範囲には境界値が含まれる。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」とは、天然のアミノ酸及び合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸は、Ｄ／Ｌ光学異性体を含め、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、及び後で改変されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ−カルボキシグルタメート及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基に結合している炭素を有する化合物を指す（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、本明細書で使用する場合、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
「ヌクレオチド」は、核酸分子の基本単位であり、典型的には、リン酸基に結合しているリボースまたはデオキシリボースのような五炭糖に結合したアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルのような塩基を含む。ヌクレオチドは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡでは見られない代替的なまたは非天然の塩基または糖も含むことができる。ペプチド核酸では、１つ以上の糖がアミノ酸によって置換されている場合があり、いくつかの核酸類似体では、フォスフェートの少なくとも一部分が、ヒドロキシル基によって置き換わっている場合がある。ヌクレオチドを用いて、一本鎖の核酸分子の長さを示すことが多いとともに、「塩基対」（すなわち、塩基対合したヌクレオチド）を用いて、二本鎖の核酸分子の長さを示すことも多いが、本願では、「ヌクレオチド」または「ｎｔ」を「塩基対」または「ｂｐ」と同義的に用いることもあり、一方の用語またはもう一方の用語を使用することは、記載されている核酸分子のタイプを一本鎖または二本鎖のいずれかに制限することを意味するのではない。「キロベース」または「ｋｂ」を長さの単位として使用することも、一本鎖の核酸分子と二本鎖の核酸分子に平等に適用される。
「核酸コンストラクト」、「ＤＮＡコンストラクト」または単に「コンストラクト」は、組み換え手段によって生成される核酸分子であって、並置されているかまたは機能的に連結されている少なくとも２つの核酸配列であって、天然では互いに並置されたりまたは機能的に連結されたりしない核酸配列を含む核酸分子である。
「エピソームＤＮＡ分子」または「ＥＤＭ」は、独立して複製する核酸分子であって、そのＥＤＭが存在するとともに複製する宿主生物のゲノムには組み込まれない核酸分子である。ＥＤＭは、安定している場合もあり、その際には、何世代にもわたって存続し、あるいは、ＥＤＭは、不安定である場合もあり、その際には、ＥＤＭは、連続的な細胞分裂によって徐々に希釈され、集団からなくなる。安定したＥＤＭは、選択圧（例えば、抗生物質の存在）によって、細胞集団内に保持し得る。
「検出可能マーカー」は、その遺伝子を発現する細胞上に、いくつかの検出可能な表現型を付与する遺伝子またはその遺伝子によってコードされるポリペプチドである。検出は、比色検出（例えば、発色基質の存在におけるβガラクトシダーゼもしくはβグルクロニダーゼの発現による青色）であることも、発光または蛍光の検出によることもできる。検出可能マーカーは概して、検出可能ポリペプチド、例えば、緑色蛍光タンパク質またはシグナル生成酵素（ルシフェラーゼなど）をコードし、これらは、適切な作用物質（具体的には、緑色蛍光タンパク質の場合には特定の波長の光、ルシフェラーゼの場合にはルシフェリン）と接触すると、肉眼によってまたは適切な計器を用いて検出できるシグナルを生成する（Ｇｉａｃｏｍｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１１６：５９−７２，１９９６、Ｓｃｉｋａｎｔｈａ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１２１，１９９６、Ｇｅｒｄｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３８９：４４−４７，１９９６、またＪｅｆｆｅｒｓｏｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１−３９０７，１９９７も参照されたい）。
「選択可能マーカー」または「選択マーカー」という用語は、その遺伝子を発現する生物が、選択的な条件下で生存できるようにする表現型を付与する遺伝子（またはそのコードされたポリペプチド）を指す。例えば、選択可能マーカーは概して、細胞に存在するかまたは細胞内で発現すると、そのマーカーを含む細胞に、選択的利点（またはネガティブ選択可能マーカーの場合には、欠点）、例えば、選択可能マーカーがなければその細胞を死滅させる作用物質の存在下で増殖する能力、または特定の栄養素の非存在下で増殖する能力をもたらす分子である。
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子である。ただし、このＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡ配列で見られるウリジン、すなわちＵの代わりに、核酸塩基のチミン、すなわちＴを用いる。ｃＤＮＡは、一本鎖であることも、二本鎖であることもできるとともに、ｍＲＮＡ配列の相補物であることができる。好ましい実施形態では、ｃＤＮＡは、そのｃＤＮＡが対応する天然の遺伝子（生物のゲノム内の遺伝子）で見られる１つ以上のイントロン配列を含まない。例えば、ｃＤＮＡは、天然の遺伝子のイントロンの下流（３’）の配列に並置された状態で、天然の遺伝子のイントロンの上流（５’）に配列を有することができ、天然においては、ＤＮＡ分子（すなわち、天然の遺伝子）では、この上流配列と下流配列は並置されていない。ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）によるｍＲＮＡ分子の逆転写によって生成でき、またはそのｃＤＮＡ配列に関する知見に基づき、例えば、化学合成によって及び／もしくは１つ以上の制限酵素、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のポリメラーゼ（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用できる高温耐性ポリメラーゼが挙げられるが、これに限らない）、１つ以上のリコンビナーゼなどを用いることによって合成でき、そのｃＤＮＡ配列に関する知見は、任意で、ゲノム配列及び／または１つ以上のｃＤＮＡの配列からコード領域を同定することに基づくことができる。
「コード配列」または「コード領域」とは、本明細書においてｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子に関して使用する場合、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ分子の部分のうち、ポリペプチドをコードする部分を指す。この用語は、典型的には、その分子のヌクレオチド残基のうち、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に、トランスファーＲＮＡ分子のアンチコドン領域と対合するか、または終止コドンをコードするヌクレオチド残基からなる。コード配列は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質には存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質の移行シグナル配列におけるアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を含んでよい。
「〜に由来する」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の起源を指し、典型的には、その核酸分子、タンパク質またはペプチドの配列が、言及されている核酸分子、タンパク質またはペプチドの配列に基づくことを意味する。その核酸分子、タンパク質またはペプチドは、言及されている核酸分子、タンパク質もしくはペプチドに対する同一性が少なくとも６０％（様々な例では、同一性が少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも８５％）であるバリアント、及び／または言及されている核酸分子、タンパク質もしくはペプチドの切断型もしくは内部欠損型バリアントのいずれかである。例えば、タンパク質またはペプチドは、その由来元のタンパク質またはペプチドと比べて、Ｃ末端もしくはＮ末端が切断されているか、または内部が欠損されていてもよいとともに、Ｃ末端、Ｎ末端または内部に、いずれかの数のアミノ酸、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸の欠損を有してよい。核酸分子は、その由来元の核酸分子と比べて、５’または３’が切断されているか、または内部が欠損されていてよいとともに、５’、３’または内部に、いずれかの数のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個または２００個のヌクレオチドの欠損を有してよい。
「内因性」という用語は、本開示の文脈においては、細胞または生物の天然部分であるいずれかのポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列を指す。
「外因性」核酸分子または遺伝子は、宿主細胞に導入された核酸分子または遺伝子である。例えば、外因性核酸分子または遺伝子は、ある１つの種に由来し、人間の介入、例えば、組み換え核酸コンストラクトによって、別の生物、微生物または細胞に導入（「形質転換」）されたものである。外因性核酸は、ある１つの種に由来する配列であって、別の種に導入された配列、すなわち、異種の核酸分子であることができる。外因性核酸分子も、宿主細胞または生物に対して相同である（すなわち、その核酸配列が、天然において、その種で見られるか、または天然において、宿主種で見られるポリペプチドをコードする）とともに、その生物の細胞に再導入された配列であることもできる。宿主生物に対して相同である（同じ種のものである）配列を含む外因性（導入）核酸分子は、その相同な核酸配列に結合させた配列、例えば、宿主生物に天然には備わっていない調節配列であって、組み換え核酸コンストラクトにおける内因性遺伝子配列に隣接している調節配列の存在によって、天然の配列と区別できることが多い。この代わりにまたはこれに加えて、安定的に形質転換された外因性核酸分子は、その分子が組み込まれたゲノム内の配列に並置することによって、天然遺伝子から検出できるか、または天然遺伝子と区別できる。核酸分子が、考慮対象の細胞、生物、または株の前駆体に導入されたものである場合、その分子は外因性とみなす。
「発現カセット」とは、本明細書で使用する場合、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を誘導できるＤＮＡ配列を意味し、目的のヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモーターを含み、このプロモーターは、任意で、終結シグナル及び／またはその他の調節エレメントに機能的に連結できる。発現カセットは、ヌクレオチド配列の翻訳を実現、仲介または促進する配列も含んでよい。コード領域は通常、目的のタンパク質をコードするが、センスまたはアンチセンス方向に、目的の機能的なＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡもコードしてよい。発現カセットは、完全に細胞外で（例えば、組み換えクローニング技法によって）組み立ててよい。しかしながら、発現カセットは、部分的に内因性成分を用いて組み立ててもよい。例えば、発現カセットは、内因性配列の上流にプロモーター配列を配置する（または挿入する）ことによって得てよく、これにより、内因性配列は、前記プロモーター配列によって機能的に連結され、制御されることになる。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、または宿主細胞がいくつかの特定の外的刺激にさらされたときのみに転写を開始させる誘導性プロモーターの制御下にあってよい。
「発現ベクター」とは、発現させるヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作動性エレメントを含み、発現のための他のエレメントを宿主細胞によって、またはインビトロ発現系内に供給することもできる。当該技術分野において既知の発現ベクターの例としては、組み換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド及びウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用する場合、ヌクレオチド長が２００以下の核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくはＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせ、核酸誘導体、または合成核酸であることができ、例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸またはロックト核酸であることができるとともに、一本鎖、二本鎖または部分的に一本鎖で部分的に二本鎖であることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド長が約４〜約２００、ヌクレオチド長が約６〜約２００、ヌクレオチド長が約１０〜約２００、ヌクレオチド長が約１５〜約２００、ヌクレオチド長が約１７〜約２００、ヌクレオチド長が約２０〜約２００、またはヌクレオチド長が約４０〜約２００であることができる。更なる例では、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド長が約１５〜約１８０、ヌクレオチド長が約１５〜約１６０、ヌクレオチド長が約１５〜約１４０、ヌクレオチド長が約１５〜約１２０、ヌクレオチド長が約１７〜約１００、ヌクレオチド長が約１７〜約８０、またはヌクレオチド長が約１７〜約７０、例えば、ヌクレオチド長が約２０〜約６５であることができる。
ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素に関して用いるときには、「異種の」という用語は、宿主種に由来せず、例えば、宿主細胞とは異なる種に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチドまたは酵素を指す。例えば、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属微生物に由来するかまたは植物に由来する脂肪酸不飽和化酵素に対するコード配列で形質転換したナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属トランスジェニック微生物は、異種の不飽和化酵素遺伝子で形質転換されている。核酸コンストラクトまたは分子内で機能的に連結しているかまたは別段の形で繋がり合っている（「並置されている」）核酸配列に言及するときには、「異種の配列」とは、本明細書で使用する場合、天然では、機能的に連結していないか、または近接もしくは隣接し合っていない配列である。例えば、テトラセルミス属（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｐ．）に由来するプロモーターは、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属コード領域配列に対して異種であるとみなす。また、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属に由来するチューブリン遺伝子をコードする遺伝子に由来するプロモーターに機能的に連結したナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属脂肪酸不飽和化酵素コード配列は、異種のプロモーターに機能的に連結しているとみなす。同様に、遺伝子配列を保持または操作するのに用いる遺伝子調節配列または補助的な核酸配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、Ｋｏｚａｋ配列、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム侵入配列、ゲノム相同領域、組み換え部位など）に言及するときには、「異種の」とは、その調節配列または補助配列が、コンストラクト、ゲノム、染色体またはエピソームにおいて、その調節配列または補助的な核酸配列と並置されているか機能的に連結している遺伝子と異なる起源（例えば、宿主生物と同じ種か異なる種にかかわらず、異なる遺伝子）に由来していることを意味する。
「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用する場合、概ね、相補的な塩基鎖対合によって結合する核酸分子の能力を指す。核酸分子が適切な条件下で接触すると、このようなハイブリダイゼーションが生じ得る。本明細書で使用する場合、２つの核酸分子が、アンチパラレル型の二本鎖核酸構造を形成できる場合、これらの２つの分子は、互いに特異的にハイブリダイズできるという。核酸分子は、別の核酸分子と完全な相補性を示す場合、すなわち、これらの分子の一方の全てのヌクレオチドが、もう一方の分子の塩基対合パートナーのヌクレオチドと相補的であるとき、別の核酸分子の「相補物」であるという。２つの分子は、少なくとも従来の低ストリンジェントな条件下で、互いにアニーリングした状態を保持させるのに十分な安定性で、互いにハイブリダイズできる場合には、「最小限の相補性を有する」という。分子は、従来の高ストリンジェントな条件下で、互いにアニーリングした状態を保持させるのに十分な安定性で、互いにハイブリダイズできる場合には、「相補的である」という。従来のストリンジェントな条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記の１９８９年の文献）によって、及びＨａｙｍｅｓらによってＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）において記載されている。したがって、完全な相補性がなくても、それらの分子が二本鎖構造を形成する能力を完全に失っていなければ、許容可能である。すなわち、本発明の核酸分子またはそのフラグメントが、プライマーまたはプローブとして機能するためには、用いる特定の溶媒及び塩濃度ならびに温度下で、安定な二本鎖構造を形成できるように、配列において十分に相補的でさえあればよい。
核酸のハイブリダイゼーションを促す適切なストリンジェントな条件としては、例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に次いで、約５０℃で２．０×ＳＳＣでの洗浄が挙げられる。加えて、洗浄工程の温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェントな条件から約６５℃の高ストリンジェントな条件まで上昇させることができる。温度と塩の両方を変化させても、温度または塩濃度のいずれかを一定に保ちながら、もう一方を変化させてもよい。これらの条件は、当業者に知られており、あるいは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見ることができる。例えば、低ストリンジェントな条件を用いて、標的核酸配列に対する配列同一性のより低い核酸配列を選択してよい。約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩化ナトリウムと、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度のような条件の採用を望んでもよい。高ストリンジェントな条件を用いて、開示されている核酸配列に対する同一性がより高度な核酸配列について選択してよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる上記の１９８９年の文献）。本発明の一実施形態では、高ストリンジェントな条件には、約２×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ（蒸留水中で３Ｍの塩化ナトリウムと０．３Ｍのクエン酸ナトリウムを含む２０×ＳＳＣストック溶液（ｐＨ７．０）から希釈）、約２．５×〜約５×デンハート液（蒸留水中で１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、１％（ｗ／ｖ）のフィコール及び１％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドンを含む５０×ストック溶液から希釈）、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの魚類精子ＤＮＡ、ならびに約０．０２％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳでの核酸ハイブリダイゼーションと、約５０℃〜約７０℃で、数時間から一晩インキュベートすることが含まれる。高ストリンジェントな条件は典型的には、６×ＳＳＣ、５×デンハート液、１００ｍｇ／ｍＬの魚類精子ＤＮＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳと、５５℃で数時間インキュベートすることによって実現される。ハイブリダイゼーションの後には概ね、数回の洗浄工程を行う。洗浄組成物は概して、０．５×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣと、０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むとともに、１５分、約２０℃〜約７０℃でインキュベートを行う。典型的には、相補的な核酸セグメントは、０．１×ＳＳＣ中で６５℃において少なくとも１回洗浄後も、ハイブリッドしたままである。
「配列同一性の割合」は、本明細書で使用する場合、同定されたセントロメア配列に関しては、示されているヌクレオチド配列（例えばセントロメアフラグメント）の特定の長さによって定義される比較ウィンドウにわたって、特定のセントロメア配列またはそのフラグメントを、局所アラインメントを最適に行った配列と比較することによって割り出す。別の文脈では、２つの配列間の配列同一性の割合に関する比較ウィンドウは、２つの配列間の局所アラインメントによって定義される。例えば、比較ウィンドウ内のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて、その２つの配列の最適な配列について、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を含んでよい。この関連では、２つの配列間の局所アラインメントには、各配列のセグメントのうち、アラインメントを行うのに使用するアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ）に依存する基準に従って、十分に類似しているとみなされるセグメントのみが含まれる。同一性の割合は、両方の配列で、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が見られる位置の数を割り出して、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じることによって算出する。比較のための、配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの全体的相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４，１９８８）、これらのアルゴリズムのヒューリスティックな方法の実施（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴ、ＳＩＭ、ＢＬＡＳＴＺ）または検証によって行ってよい。例えば、ＧＡＰ及びＢＥＳＴＦＩＴを用いて、比較のために同定された２つの配列の最適なアラインメントを割り出すことができる。典型的には、ギャップウェイトは、デフォルト値の５．００、ギャップウェイト長は０．３０を使用する。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の「実質的な配列同一性」という用語は、これらのプログラムを用いた場合の基準配列に対する配列同一性が少なくとも５０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％であるか、または配列同一性が少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。加えて、ペアワイズ配列相同性または配列類似性は、使用する場合、アラインメントした２つの配列間で類似している残基の割合を指す。類似の側鎖を持つアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において十分に明らかにされている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
例えば、照会する核酸及びアミノ酸配列は、公衆または私有のデータベースに存在する目的の核酸またはアミノ酸配列に対して検索できる。このような検索は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ ｖ２．１８）のプログラムを用いて行うことができる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムは、インターネット上で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能である。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴの例示的なパラメーターとしては、「デフォルト」に設定したＦｉｌｔｅｒオプション、「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定したＣｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｍａｔｒｉｘ、「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定したＧａｐ Ｃｏｓｔ、３に設定したＷｏｒｄ Ｓｉｚｅ、１ｅ〜３に設定したＥｘｐｅｃｔ（Ｅ閾値）、及び照会配列長の５０％に設定した局所アラインメント最短長が挙げられる。配列同一性及び類似性は、ＧＥＮＯＭＥＱＵＥＳＴ（商標）というソフトウェア（Ｇｅｎｅ−ＩＴ、米国マサチューセッツ州ウースター）を用いて割り出してもよい。
本明細書で使用する場合、「単離」核酸分子またはタンパク質は、その天然の状態、またはその核酸分子もしくはタンパク質が天然に存在する状況から取り出したものである。例えば、単離タンパク質または核酸分子は、その天然または自然な環境において付随している細胞または生物から取り出したものである。すなわち、「単離」核酸分子は典型的には、その核酸の由来元である生物の細胞において天然ではその核酸に隣接している配列（すなわち、その核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を含まない。単離核酸分子またはタンパク質は、いくつかのケースでは、部分的または実質的に精製することができるが、単離には特定の精製レベルが必須なわけではない。例えば、単離核酸分子は、天然においてその分子が組み込まれている染色体、ゲノムまたはエピソームから切除した核酸配列であることができる。したがって、単離核酸としては、精製分子として存在する核酸、またはベクターもしくは組み換え細胞に組み込まれている核酸分子が挙げられるが、これらに限らない。
「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、肉眼では見えないほど小さい生物を指す目的で同義的に用いる。微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）には、細菌と原虫（単細胞の原虫と群体を形成する原虫を含む）が含まれ、真菌、アメーバ、メソミセトゾア、単細胞不等毛類（例えば、ラビリンチュラ、卵菌）及び微細藻類などがあるが、これらに限らない。
「精製」核酸分子またはヌクレオチド配列は、細胞物質と細胞成分を実質的に含まない。精製核酸分子は、例えば、バッファーまたは溶媒以外の化学物質を含まないこともある。「実質的に含まない」とは、新規の核酸分子以外の他の成分が検出不能であることを意味するようには意図されていない。いくつかの状況においては、「実質的に含まない」とは、その核酸分子またはヌクレオチド配列が、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）の細胞物質及び細胞成分を含まないことを意味する場合もある。
「天然」という用語は、本明細書では、天然において宿主で見られる場合の核酸配列またはアミノ酸配列を指す目的で用いる。「非天然」という用語は、本明細書では、天然においては宿主で見られないか、または宿主で天然に構成されているものとして構成されていない核酸配列またはアミノ酸配列を指す目的で用いる。例えば、非天然遺伝子としては、宿主に対して相同である（すなわち、宿主と同じ種の）導入遺伝子であって、異種のプロモーターとともに、及び／または天然遺伝子で見られる１つ以上のイントロンが欠損した状態で、宿主に再導入された導入遺伝子が挙げられる。宿主細胞から取り出し、実験室で操作を行い、宿主細胞に導入または再導入した核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」とみなす。非天然遺伝子には更に、宿主微生物に対して内因性の遺伝子であって、１つ以上の異種の調節配列に機能的に連結しており、宿主ゲノムに再び組み込んだ遺伝子、または宿主生物に対して内因性の遺伝子であって、天然で見られるゲノム遺伝子座以外のゲノム遺伝子座に位置する遺伝子が含まれる。
核酸分子またはポリペプチドについては、「天然」及び「野生型」という用語は、天然で見られる形態を指す。例えば、天然または野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然の起源に存在してよいとともに、天然の起源から単離してよく、人の操作によって意図的に改変されていない。
「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド分子」という用語は、本明細書では、同義的に使用し、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸類似体を含め、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両方を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの３次元構造を有することができる。ポリヌクレオチドは、天然または合成の起源であることができる。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であることができる。ポリヌクレオチドの非限定例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、キメラガイドＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐型ポリヌクレオチド、核酸プローブ及び核酸プライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、従来型ではないか、または改変されたヌクレオチドを含んでよい。
本明細書で使用する場合、「機能的に連結した」とは、一方の配列におけるかまたは一方の配列上の活性が、もう一方の配列におけるかまたはもう一方の配列上の活性に影響を及ぼすようになっている、２つ以上の配列間の機能的な連結を意味するように意図されている。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えばプロモーター）との機能的な連結は、目的のポリヌクレオチドを発現させる機能的な連結である。この意味では、「機能的に連結した」という用語は、調節領域が、目的のコード配列の転写または翻訳を調節するのに有効なように、調節領域と、転写されるコード配列を配置することを指す。例えば、コード配列と調節領域を機能的に連結するには、典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位を、調節領域の１〜約５０ヌクレオチド下流に配置する。しかしながら、調節領域は、翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドほども上流、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に配置することもできる。機能的に連結したエレメントは、隣接していても、隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指す目的で使用するときには、「機能的に連結した」は、それらのコード領域が同じリーディングフレームにあることを意図している。エンハンサーの作用を指す目的で使用するときには、「機能的に連結した」は、そのエンハンサーが、目的の特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を増大させることを示した。核酸配列の文脈における「〜と並置された」とは、言及されている配列が、細胞に導入された核酸コンストラクトなど、同じ連続的核酸分子の一部であることを意味する。「物理的に連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸配列について言及するときには、核酸配列が、例えば、細胞に導入された核酸コンストラクトなど、同じ連続的核酸分子の一部であるか、または、本発明の目的上、互いに対して２００ｋｂ以内、概して、互いに対して１００ｋｂ以内、互いに対して５０ｋｂ以内、もしくは互いに対して２５ｋｂ以内で、ゲノムＤＮＡ（例えば、染色体）上に配置されているかのいずれかであることを意味する。
「浸透度」という用語は、遺伝学では、その表現型に影響を及ぼすことが知られている所定の遺伝子が遺伝学的に同一である生物で観察される表現型のばらつき変動性を示す目的で用いる。浸透度、すなわち、生物において形質が発現される程度の差は、個々の生物の遺伝的背景に依存し得るか、または、環境的要因もしくはエピジェネティックな要因の影響を受け得る。本願では、「浸透度」は、その形質転換遺伝子が同一であり、同じプロモーターに機能的に連結されている（同じプロモーターによって調節される）場合に、微生物または細胞に導入した遺伝子の発現レベルの差の有無を指す目的で使用する。単一の形質転換体から得られた細胞集団において、導入遺伝子の発現が不完全浸透性である場合、その導入遺伝子をバックグラウンドを上回るレベルでは発現しない亜集団が生じる。例えば、導入遺伝子が蛍光タンパク質をコードする場合、不完全浸透性は、フローサイトメトリーによって、典型的には、非形質転換細胞の自己蛍光ピークと一致する単一の蛍光ピークか、または２つの発現（蛍光強度）ピーク（そのうちの１つは、非形質転換細胞の自己蛍光ピークと一致しており、すなわち、形質転換集団の一部が導入遺伝子を発現していない）のいずれかとして観察できる。本発明をいずれかの特定の機構に限定することなく、導入遺伝子の発現差が観察されるのは、少なくとも部分的には、その遺伝子が組み込まれたゲノムの部位、例えば、クローン培養物全体にわたって導入遺伝子を一貫性なく発現させる「位置作用」（例えば、培養物全体にわたるいずれかの所定の時点における細胞の細胞周期ステージ、培養物全体にわたる細胞の栄養状況または環境状況、または未知のエピジェネティックな要因、確率的な要因、もしくは環境的要因に起因し得る）によるものと思われる。「完全浸透度での」発現は、導入遺伝子が蛍光タンパク質をコードする場合、フローサイトメトリーのヒストグラムにおいて、非形質転換細胞の自己蛍光ピークよりも大きい単一の蛍光強度ピークとして観察できる。
「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド分子の配列を同義的に指し、例えば、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指すことができる。３７ ＣＦＲ §１．８２２に定められているようなヌクレオチド塩基の命名法が、本明細書で用いられている。
「プロモーター」とは、宿主細胞において転写を開始できるとともに、本発明のヌクレオチド配列またはそのフラグメントの転写を駆動または促進できる転写制御配列を指す。このようなプロモーターは、天然の配列のものである必要はない。加えて、このようなプロモーターは、目的の宿主細胞または宿主生物に由来する必要がないことが分かるであろう。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、同義的に使用するとともに、翻訳後修飾、例えば、リン酸化またはグルコシル化にかかわらず、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはその他のペプチド模倣体の化合物を指す。これらのサブユニットは、ペプチド結合またはその他の結合（例えば、エステル結合もしくはエーテル結合など）によって連結されていてよい。完全長ポリペプチド、切断型ポリペプチド、点変異体、挿入変異体、スプライスバリアント、キメラタンパク質及びこれらのフラグメントが、この定義に含まれる。様々な実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸、または少なくとも２５個、または少なくとも５０個、または少なくとも７５個、または少なくとも１００個、または少なくとも１２５個、または少なくとも１５０個、または少なくとも１７５個または少なくとも２００個のアミノ酸を有することができる。
本明細書で使用する場合、「子孫」とは、生物の子孫または誘導体を意味する。例えば、トランスジェニック藻に由来する娘細胞は、そのトランスジェニック藻の子孫である。継代においては、変異または環境的影響により、ある特定の改変が見られることがあるので、このような子孫または誘導体は、実際には、親細胞と同一ではないこともあるが、それでも、本明細書で使用する場合には、この用語の範囲に含まれる。
「組み換えられた」または「操作された」という用語は、本明細書で使用する場合、核酸分子に関しては、人間の介入によって改変された核酸分子を指す。非限定例としては、インビトロポリメラーゼ反応によって生成されたか、リンカーが結合されたか、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターのようなベクターに組み込まれたいずれかの核酸分子のように、ｃＤＮＡは、組み換えＤＮＡ分子である。非限定例としては、組み換え核酸分子は、１）例えば、核酸分子の化学的もしくは酵素的技法を用いて（例えば、化学的な核酸合成の使用によって、または複製、高分子化、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）もしくは組み換え（相同組み換えと部位指向性組み換えを含む）用の酵素の使用によって）、インビトロで合成または改変されたものであり、２）天然では結合されていない結合ヌクレオチド配列を含み、３）天然の核酸分子配列に対して、１つ以上のヌクレオチドが欠損するように、分子クローニング技法を用いて操作されたものであり、及び／あるいは４）天然の核酸配列に対して、１つ以上の配列の変化または転位を有するように、分子クローニング技法を用いて操作されたものである。「組み換えタンパク質」は、遺伝子操作、例えば、遺伝子操作された核酸分子の細胞内での発現によって生成したタンパク質である。
「調節領域」、「調節配列」、「調節エレメント」または「調節エレメント配列」という用語は、本発明で使用する場合、転写または翻訳の開始または速度、ならびに転写産物または翻訳産物の安定性及び／または移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。このような調節領域は、天然の配列のものである必要はない。調節配列としては、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。調節領域は典型的には、少なくともコア（基礎的な）プロモーターを含む。調節領域は、エンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）のような制御エレメントも少なくとも１つ含んでよい。
本明細書で使用する場合、「合成的染色体コンストラクト」は、セントロメアと少なくとも１つのＡＲＳとを含むＤＮＡコンストラクトである。「合成的染色体」という用語は、本明細書では、宿主細胞において、自律的に複製するとともに、正確に分離する合成的染色体コンストラクトを指す目的で使用する。「正確に分離する」とは、合成的染色体が、細胞分裂中に、２つの娘細胞に均等に分かれる（すなわち、セントロメアが宿主細胞内で活性化される）ことを意味する。
本明細書で使用する場合、「トランスジェニック生物」とは、異種のポリヌクレオチドを含む生物を指す。生物に適用するときには、「トランスジェニック」、「組み換えられた」、「操作された」、または「遺伝子操作された」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、外因性の核酸配列または組み換え核酸配列をその生物に組み込むことによって操作された生物を指す。概して、その異種のポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定的に組み込まれていて、そのポリヌクレオチドが、後続の世代に受け継がれるようになっているが、エピソームに存在することもでき、そのトランスジェニック生物の合成的染色体に存在してもよい。非天然のポリヌクレオチドは、単独で、または組み換え発現カセットの一部として、ゲノムに組み込まれていてもよい。更なる例では、トランスジェニック微生物は、導入された外因性の調節配列であって、そのトランスジェニック微生物の内因性遺伝子に機能的に連結されている調節配列を含むことができる。このような操作の非限定例としては、遺伝子ノックアウト、標的変異及び遺伝子置換、プロモーター置換、欠失または挿入、ならびに導入遺伝子の生物への組み込みが挙げられる。組み換えたかまたは遺伝子操作された生物は、遺伝子「ノックダウン」用のコンストラクトが導入された生物であることもできる。このようなコンストラクトとしては、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス及びリボザイムコンストラクトが挙げられるが、これらに限らない。また、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの活性によってゲノムが改変された生物も含まれる。本明細書で使用する場合、「組み換え微生物」または「組み換え宿主細胞」には、本発明の組み換え微生物の子孫または誘導体が含まれる。継代においては、変異または環境的影響のいずれかから、ある特定の改変が見られることがあるので、このような子孫または誘導体は、実際には、親細胞と同一ではないこともあるが、それでも、本明細書で使用する場合には、この用語の範囲に含まれる。
核酸及びポリペプチドに関しては、「バリアント」という用語は、本明細書では、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、そのバリアントの配列同一性が少なくとも７０％となるように、それぞれ、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比べて、合成的にまたは天然に生じたいくつかの差異を塩基配列またはアミノ酸配列に持つポリペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチド分子を示す目的で使用する。他の実施形態では、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、そのバリアントの配列同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であることができる。この代わりにまたはこれに加えて、バリアントは、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、１つ以上の挿入または欠失を有することができる。例えば、タンパク質バリアントは、基準配列に対して、Ｎ末端が切断されているか、またはＣ末端が切断されていてもよく、あるいは、１つ以上の内部欠損を有することができる一方で、核酸バリアントは、５’末端及び／もしくは３’末端配列のトランケーションを有してもよく、ならびに／または、１つ以上の内部欠損を有することができる。更に、タンパク質バリアントは、基準配列に対して、Ｎ末端及び／またはＣ末端に付加された追加の配列を有してよく、あるいは、１つ以上の内部追加配列を有することができる一方で、核酸バリアントは、５’末端及び／もしくは３’末端配列の付加を有することができ、ならびに／または１つ以上の内部配列の付加を有することができる。バリアントは、基準のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、置換、挿入及び／または欠失のいずれかの所望の組み合わせを有することができる。ポリペプチド及びタンパク質バリアントは更に、翻訳後修飾（グルコシル化、メチル化、リン酸化など）の差異を含むことができる。「バリアント」という用語を微生物に関して用いるときには、典型的には、その属する種の特徴が同定されている微生物株であって、親株に対して、少なくとも１つのヌクレオチド配列変異または同定可能に異なる形質を有し、その形質が、遺伝に基づく（遺伝性である）微生物株を指す。
「ベクター」は、宿主細胞における外来のポリヌクレオチドの遺伝的移入、発現または複製の媒体として機能できるいずれかの遺伝的エレメントである。例えば、ベクターは、人工の染色体またはプラスミドであってよく、宿主細胞ゲノムに安定的に組み込むことができてよいか、または、独立した遺伝的エレメント（例えば、エピソーム、プラスミド）として存在してよい。ベクターは、１つのポリヌクレオチドとして、または２つ以上の別個のポリヌクレオチドとして存在してよい。ベクターは、宿主細胞に存在するとき、シングルコピーベクターまたはマルチコピーベクターであってよい。
「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」は、本明細書では、ＣＲＩＳＰＲシステムの酵素を総称的に指す目的で使用し、言及されているそのヌクレアーゼは、部位特異的な形でＤＮＡを加水分解し、その標的部位は、そのヌクレアーゼと相互作用するＲＮＡ分子によって決定される。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｂｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、これらのホモログ及びこれらの改変型が挙げられるが、これらに限らない。
「ＣＲＩＳＰＲシステム」または「ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステム」とは、Ｃａｓ９タンパク質もしくはそのバリアント、またはＣａｓタンパク質をコードする核酸分子など（しかしこれらに限らない）のＣａｓタンパク質とともに、遺伝子座を標的とし及び／または改変するのに必要な１つ以上のＲＮＡを指す。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも１つのｔｒａｃｒＲＮＡ（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」）またはｔｒａｃｒ ＲＮＡをコードする遺伝子と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ、すなわち「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」、またはｃｒＲＮＡをコードする遺伝子とを含むことができ、このｃｒＲＮＡは、標的核酸配列に相同である配列を含む。ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズできる「ｔｒａｃｒメイト」配列を更に含んでよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃａｓタンパク質（またはｃａｓタンパク質をコードする遺伝子もしくは転写産物）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列の両方を含む遺伝子または転写産物とを含むことができる。ｔｒａｃｒ配列とｃｒ（標的と相同な）配列の両方を含む１つのＲＮＡ分子は、本明細書では、「キメラガイドＲＮＡ」または単純に「ガイドＲＮＡ」という。ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるように、「ダイレクトリピート」及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡで処理される部分的ダイレクトリピートを含む）を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上のエレメントは、タイプＩ、タイプＩＩまたはタイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓシステムと、そのゲノム編集における利用は、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６−８２１、Ｂｒｏｕｎｓ（２０１２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８０８、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：３９７−４０５、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５７：１２６２−１２７８、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３−８２６、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ １５２：１１７３−１１８３、Ｗａｌｓｈ＆Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ（２０１３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １１０：１５５４１４−１５５５１５、Ｓａｎｄｅｒ＆Ｊｏｕｎｇ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｎａｔｕｒｅ ５０７：６３−６７、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、米国特許第８，６９７，３５９号、米国特許出願公開第２０１４０１７０７５３号、米国特許出願公開第２０１４０１７９００６号、米国特許第２０１４０１７９７７０号、米国特許出願公開第２０１４０１８６８４３号及び米国特許出願公開第２０１５００４５５４６号に開示されており、これらは全て、参照により、その全体が援用される。
概して、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連においては、プロトスペーサーともいう）で、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促すエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の関連においては、「標的配列」とは、ガイド配列がその配列と相補性を有するように設計されている配列を指し、標的配列とガイド配列とのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促される。完全相補性は必ずしも必要ではなく、ハイブリダイズさせて、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促すのに十分な相補性があればよい。標的配列は、ＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドのようないずれかのポリヌクレオチドを含んでよい。標的配列を含む標的遺伝子座への組み換えに用いてよい配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集配列」、「ドナー配列」または「ドナーＤＮＡ」という。本発明の態様では、外因性の鋳型ポリヌクレオチドは、ドナーＤＮＡ分子ということがある。
本明細書で使用する場合、「メガヌクレアーゼ」（「ホーミングエンドヌクレアーゼ」としても知られている）は、少なくとも１２塩基対の認識部位を有するエンドデオキシヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２００６，３８：４９−９５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を引き起こす。ホーミングエンドヌクレアーゼは、特異性が高く、１２〜４５塩基対（ｂｐ）長の範囲、通常は１４〜４０ｂｐ長の範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。このようなエンドヌクレアーゼの例としては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ Ｉ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、ＨＯ、ＰＩ−ＣｉｖＩ、ＰＩ−ＣｔｒＩ、ＰＩ−ＡａｅＩ、ＰＩ−ＢｓｕＩ、ＰＩ−ＤｈａＩ、ＰＩ−ＤｒａＩ、ＰＩ−ＭａｖＩ、ＰＩ−ＭｃｈＩ、ＰＩ−ＭｆｕＩ、ＰＩ−ＭｆｌＩ、ＰＩ−ＭｇａＩ、ＰＩ−ＭｇｏＩ、ＰＩ−ＭｉｎＩ、ＰＩ−ＭｋａＩ、ＰＩ−ＭｌｅＩ、ＰＩ−ＭｍａＩ、ＰＩ−ＭｓｈＩ、ＰＩ−ＭｓｍＩ、ＰＩ−ＭｔｈＩ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｘｅＩ、ＰＩ−ＮｐｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＲｍａＩ、ＰＩ−ＳｐｂＩ、ＰＩ−ＳｓｐＩ、ＰＩ−ＦａｃＩ、ＰＩ−ＭｊａＩ、ＰＩ−ＰｈｏＩ、ＰＩ−ＴａｇＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｋｏＩ、ＰＩ−ＴｓｐＩ及びＩ−Ｍｓｏｌが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、例えばメガヌクレアーゼまたは制限ヌクレアーゼＦｏｋＩのような制限エンドヌクレアーゼに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む、操作された制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定のゲノム部位を標的とするための特定のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。
「ＴＡＬＥ」、すなわち「転写活性化因子様エフェクター」は、その中央のリピートドメイン内のアミノ酸の配列によって、ＤＮＡ配列における特定の塩基を認識できるＤＮＡ結合タンパク質である。すなわち、ＴＡＬＥタンパク質は、特定のＤＮＡ配列と結合するように操作でき、「ＴＡＬＥＮ」、すなわち「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」として、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）に融合してよい。
本明細書で言及されている全ての文献及び特許出願は、個々の文献及び特許出願がそれぞれ、参照により援用されることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により、本明細書に援用される。
いずれの参照も、先行技術を構成すると認めるものではない。参照文献の考察は、執筆者の主張するものを提示しており、本出願者は、引用文献の正確性と妥当性に異議を申し立てる権利を持っている。本明細書では、多くの先行技術文献に言及しているが、この言及により、これらの文献のいずれも、当該技術分野における周知の一般的知識の一部を形成すると認めることにはならないことは、明らかに分かるであろう。
本明細書に示されている一般的な方法に関する考察は、例示することのみを意図している。他の代替的な方法と実施形態は、本開示を検討すれば、当業者には明らかであろう。
ＣＲＩＳＰＲシステム
ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃａｓ９ヌクレアーゼに加えて、標的部位配列との相補性によってゲノム標的部位と相互作用する標的化ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」ということが多い）と、ｃａｓ９ポリペプチドと複合体を形成するトランス活性化ＲＮＡとを含み、（相補性によって）標的化ｃｒＲＮＡと結合する領域も含む。
ヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して、二本鎖切断を引き起こす。続いて、これらの切断部は、非相同末端結合と相同配向性修復という２つの方法のうちの１つで、細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、二本鎖切断は、切断末端を相互に直接ライゲーションすることによって修復される。このケースでは、この部位には新たな核酸物質は挿入されないが、いくつかの核酸物質が喪失することがあり、その結果、欠失する。相同配向性修復では、切断された標的ＤＮＡ配列の修復用の鋳型として、切断された標的ＤＮＡ配列に対する相同性を有するドナーポリヌクレオチドを使用し、その結果、ドナーポリヌクレオチドからの遺伝情報が標的ＤＮＡに移入される。すなわち、切断部位に新たな核酸物質を挿入／コピーすることができる。いくつかのケースでは、ドナーＤＮＡ、例えば、宿主細胞に導入したドナーＤＮＡと標的ＤＮＡを接触させる。ＮＨＥＪ及び／または相同配向性修復による標的ＤＮＡの改変により、例えば、遺伝子補正、遺伝子置換、遺伝子のタギング、導入遺伝子の挿入、ヌクレオチドの欠失、遺伝子破壊、遺伝子変異などをもたらすことができる。
いくつかのケースでは、部位指向性改変ポリペプチドによるＤＮＡの切断を用いて、標的ＤＮＡ配列を切断して、外部から供給されるドナーポリヌクレオチドの非存在下で、その配列を細胞に修復させることによって、核酸物質を標的ＤＮＡ配列から欠損させてよい。
あるいは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡとｃａｓポリペプチドをドナーＤＮＡとともに、同時に細胞に与える場合には、本主題の方法を用いて、核酸物質を標的ＤＮＡ配列に付加、すなわち、挿入または置換して（例えば、挿入突然変異によって「ノックアウト」するか、またはタンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどをコードする核酸を「ノックイン」して）、タグ（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧなど）を付加したり、調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナルなど）を遺伝子に付加したり、核酸配列を改変したり（例えば、変異を導入する）などしてよい。
本発明は、ゲノム編集用に宿主菌株に共形質転換できる２つのＲＮＡ分子（「ｃｒＲＮＡ」と「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）の使用、または、本明細書において実施例に開示されているように、標的配列に相補的な配列と、ｃａｓ９タンパク質と相互作用する配列とを含むシングルガイドＲＮＡの使用を想定している。すなわち、本発明で用いるＣＲＩＳＰＲシステムは、２つの別個のＲＮＡ分子（「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」というＲＮＡポリヌクレオチド。下記を参照）を含むことができ、本明細書では、「二重分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「二分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」という。あるいは、実施例に示されているように、ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子（１つのＲＮＡポリヌクレオチド）であることができ、本明細書では、「キメラガイドＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」という。「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、包含的であり、二重分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡと、一分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の両方を指す。
例示的な二分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッターＲＮＡ）は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）と、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡの二重鎖の片方を形成する一連のヌクレオチド（「二重鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーターＲＮＡ）は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡの二重鎖のもう片方を形成する一連のヌクレオチド（二重鎖形成セグメント）を含む。換言すると、ｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドと相補的であり、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の一連のヌクレオチドとハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡの二重鎖を形成する。すなわち、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有するということができる。加えて、ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを備える。したがって、ｃｒＲＮＡ様分子とｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、（対応する対として）ハイブリダイズして、ＤＮＡ標的化ＲＮＡを形成する。所定のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、そのＲＮＡ分子が見られる種に特有のものである。
「アクチベーターＲＮＡ」という用語は、本明細書では、二重分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意味するものとして使用する。「ターゲッターＲＮＡ」という用語は、本明細書では、二重分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡのｃｒＲＮＡ様分子を意味するものとして使用する。「二重鎖形成セグメント」という用語は、本明細書では、対応するアクチベーターＲＮＡまたはターゲッターＲＮＡ分子の一連のヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、ｄｓＲＮＡの二重鎖の形成に寄与するアクチベーターＲＮＡまたはターゲッターＲＮＡの一連のヌクレオチドを意味するものとして使用する。換言すると、アクチベーターＲＮＡは、対応するターゲッターＲＮＡの二重鎖形成セグメントに相補的である二重鎖形成セグメントを含む。すなわち、アクチベーターＲＮＡは、二重鎖形成セグメントを含む一方で、ターゲッターＲＮＡは、二重鎖形成セグメントと、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの両方を含む。したがって、本主題の二重分子型ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、いずれかの対応するアクチベーターＲＮＡおよびターゲッターＲＮＡのペアから構成できる。
「宿主細胞」とは、本明細書で使用する場合、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞（例えば、細菌細胞もしくは古細菌細胞）、または単細胞体として培養した多細胞生物細胞（例えば細胞株）であって、その真核細胞もしくは原核細胞を核酸の受容細胞として使用できるか、または使用したものを示す。「宿主細胞」には、核酸によって形質転換した、元の細胞の子孫も含まれる。１つの細胞の子孫は、自然変異、偶発的変異または意図的な変異により、必ずしも形態、またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補物が、元の親細胞と完全に同一でなくてもよいことが分かる。「組み換え宿主細胞」（「遺伝子改変宿主細胞」ともいう）は、外因性の核酸、例えば、発現カセットまたはベクターが導入された宿主細胞である。
一分子型ガイドＲＮＡと２つのＲＮＡシステムの両方については、参照により本明細書に援用される文献、例えばＵＳ２０１４００６８７９７に詳細に説明されている。２つ以上のｃａｓ９タンパク質由来のドメインを兼ね備えてよいキメラＣａｓ９タンパク質と、同定されているｃａｓ９タンパク質のバリアント及び変異体を含め、いずれかのＣａｓ９タンパク質を本発明の方法で用いることができる（例えば、ＵＳ２０１４００６８７９７に配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６として示されているｃａｓ９タンパク質を参照されたい）。
例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの変異体の１つは、標的ＤＮＡの相補鎖を切断できるが、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が低下している（その結果、二本鎖切断（ＤＳＢ）ではなく、一本鎖切断（ＳＳＢ）が行われる）Ｄ１０Ａ（１０位のアミノ酸におけるアスパルテートからアラニンへの）変異（または、ＵＳ２０１４００６８７９７の配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６に示されているタンパク質のいずれかの、対応する変異）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態は、標的ＤＮＡの非相補鎖を切断できるが、標的ＤＮＡの相補鎖を切断する能力が低下している（その結果、ＤＳＢの代わりに、ＳＳＢが行われる）Ｈ８４０Ａ（８４０位のアミノ酸におけるヒスチジンからアラニンへの）変異（または、配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６に示されているタンパク質のいずれかの、対応する変異）である。Ｃａｓ９のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａバリアント（または、ＵＳ２０１４００６８７９７の配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６として示されているタンパク質のいずれかの、対応する変異）の使用により、予想される生物学的結果を変化させることができる。ＳＳＢではなく、ＤＳＢが存在すると、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が行われる可能性がかなり高くなるからである。他の残基を変異させて、同じ効果を得る（すなわち、一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ことができる。非限定例として、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６及び／もしくはＡ９８７の残基（または、配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６として示されているタンパク質のいずれかの、対応する変異）を変更する（すなわち、置換する）ことができる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存性に関する更なる情報については、図３、図５、図１１Ａ及び表１を参照されたい）。また、アラニン置換以外の変異も好適である。いくつかの実施形態では、部位指向性ポリペプチド（例えば、部位指向性改変ポリペプチド）の触媒活性が低下しているときには（例えば、Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７の変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ及び／またはＤ９８６Ａを有するときには）、そのポリペプチドは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと相互作用する能力を保持している限りは、依然として、部位特異的な形で標的ＤＮＡに結合できる（依然として、ＤＮＡ標的化ＲＮＡによって、標的ＤＮＡ配列に誘導されるからである）。
いくつかの例では、Ｃａｓ９ポリペプチドが標的ＤＮＡの相補鎖と非相補鎖の両方を切断する能力が低下するように、Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態は、Ｄ１０Ａ変異とＨ８４０Ａ変異の両方（または、ＵＳ２０１４００６８７９７の配列番号１〜２５６及び７９５〜１３４６として示されているタンパク質のいずれかの、対応する変異）を有する（すなわち、そのバリアントは、実質的に、ヌクレアーゼ活性を有さないことができる）。
Ｃａｓタンパク質
宿主細胞に導入された核酸分子によってコードされるＣａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、これらのホモログまたはこれらの改変型のようないずれかのｃａｓタンパク質であることができる。非限定例として、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）またはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質のようなＣａｓ９タンパク質であることができる。Ｃａｓ９酵素は、標的配列内及び／または標的配列の相補物内などの標的配列の位置で、ＤＮＡの一方または両方の鎖を切断できる。例えば、ｃａｓ９酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約１塩基対、２塩基対、３塩基対、４塩基対、５塩基対、６塩基対、７塩基対、８塩基対、９塩基対、１０塩基対、１５塩基対、２０塩基対、２５塩基対、５０塩基対、１００塩基対または２００塩基対以内で、一方または両方の鎖の切断を方向づけることができる。
いくつかの例では、変異ｃａｓ９酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力が欠損するように、高効率ゲノム編集用細胞株を産生させるために宿主細胞に導入した核酸分子は、対応する野生型酵素と比べて変異しているｃａｓ９酵素をコードする。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の触媒ドメインＲｕｖＣ Ｉにおけるアスパルテートからアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼから、ニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例としては、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ及びＮ８６３Ａが挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列、例えば、ＤＮＡ標的のセンス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列と組み合わせて用いてよい。この組み合わせにより、両方の鎖にニックを入れて、ＮＨＥＪを誘導するのに用いることができるようになる。２つのニッカーゼ標的（近接範囲内であるが、ＤＮＡの異なる鎖を標的とする）を用いて、変異原性のＮＨＥＪを誘導できる。対向鎖をずれた位置で切断する酵素を用いて、遺伝子座をこのように標的化すると、標的外での切断を低減することもできる。ゲノム変異を実現するには、両方の鎖は、正確かつ特異的に切断しなければならないのである。
更なる例としては、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ及びＲｕｖＣ ＩＩＩ）を変異させて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性が欠損している変異Ｃａｓ９を産生させてよい。いくつかの実施形態では、Ｄ１０Ａ変異をＨ８４０Ａ、Ｎ８５４ＡまたはＮ８６３Ａ変異の１つ以上と組み合わせて、実質的に全てのＤＮＡ切断活性が欠損しているＣａｓ９酵素を産生させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、その変異酵素のＤＮＡ切断活性が、その非変異体に対して約２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満であるか、またはそれよりも低いときに、実質的に全てのＤＮＡ切断活性が欠損しているとみなす。他の変異が有用である場合もあり、その場合、Ｃａｓ９またはその他のＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ以外の種に由来し、対応するアミノ酸の変異を行って、同様の効果を得てよい。
いくつかのケースでは、バリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドは、融合ポリペプチド（「バリアントＣａｓ９融合ポリペプチド」）であり、すなわち、ｉ）バリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドと、ｂ）共有結合している異種のポリペプチド（「融合パートナー」ともいう）とを含む融合ポリペプチドである。異種の核酸配列を、別の核酸配列に（例えば、遺伝子操作によって）連結させて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成してよい。いくつかの実施形態では、バリアントＣａｓ９融合ポリペプチドは、細胞内に局在化させる異種の配列（すなわち、この異種の配列は、細胞内局在化配列、例えば、核に導く核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアに導くミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体に導く葉緑体局在化シグナル、ＥＲ
保留シグナルなどである）と、バリアントＣａｓ９ポリペプチドを融合することによって生成する。いくつかの実施形態では、この異種の配列は、トラッキング及び／または精製をしやすくするためのタグをもたらすことができる（すなわち、異種の配列は、検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、宿主細胞での最適な発現用にコドン最適化できる。
高効率ゲノム編集用の宿主細胞
本発明では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを発現するとともに、ゲノム編集効率が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％または少なくとも８０％である細胞株と微生物株を含む宿主細胞を提供する。ゲノム編集効率は、ドナーＤＮＡで形質転換されている細胞であって、標的遺伝子座で改変される細胞の割合である。典型的には、その編集コンストラクトを受容する細胞を選択できるように、ドナーＤＮＡ（編集ＤＮＡともいう）は、選択可能マーカーを含む。改変された標的遺伝子座を有する選択済み形質転換体の割合は、その細胞株または株におけるゲノム編集効率を表す。
特定の遺伝子座を標的とすることは、キメラガイド（宿主ゲノム内の標的部位に対して相同性を有するｃｒＲＮＡ配列に加えて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む）またはゲノム標的部位と相同である、約１６〜約２０ヌクレオチドの配列を含むとともに、ｔｒａｃｒＲＮＡと相互作用する配列（「ｔｒａｃｒメイト配列」）も含むｃｒＲＮＡのいずれかであることもできるガイドＲＮＡを細胞に共形質転換することによって行われる。あるいは、発現コンストラクトを宿主細胞に形質転換することによって、キメラガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡを宿主細胞において発現させることができる。別の変形形態では、宿主細胞は、その細胞内に操作されたコンストラクトからｔｒａｃｒＲＮＡを発現でき、標的化ｃｒＲＮＡをその細胞に形質転換でき、例えば、ｃｒＲＮＡは、ドナーＤＮＡとともに、宿主細胞に共形質転換できる。
導入したＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ遺伝子を完全浸透性で、すなわち培養物全体にわたって発現する細胞株と株を単離することによって、これらの高い効率を得ることができることを本発明者は発見した。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ遺伝子、例えば、タイプＩＩ Ｃａｓ遺伝子（Ｃａｓ９遺伝子など）を完全浸透度で発現させる宿主株は、同じコンストラクト上で、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を、検出可能マーカー（蛍光タンパク質など）をコードする遺伝子とともに細胞集団に導入し、物理的に連結された検出可能マーカー遺伝子の発現レベルを評価することによって単離できる。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９をコードする遺伝子を含むとともに、蛍光タンパク質をコードする遺伝子も含むコンストラクトで形質転換した細胞株または微生物株を、フローサイトメトリーによって解析する。１つの蛍光強度ピークを示す形質転換細胞株であって、フローサイトメトリーのヒストグラム上のその１つの蛍光ピークの蛍光レベルが、対照細胞（蛍光タンパク質遺伝子を持たない細胞）の示すピークよりも高い形質転換細胞株を、完全浸透性の細胞株として同定する。
本明細書における実施例に示されているように、１つの形質転換コロニーに由来する細胞培養物のフローサイトメトリーから得られるヒストグラム（蛍光がｘ軸に、典型的には対数スケールで示されており、細胞数がｙ軸に示されている）には、その培養物における発現レベルの分布が示されている。蛍光タンパク質遺伝子を発現しない対照細胞（例えば、非形質転換細胞）であって、バックグラウンド（自己蛍光）レベルで単一のピークを示す細胞の蛍光レベルと比べると、形質転換細胞株は、対照細胞のピークと一致する単一のピークを示すことができる（その細胞株が、非発現体であることを示す）か、または、２つのピークを示すことができ、そのうちの１つは、対照細胞のピークと一致する（その細胞株が、蛍光タンパク質遺伝子の発現に関して完全浸透性ではないことを示す）ことが分かっている。本発明における実施例では、ＧＦＰ導入遺伝子に物理的に連結している導入遺伝子（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｒｅリコンビナーゼ、タイプＩ ＦＡＳ、ＺｎＣｙｓ−２８４５ＲＮＡｉ）の発現は、その連結ＧＦＰ遺伝子が完全浸透度での発現を示すと、完全浸透度での発現を示すことが示されている。
完全浸透性の細胞株または株の単離方法では、独立した形質転換イベントに由来する細胞集団ではなく、クローン細胞株または株を解析する。フローサイトメトリー法には、単一クローンに由来する、解析細胞培養物の亜集団の選択は含まれない。すなわち、様々な好ましい実施形態における方法は、セルソーティングを含まない。
導入遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株または微生物株の同定方法を用いて、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを完全浸透度で発現する細胞株または株を同定できる。
標的細胞
本明細書に示されている方法を用いて、インビボ及び／またはエキソビボ及び／またはインビトロで、有糸分裂細胞または分裂終了細胞におけるＤＮＡの切断、ＤＮＡの改変及び／または転写調節を誘導してよい（例えば、個体に再導入できる遺伝子改変細胞を生成してよい）。ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることによって、特異性をもたらすので、開示されている方法において対象となる有糸分裂細胞及び／または分裂終了細胞は、いずれかの生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫類など）由来の細胞、脊柱動物（例えば、魚類、両生動物、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞など）を含んでよい。
いずれかのタイプの細胞を対象としてよい（例えば、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞）、体細胞（例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞）、いずれかの段階における胚のインビトロまたはインビボ胚細胞（例えば、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期などのゼブラフィッシュ胚）など）。細胞は、樹立細胞株由来であってよく、あるいは、初代細胞であってよく、「初代細胞」、「初代細胞株」及び「初代培養物」は、本明細書では、対象から得たとともに、限られた継代数、すなわち分裂数の培養でインビトロ増殖できる細胞及び細胞培養物を指す目的で同義的に使用する。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回または１５回継代したものであってよいが、クライシス期を経るのに十分な回数ではない培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、インビトロで１０継代未満維持される。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であり、または培養物中で増殖させる。
ゲノム改変用の宿主細胞は、植物細胞、動物細胞または微生物細胞であることができるとともに、任意で、藻類細胞（アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、Ｈａｌｏｃａｆｅｔｅｒｉａ、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属またはボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属の種の細胞など）であってよい。
例示的な珪藻としては、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、Ｃｙｍｂｅｌｌａ属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、シュードニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、Ｐｓａｍｍｏｄｉｃｔｙｏｎ属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｎｅｍａ属及びタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属のメンバーが挙げられる。本明細書に示されているような合成的染色体コンストラクトと合成的染色体のための宿主であってよいユースティグマトファイトの例としては、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属の種のみならず、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属及びユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属の種も挙げられる。いくつかの例では、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属（Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）、Ｎ．ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｎ．ｌｉｍｎｅｔｉｃａ、Ｎ．ｏｃｅａｎｉｃａ、Ｎ．ｏｃｕｌａｔａ及びＮ．ｓａｌｉｎａなどがあるが、これらに限らない）の種の藻が、本明細書に示されているような合成的染色体コンストラクトで形質転換されている。
この代わりにまたはこれに加えて、本発明の合成的染色体コンストラクトまたは合成的染色体を含む宿主細胞は、任意で、不等毛類細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌細胞または原生生物であってよい。例えば、不等毛類としては、上に列挙されているようなユースティグマトファイトと珪藻のみならず、ラビリンチュリッド及びスラウストキトリッドを含むツボカビ種も挙げられる。いくつかの例では、本発明で使用されることが検討される不等毛類の種としては、珪藻類、ユースティグマトファイト、ラビリンチュリッド及びスラウストキトリッドが挙げられるがこれらに限らない。いくつかの例では、株は、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属またはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属の種であってよい。例えば、株は、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属またはアウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であってよい。
原核生物の宿主細胞も考えられ、例えば、宿主細胞は、古細菌、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌（例えばＣｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌もしくは紅色非硫黄細菌の群のいずれか、またはアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）属、デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）属、ロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属もしくはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のいずれかに属する種のものであることができる。
宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の群のいずれかの細胞であることができ、あるいは、メソミセトゾア（例えば、Ｓｐｈａｅｒｏｆｏｒｍａ）、不等毛類または藻の細胞であることができる。
藻の宿主細胞は、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属のものであることができる。
例えば、本明細書に示されているようなＣａｓ９発現宿主は、珪藻（例えば、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、Ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｕｓ属、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、Ｃｙｍｂｅｌｌａ属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、シュードニッチア（Ｐｓｅｕｄｏ−Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、Ｐｓａｍｍｏｄｉｃｔｙｏｎ属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｎｅｍａ属及びタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属のいずれかの一種など）であることができる。高効率なｃａｓ９エディター株であることができるユースティグマトファイトとしては、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、及びヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属の種が挙げられるが、これらに限らない。例えば、本明細書に開示されているような遺伝子改変または核酸単離用の微生物としては、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のメンバーが挙げられる。好適な種としては、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）、Ｎ．ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｎ．ｌｉｍｎｅｔｉｃａ、Ｎ．ｍａｒｉｔｉｍｅ、Ｎ．ｏｃｅａｎｉｃａ、Ｎ．ｏｃｕｌａｔａ及びＮ．ｓａｌｉｎａが挙げられるが、これらに限らない。ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のいくつかの好ましい種としては、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）、Ｎ．ｏｃｅａｎｉｃａ、Ｎ．ｏｃｕｌａｔａ及びＮ．ｓａｌｉｎａが挙げられるが、これらに限らない。
対象となってよい他のタイプの細胞としては、例えば、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞）、体細胞（例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞）、いずれかの段階における胚のインビトロまたはインビボ胚細胞（例えば、１細胞期、２細胞期、４細胞期、８細胞期などのゼブラフィッシュ胚など）が挙げられる。細胞は、樹立細胞株由来であってよく、あるいは、初代細胞であってよく、「初代細胞」、「初代細胞株」及び「初代培養物」は、本明細書では、対象に由来するとともに、限られた継代数、すなわち分裂数の培養でインビトロ増殖できる細胞及び細胞培養物を指す目的で同義的に使用する。例えば、初代培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回または１５回継代したものであってよいが、クライシス期を経るのに十分な回数ではない培養物である。初代細胞株は、インビトロで１０継代未満維持することができる。標的細胞は、多くの実施形態では、単細胞生物であり、または培養物中で増殖させる。
細胞が初代細胞である場合、その細胞は、いずれかの利便的な方法によって、個体から採取してよい。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球除去療法、密度勾配分離などによって、利便的に採取できる一方で、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織に由来する細胞は、最も利便的には、生検によって採取する。採取した細胞の分散または懸濁には、適切な溶液を用いてよい。このような溶液は概ね、低濃度、例えば５〜２５ｍＭの許容可能なバッファーと併せて、ウシ胎児血清または他の天然の因子を利便的に添加した平衡塩類溶液、例えば、通常生理食塩溶液、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液などとなる。利便的なバッファーとしては、ＨＥＰＥＳ、リン酸バッファー、乳酸バッファーなどが挙げられる。細胞は、すぐに用いても、長期間にわたって保管、凍結し、解凍し、再利用できてもよい。このようなケースでは、細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝化媒体またはこのように凍結する温度で細胞を保存する目的で、当該技術分野において一般に用いられているいずれかの他の同様の溶液中で凍結し、凍結培養細胞を解凍するためとして当該技術分野で広く知られているような形式で解凍される。
核酸の宿主細胞への導入
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、またはトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、キメラガイドＲＮＡ（キメラｇＲＮＡ）もしくはゲノム遺伝子座を標的とするｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、様々な周知の方法のいずれかによって、宿主細胞に導入できる。Ｃａｓポリペプチド（Ｃａｓ９ポリペプチドなど）またはそのバリアントをコードする遺伝子など、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の宿主細胞への導入は、様々な周知の方法のいずれかによるものであることができる。
核酸の宿主細胞への導入方法は、当該技術分野において周知であり、いずれかの既知の方法を用いて、核酸（例えば発現コンストラクト）を幹細胞、前駆細胞、細胞株、初代細胞または微生物細胞に導入できる。好適な方法としては、例えばウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ．１３． ｐｉｉ：５０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照されたい）などが挙げられる。
遺伝子形質転換により、導入遺伝子またはｔｒａｃｒＲＮＡの安定した挿入及び／または発現を実現でき、いくつかのケースでは、導入遺伝子、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡの一過性発現を実現できる。編集（ドナー）ＤＮＡの導入にも、形質転換法を用いることができる。藻類を含む微生物で使用できる形質転換法の非限定例としては、例えば、Ｄｕｎａｈａｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５（３）：４５２−４６０，１９９３、Ｋｉｎｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０、Ｍｉｃｈａｅｌ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１３，４２７−４３５，１９９８に報告されているような、ガラスビーズまたは炭化ケイ素ウィスカーの存在下での細胞の攪拌が挙げられる。ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓｐ．）属（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，４４：７６８−７６，２００８を参照されたい）、クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９：３６５−３７０，２００１、Ｃｈｏｗ ａｎｄ Ｔｕｎｇ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．９，７７８−７８０，１９９９を参照されたい）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８：１８２１−１８２８，１９９８）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０（３）：１８５−１９２，２００５）を含むいくつかの微細藻類種の遺伝形質転換に、エレクトロポレーション技法が良好に用いられてきている。例えば、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属（Ａｐｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２５２：５７２−５７９，１９９６）、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属及びナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属（Ｄｕｎａｈａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３１：１００４−１０１２，１９９５）、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３５：１１３−１２０，１９９９）、ならびにキートケロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｓｐ．）（Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．５９：１１３−１１９，２０１１）のような珪藻種と、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属（Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ，Ｂｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２：２０９−２１６，１９９９）及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）種（Ｊａｋｏｂｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５５：３８１−９３，２００４）のような緑藻種とを含むいくつかの藻類種には、マイクロプロジェクタイルボンバードメント（微粒子ボンバードメント、遺伝子銃形質転換またはバイオリスティックボンバードメントともいう）が良好に用いられてきている。加えて、例えば、Ｋｕｍａｒ，Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．，１６６（３）：７３１−７３８，２００４及びＣｈｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．３７，Ｓｕｐｐｌ．１１，２００１によって報告されているように、微細藻類の遺伝子形質転換には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介遺伝子移入技法も有用であり得る。
本明細書に記載されているような形質転換ベクターもしくはコンストラクト、及び／または本明細書に開示されている方法で用いられているようなドナー（編集）ＤＮＡは典型的には、目的の宿主細胞に選択可能またはスコア化可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むことになる。一般的な選択可能マーカーとしては、抗生物質耐性の蛍光マーカー及び生化学的マーカーが挙げられ、一般的な選択可能マーカーは、当該技術分野において周知である。微細藻類の形質転換体の選択には、ブラストサイジン、ブレオマイシン（例えば、Ａｐｔらによる上記の１９９６年の文献、Ｆｉｓｃｈｅｒらによる上記の１９９９年の文献、Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９， ３５３−６１，１９９９、Ｌｕｍｂｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１４（４）：４４１−４４７，１９９８、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３６：３７９−３８６，２０００を参照されたい）、スペクチノマイシン（Ｃｅｒｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５：９７−１１０，１９９７、Ｄｏｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９，４９−６０，２００１、Ｆａｒｇｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９８０−９０，１９９９）、ストレプトマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５３：４０１−４１２，２００２）、パロモマイシン（Ｊａｋｏｂｉａｋらによる上記のＰｒｏｔｉｓｔの文献、Ｓｉｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２７７：２２１−２２９，２００１）、ノウルセオスライシン（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら２０００年の文献）、Ｇ４１８（Ｄｕｎａｈａｙらによる上記の１９９５年の文献、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２７２：３４１３−３４２３，２００５、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａらによる上記の２０００年の文献）、ハイグロマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄらによる上記の２００２年の文献）、クロラムフェニコール（Ｐｏｕｌｓｅｎ及びＫｒｏｇｅｒによる上記の２００５年の文献）などを含むいくつかの様々な抗生物質に対する耐性遺伝子が良好に用いられてきている。クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属のような微細藻類用の更なる選択可能マーカーは、カナマイシンに対する耐性及びアミカシン耐性（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０，２０００）、ゼオマイシン及びフレオマイシン（例えばＺＥＯＣＩＮ（商標）フレオマイシンＤ１）耐性（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：２３−３０，１９９６）、ならびにパラモマイシン及びネオマイシン耐性（Ｓｉｚｏｖａによる上記の２００１年の文献）をもたらすマーカーであることができる。
用いられてきた蛍光マーカーまたは発色マーカーとしては、ルシフェラーゼ（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ２００４、Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１７−３２２，１９９１）、β−グルクロニダーゼ（Ｃｈｅｎらによる上記の２００１年の文献、Ｃｈｅｎｅｙらによる上記の２００１年の文献、Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇによる上記の１９９９年の文献、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈによる上記の１９９９年の文献、Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅらによる上記の１９９９年の文献、Ｋｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：１６５−１６９，１９９４）、β−ガラクトシダーゼ（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５：３４５−３４９，２００３、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，２１：１２１１−１２１６，２００３、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３： ８７−８９，２００３）、ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｈｅｎｅｙらによる上記の２００１年の文献、Ｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，２００２、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２００２；５６，１４８−２１０）が挙げられる。
形質転換システム用には、微細藻類種において有用なプロモーターを含め、様々な既知のプロモーター配列を有益に配置することができる。例えば、微細藻類において導入遺伝子の発現を駆動する目的で用いるプロモーターとしては、渦鞭毛藻類及び緑藻植物の両方で用いられてきている様々な型のカリフラワーモザイクウイルスプロモーター３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１８：７７８−７８０，１９９９、Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３１７−３２１，１９９１、Ｌｏｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎ ｔＪ．，１３：４２７−４３５，１９９８）が挙げられる。シミアンウイルス由来のＳＶ４０プロモーターも、いくつかの藻類において活性を持つことが報告されている（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５１ ３４５−３４９，２００３、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ ３９８−３９９，４６９−４７２，１９９９）。ＲＢＣＳ２（リブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼ、小サブユニット）のプロモーター（Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９：３５３−３６１，１９９９）及びクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属由来のＰｓａＤ（光化学系Ｉ複合体の豊富なタンパク質、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｏｃｈａｉｘ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８１：５５５５−５５６０，２００１）も有用であり得る。ＨＳＰ７０Ａ／ＲＢＣＳ２及びＨＳＰ７０Ａ／β２ＴＵＢ（チューブリン）の融合プロモーター（Ｓｃｈｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２１：１２１−１３１，２０００）も、導入遺伝子の発現の向上に有用であり得、このＨＳＰ７０ Ａプロモーターは、他のプロモーターの上流に配置すると、転写活性化因子として機能できる。目的の遺伝子の高レベル発現は、例えば珪藻種においては、珪藻フコキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｆｃｐ遺伝子（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３７９−３８６，２０００）またはユースティグマトファイトビオラキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｖｃｐ遺伝子（米国特許第８，３１８，４８２号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）のプロモーターの制御下において実現することもできる。
誘導性プロモーターは、本発明の様々な態様（ｃｒｅのような部位特異的リコンビナーゼの発現が挙げられるが、これに限らない）において有用であり得る。例えば、硝酸レダクターゼをコードするＮＲ遺伝子のプロモーター領域は、微細藻類を含む微生物において、誘導性プロモーターとして使用できる。ＮＲプロモーター活性は典型的には、アンモニウムによって抑制され、アンモニウムがナイトレートによって置換されると誘導される（Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２７２：３４１３−３４２３，２００５）ので、アンモニウム／ナイトレートの存在下で微細藻類細胞を増殖させると、遺伝子発現のオン／オフを切り替えることができる。本明細書に示されているコンストラクト及び形質転換システムで使用できる更なる藻類プロモーターとしては、米国特許第８，８８３，９９３号、米国特許出願公開第２０１３／００２３０３５号、米国特許出願公開第２０１３／０３２３７８０号及び米国特許出願公開第２０１４／０３６３８９２号に開示されているものが挙げられ、これらはいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／またはバリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を宿主細胞（または宿主細胞の集団）に導入することを含むことができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／または部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む好適な核酸としては、発現ベクターが挙げられ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／または部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組み換え発現ベクター」である。
使用する宿主／ベクターシステムに応じて、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、多くの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかを、発現ベクターにおいて用いてよい（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／またはバリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（プロモーターなど）に機能的に連結している。この転写制御エレメントは、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、または原核細胞（例えば、細菌もしくは古細菌細胞）のいずれかにおいて機能的であってよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／またはバリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ及び／またはバリアントＣａｓ９の部位指向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の原核細胞と真核細胞の両方での発現を可能にする多数の制御エレメントに機能的に連結している。
プロモーターは、構成的活性型プロモーター（すなわち、構成的に活性／「オン」状態であるプロモーター）であることができ、誘導性プロモーター（すなわち、その活性／「オン」状態または不活性／「オフ」状態が、外的刺激、例えば、特定の温度、化合物またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であってもよく、空間制限型プロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーターなど）であってもよく、時間制限型プロモーター（すなわち、そのプロモーターは、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセス、例えば、マウスの毛包サイクルの特定の段階中に、「オン」状態または「オフ」状態である）であってもよい。
好適なプロモーターは、ウイルスに由来することができるので、ウイルスプロモーターということができ、あるいは、原核生物または真核生物を含むいずれかの生物に由来することができる。好適なプロモーターを用いて、いずれかのＲＮＡポリメラーゼ（例えばｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を駆動できる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス長鎖末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）など）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６低分子核内プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７−５００（２００２））、増強Ｕ６プロモーター（例えばＸｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが挙げられるが、これらに限らない。
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節型プロモーター、ラクトース誘導型プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えばＴｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲンレセプター調節型プロモーターなどが挙げられるが、これらに限らない。したがって、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、エストロゲンレセプター、エストロゲンレセプター融合体などを含む（しかしこれらに限らない）分子によって調節することができる。
選択可能マーカー
選択可能マーカーは、非限定例としては、ブラストサイジン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｇ４１８、ゲンタマイシン、グライフォセート、ハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ノウルセオスライシン、パロモマイシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシンまたはゼオマイシンのような抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子であることができる。選択可能マーカーは、メトトレキサートもしくはＤＦＭＯ、またはフォスフィノスライシン、グライフォセート、イミダゾリノン、スルフォニル尿素、アトラジン、グルフォシネートまたはスルフォンアミドのような除草剤に対する耐性も付与することができる。例えば、アルギニン合成のためのアルギノサクシネートリアーゼ、窒素同化（ナイトレートを利用する能力）のためのナイトレートレダクターゼ、チアミン生合成のためのｔｈｉ１０またはニコチンアミド生合成のためのｎｉｃをコードする遺伝子のように、選択可能マーカーは、栄養要求性宿主株の独立栄養増殖も可能にできる。
検出可能マーカーまたはレポーター遺伝子は、様々な蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質及び赤色蛍光タンパク質、ならびにこれらのバリアントが挙げられるが、これらに限らない）をコードする遺伝子を含むことができる。用いることができるその他のマーカーとしては、ルシフェラーゼ（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４、Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１７−３２２，１９９１）、β−グルクロニダーゼ（Ｃｈｅｎらによる上記の２００１年の文献、Ｃｈｅｎｅｙらによる上記の２００１年の文献、Ｃｈｏｗ及びＴｕｎｇによる上記の１９９９年の文献、Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈらによる上記の１９９９年の文献、Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅらによる上記の１９９９年の文献、Ｋｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：１６５−１６９，１９９４）、ならびにβ−ガラクトシダーゼ（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５：３４５−３４９，２００３、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，２１：１２１１−１２１６，２００３、Ｑｉｎ ｅｔａｌ．，Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１３：８７−８９，２００３）を含め、蛍光または発色産物を生成させる酵素が挙げられる。着色または標識産物を検出するのに用いることのできる酵素の更なる非限定例としては、アリールスルファターゼ（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：２９５９−２９６５、Ｈａｌｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｕｍｐｅｒ（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１：１４３−１５０）、アルカリホスファターゼ（Ｅｌ−Ｓａｎｋａｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ２９：１４９９−１５０４）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｋｉｙａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１０７３８−１０７４４）が挙げられる。
選択可能マーカーは、そのマーカーを発現する、すなわち、合成的染色体コンストラクトを含む不等毛類細胞、藻類細胞、酵母細胞、植物細胞またはこれらの組み合わせを得るための手段をもたらすことができるので、本開示の合成的染色体の成分として有用であり得る。選択可能マーカーの例としては、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のデアミナーゼのようなデアミナーゼをコードする遺伝子であって、ブラストサイジンＳに対する耐性を付与する遺伝子（Ｔａｍｕｒａ，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：２３３６−２３３８，１９９５）と、ブレオマイシン、ゲンタマイシン、グライフォセート、ハイグロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、フレオマイシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン及びストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼは、アミノグリコシドネオマイシン、カナマイシン及びパロマイシンに対する耐性を付与し（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ． ２：９８７−９９５，１９８３）、「ハイグロ」遺伝子は、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Ｍａｒｓｈ，Ｇｅｎｅ ３２：４８１−４８５，１９８４）。微細藻類の形質転換体の選択には、ブラストサイジン、ブレオマイシン（例えば、Ａｐｔらによる上記の１９９６年の文献、Ｆｉｓｃｈｅｒらによる上記の１９９９年の文献、Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９，３５３−６１，１９９９、Ｌｕｍｂｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１４（４）：４４１−４４７，１９９８、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３６：３７９−３８６， ２０００を参照されたい）、スペクチノマイシン（Ｃｅｒｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４５：９７−１１０，１９９７、Ｄｏｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９，４９−６０，２００１、Ｆａｒｇｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９：６９８０−９０，１９９９）、ストレプトマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｉｓｔ，１５３：４０１−４１２，２００２）、パロモマイシン（Ｊａｋｏｂｉａｋらによる上記のＰｒｏｔｉｓｔの文献、Ｓｉｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ，２７７：２２１−２２９，２００１）、ノウルセオスライシン（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａらによる上記の２０００年の文献）、Ｇ４１８（Ｄｕｎａｈａｙらによる上記の１９９５年の文献、Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ２７２：３４１３−３４２３，２００５、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａらによる上記の２０００年の文献）、ハイグロマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄらによる上記の２００２年の文献）、クロラムフェニコール（Ｐｏｕｌｓｅｎ及びＫｒｏｇｅｒによる上記の２００５年の文献）などを含むいくつかの様々な抗生物質耐性遺伝子が良好に用いられてきている。微細藻類で用いる更なる選択可能マーカーは、カナマイシン及びアミカシン（Ｂａｔｅｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０，２０００）、ゼオマイシン及びフレオマイシン（例えば、ＺＥＯＣＩＮ（商標）フレオマイシンＤ１）（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：２３−３０，１９９６）、ならびにパラモマイシン及びネオマイシン（Ｓｉｚｏｖａらによる上記の２００１年の文献）に対する耐性をもたらすマーカーであることができる。
メトトレキサート等の代謝拮抗物質に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｒｅｉｓｓ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． Ａｄｖ．）１３：１４３−１４９，１９９４）、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：８０４７，１９８８）、細胞がマンノースを利用できるようにするマンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ（ＷＯ９４／２０６２７）、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターに対する耐性を付与するオルニチンデカルボキシラーゼ、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ、ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，１９８７，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ．）をコードする遺伝子も考えられる。更なる選択可能マーカーとしては、除草剤耐性を付与するもの、例えば、フォスフィノスライシンに対する耐性を付与するフォスフィノスライシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：１０６２，１９９０、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５−６３１，１９９０）、グライフォセート耐性を付与する変異体ＥＰＳＰＶ−シンターゼ（Ｈｉｎｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９１：９１５−９２２，１９９８）、イミダゾリノンもしくはスルフォニル尿素耐性を付与する変異体アセトラクテートシンターゼ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４１−１２４８，１９８８）、アトラジンに対する耐性を付与する変異体ｐｓｂＡ（Ｓｍｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０３：９１１−９１７，１９９３）、もしくは変異体プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（米国特許第５，７６７，３７３号を参照されたい）、またはグルフォシネート、スルフォンアミド、フォスフィノスライシンもしくはスルフォニル尿素のような除草剤に対する耐性を付与するその他のマーカー（例えば、Ｍａｌｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐａｇｅ ３９を参照されたい）が挙げられる。Ｅ． ｃｏｌｉのような原核生物における合成的染色体コンストラクトの選択には、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールのような抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を用いることができる。
栄養要求性マーカーは、例えば、アルギニン合成のためのアルギノサクシネートリアーゼ、窒素同化（ナイトレートを用いる能力）のためのナイトレートレダクターゼ、チアミン生合成のためのｔｈｉ１０及びニコチンアミド生合成のためのｎｉｃのような代謝酵素をコードする遺伝子において変異を有する宿主で使用できる選択可能マーカーである。
合成的染色体コンストラクトまたは合成的染色体に含めてよいネガティブ選択マーカーとしては、チミジンキナーゼ（Ｌｕｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：３３７４−３３７８）、ＤＡＯＯ（Ｅｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ ２２：４５５−４５８）、ＵＲＡ及びｓａｃＢ（Ｑｕｅｎｅｅ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８：６３−６７）が挙げられるが、これらに限らない。
微細藻類種及び不等毛類種の形質転換システム用に、様々な既知のプロモーター配列を有益に配置することができる。例えば、微細藻類において導入遺伝子の発現を駆動する目的で一般的に用いられているプロモーターとしては、渦鞭毛藻類及び緑藻植物の両方で用いられてきている様々な型のカリフラワーモザイクウイルスプロモーター３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）（Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１８： ７７８−７８０，１９９９、Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３１７−３２１，１９９１、Ｌｏ ｈｕｉｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １３：４２７−４３５，１９９８）が挙げられる。シミアンウイルス由来のＳＶ４０プロモーターも、いくつかの藻類において活性を持つことが報告されている（Ｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．，１５１ ３４５−３４９，２００３、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ ３９８−３９９，４６９−４７２，１９９９）。ＲＢＣＳ２（リブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼ、小サブユニット）のプロモーター（Ｆｕｈｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，１９：３５３−３６１，１９９９）及びクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属由来のＰｓａＤ（光化学系Ｉ複合体の豊富なタンパク質、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｏｃｈａｉｘ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８１：５５５５−５５６０，２００１）も有用であり得る。ＨＳＰ７０Ａ／ＲＢＣＳ２及びＨＳＰ７０Ａ／β２ＴＵＢ（チューブリン）の融合プロモーター（Ｓｃｈｒｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２１：１２１−１３１，２０００）も、導入遺伝子の発現の向上に有用であり得、このＨＳＰ７０ Ａプロモーターは、他のプロモーターの上流に配置すると、転写活性化因子として機能できる。目的の遺伝子の高レベル発現は、不等毛類、例えば珪藻種において、珪藻フコキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｆｃｐ遺伝子（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１：２３９−２５１，１９９９、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３７９−３８６，２０００）またはユースティグマトファイトビオラキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｖｃｐ遺伝子（米国特許第８，３１８，４８２号を参照されたい）のプロモーターの制御下において実現することもできる。所望される場合、誘導性プロモーターは、トランスジェニック微細藻類において、遺伝子を迅速かつ厳密に制御した形で発現させることができる。例えば、ナイトレートレダクターゼをコードするＮＲ遺伝子のプロモーター領域をそのような誘導性プロモーターとして用いることができる。ＮＲプロモーター活性は典型的には、アンモニウムによって抑制され、アンモニウムがナイトレートによって置換されると誘導される（Ｐｏｕｌｓｅｎ ａｎｄ Ｋｒｏｇｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２７２：３４１３−３４２３，２００５）ので、アンモニウム／ナイトレートの存在下で微細藻類細胞を増殖させると、遺伝子発現のオン／オフを切り替えることができる。ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属由来の他の調節可能なプロモーターとしては、米国特許出願公開第２０１３／００２３０３５号（参照により、本明細書に援用される）に開示されているものが挙げられる。本明細書に示されているコンストラクト及び形質転換システムで使用できる更なるナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）藻類プロモーターとしては、米国特許第８，７０９，７６６号、米国特許出願公開第２０１３／０３２３７８０号、２０１２年１２月４日に提出された米国特許出願第１３／６９３，５８５号及び２０１３年６月１１日に提出された米国特許出願第１３／９１５，５２２号に開示されているものが挙げられ、これらはいずれも、参照により、本明細書に援用される。
実施例１．Ｃａｓ９発現型ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）株の構築
ｐＣＣ１ＢＡＣ骨格に基づくベクターを用いて、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ） Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を発現させるように、コンストラクトを操作した。このベクターは、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化した配列を有する操作されたＣａｓ９遺伝子（配列番号１）であって、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号２）をコードする、遺伝子を含んでいた。ＳＶ４０由来の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ペプチド（配列番号３）をコードする配列であって、同様にナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化した配列（配列番号４）を、Ｃａｓ９コード配列の５’末端に連結し、ＦＬＡＧタグペプチド（配列番号６）をコードする配列（配列番号５）をＣａｓ９コード配列の３’にクローニングした。操作されたＮＬＳ−Ｃａｓ９−Ｃ末端ＦＬＡＧタンパク質（配列番号８）をコードする操作されたＣａｓ９遺伝子の全体（配列番号７）をＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ７プロモーター（配列番号９）の３’と、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ６４８７ターミネーター（配列番号４２）の５’にクローニングした。このコンストラクトは、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されているアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ブラストサイジンＳデアミナーゼ（「ｂｌａｓｔ」）遺伝子（配列番号１０）であって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）によって駆動される遺伝子を含む選択可能マーカー発現カセットも含んでいた。ＥＩＦ３ターミネーター（配列番号１２）をｂｌａｓｔ遺伝子の３’末端に配置した。加えて、このベクターは、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）アシル−ｃｏＡオキシダーゼ遺伝子（配列番号１４）を標的とする２０ｂｐ配列を含むように設計されたキメラガイドＲＮＡ（配列番号１３）の発現を駆動するように設計された発現カセットであって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）推定Ｕ６プロモーター（配列番号１５）及びＵ６ターミネーター（配列番号１６）によって駆動される発現カセットを含んでいた。このコンストラクト（ｐＳＧＥ−６１３３という）の図は、図１に示されている。
Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を標的とするために、ＳｗａＩ制限酵素でｐＳＧＥ−６１３３コンストラクトを線状化し、当該技術分野において既知の方法（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０１８３８３８号（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい）に基本的に従って、エレクトロポレーションによってナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属細胞に形質転換した。ブラストサイジン耐性コロニーを得て、コロニーに対してコロニーＰＣＲを行い、Ｃａｓ９遺伝子の存在についてスクリーニングした。ＰＣＲによるコロニースクリーニングのために、スクリーニング対象のコロニーから得た少量の細胞を、５％のＣｈｅｌｅｘ１００ Ｒｅｓｉｎ（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）／ＴＥ溶液１００μｌに懸濁させ、その懸濁液を１０分間、９９℃で煮沸した後、その試験管を軽く回転させた。その溶解液上清を１マイクロリットル、ＰＣＲ反応混合物に加え、そのＰＣＲ混合物と反応物を設置し、メーカーから得たＱＩＡＧＥＮ Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン）（ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍで入手可能なＨａｎｄｂｏｏｋ）に従って、操作されたＣａｓ９コンストラクトの配列に由来するプライマーを用いて行った。
続いて、Ｃａｓ９遺伝子を含んでいることが分かった１２個の形質転換株をウエスタンブロットによってスクリーニングして、その細胞におけるＣａｓ９タンパク質のレベルを割り出した。選択した株の液体培養物から試料を取り出し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを用いて細胞を計数した。その細胞数に基づき、２×１０８個の細胞のアリコートを各試料培養物から取り出し、微量遠心機において最高速度で遠心分離した。その上清を破棄し、１００ｍＭのＤＴＴを含む２×ＬＤＳバッファーに、ペレット化された細胞を再懸濁させた。その試料を１０分間（９９℃で）煮沸した。その溶解液（１０μｌ）をトリス−アセテート／ＳＤＳランニングバッファーとともに３〜８％トリス−アセテートゲルにかけ、タンパク質を分離した後、ｉＢｌｏｔウエスタントランスファー装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）をメーカーの説明書に従って用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。ＦＬＡＧタグの付いたＣａｓ９タンパク質の検出のために、まず、ＴＢＳＴ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１５％のＴｗｅｅｎ２０）中の５％のミルクのブロッキング溶液で膜をブロックしてから、抗ＦＬＡＧアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体（ブロッキング溶液で１〜４０００倍に希釈した）とともに一晩インキュベートした。その膜をＴＢＳＴで３回洗浄してから、その膜を色原体ＢＣＩＰ／ＮＢＴで発色させ、乾燥して、その抗体結合タンパク質を可視化した。
Ｃａｓ９タンパク質が最高レベルであることが分かった株は、ＧＥ−６５７１であった。この株は、Ｃａｓ９タンパク質の発現レベルが最も高かったうえに、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子（配列番号４８）を標的とするキメラガイドＲＮＡ（配列番号１３）を発現するように操作したので、残りのウエスタン陽性菌株とともに、上記のように、ＧＥ−６５７１株をコロニーＰＣＲによって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子内の変異に関して解析した。ＰＣＲのために、用いたプライマーは、ＡＣＯ２−ｕｐｓｔｒｅａｍＦ（配列番号１７）とＡＣＯ２−ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＲ（配列番号１８）であり、これらは、併せて、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の標的部分を含む８５２ｂｐのＰＣＲフラグメント（配列番号１９）を産生した。同じプライマーを用いて、ＰＣＲフラグメントをサンガーシーケンシングにかけ、いずれかの変異の存在を割り出した。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の標的部位では、変異が検出されなかった。その後のノーザンブロットとＲＴ−ＰＣＲ実験では、いずれのガイドＲＮＡ転写産物も検出されなかった。
実施例２．インビトロで合成したガイドＲＮＡと選択可能ドナーＤＮＡの共形質転換によって、標的とするＣＨＯＲＤ−３２６６変異体を生成するための、ＧＥ−６５７１株の使用
続いて、インビトロで合成したキメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号２０）であって、ＣＨＯＲＤ（システイン及びヒスチジンリッチ）ドメインを有するＣＨＯＲＤ−３２６６ポリペプチドをコードするナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属遺伝子内の配列（配列番号２１）を標的とするキメラガイドＲＮＡと、１）Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２３）の制御下にあるハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）遺伝子（配列番号２２）と、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されており、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ２４プロモーター（配列番号２５）の制御下にあるＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）（配列番号２４）とのみを含み、この両方の遺伝子が、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端し、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ゲノムにおいてＮＡＤＨ依存性フマレートリダクターゼ遺伝子とＤ−チロシル−ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）デアシラーゼ遺伝子との間に見られるフラグメント、２）上記のフラグメントのエレメントの全てを含むが、このケースでは、それらのエレメントが、ＣＲＩＳＰＲ標的配列（配列番号３０）の上流及び下流の配列に相同である２ｋｂの「上流」アーム（配列番号２８）と「下流」アーム（配列番号２９）に隣接している、「Ｃｈｏｒｄ３−ＫＯベクター」という名称の環状形態のベクター（配列番号２７、図２）であって、ｐｕｃ１９ベクター骨格を含むベクター、または３）「Ｃｈｏｒｄ３−ＫＯベクター」からＰｍｅＩ消化によって放出させた直鎖状ＤＮＡ分子であって、ｐｕｃ１９骨格を除き、環状の相同ベクターの全てのエレメントを含む直鎖状ＤＮＡ分子という３つの形態の選択可能ＤＮＡのうちの１つとを共形質転換することによって、ＧＥ−６５７１ Ｃａｓ９発現菌株が標的遺伝子に変異を起こす能力について試験した。対照として、ｇＲＮＡなしで、同じＤＮＡシリーズをＧＥ−６５７１に形質転換した。
ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子のコード領域を標的とするように設計したキメラガイドＲＮＡは、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）配列を含む１０３個の全キメラガイドＲＮＡ配列（配列番号３２）内に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）の上流のＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子におけるＣＲＩＳＰＲ標的（配列番号３０）に対する相同性を有する２０ヌクレオチドの配列（配列番号３１）を含んでいた。全キメラガイド配列は、まず、相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号３３及び配列番号３４）で構成されているＤＮＡ鋳型であって、ガイドＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列がＴ７プロモーター配列（配列番号３５）の下流に含まれるＤＮＡ鋳型を作製することによって合成した。これらのオリゴをアニールして、二本鎖のＤＮＡ鋳型を作製し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＭ１３５４Ｍ、カリフォルニア州カールズバッド）をメーカーのプロトコールに従って用いて行ったインビトロ転写反応の鋳型として用いた。Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ−Ｅカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州アーバイン、カタログ番号Ｃ１０２４−２５）をメーカーのプロトコールに従って用いて、得られたＲＮＡを精製した。
ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子を標的とする精製キメラガイドＲＮＡを５μｇと、この実施例において既に述べた選択可能ドナーＤＮＡ（１、２または３）の形態のうちの１つを１μｇ用いて、ＧＥ−６５７１ Ｃａｓ９発現株をエレクトロポレーションによって形質転換した。エレクトロポレーション後、ハイグロマイシンを含む寒天培地に細胞を播種して、ハイグロマイシンカセットが組み込まれた形質転換体を選択した。形質転換体は、ＣＨＯＲＤ−ＣＲＩＳＰＲ標的（配列番号３６及び配列番号３７）にわたって増幅するように設計したプライマーを用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、ＤＮＡが挿入されておらず、ＮＨＥＪによる修復ミスがなかったか、わずかしかなかった場合には、１００ｂｐのバンドが現れ、ＮＨＥＪまたは相同組み換えによって、選択可能マーカーとレポーターカセットが挿入された場合には、４ｋｂのバンドが１本現れた（図３）。ＮＨＥＪによる修復ミスによる小規模な挿入または欠失は、１００ｂｐの産物において小さいシフトとして見られる可能性が高くなり、３％アガロースゲル電気泳動を用いれば、検出可能だったはずである。しかしながら、ＮＨＥＪによる修復ミスによる、小規模かつ検出のしにくいいずれかの挿入または欠失を排除するために、最初に１００ｂｐのバンドが１本現れた株に対して、プライミング部位がＣＲＩＳＰＲ標的部位から更に遠くに位置する別のプライマーセットを用いて、コロニーＰＣＲをもう１ラウンド行い、同じプライマーを用いて、ＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにかけた。異なる形質転換策（すなわち、この実施例において上述したような３つの異なる形態の選択可能ドナーＤＮＡを用いた）についてスクリーニングした５５５個のハイグロマイシン耐性コロニーのうち、変異体は５個しか見られず、変異率は約１％であった。更に、５個の変異体は全て、相同なアームを有する選択可能ＤＮＡの共形質転換によって得られ（すなわち、環状のドナーＤＮＡ形態及び直鎖状のドナーＤＮＡ形態の両方において、ＤＮＡの挿入は、遺伝子ホモロジーアーム内の二重組み換えによるものであった）、ＣＨＯＲＤ−３２６６相同アームが欠損しているフラグメントを用いたときには、変異体は得られなかった。ホモロジーアームを含まないこのフラグメントでは、ＮＨＥＪの「ノックイン」による挿入は観察されなかったうえに、明らかなＮＨＥＪによる修復ミスによっては、変異体は生じなかった。ｇＲＮＡが除外された対照の形質転換によって生成した形質転換体からは、変異体は得られなかった。
実施例３．完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株の作製
ゲノム改変を行う効率を向上させるために、改良型のＣａｓ９発現株を作製した。これを行うために、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属株を操作し、増殖培養物の細胞集団の基本的に１００％で、導入されたＣａｓ９遺伝子が発現した株を単離した。
完全浸透性のＣａｓ９株を生成する際の第１の工程は、Ｃａｓ９遺伝子を含むベクターに、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を導入することであった。ベクターのｐＳＧＥ−６２０６（配列番号３８）（図４）は、１）ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９遺伝子（配列番号１）を、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（配列番号５）と、核局在化シグナル（配列番号４）と、ペプチドリンカー（配列番号３９）とともに含み、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ２４プロモーター（配列番号２５）によって駆動され、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端するＣａｓ９発現カセットと、２）Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ｂｌａｓｔ遺伝子（「ＢＳＤ」、配列番号１０）を含み、Ｎ ｇａｄｉｔａｎａ ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）に駆動され、ＥＩＦ３ターミネーター（配列番号１２）が続いている選択可能マーカー発現カセットと、３）ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されているＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）（配列番号２４）を含み、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ４Ａ−ＩＩＩプロモーター（配列番号４０）によって駆動され、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター５（配列番号４１）（Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ゲノムにおいて、グルコサミン６−フォスフェートイソメラーゼ２遺伝子と、ＹＶＴＮリピート様キノプロテインアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子との間に見られる）が続いているＧＦＰレポーター発現カセットという３つのエレメントを含んでいた。
ＧＦＰでトラッキング可能な追加のＣａｓ９ベクター（ｐＳＧＥ−６２０２）であって、ｐＳＧＥ−６２０２においては、ｐＳＧＥ−６１３３ベクター（実施例１）でも使用したＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ７プロモーター（配列番号９）とＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ６４８７ターミネーター（配列番号４２）によってＣａｓ９遺伝子が駆動される以外は、ｐＳＧＥ−６２０６と同様のベクターを作製した。
１００ｍｇ／Ｌのブラストサイジンを含むＰＭ７４寒天培地に、ｐＳＧＥ−６２０６またはｐＳＧＥ−６２０２のいずれかで形質転換した株を播種した。解析と保存のために、コロニーを選択培地にパッチした。そのパッチから少量のバイオマスを採取し、１×Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ液（Ａｑｕａｔｉｃ Ｅｃｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ、フロリダ州アポップカ）３００μｌに完全に再懸濁させた。バイオマスを加えすぎないように注意して、薄緑色の再懸濁液が得られるようにした。４８８ｎｍのレーザーと５３０／１０ｎｍのフィルターを用いたＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーによって、この液体を直接解析して、細胞１個当たりのＧＦＰ蛍光を測定した。遅いフルイディクス設定を用いて、試料ごとに、１０，０００〜３０，０００イベントを記録した。得られたヒストグラムを、別に実施した野生型細胞（すなわち、蛍光タンパク質を発現しない細胞）のヒストグラムと重ねた。培養物における完全浸透度で発現した株のみを引き継ぎ、これは、フローサイトメトリーのＧＦＰ蛍光ヒストグラムにおいて、単一のピークまたは釣鐘形状の曲線が現れ、ログスケールでプロットしたところ、その蛍光ピークが、野生型自己蛍光（バックグラウンド蛍光）ピークよりも完全に高くシフトしたことを意味する（図５Ａ及びＢ）。これらの株は、その株の培養物の細胞全体にわたってＧＦＰ遺伝子の発現が見られたという点で、「完全浸透性の」Ｃａｓ９発現株として定めた。すなわち、いずれかの所定の時点において、ＧＦＰの量（すなわち、蛍光）が、細胞間で多少異なり、その結果、複数のピークまたは釣鐘形状の曲線が現れ得たが、シフトしたそのピークに対して別個のＧＦＰ発現分布を示した細胞亜集団は存在しなかった。したがって、完全浸透性株は、単一のピーク（またはピークが１つの釣鐘形状の曲線）が現れ、そのピークが、非発現細胞（例えば、ＧＦＰ発現コンストラクトで形質転換しなかった細胞）のバックグラウンドピークとは別で、非発現細胞よりも高い蛍光値であった株であった。ＧＦＰ遺伝子は、導入されたコンストラクトにおいて、Ｃａｓ９遺伝子と物理的に関連付けられていたので、完全浸透性のＧＦＰ株においては、Ｃａｓ９遺伝子も、その株の培養物の細胞全体にわたって発現する可能性が高いものと想定した。
続いて、非形質転換細胞に対して明らかにシフトした１つの蛍光ピークが現れた、完全ＧＦＰ浸透性のＣａｓ９株（図５Ａ及び表１（ピークが１つか２つかに従って、「Ｘ」によってクローンがスコアリングされている）を参照されたい）を、Ｃａｓ９発現の証明のために、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロットによって試験した。非形質転換細胞の自己蛍光ピークとは別の単一のピークが現れた菌株（クローンｐ１−２７）の例が図５Ａに示されており、また、２つのピークが現れたとともに、その１つが対照（非ＧＦＰコンストラクト）のピークと一致していたクローンｐ２−０２（図５Ｂ）と比較されている。各ベクター（ｐＳＧＥ−６２０６及びｐＳＧＥ−６２０２）で形質転換して得られた株であって、ＧＦＰ蛍光レベルを記録するフローサイトメトリーによって、単一のピークのみが現れ、その単一のピークが、非ＧＦＰ対照よりも高い蛍光レベルにシフトしていたとともに、ウエスタンによってＣａｓ９タンパク質の発現も示された（図６）１つの株を、ゲノム編集試験のために引き継いだ。ｐＳＧＥ−６２０２による形質転換から得られた完全浸透性のＣａｓ９株として、ＧＥ−６５９４株を選択し、ｐＳＧＥ−６２０６による形質転換から得られた完全浸透性のＣａｓ９株として、ＧＥ−６７９１株を選択した。
（表１）フローサイトメトリーによって、２つまたは１つの蛍光ピークの出現について、Ｃａｓ９発現ベクターｐＳＧＥ−６２０２で形質転換したナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属株をスコアリングした結果
Figure 2018500037
実施例４．完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株を用いたＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子の高頻度ノックアウト
完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１を、ゲノム編集能について試験するために、同じインビトロ合成キメラｇＲＮＡを用いて、実施例２で説明したものと同様のゲノム編集アプローチを取った。しかしながら、新たな完全浸透性株を用いたこの例では、共形質転換で用いた選択可能ドナーＤＮＡには、ＧＦＰ遺伝子と、関連するプロモーター及びターミネーターは含まれていなかった。これらの株は、ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子（ＣＨＯＲＤ（システイン及びヒスチジンリッチ）ドメインを有するタンパク質産物をコードする）を標的とするｇＲＮＡと、１）Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２３）の制御下にあり、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端するハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）遺伝子（配列番号２２）のみを含む（機能的に連結したＨｙｇＲ遺伝子と、プロモーターと、ターミネーターは、本明細書では、ＨｙｇＲカセットという）とともに、ＩＤ配列に隣接したＨｙｇＲカセットフラグメント（配列番号４６）をもたらすように、上記の遺伝子の５’末端にある２７塩基対の識別配列（配列番号４３）と３’末端にある２７塩基対の識別配列（配列番号４４）に隣接したＨｙｇＲフラグメント、または２）上記のフラグメントの全てのエレメントを含むが、それらのエレメントが、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ標的
（配列番号３０）の上流及び下流の配列に対して相同である２ｋｂの「上流」アーム（配列番号２８）と「下流」アーム（配列番号２９）に隣接している環状形態のベクターｐＳＧＥ−６２８１（配列番号４７）（図７）であって、ｐｕｃ１９ベクター骨格も含むベクターという選択可能ＤＮＡ分子のうちの１つで形質転換した。対照群として、ｇＲＮＡなしで、同じＤＮＡシリーズを形質転換した。
ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子を標的とする精製キメラガイドＲＮＡを５μｇと、上記の選択可能ＤＮＡの形態のうちの１つを１μｇ用いて、エレクトロポレーションによって、完全浸透性のＣａｓ９発現株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１を形質転換した。エレクトロポレーション後、ハイグロマイシンを含む寒天培地に細胞を播種して、ハイグロマイシンカセットが組み込まれた形質転換体を選択した。実施例２で説明したように、コロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングした。結果は表２に示されている。
（表２）完全浸透性のＣａｓ９エディター株における選択による、遺伝子座ＣＨＯＲＤ−３２６６を標的とするインビボゲノム編集の割合
Figure 2018500037
これらの新しいＣａｓ９親株における変異頻度は、元の親株ＧＥ−６５７１よりも大幅に向上した。更に、相同組み換えベクターｐＳＧＥ−６２８１をドナーＤＮＡとして用いたところ、完全浸透性のＣａｓ９株ＧＥ−６７９１では、解析した９個のハイグロマイシン耐性形質転換体から、ドナーＤＮＡが標的遺伝子座に組み込まれたクローンが８個得られ、完全浸透性のＣａｓ９株ＧＥ−６５９４では、解析した５個のハイグロマイシン耐性形質転換体から、ＤＮＡが標的遺伝子座に組み込まれた変異体が５個得られた。ＨｙｇＲカセットフラグメント（配列番号４６、標的遺伝子座に対して相同性を有するフランキング配列が欠損している）を用いたところ、ＧＥ−６７９１では、解析した６１個から、ドナーフラグメントによって破壊された標的遺伝子座を有するクローンが１９個得られ、ＧＥ−６５９４では、解析した１７個のハイグロマイシン耐性形質転換体から、標的遺伝子座への組み込みによる変異体が６個得られた。ｇＲＮＡを除外した対照の形質転換によって生成された形質転換体からは、変異体は得られなかった。野生型のサイズのＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにかけて、ＮＨＥＪによる修復ミスによる、小規模かつ検出のしにくいいずれかの挿入または欠失を探したが、観察されなかった。
この例では、完全浸透性のＣａｓ９株を用いて、標的遺伝子座に対する相同性が欠損しているＨｙｇＲカセットのみによる共形質転換によって変異体が得られたので、標的遺伝子変異は、相同組み換え（ＨＲ）ベクターの使用に依存していなかった。これは、目的の遺伝子に隣接するドナーフラグメントにホモロジーアームが存在するときのみに、ドナーフラグメントの組み込みが行われる元の親株ＧＥ−６５７１（実施例２）では観察されなかった。それにもかかわらず、相同組み換えによっては生成されないこの新しい型の変異体では、コロニーＰＣＲによって、標的遺伝子座における挿入を示す大きなバンドが現れることが分かったとともに、そのＰＣＲ産物のサンガーシーケンシングによって、これらの変異体の全てで、標的遺伝子座にＨｙｇＲカセットが挿入されたことが確認された。ドナーフラグメントの組み込みは、いずれかの配向で行われたことが分かっており、ＮＨＥＪによる修復の最中に（すなわち、ＮＨＥＪ「ノックイン」によって）挿入されたと推定される。これらのＮＨＥＪによる組み込みイベントは、ＰＣＲ産物のシーケンシングによって配列を確認した。
この新しいＣａｓ９発現株の変異頻度が、元株よりも向上していることは、これらの新株をプレスクリーニングしたところ、基本的に、形質転換前において、ＧＦＰに関して、表現型的に１００％浸透性であったと判断されたことによって最も的確に説明される。元株ＧＥ−６５７１は、ＧＦＰカセットを有さず、このコンストラクトで形質転換した完全浸透性の株は単離しなかった。ウエスタンブロットによると、ほぼ間違いなくＧＥ−６５７１の方が、Ｃａｓ９発現量が高かったが（図８）、浸透性が部分的に過ぎなかった可能性が高い（すなわち、集団における発現レベルが一貫していなかったと考えられる）。図８には、完全浸透性のＣａｓ９発現株を単離する大まかなスキーマであって、Ｃａｓ９遺伝子に加えて、選択可能マーカーとレポーター遺伝子（好ましくは蛍光タンパク質をコードする）を含むコンストラクトで株を形質転換することと、選択培地上の形質転換体を単離することと、フローサイトメトリーによって浸透度スクリーニングを行って、蛍光タンパク質の浸透度が１００％である株を同定することと、例えばウエスタンブロットによって、Ｃａｓ９の発現を確認することとを含むスキーマが示されている。興味深いことに、図８のウエスタンブロットでは、浸透度についてスクリーニングしなかったとともに、Ｃａｓ９変異頻度が非常に低かったＧＥ−６５７１（実施例２）のＣａｓ９タンパク質レベルが、完全浸透性の２つのエディター株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１（Ｃａｓ９変異率が大幅に高い（実施例４））よりも高かったことが示されており、Ｃａｓ９タンパク質レベルを評価するよりも、浸透度の方がはるかに信頼できるスクリーニングであることが分かった。
実施例５．完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株を用いた、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の高頻度ノックアウト
浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１のゲノム編集能について更に試験するために、実施例４と同様の編集アプローチを取り、このアプローチでは、ＣＨＯＲＤ−３２６６遺伝子を良好かつ効率的に標的とした。Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子（配列番号４８）を標的とするために、ａｃｏ２標的配列を標的とするようにキメラガイドＲＮＡを設計し、このキメラガイドＲＮＡは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子内に見られるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列のすぐ上流にあるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子配列（配列番号４９、２０ヌクレオチドの標的配列＋ＰＡＭ）に対する相同性を有する２０ヌクレオチドの配列を含み、この２０ヌクレオチドの標的化配列は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）配列を含む１０３塩基のキメラガイドＲＮＡ配列（配列番号５０）内に存在していた。キメラガイド配列全体は、まず、相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号５１及び配列番号５２）で構成されるＤＮＡ鋳型を作製することによって合成し、その際、ガイドＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列は、Ｔ７プロモーター（配列番号３５）の下流に含まれていた。これらのオリゴをアニールして二本鎖のＤＮＡ鋳型を作製し、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号ＡＭ１３５４Ｍ）をメーカーのプロトコールに従って用いて行うインビトロ転写反応の鋳型として用いた。Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ−Ｅカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ番号Ｃ１０２４−２５）をメーカーのプロトコールに従って用いて、得られたＲＮＡを精製した。
ａｃｏ２を標的とするｇＲＮＡと、１）Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２３）の制御下にあり、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端するハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）遺伝子（配列番号２２）（機能的に連結したＨｙｇＲ遺伝子と、プロモーターと、ターミネーターは、本明細書では、ＨｙｇＲカセットという）のみを含むＨｙｇＲカセット、または２）ｐｕｃ１９骨格に基づく環状形態のベクターｐＳＧＥ−６２８２（配列番号５３）（図９）であって、１）に記載されているフラグメントの全てのエレメントを含むが、それらのエレメントが、ａｃｏ２標的（配列番号４９）の上流及び下流の配列に相同である１．７ｋｂの「上流」アーム（配列番号５４）と０．８ｋｂの「下流」アーム（配列番号５５）に隣接したベクターという選択可能ＤＮＡ分子のうちの１つとで、株を形質転換した。ホモロジーアームは、ａｃｏ２標的部位の周囲の１１３ｂｐのＤＮＡを除外する。対照として、ｇＲＮＡなしで、同じドナーＤＮＡ（１）及び２））をＣａｓ９エディター株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１に形質転換した。
ａｃｏ２標的部位を標的とする精製キメラガイドＲＮＡを５μｇと、上記の選択可能ドナーＤＮＡの形態のうちの１つを１μｇ用いて、エレクトロポレーションによって、Ｃａｓ９発現菌株ＧＥ−６５９４及びＧＥ−６７９１を形質転換した。エレクトロポレーション後、ハイグロマイシンを含む寒天培地に細胞を播種して、ハイグロマイシンカセットが組み込まれた形質転換体に関して選択した。形質転換体は、上記のようなコロニーＰＣＲ（実施例２を参照されたい）によって、ただし、ａｃｏ２標的に隣接するプライマー（配列番号１７及び配列番号１８）を用いてスクリーニングした。結果は表３に示されている。
（表３）アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子座を標的とする完全浸透性のＣａｓ９エディター株におけるインビボゲノム編集の割合
Figure 2018500037
これらの新しいＣａｓ９エディター株における変異頻度は、元の親株ＧＥ−６５７１の変異頻度よりも大幅に向上した。相同組み換えベクターｐＳＧＥ−６２８２を用いたところ、ＧＥ−６７９１では、解析した６１個から、４３個の陽性クローンが得られ、ＧＥ−６５９４では、解析した６２個から、４６個の陽性変異体が得られた。ＨｙｇＲカセットのみを用いたところ（ホモロジーアームなし）、ＧＥ−６７９１では、解析した１６０個から、９０個の陽性クローンが得られ、ＧＥ−６５９４では、解析した９６個から、４４個の陽性変異体が得られた。ｇＲＮＡを除外した対照の形質転換によって生成された形質転換体からは、変異体は得られなかった。野生型サイズのＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングにかけて、ＮＨＥＪによる修復ミスによる、小規模かつ検出のしにくいいずれかの挿入または欠失を探したが、観察されなかった。
この例では、実施例４におけるように、ＨｙｇＲカセットフラグメントのみの共形質転換によって、変異体が得られたとともに、耐性カセットに隣接する標的遺伝子座に相同である配列を有するＨＲベクターの使用に依存しなかった。これは、元の親株ＧＥ−６５７１では観察されなかった（実施例２を参照されたい）。更に、これにより、これらの新株をプレスクリーニングしたところ、形質転換前に、ＧＦＰに関して表現型について完全浸透性であることが分かったことによって、新しいＣａｓ９エディター株が元株よりも変異頻度が向上したことが説明できる可能性が高いことが示されている。
実施例６．完全浸透性のＣａｓ９発現パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株の作製
パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属においてストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ） Ｃａｓ９遺伝子を発現させるように、ベクターｐＳＧＥ−６７０９（図１０）を操作した。このベクターは、１）パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属用にコドン最適化されているとともに、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属由来のイントロンを含む操作されたＣａｓ９遺伝子を含むとともに、Ｎ末端ＦＬＡＧタグと、核局在化シグナルと、ペプチドリンカーとも含むＣａｓ９発現カセット（配列番号５６）であって、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ１７プロモーター（配列番号５７）に機能的に連結しており、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ１７ターミネーター（配列番号５８）によって終端する発現カセットと、２）パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属用にコドン最適化したアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ブラストサイジン耐性遺伝子であって、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属イントロンを含む遺伝子（配列番号５９）を含む選択可能マーカー発現カセットであって、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ４プロモーター（配列番号６０）に機能的に連結しており、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ４ターミネーター（配列番号６１）によって終端する発現カセットと、３）ＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）（配列番号２４）を含むＧＦＰレポーター発現カセットであって、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＡＣＰ１プロモーター（配列番号６２）によって駆動され、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＡＣＰ１ターミネーター（配列番号６３）によって終端する発現カセットという３つのエレメントを含んでいた。
このベクターを遺伝子銃によってパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）に形質転換した。パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属野生株ＷＴ−１１８５の形質転換は、基本的に米国特許出願公開第２０１４／０１５４８０６号（参照により、本明細書に援用される）に記載されているように、ＢｉｏＲａｄ Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。形質転換用のＤＮＡを金粒子上に析出し、その金粒子をチューブの丈の内側に付着させ、遺伝子銃内に配置したチューブに、高圧のヘリウムガスを噴射して、固体の非選択培地（ＰＭ０７４藻増殖培地を含む２％寒天平板）に接着したパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属株ＷＴ−１１８５細胞に、ＤＮＡ被覆金粒子を打ち込んだ。Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎを用いて、細胞環当たり２発を６００ｐｓｉで、平板から３〜６ｃｍの距離から撃った。翌日、形質転換コロニーの増殖のために、細胞を選択培地に移した。
実施例３で説明したように、フローサイトメトリーによって、完全なＧＦＰ浸透度と、野生型蛍光ピークよりも高い値にシフトした１つの蛍光ピークが現れた形質転換菌株の同定について、コロニーをスクリーニングした。非形質転換細胞に対して明らかにシフトした蛍光ピークを示した完全浸透性のＣａｓ９株のＣａｓ９発現について、Ｃａｓ９発現の証明のために、抗Ｃａｓ９ウエスタンブロッティングによって試験した（図１１）。これらのスクリーニングに基づき、単離体６７０９−２を引き継ぎ、識別株ＧＥ−１５６９９を得た。
実施例７．完全浸透性のパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 Ｃａｓ９エディター株を用いた、ＳＲＰ５４のノックアウト
新株ＧＥ−１５６９９のゲノム編集能を試験するために、実施例２及び４に説明されているものと類似の編集アプローチを取った。パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属における葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子（配列番号６５）を標的とするように、キメラｇＲＮＡ（配列番号６４）を設計して、インビトロで合成した。ＧＥ−１５６９９をエレクトロポレーションによって、精製キメラガイドＲＮＡ、１〜２μｇと、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属用にコドン最適化されているとともに、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属由来のイントロンを含むブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子（配列番号６６）を含む選択可能マーカーＤＮＡ、１μｇとで形質転換した。ＢｌｅＲ遺伝子は、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ４プロモーター（配列番号６０）に機能的に連結したとともに、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＲＰＳ４ターミネーター（配列番号６１）によって終端した。
形質転換の２日前に、形質転換を用いて１Ｌの培養物を１×１０６細胞／ｍＬに播種する６日前に、１×１０６細胞／ｍＬに播種した種培養物を１００ｍＬ播種することによって、エレクトロポレーションを行った。形質転換の日に、５０００×ｇで２０分、遠心分離することによって細胞をペレット化し、０．１ｕｍのろ過済み３８５ｍＭソルビトールで３回洗浄し、再懸濁させて、３８５ｍＭソルビトール中、５×１０９細胞／ｍＬにした。ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ（商標）内の０．２ｃｍのキュベットで、様々な条件下で、１００μＬの濃縮細胞のエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの最適化に用いたＤＮＡは、ｂｌｅ及びＴｕｒｂｏＧＦＰ発現カセットを含む線状化ｐＳＧ６６４０であった。ＴｕｒｂｏＧＦＰカセットは、ＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（配列番号２４）に機能的に連結したパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＡＣＰプロモーター（配列番号６２）と、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 ＡＣＰターミネーター（配列番号６３）を含んでいた。予冷した細胞とキュベットのエレクトロポレーションを行った直後に、１ｍＬの冷ソルビトールを加えて、細胞を１０ｍＬのＰＭ０７４に移すのに用いた。一晩回収後、細胞を濃縮し、２５０ｍｇ／Ｌでゼオシンを含む直径１３ｃｍのＰＭ０７４培地上に拡散し、遺伝子銃の項で列挙されている条件下で増殖させた。
様々な電圧、抵抗及び静電容量を試験した後、最適なエレクトロポレーション条件は、１．０〜１．２ｋＶ（５０００〜６０００Ｖ／ｃｍ）、２００〜３００オーム及び２５〜５０μＦであることが分かった。大量のＤＮＡの使用により、得られるゼオシン耐性コロニーの数が増えたが、４μｇを超える量では、効果は横ばいであった。
エレクトロポレーション後、２５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含む寒天培地（ＰＭ１３０）に細胞を播種して、ｂｌｅＲカセットが組み込まれた形質転換体について選択した。天然の標的遺伝子座にわたって増幅するように設計したプライマー（ｏｌｉｇｏ−ＡＥ５９６（配列番号６７）及びｏｌｉｇｏ−ＡＥ５９７（配列番号６８））を用いたコロニーＰＣＲによって、形質転換体をスクリーニングした。これらのプライマーは、遺伝子座への組み込み（例えば、ＢｌｅＲカセットのノックイン）の非存在下では、７００ｂｐのバンドが現れるように、または、１つのＢｌｅＲカセットが標的遺伝子座に組み込まれる場合には、４．３ｋｂのバンドが現れるように設計した。加えて、コロニーＰＣＲは、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子（ｏｌｉｇｏ−ＡＥ５９７、配列番号６８）から選択可能マーカー（ｏｌｉｇｏ−ＡＥ４０５（配列番号６９）及びｏｌｉｇｏ−ＡＥ４０６（配列番号７０））までに及ぶフラグメントを増幅するように設計したプライマーを用いて行った。組み込まれたｂｌｅカセットの配向に応じて、ｂｌｅＲカセット内でｃｐＳＲＰ５４遺伝子まで及ぶプライマー４０５／５９７または４０６／５９７によるいずれかの増幅から、１．２ｋｂのバンドが現れることになる。これらの結果から、ホモロジーアームの非存在下で、標的遺伝子座へのＢｌｅＲカセットのノックインが高頻度（この試料において４０〜４５％）に生じることが示されている（図１２）。ｃｐＳＲＰ５４のノックアウトにより、薄緑色の表現型が現れるので、この画像では、これらのコロニーパッチが、ＰＣＲの結果と重ねられている。
実施例８．Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲを用いて、天然のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ａｃｃａｓｅ遺伝子の発現を向上させるためのプロモーター強化
Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） Ａｃｃａｓｅ遺伝子のプロモーター領域を標的として、そのプロモーターの機能を高めた。実施例４に記載されているようなハイグロマイシン耐性カセットを含むが、５’及び３’識別配列が欠損しているコンストラクトを設計した（配列番号４５）。このＨｙｇＲカセットは、外方向に配向した強力プロモーターに隣接していた（図１３Ａ）。この外向きのデュアルプロモーターデザインは、そのドナーフラグメントをＡｃｃａｓｅ遺伝子の上流領域に標的化したときに、ＨｙｇＲカセットが組み込まれた配向にかかわらず、それらのプロモーターの１つが、Ａｃｃａｓｅ遺伝子の発現を促進するように配置されるようにした（図１３Ｂ）。このコンストラクトは、組み込み領域に対するホモロジーアームが欠損していたので、意図する挿入形態は、ＮＨＥＪによるものであった。ＨｙｇＲカセットの「上流」に位置する外向きのプロモーターは、ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）であった。ＨｙｇＲカセットの「下流」に位置する外向きのプロモーターは、ＲＰＬ２４プロモーター（配列番号２５）であり、これにより、デュアルプロモーターＨｙｇＲカセットというＤＮＡフラグメント（配列番号７１）が得られた。
４つのキメラガイドＲＮＡを、実施例２で説明したように合成し（それぞれ２０ヌクレオチド長（配列番号７２〜７５））、図１３Ｂに示されているように、プロモーターに隣接するハイグロマイシンカセット（配列番号７１）を様々な標的部位（Ａｃｃ１〜Ａｃｃ４）に組み込むことを対象とした。基本的に実施例４で説明したようにエレクトロポレーションを用いて、実施例３で説明したＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）エディター株ＧＥ−６７９１の形質転換を行い、その際、４つのガイドＲＮＡをそれぞれ、プロモーターに隣接するハイグロマイシンカセット（配列番号７１）と個別に共形質転換した。各形質転換において、ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、ＰＣＲによって解析して、Ａｃｃａｓｅ遺伝子の５’領域にＨｙｇＲカセットが組み込まれたか否かを同定した。破壊遺伝子座を確実に確認するために、ＰＣＲ産物をシーケンシングした。使用したプライマーは、Ａｃｃａｓｅ遺伝子の標的上流領域に隣接するＡｃｃａｓｅ−Ｆ（配列番号７６）とＡｃｃａｓｅ−Ｒ（配列番号７７）であった。
プロモーター領域の改変が確認された２つの形質転換体（ＡＣＣ−ＫＩ−１及びＡＣＣ−ＫＩ−２という）を更なる解析のために選択した。ＡＣＣ−ＫＩ−１では、挿入は、推定転写開始部位の１３ｂｐ上流のＡｃｃ１ガイドＲＮＡ部位を標的とし、ＡＣＣ−ＫＩ−２では、推定転写開始部位の２８ｂｐ上流のＡｃｃ２ガイドＲＮＡ部位を標的としていた。「プロモーター強化」コンストラクトの効果を割り出すために、２つの株ＡＣＣ−ＫＩ−１及びＡＣＣ−ＫＩ−２において、Ｒｏｅｓｓｌｅｒ Ｐ．（１９８８） Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２６７：５２１−５２８）に記載されているように、Ａｃｃａｓｅ酵素活性を正確に測定し、それらの酵素活性を野生型細胞の酵素活性と比較した。ＡＣＣ−ＫＩ−１及びＡＣＣ−ＫＩ−２の両方において、総タンパク質１ミリグラム当たりをベースとする総ＡＣＣａｓｅ酵素活性の増大が観察され（表４）、説明したような遺伝子プロモーターの改変により、遺伝子の発現が増大し、コードされたタンパク質のレベルが増大したことが示された。
（表４）
Figure 2018500037
実施例９．ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属におけるＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子座のノックアウト
ＣＲＩＳＰＲ技術を用いて、ＺｎＣｙｓ−２８４５脂質レギュレーター遺伝子もノックアウトした。挿入によるノックアウト用のキメラガイドＲＮＡとドナーＤＮＡで形質転換する宿主として、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ） Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする遺伝子を発現するナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株ＧＥ−６７９１を使用した。
ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子を破壊の標的とするために、ガイドＲＮＡを産生させるように、ＤＮＡコンストラクトを作製し（ＳＧＩ−ＤＮＡ、カリフォルニア州ラホヤ）、そのＤＮＡ分子は、Ｔ７プロモーター（配列番号３５）の下流に、操作されたキメラガイドの配列を含んでいた。そのキメラガイド配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）の上流にあるＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子配列内の配列に相同である１８ｂｐの標的配列（配列番号７８）を含んでいたとともに、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ（ｔｒａｃｒ）配列も含んでいた。このキメラガイド配列は、まず、相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号７９及び配列番号８０）で構成されるＤＮＡ鋳型を作製することによって合成し、それらのオリゴヌクレオチドをアニーリングして、Ｔ７プロモーター配列を含む二本鎖のＤＮＡ鋳型を作り、その鋳型を、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔ ｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号ＡＭ１３５４Ｍ）をメーカーの説明書に従って用いるインビトロ転写反応で用いて、ガイドＲＮＡを合成した。Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ−Ｅカラム（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ番号Ｃ１０２４−２５）をメーカーのプロトコールに従って用いて、得られたＲＮＡを精製した。
標的ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子座に挿入するドナーフラグメント（配列番号４６）は、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２３）の下流に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨｙｇＲ、配列番号２２）を含み、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）が続く選択可能マーカーカセットを含んでおり、このプロモーター−ハイグロマイシン耐性遺伝子−ターミネーター配列の全体を、５’末端の２７塩基対の識別配列（配列番号４３、５’ＩＤ）と３’末端の２７塩基対の識別配列（配列番号４４、３’ＩＤ）と隣接させ、「Ｈｙｇ耐性カセット」（配列番号４６、ＨｙｇＲカセット）というＤＮＡフラグメントを得た。
ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子座を標的どおりノックアウトするために、基本的にＵＳ２０１４／０２２０６３８に記載されているようにして、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子を標的とする精製キメラガイドＲＮＡを５μｇと、選択可能ドナーＤＮＡ（ＨｙｇＲカセット、配列番号４６）を１μｇ用いて、エレクトロポレーションによって、Ｃａｓ９エディター株ＧＥ−６７９１を形質転換した。エレクトロポレーション後、ハイグロマイシンを含むＰＭ１２４寒天培地に細胞を播種して、ハイグロマイシン耐性カセットが組み込まれた形質転換体について選択した。形質転換体を新鮮なプレートにパッチし、コロニーＰＣＲによって、ドナーフラグメントのＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子への挿入についてスクリーニングした。
コロニーＰＣＲスクリーニングは、実施例１で説明したように行った。ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の標的遺伝子座へのドナーフラグメントの挿入を検出するのに用いたプライマーは、配列番号８１及び配列番号８２であった。ＰＣＲベースのコロニースクリーニングに基づき、標的ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子に挿入されたドナーＤＮＡ（ＨｙｇＲカセット）を有するノックアウト株ＧＥ−８５６４及びＧＥ−８５６５（図１４Ａ）を産生性アッセイで試験した。
バッチ産生性アッセイでは、細胞が利用可能な唯一の窒素源として１５ｍＭのナイトレートを含む窒素の豊富な培地ＰＭ１２３（すなわち、この培養培地は、還元窒素源を有していなかった）において、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト株ＧＥ−８５６４及び野生型前駆株ＷＴ−３７３０を培養した。ＺｎＣｙｓ−２８４５変異体は、還元窒素の非存在下では増殖しないことが分かっているので、８．８ｍＭのナイトレートに加えて、５ｍＭのアンモニウムを含むＰＭ１２４培地で増殖させた種（スケールアップ）培養物から、産生培養物を開始ＯＤ７３０＝０．５で播種した。
播種後、バッチアッセイにおいて、トリプリケート培養で、唯一の窒素源として１５ｍＭのナイトレートを含む１７５ｍｌのＰＭ１２３培地の入った７５ｃｍ２の組織培養用角型フラスコで、７日間、ＺｎＣｙｓノックアウト株ＧＥ−８５６４と野生型株ＷＴ−３７３０を増殖させた。これらのフラスコは、その「幅」が最も狭い部分に対して、自然照明を模倣するように設計した曲線に沿った光強度で、１６時間の点灯と８時間の消灯というサイクルにプログラムしたＬＥＤ光源が当たるように配置し、その光源の光強度は、明期の中間に約１２００μＥでピークに達するものであった。毎日、培養物に脱イオン水を加え、蒸発損失分を補った。培養物の温度は、２５℃に設定したウォーターバスによって調節した。培養物を０日目に播種し、細胞密度、脂質の尺度としての脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）及び全有機体炭素（ＴＯＣ）を評価するために、試料（５ｍｌ）を３日目、５日目及び７日目に採取した。
ＦＡＭＥ解析は、ＧｅｎｅＶａｃ ＨＴ−４Ｘを用いて乾燥した２ｍＬの試料で行った。各乾燥ペレットに、メタノール中の５００ｍＭのＫＯＨを５００μＬと、０．０５％のブチル化ヒドロキシルトルエンを含むテトラヒドロフランを２００μＬと、２ｍｇ／ｍｌのＣ１１：０遊離脂肪酸／Ｃ１３：０トリグリセリド／Ｃ２３：０脂肪酸メチルエステル内部標準混合液を４０μＬと、ガラスビーズ（直径４２５〜６００μｍ）を５００μＬ加えた。このバイアルをオープントップのＰＴＦＥセプタム付きキャップで閉じ、１．６５ｋｒｐｍのＳＰＥＸ ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ内に７．５分置いた。続いて、試料を８０℃で５分加熱し、放冷した。誘導体化のために、メタノール中の１０％の三フッ化ホウ素を５００μＬ、試料に加えてから、８０℃で３０分加熱した。それらの試験管を放冷してから、ヘプタンを２ｍＬと、５ＭのＮａＣｌを５００μＬ加えた。それらの試料を５分、２０００ｒｐｍでボルテックスし、最後に、３分、１０００ｒｐｍで遠心分離した。Ｇｅｒｓｔｅｌ ＭＰＳ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用いて、ヘプタン層をサンプリングした。計量では、Ｃ２３：０ ＦＡＭＥ内部標準物質を８０μｇ用いた。
２ｍＬの細胞培養物をＤＩ水で総体積２０ｍＬまで希釈することによって、全有機体炭素（ＴＯＣ）を割り出した。全炭素（ＴＣ）と全無機炭素（ＴＩＣ）を割り出すために、１測定当たり、３回の注入をＳｈｉｍａｄｚｕ ＴＯＣ−Ｖｃｓｊ Ａｎａｌｙｚｅｒに行った。燃焼炉は、７２０℃に設定し、ＴＯＣは、ＴＣからＴＩＣを減じることによって割り出した。４点較正範囲は、非希釈培養物の２０〜２０００ｐｐｍに対応する２ｐｐｍ〜２００ｐｐｍであり、相関係数はｒ２＞０．９９９であった。
これらの解析の結果は、表５〜７に示されている。野生型及びノックアウトＧＥ−８５６４変異体について示されている値は、３つの培養物の平均と、標準偏差（ｓｄ）である。
（表５）ナイトレートのみの培養培地によるバッチアッセイにおいて、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト変異体と野生型培養物によって産生された脂質（ＦＡＭＥ）
Figure 2018500037
（表６）ナイトレートのみの培養培地によるバッチアッセイにおいて、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト変異体及び野生型培養物によって産生されたバイオマス（ＴＯＣ）
Figure 2018500037
（表７）ナイトレートのみの培養培地によるバッチアッセイにおけるＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト変異体と野生型株のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比
Figure 2018500037
ナイトレートのみの培地におけるＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト変異体培養物のＦＡＭＥ含有量は、培養３日目（アッセイ初日）に加え、５日目と７日目にも、野生型よりも高いレベルであったが（表５）、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト株の３日目〜７日目における１日当たりのＦＡＭＥの増加率は、野生型株よりも低かった。表６には、この期間にわたって、ナイトレートのみの培地で培養したＺｎＣｙｓ− ２８４５遺伝子破壊変異体では、野生型に比べて、その全有機体炭素の増加率がかなり低かったことが示されており、これにより、ＴＯＣの蓄積によって評価した場合に、安定した培養が示された。すなわち、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト株は、唯一の窒素源としてナイトレートを含む培地で培養すると、窒素飢餓状態にあるような挙動を見せた。表７によって、このことが確認されており、１週間の産生性アッセイにわたって、ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト株ＧＥ−８５６４のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比が、野生型のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比よりも有意に高かった（野生型のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比の約３倍）ことが示されている。
実施例１０．挿入によるＣａｓ９ ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウンコンストラク
ト
Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を用いて、追加の変異株を操作して、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の発現が低下するようにした。そのオープンリーディングフレームの最初のアミノ酸をコードするＡＴＧの上流、その遺伝子のイントロン内、その遺伝子の３’末端内であるが、コード配列内、またはその遺伝子の３’非翻訳領域内の配列を標的とするように、１２個のキメラガイドＲＮＡを設計した（図１４Ａ）。これらのコンストラクトは、その遺伝子の領域内の部位にドナーフラグメントを挿入するように設計されており、その挿入によって、天然の配列が破壊されて、標的遺伝子の発現レベルが野生型よりも低下することが見込まれるので、本明細書では、「Ｂａｓｈノックダウンコンストラクト」または簡潔に「Ｂａｓｈコンストラクト」という。（これに応じて、このような挿入部を含む株は、「Ｂａｓｈ株」、「Ｂａｓｈｅｒ」または「Ｂａｓｈノックダウン変異体」という。）ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子（標的部位配列）に対して相同性を有する１２個の１８ヌクレオチド配列は、表８に示されている。
（表８）ＺｎＣｙｓ−２８４５の発現を減弱させる標的配列及びキメラガイド配列
Figure 2018500037
キメラガイドＤＮＡコンストラクトは、２本の相補鎖として合成し、それらの相補鎖をアニーリングして、そのガイド配列（１８ヌクレオチドの標的配列を含む）の上流に配置されたＴ７プロモーターとともに、二本鎖コンストラクトを生成し、それを用いて、キメラガイドＲＮＡをインビトロ転写によって生成し、実施例３で説明したようにして精製した。実施例３で説明したように、Ｈｙｇ耐性（「ＨｙｇＲ」）カセット（配列番号４６）を含むドナーフラグメントとともに、各キメラガイドＲＮＡを個々にナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属エディター株ＧＥ−６７９１に形質転換した。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択して、説明したように、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の標的領域に隣接するプライマーを用いて、コロニーＰＣＲによってスクリーニングした（プライマーＭＡ−ＺｎＣｙｓ−ＦＰ（配列番号８１）及びＭＡ−ＺｎＣｙｓ−ＲＰ（配列番号８２）を用いて、ノックアウト（ＧＥ−８５６４）とドナーフラグメントのイントロンへの挿入を確認し、プライマーＭＡ−５’Ｂａｓｈ−ＺｎＣｙｓ−ＦＰ（配列番号９５）及びＭＡ−５’Ｂａｓｈ−ＺｎＣｙｓ−ＲＰ（配列番号９６）を用いて、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の５’領域へのドナーフラグメントの挿入を確認し、プライマーＭＡ−３’Ｂａｓｈ−ＺｎＣｙｓ−ＦＰ（配列番号９７）及びＭＡ−３’Ｂａｓｈ−ＺｎＣｙｓ−ＲＰ（配列番号９８）を用いて、ＺＮＣｙｓ−２８４５遺伝子の３’領域へのドナーフラグメントの挿入を確認した。１２個のガイドＲＮＡのうち１１個によって、標的遺伝子座にＨｙｇ遺伝子が挿入されたことがコロニーＰＣＲによって判断された単離体が得られた。
ノックダウン株から単離したＲＮＡに対して、定量的逆転写−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を行って、それらの株において、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の発現が実際に低下したか確かめた。窒素を豊富に含む標準的な条件（ＰＭ０７４（ナイトレートのみの）培地）で、ＺｎＣｙｓ−２８４５Ｂａｓｈノックダウン株を増殖させ、定常期初期中に回収した。ＺｎＣｙｓ−２８４５ Ｂａｓｈノックダウン細胞から全ＲＮＡを単離し、ＢｉｏＲａｄのｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｕｐｅｒｍｉｘキットをメーカーのプロトコールに従って用いて、ｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲのために、Ｓｓｏｆａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を遺伝子特異的プライマーとともに用いた。ＣＦＸ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）と連結したＣ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ ＣｙｃｌｅｒでＰＣＲ反応を行った。プライマーとｃＤＮＡの濃度は、メーカーの推奨に従った。ＺｎＣｙｓ−２８４５転写産物の配列を増幅するためのプライマーは、配列番号９９及び配列番号１００であった。異なる培養条件下で、一貫した発現レベルを有するハウスキーピング遺伝子（１Ｔ５００１７０４、配列番号１０１）に対して、各試料の転写産物レベルを正規化し、ＢｉｏＲａｄのＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒというソフトウェアを用いて、ｄｄＣＴ法を使用して、相対的な発現レベルを算出した。
図１４Ｂには、上記の株のいくつかで、ＺｎＣｙｓ−２８４５転写産物のレベルが低下したことが示されている。これらのうち、ＧＥ−１３１０８株（ＺｎＣｙｓ−２８４５ Ｂａｓｈ−３）及びＧＥ−１３１０９株（ＺｎＣｙｓ−２８４５ Ｂａｓｈ−４）（ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の５’末端を標的とする）、ならびにＧＥ−１３１１２株（ＺｎＣｙｓ−２８４５３ Ｂａｓｈ−１２）（ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の３’末端を標的とする）を産生性アッセイ用に選択した。
実施例１１．ＺｎＣｙｓ−２８４５ ＲＮＡｉノックダウンコンストラクト
ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の発現低下により、それらの細胞が、依然として野生型よりも多くの脂質量を産生しながら、Ｃａｓ９仲介ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックアウト（実施例９）よりも多くの炭素を蓄積できるようになるのか判断する別の策では、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属細胞での発現用に、干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）コンストラクト（図１５に示されている）を設計した。このコンストラクトは、ヘアピンを形成するように設計された配列であって、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の領域（配列番号１０２）に相同である配列を含み、その後にループ配列が続き、続いてＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子に相同な配列に対する逆配列が続き、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号４５）によって駆動され、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）「ターミネーター９」（配列番号１０３）が続く配列を含む。このＲＮＡｉ発現カセットを含むコンストラクトは、ＴｕｒｂｏＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）をコードするナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属コドン最適化遺伝子（配列番号２４）であって、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属用にコドン最適化されており、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 ４ＡＩＩＩプロモーター（配列番号４０）の制御下にあり、「ターミネーター５」（配列番号４１）が続いている遺伝子とともに、ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子（配列番号４４）であって、ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）によって駆動され、ＥＩＦ３ターミネーター（配列番号１２）によって終端する遺伝子も含んでいた。このコンストラクトのＲＮＡｉ発現カセットは、ハイグロマイシン耐性発現カセット（ＲＮＡｉコンストラクトの５’に配置したとともに、ＲＮＡｉコンストラクトの転写方向と反対の転写方向に配向させた）と、ＧＦＰ発現カセット（ＲＮＡｉカセットの３’に配置したとともに、ＲＮＡｉカセットと同じ転写方向に配向させた）との間に配置した。このコンストラクトは、線状化して、説明したとおりに、エレクトロポレーションによって、野生型ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ） ＷＴ−３７３０に形質転換した。
ハイグロマイシン耐性コロニーをＰＣＲによって、ＲＮＡｉコンストラクトの存在についてスクリーニングし、上記の実施例３で説明したように、フローサイトメトリーを用いて、ＧＦＰの完全浸透度について更にスクリーニングした。フローサイトメトリーを行って、ＲＮＡｉコンストラクトについて陽性であった形質転換体から単離した株６、７、１０、１２、１３、２１、２５及び３０の浸透度を試験し、野生型対照の波形と重ねた。
ＲＮＡｉを用いて、異なるレベルの遺伝子減弱を試験したので、異なる浸透度パターンを示す株の表現型を試験することが重要であった。例えば、ＲＮＡｉコンストラクトを有するいくつかの株（株１０、１３、２１及び３０など）は、完全浸透性ではなかった。すなわち、これらの蛍光波形は、基本的に野生型の波形と一致していた。興味深いことに、野生型レベルに対するＲＮＡレベルの低下は、株２５が最も大きく、続いて、株７、１０、６及び１２であった。ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の減弱の特徴は、窒素源としてナイトレートのみを含む培地で増殖できないこと（または、ＺｎＣｙｓ２８４５遺伝子発現の減弱レベルによっては、この増殖の軽減）である。ノックアウトでは、増殖は見られず（右端のフラスコ）、株１及び株１２でも、わずかな増殖が見られるか、または増殖は見られなかった。株７及び２５では、ナイトレートのみの培地において増殖が軽減され、株１０、１３、２１及び３０では、野生型と同様の増殖が見られた。特に、株１０（ＲＮＡレベルにより、（少なくとも株６と同程度に）高レベルで遺伝子を減弱すると見られる）は、株６ほどの強さで表現型を示さない。この表現型の差は、ＲＮＡレベルから予測不能であるが、株１０のＧＦＰ発現の不完全浸透性と、株６におけるＧＦＰの完全浸透度での発現とはよく相関していた。すなわち、クローン集団における結合蛍光タンパク質遺伝子の蛍光の評価は、目的の遺伝子を一貫して発現する株を単離するための信頼性の高い方法であった。
株７（完全浸透度を示したが、ナイトレートのみの培地において、ノックアウト株よりも増殖軽減度が小さかった）は、ＧＥ−１３１０３株という名称を新たに付けて、プロモーターと、実施例１０において単離した３’末端破壊株とともに、更なる評価のために選択した。
実施例１２．ＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウンコンストラクトの表現型の解析
脂質調節因子の表現型を厳密に試験するために、バッチ産生性アッセイにおいて、培養培地ＰＭ１２４（ＮＨ４とＮＯ３の両方を窒素源として含む）で培養物をスケールアップするとともに、ナイトレートを唯一の窒素源として含むＰＭ１２３培養培地でアッセイを行うことによって、ＺｎＣｙｓ−２８４５ ＲＮＡｉ株ＧＥ−１３１０３、ならびにＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウンによる挿入「ｂａｓｈｅｒ」株ＧＥ−１３１０８、ＧＥ−１３１０９及びＧＥ−１３１１２を試験した。
顕著なことに、サンプリングした全ての日に、ナイトレートを唯一の窒素源として用いて培養したところ、元のノックアウト変異体ＧＥ−８５６４を含む全ての遺伝子減弱変異体が、野生型を上回る量でＦＡＭＥを産生した（表９）。しかしながら、これらの条件では、元のノックアウト株ＧＥ−８５６４では、野生型よりも全有機体炭素の蓄積速度が有意に低かったが（表１０）、ＺｎＣｙｓ−２８４５遺伝子の発現が低下した減弱ノックダウン株（「Ｂａｓｈ」株及びＲＮＡｉ株）のＴＯＣ蓄積速度は、野生型と近いかまたは（例えば、ＧＥ−１３１１２の場合）基本的に同一であった（表１０）。顕著なことに、これらのＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウン変異体では、ＴＯＣに対するＦＡＭＥの比が、野生型よりも有意に高まった（表１１）。
（表９）ＮＯ３を含む培養培地によるバッチアッセイにおけるＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウン株のＦＡＭＥ産生性の野生型との比較（培養物１Ｌ当たりのｍｇ）
Figure 2018500037
（表１０）ＮＯ３を含む培養培地によるバッチアッセイにおけるＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウン株のＴＯＣ産生性の野生型との比較（培養物１Ｌ当たりのｍｇ）
Figure 2018500037
（表１１）ＮＯ３を含む培養培地によるバッチアッセイにおけるＺｎＣｙｓ−２８４５ノックダウン株のＦＡＭＥ／ＴＯＣ比の野生型との比較
Figure 2018500037
実施例１３．完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株を用いた、導入遺伝子の標的組み込み
実施例３のＣａｓ９エディター株ＧＥ−６７９１を用いて、トランスジェニック経路の特定の遺伝子座への標的組み込みも評価した。アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子内のａｃｏ２ ＣＲＩＳＰＲ標的遺伝子座を再度選択した（配列番号４８）。実施例５のＨｙｇＲカセットを用いると、良好に破壊されるとともに、遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（配列番号４９）が既に入手可能であったからである（実施例５を参照されたい）。ａｃｏ２部位への標的組み込み用に、ベクターｐＳＧＥ−６３３７（配列番号１０４）のＡｓｃ／Ｎｏｔ制限消化とゲル精製によって得た２２．３ｋｂフラグメントを選択した。このフラグメントは、代謝操作用の６個の発現カセットを含んでおり、タンデムに並んだこの６個の発現カセットは、一方の末端はＨｙｇＲカセットに、もう一方の末端はＧＦＰカセットに隣接していた（図１６）。
ａｃｏ２標的部位を標的とする精製キメラガイドＲＮＡを５μｇと、ｐＳＧＥ−６３３７−Ａｓｃ／Ｎｏｔフラグメント（配列番号１０４）の１つを１μｇ用いて、エレクトロポレーションによって、ＧＥ−６７９１ Ｃａｓ９発現株を形質転換した。エレクトロポレーション後、ハイグロマイシンを含む寒天培地に細胞を播種して、２２．３ｋｂのＤＮＡ分子が組み込まれた形質転換体について選択した。上で説明したようにして（実施例２を参照されたい）、ただし、ａｃｏ２標的に隣接するプライマー（配列番号１７）（配列番号１８）を用いるコロニーＰＣＲと、ＨｙｇＲ遺伝子（配列番号１０５）をプライムオフする第３のプライマー（このフラグメントの一方の末端の近くに位置するとともに、外側に向いている）を含む別の反応とによって、形質転換体をスクリーニングした。ＰＣＲの結果は、詳細に示されており（図１７）、コロニー５、６、７、８、９、２０、２７、２８及び３１において、２２．３ｋｂのドナーＤＮＡが標的ａｃｏ２部位に組み込まれたようである。
実施例１４．ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属エディター株
１）ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９遺伝子（配列番号１）とともに、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ（配列番号５）と、核局在化シグナル（配列番号４）と、ペプチドリンカー（配列番号３９）とを含むＣａｓ９発現カセットであって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ２４プロモーター（配列番号２５）によって駆動され、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端する発現カセットと、２）ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号１０６）の発現を駆動するように設計された発現カセットであって、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズする２０ｂｐ配列と、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する１６〜２２ヌクレオチド配列を含み、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）推定Ｕ６プロモーター（配列番号１５）によって駆動され、Ｕ６ターミネーター（配列番号１６）が続いている発現カセットと、４）Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来ｂｌａｓｔ遺伝子（配列番号１０）を含む選択可能マーカー発現カセットであって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）によって駆動され、ＥＩＦ３ターミネーター（配列番号１２）が続く発現カセットと、４）ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）（配列番号２４）を含むＧＦＰレポーター発現カセットであって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ４Ａ−ＩＩＩプロモーター（配列番号４０）に駆動され、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター５（配列番号４１）（Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ゲノムにおいては、グルコサミン６−フォスフェートイソメラーゼ２遺伝子とＹＶＴＮリピート様キノプロテインアミンデヒドロゲナーゼ遺伝子との間に見られる）が続く発現カセットとを含むコンストラクトで、野生型ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属を形質転換することによって、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属エディター株を操作することもできる。
ブラストサイジンを含むＰＭ７４寒天培地に、このコンストラクトで形質転換した株を播種した。解析と保存のために、コロニーを選択培地にパッチし、任意で、コンストラクトの存在について、ＰＣＲによってスクリーニングする。実施例３で説明したようにして、フローサイトメトリーによって、１つのコロニー単離体から得た形質転換体をスクリーニングする。得られたヒストグラムを、別に実施した野生型細胞（すなわち、蛍光タンパク質を発現しない細胞）のヒストグラムと重ねる。培養物における完全浸透度で発現した株のみを更に調べ、これは、フローサイトメトリーのＧＦＰ蛍光ヒストグラムにおいて、単一のピークまたは釣鐘形状の曲線が現れ、ログスケールでプロットしたところ、その蛍光ピークが、野生型自己蛍光（バックグラウンド蛍光）ピークよりも完全に高くシフトしたことを意味する。これらの株は、その株の培養物の細胞全体にわたって、物理的に連結されたＧＦＰ遺伝子の発現が見られたという点で、「完全浸透性の」Ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡ発現株として定められる。すなわち、いずれかの所定の時点において、ＧＦＰの量（すなわち、蛍光）が、細胞間で多少異なることがあり、その結果、複数のピークまたは釣鐘形状の曲線が現れたが、シフトしたそのピークに対して別個のＧＦＰ発現分布を示す細胞亜集団は、これらの株では観察されない。
続いて、非形質転換細胞に対して明らかにシフトした１つの蛍光ピークが現れた、完全にＧＦＰ浸透性のＣａｓ９株（例えば、図５Ａ及び５Ｂ、ならびに表１（ピークが１つか２つかに従って、「Ｘ」によってクローンがスコアリングされている）を参照されたい）を、Ｃａｓ９発現の証明のために、抗ＦＬＡＧ抗体によるウエスタンブロットによって試験したとともに、核酸プローブによって、ｔｒａｃｒＲＮＡの存在について試験した。
ゲノム編集のために、特定のゲノム遺伝子座を標的とするｃｒＲＮＡと、編集遺伝子座への挿入用のドナーＤＮＡで、完全浸透性のＣａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡ発現株を形質転換する。用いるｃｒＲＮＡは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子（配列番号１４）を標的とする２０ヌクレオチド配列であって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子標的化ＲＮＡ全体（配列番号１０７）をもたらすように、２０ヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ認識配列または「ｔｒａｃｒメイト」配列と並置された配列を含む。このドナーＤＮＡは、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＥＩＦ３プロモーター（配列番号２３）の制御下で、ハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）遺伝子（配列番号２２）を含んでおり、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）双方向ターミネーター２（配列番号２６）によって終端していた（機能的に連結したＨｙｇＲ遺伝子、プロモーター及びターミネーターは、本明細書では、ＨｙｇＲカセットという）。
形質転換後、ＨｙｇＲコロニーを、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子の遺伝子座におけるＨｙｇＲカセットの存在についてスクリーニングする。
実施例１５．ｔｒａｃｒＲＮＡが発現され、ｃｒＲＮＡが導入されたクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属エディター株
別の例では、遺伝子カセットを標的遺伝子座に組み込むために、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡの両方を完全浸透性のパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 Ｃａｓ９エディター株ＧＥ−１５６９９に形質転換する。このケースでは、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは、別々の分子である。標的化ｃｒＲＮＡ（配列番号１０８）は、葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子（その破壊によって、色素表現型が軽減される）を標的とするように設計されている。ｃｒＲＮＡとトランス活性化ＲＮＡ（配列番号１０９）の両方を化学的に合成する。これらの２つのＲＮＡは、１：１のモル比で、それぞれ約３μＭの濃度で、１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（ＲＮａｓｅ無添加）において組み合わせる。その体積は、例えば、約２０μｌ〜約２００μｌの範囲であることができる。そのＲＮＡ溶液を温度ブロックで９４〜９９℃まで約２分加熱した後、その温度ブロックをオフにする。温度ブロックが２５℃以下に達するまで、ハイブリダイゼーション混合物を温度ブロック内で放冷する。続いて、実施例７に従って、エレクトロポレーション用に調製したパラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属 Ｃａｓ９エディター株ＧＥ−１５６９９細胞（０．２ｃｍのキュベット内に約５×１０８細胞）の入ったキュベットに、約１〜約５μｇの範囲の量のアニール済みＲＮＡを加える。続いて、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属での発現のために最適化したＢｌｅＲカセット（配列番号６６）を含むドナーＤＮＡ（約１μｇ）をキュベットに加え、実施例７で示した方法に従って、細胞に対してエレクトロポレーションを行う。ゼオシン耐性コロニーを、色素の減少について目視で調べる。天然の標的遺伝子座にわたって増幅するように設計したプライマー（ｏｌｉｇｏ−ＡＥ５９６（配列番号６７）及びｏｌｉｇｏ−ＡＥ５９７（配列番号６８））を用いて、コロニーＰＣＲによって、薄緑色のコロニーを、ｃｐＳＲＰ５４遺伝子座におけるドナーフラグメントの存在についてスクリーニングする。
実施例１６．ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株とＱｄｏｔを用いたマーカーレス形質転換
ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株での非常に効率の高いゲノム編集により、マーカーレス形質転換が可能になる。１つの方策においては、光合成調節因子遺伝子Ｌａｒ１（同時係属の米国特許出願公開第２０１４／０２２０６３８号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている）を変異の標的とした。Ｌａｒ１遺伝子の変異により、非濃縮法よりも容易に識別可能な表現型（クロロフィルの減少）であって、変異体回収率のいずれかの向上が見られるか割り出すために目視でスコアリングできる表現型が生じるからである。Ｌａｒ１を標的とするキメラｇＲＮＡ（配列番号１０９）とＱＤｏｔ５８５「Ｑｔｒａｃｋｅｒ」ナノ粒子（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ番号Ｑ２５０１１ＭＰ）でＣａｓ９エディター株ＧＥ−６７９１を形質転換した。予め混合したＱｔｒａｃｋｅｒ（メーカーの説明書に従った）２μｌとｇＲＮＡ、５μｇを混合し、上で説明したように、エレクトロポレーションによってナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属細胞に形質転換した。形質転換後、細胞を１）寒天培地に直接播種するか、２）ＦＡＣによって選別して、Ｑｄｏｔ陽性細胞について濃縮してから播種するか、または３）メーカーの説明書に従ってＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｂｌｕｅ染色液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ番号Ｌ−２３１０５）とともにインキュベートし、ＦＡＣによって選別し、Ｑｄｏｔ陽性細胞について濃縮する一方で、染色された「死」細胞を除外してから播種した。
ＰＣＲシーケンシング用に、最小かつ最も薄いコロニーをパッチし、それらのコロニーに対して配列確認を行い、ＮＨＥＪによる修復ミスによる小さな挿入または欠失（平均で１または２塩基）があるか検証した。変異体回収率の向上は、直接播種した場合の０．０５％から、ＱｄｏｔをＦＡＣＳで濃縮し、死細胞を除外した場合の０．１３％まで向上した（表４）。この向上は有意であるが、偽陽性率がかなり高かった。若干の割合のＱｄｏｔ陽性細胞は、細胞壁に伴うＱｄｏｔを有していたと考えられ、必ずしも細胞内部に存在していたわけではないと仮定した。
（表１２）完全浸透性のＣａｓ９エディター株を用いたマーカーレス変異頻度
Figure 2018500037
実施例１７．ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株と、インビトロで転写したＧＦＰ用ｍＲＮＡを用いたマーカーレス形質転換
これらの実験では、Ｑｄｏｔの代わりに、インビトロ合成したメッセンジャーＲＮＡであって、ＴａｇＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ、ロシアのモスクワ）のような蛍光タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡとともに、キメラガイドＲＮＡをナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属に形質転換する。これにより、実施例９で見られた高い偽陽性率が排除されることになる。ＧＦＰ ｍＲＮＡが細胞内部に存在して、そのリボソーム機構と接触しなければ、蛍光タンパク質が作られないからである。この実験では、形質転換後、例えば、試験できる期間、ただし、形質転換後４〜４８時間であり得る期間に、細胞を回収可能となり、その後、細胞をフローサイトメトリーによって選別することになる。バックグラウンドを上回る蛍光（バックグラウンド蛍光は、ＧＦＰをコードするＲＮＡなしで形質転換した細胞によって割り出す）を示した細胞を選択するとともに、選択なしで播種して、後で、標的ゲノム遺伝子座に隣接する配列に対して相同性を有するプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする。更に、ＴａｇＧＦＰ（ＧＦＰの単量体型である）をＣａｓ９遺伝子のＮ末端またはＣ末端のいずれかに、翻訳によって融合することもでき、Ｃａｓ９遺伝子も、宿主細胞に組み込む代わりに、一過性に発現させて、ゲノム編集機能を果たすようにしてもよい。これにより、Ｃａｓ９編集に対して、非ＧＭＯ的アプローチが可能になる。
実施例１８．抑制性Ｃｒｅリコンビナーゼ発現能を有するマーカーレス・レポーターレスナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 Ｃａｓ９エディター株の作製
ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）におけるＣａｓ９ヌクレアーゼの構成的発現と、Ｃｒｅリコンビナーゼの抑制的発現のために、ベクターのｐＳＧ６４８３を設計及び操作した（図１８）。このベクターは、１）実施例３（「完全浸透性のナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属Ｃａｓ９エディター株の作製」）で説明したＣａｓ９発現カセットと、２）実施例３で説明した選択可能マーカーカセット（「ＨｙｇＲカセット」）と、３）実施例３で既に説明した同じＧＦＰレポーターカセットと、４）ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化したＰ１バクテリオファージ由来Ｃｒｅリコンビナーゼであって、Ｃａｓ９コンストラクトで用いた同じＮ末端ＮＬＳを含むとともに、Ｃｒｅコード領域に挿入されたＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）イントロンも含むＣｒｅリコンビナーゼ（（配列番号１１１に示されているような操作されたＣｒｅ遺伝子）を含む抑制性ＣＲＥ発現カセットという４つのエレメントを含んでいた。このナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属の操作されたＣｒｅ遺伝子は、そのＣｒｅ遺伝子の５’末端においては「アンモニア抑制性亜硝酸／亜硫酸レダクターゼ」プロモーター（配列番号１１２）に、そのＣｒｅ遺伝子の３’末端においては、「亜硝酸／亜硫酸レダクターゼ」ターミネーター（配列番号１１３）に機能的に連結されていた。ＢｌａｓｔＲ選択可能マーカーとＧＦＰレポーターカセットは、コンストラクトにおいてタンデムに並んでいるとともに、同じ配向で同一のｌｏｘ部位に隣接している。ｌｏｘＰ部位に隣接する機構は一般的に、「フロックス」という。アンモニア抑制性プロモーターは、抗生物質耐性コロニーが生成され、ＧＦＰの表現型浸透度が１００％になるまで、可能な限り、Ｃｒｅ遺伝子の発現を抑制するものであった。加えて、ｌｏｘ部位を含むベクターにＣｒｅをクローニングすることは、問題があることが明らかになっている。Ｃｒｅをクローニングすると、Ｅ．ｃｏｌｉにおける基底レベルのＣｒｅ発現でも、フロックスＢｌａｓｔＲとＧＦＰがループアウトしたからでる。このハードルを避けるために、イントロンをＣｒｅ遺伝子に挿入して、触媒ドメインと求核ドメインを破壊した。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてそのフロックスマーカーを自己切除しない最終的な安定ベクターｐＳＧＥ−６４８３（図１８）が得られた。
ｐＳＧＥ−６４８３をナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）に形質転換し、アンモニアを含むが、ナイトレートを含まないＰＭ１２８寒天培地に播種した（この培地は、ブラストサイジンを１００ｍｇ／Ｌ含んでいた）。解析と保存のために、コロニーを同じ選択ＰＭ１２８培地に再度パッチし、ＧＦＰの表現型の完全浸透度について、実施例３で説明したように、フローサイトメトリーによってスクリーニングした。アンモニウムを唯一の窒素源として含む培地（ＰＭ１２８）、または硝酸ナトリウムを唯一の窒素源として含む培地（ＰＭ１２９）のいずれかで、いずれの培地でもブラストサイジンによる選択なしに、並行連続培養するために、６個の株を引き継いだ。連続培養の２週間後、それらの株をフローサイトメトリーによって、ＧＦＰシグナルの喪失について調べ、診断用ＰＣＲによって、フロックスＧＦＰ／ＢｌａｓｔＲカセットの切断について調べ、ウエスタンブロットとｑＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃｒｅの発現について調べ、ウエスタンブロットによって、Ｃａｓ９の発現について調べた。
ＧＦＰヒストグラムにより、異なる株において入り混じった結果が明らかになった。株６４８３−Ｆ１２は、ＮＨ４培養物とＮＯ３培養物との間でＧＦＰシグナルが明らかに切り替わった唯一の株であった。株Ｂｌｌ及びＣ１２は、ＮＨ４とＮＯ３の両方でＧＦＰシグナルが喪失したようであったが、株Ａ１１、Ｄ１２及びＥ１２は、ＮＨ４とＮＯ３の両方でＧＦＰシグナルが保持されたようであった（図１９）。
これらの株からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＲＴ−ＰＣＲの実験のために、ｃＤＮＡを生成した。Ｃｒｅ、ＧＦＰ及びナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属由来のポジティブ対照遺伝子（「１７０４」、発現レベルが実質的にその細胞の環境的条件及び窒素状態の影響を受けないことが分かっている遺伝子）における転写産物を検出及び増幅する迅速な方法として、ＲＴ−ＰＣＲを用いた。ゲルイメージにより、ＮＯ３培地で増殖した株Ｂ１１、Ｃ１２及びＦ１２におけるＧＦＰ転写産物の喪失と、ＮＯ３培地で増殖したＣｒｅ転写産物におけるシグナルの増強が示されているが、ただし、株Ｅ１２では、いずれの条件でも、検出可能なＣｒｅ転写産物は見られなかった（図２０）。ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、抑制が予測される条件（ＮＨ４）で培養した株と、非抑制／誘発条件（ＮＯ３）で培養した株との間の転写産物量の倍数変化を定量化した。ＮＨ４とＮＯ３における抑制の変化レベルを全ての株について観察した（図２１）。基底レベルのＣｒｅ発現は、株によって異なり、全ての株において、Ｆ１２の転写産物が最も少なかった。このデータは、ＧＦＰヒストグラムデータとよく一致していた。Ｆ１２が、ＮＨ４での連続培養後に、ＧＦＰ陽性ヒストグラムを有する唯一の株であった一方で、ＮＯ３において連続培養後にＧＦＰシグナルを喪失したからである。これにより、導入されたＣｒｅ遺伝子が全体に、比較的抑制されると（すなわち、誘発条件でも）、Ｃｒｅ活性の良好な抑制が行われる可能性が高くなるが、このような低発現株でも、Ｃｒｅ発現が誘発されると、フロックス配列を十分に切除することが示されている。
抗Ｃｒｅウエスタンブロットを行い（図２２）、ＲＴ−ＰＣＲによって転写産物が検出されなかったＥ１２を除き、全ての培養物から、３８ｋＤａのＣＲＥタンパク質が検出された。興味深いことに、ＮＨ４条件とＮＯ３条件の両方で、同程度の量のＣｒｅタンパク質が検出された。すなわち、培養物の様々な増殖期に、試料を取ったので、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検出されたＲＮＡレベルの差が、タンパク質レベルに反映されなかった可能性がある。抗Ｃａｓ９ウエスタンブロットも行い、形質転換細胞でＣａｓ９酵素も検出された（図２３）。
Ｆ１２培養物と誘発Ｃ１２培養物の両方で、診断用ＰＣＲを行い、フロックスＧＦＰ及びＢｌａｓｔＲ遺伝子カセットが無傷であるか、またはＣｒｅの仲介による組み換えによって切除されたかを割り出し、環状組み換え産物の存在を検出したとともに、ＧＦＰ及びＢｌａｓｔＲ遺伝子のみの存在を検出した（図２４）。Ｆ１２−ＮＨ４（抑制）培養物は、ある程度の平衡レベルにあるようである。いずれの無傷のフロックスカセットが存在するようである（プライマーセットＡ、Ｂ、Ｃ）とともに、環状組み換え産物（プライマーセットＤ）によって、抑制条件下でも、ある程度のレベルの組み換えが見られたことが示されたからである。Ｆ１２−ＮＯ３培養物では、フロックス遺伝子が組み込み部位からほぼ切除されたようである。プライマーセットＡが、無傷領域全体にわたって増幅せず（３．７ｋｂのバンドは現れず、切断により、１８５ｂｐのバンドが増幅されたか否か見極めるのは困難であった）、プライマーセットＢ及びＣでは、極めて薄いバンドが現れ、プライマーセットＤ、Ｆ及びＧでは、中程度に薄いバンドが現れたからである。Ｃ１２−ＮＯ３培養物は、切断プロセスにおいて更に進んでいるようであるが、それ自体において、ＢｌａｓｔＲ及びＧＦＰが依然として検出できた（プライマーセットＦ、Ｇ）。切断によって遺伝子座が改変されるか確実に検出するために、新たなプライマーセットを用いて、フロックス領域（図２５）にわたって増幅し、その際、無傷の遺伝子座では、４．９ｋｂのバンドが現れ、切除された遺伝子座では、１．３ｋｂのバンドが現れた。Ｆ１２−ＮＨ４培養物について、同じ平衡及び／または異種培養物を観察した。無傷のバンドと切除されたバンドの両方が見られた一方で、Ｆ１２−ＮＯ３培養物では、切除されたバンドのみが見られたからである。ＮＯ３培養物では、Ｆ１２とＣ１２の両方で、微弱なＧＦＰ及びＢｌａｓｔＲシグナルが依然として観察されたので、Ｆ１２、Ｃ１２及びＢ１１でＮＯ３培養から得られた細胞を希釈し、ＮＯ３を含み、ブラストサイジンを含まない寒天平板上で、１つの単離コロニーに播種して、その後の株の均質性を高めるようにした。Ｃ１２及びＦ１２から得た３つの単離コロニーをＰＣＲによって、Ｃｒｅ、ＢｌａｓｔＲ及びＧＦＰ遺伝子の存在について試験した（図２６）。ＧＦＰ及びＢｌａｓｔＲ遺伝子は喪失したようであり（プライマーセットＥ及びＦ）が、ＣＲＥ遺伝子は依然として容易に検出される（プライマーセットＧ）。
ＣＲＥの発現が最も抑制的であったので、Ｃｒｅによる新しいエディター株として更に試験するために、Ｆ１２株を選択した。この株をＧＥ−１３６３０とした。
実施例１９．抑制性Ｃｒｅリコンビナーゼ能を有するナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属 ｃａｓ９エディター株においてマーカーをリサイクルすることによるマーカーレスノックアウト
アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を標的とするｇＲＮＡ（既に実施例５で説明したようなもの）と、ドナーフラグメントとしてのフロックス破壊カセット（図２７）（配列番号１１５）でＧＥ−１３６３０を形質転換した。このカセットは、ハイグロマイシン耐性遺伝子とＧＦＰ遺伝子を含んでおり、これらの遺伝子が、タンデムに並べられていたとともに、同じ配向でｌｏｘＰ部位に隣接していた。これらのｌｏｘＰ部位の外側には、３つのフレームの終止コドンがある。これらのフレームは、上流では、正配向であり、下流では、逆配向である。カセットの遠端には、カセットを識別しやすいように、また、組み込み中に、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属のＤＮＡ末端修復機構による損傷から終止コドンとｌｏｘＰ部位を保護するＤＮＡバッファーとして機能するように、特有の「マーク」もある。ハイグロマイシンを５００ｍｇ／Ｌ含むＰＭ１２８寒天培地に、形質転換体を播種した。この培地は、Ｃｒｅの発現を抑制するためのアンモニウムを含み、形質転換体を耐性コロニーとして識別できるとともに、単離できるようになっている。コロニーを同じ選択培地にパッチし、ジェノタイピングし、（実施例５で説明したように）ＧＦＰの発現とコロニーＰＣＲについて解析した。ＤＮＡシグナルの混合が見られ、４．５ｋｂのフラグメント全体が挿入されたことと、１７０ｂｐの最終的な切断産物が見られた。これにより、アンモニウムの存在下でも、切断が既に進行中であったことが示された。切断を完了させるために、これらの株を選択から外し、ナイトレートを含む培地（ＰＭ１２９）で増殖し、これにより、Ｃｒｅ発現の部分抑制を除去し、培養を通じて、完全な切断プロセスを促した。続いて、それらの株をジェノタイピングし、ＧＦＰシグナルの喪失についてモニタリングした。これらの基準（ＰＣＲによって観察されるようなＨｙｇＲ−ＧＦＰフラグメントの喪失と、蛍光シグナルの喪失）をパスした１つの株を、均質性のために、ハイグロマイシンによる選択なしに、ナイトレートプレート上で画線した。４つの単離コロニーに最後のジェノタイピングを行い、これらの株のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子組み込み遺伝子座のＰＣＲ産物をシーケンシングした。これにより、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するための翻訳停止部を含んでいた残りの１７０ｂｐの傷跡のみによって、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子が破壊されたことが明確に示された。この株は、ハイグロマイシンへの感受性を持つことが立証され、ＨｙｇＲ遺伝子を含むフロックスフラグメントの切断と一致していた。このスタッキングプロセスの概要が示されている（図２８）。
実施例２０．ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）における異種のタイプＩ ＦＡＳ遺伝子の発現
浸透度スクリーニングを用いて、ＲＮＡｉの発現により、培養物全体にわたって、所望のレベルで遺伝子が減弱した形質転換菌株を選択した実施例１１で示されたように、Ｃａｓ９またはその他のゲノム編集ヌクレアーゼ以外の分子をコードするコンストラクトを発現する形質転換体のスクリーニングにも、浸透度スクリーニングが有益であることが明らかになっている。この例では、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属遺伝子調節エレメントに機能的に連結した異種のタイプＩ脂肪酸シンターゼ遺伝子を含むように操作されたコンストラクトでナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属を形質転換することから得た単離体で、浸透度スクリーニングを行った。ゼブラフィッシュ ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）タイプＩ脂肪酸シンターゼ（タイプ１ＦＡＳ）をコードする核酸配列（配列番号１１６）と、独自の単離スラウストキトリッド株のタイプＩ ＦＡＳをコードする核酸配列（配列番号１１８）を、ユースティグマトファイト藻ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）でのそれらの遺伝子の発現用に設計したコンストラクトにクローニングして、藻の細胞質において異種のタイプＩ ＦＡＳ酵素の機能を示す株を初めて単離可能にした。
Ｃ．レリオ（Ｃ．ｒｅｒｉｏ）タイプＩ ＦＡＳ発現用コンストラクトｐＳＧＥ−６２００（図２９）は、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されている、Ｄ．レリオ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）タイプＩ ＦＡＳ（「ＤｒＦＡＳ」という）をコードする遺伝子（配列番号１１６）を含んでおり、当該遺伝子は、当該ＤｒＦＡＳコード配列の５’に位置するＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ７プロモーター（配列番号Ｚ）と、当該ＤｒＦＡＳコード配列（配列番号１１６）の３’末端に位置するＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）「ターミネーター２」配列（配列番号Ｑ）とに機能的に連結されていた。この発現コンストラクトは、ＤｒＦＡＳタンパク質のＡＣＰドメインの活性化に必要なＤ．レリオ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）パンテテインホスホトランスフェラーゼ（ＰＰＴ）をコードする核酸配列（配列番号１１７）も含んでいた。このコンストラクトで用いたＰＰＴ遺伝子（配列番号１１７）も、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されており、その５’末端において、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ４ＡＩＩＩプロモーターに機能的に連結されており、その３’末端において、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ターミネーター４に機能的に連結されていた。ＤｒＦＡＳ及びＰＰＴ遺伝子の上流には、その５’末端がＴＣＴＰプロモーター（配列番号１１）（ＤｒＦＡＳ遺伝子の発現を駆動するように配置されたＲＰＬ７プロモーターと反対方向に配向していた）に機能的に連結されているとともに、その３’末端がＥＩＦ３ターミネーターに機能的に連結されているコドン最適化「ｂｌａｓｔ」遺伝子発現用カセットがあった。ＤｒＦＡＳ及びＰＰＴ遺伝子の下流には、ＴｕｒｂｏＧＦＰのコード配列（Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されていた。配列番号２４）がＥＩＦ３プロモーターとＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）ターミネーター５に機能的に連結されているＧＦＰ発現用カセットがあった。このＧＦＰ発現カセットは、ＤｒＦＡＳ及びＰＰＴ遺伝子と同じ５’〜３’方向に配向していた。
スラウストキトリッドのタイプＩ ＦＡＳの発現用コンストラクトｐＳＧＥ−６１６７（図３０）は、スラウストキトリッドのタイプＩ ＦＡＳをコードする遺伝子（「ＣｈｙｔＦＡＳ」という）（配列番号１１８）であって、Ｎ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）用にコドン最適化されており、そのＣｈｙｔＦＡＳコード配列の５’においてＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ） ＲＰＬ７プロモーター（配列番号Ｚ）に機能的に連結しており、そのＤｒＦＡＳコード配列の３’末端においてＮ．ガディタナ（Ｎ．ｇａｄｉｔａｎａ）「ターミネーター２」配列（配列番号Ｑ）に機能的に連結している遺伝子を含んでいた。このコンストラクトは、別のＰＰＴ遺伝子を含んでいなかった。ツボカビＦＡＳは、その酵素活性を含むからである。ＣｈｙｔＦＡＳ遺伝子の上流には、ＤｒＦＡＳコンストラクトで示したのと同じｂｌａｓｔ発現カセットがあり（転写方向がＦＡＳ遺伝子と反対になるように配向していた）、ＣｈｙｔＦＡＳ遺伝子の下流には、ＤｒＦＡＳコンストラクトで用いたものと同じＧＦＰ発現カセットがあった（ＦＡＳ遺伝子と同じ方向に配向していた）。
基本的にＵＳ２０１４／０２２０６３８（参照により、本明細書に援用される）に説明されているようにして、エレクトロポレーションによって、ＤｒＦＡＳ発現コンストラクトｐＳＧＥ−６２００及びＣｈｙｔＦＡＳコンストラクトｐＳＧＥ−６１６７のこれらの発現カセットを含むＤＮＡフラグメントを別々に、直鎖状分子（ベクター骨格が、コンストラクトのＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ消化によって除去され、ゲル電気泳動によって、その直鎖状フラグメントが単離された状態）として、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属に形質転換した。ブラストサイジンを含むプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲによって、コンストラクトの存在についてスクリーニングした。
続いて、コンストラクトを含むクローンを、実施例３で説明したように、ＧＦＰ蛍光についてモニタリングするフローサイトメトリーによって、浸透度についてスクリーニングし、ＤｒＦＡＳ形質転換体では、動物タイプＩ ＦＡＳまたはＦＬＡＧタグ（いくつかのコンストラクトに存在する）に対する反応性を持つ抗体、またはＣｈｙｔＦＡＳ形質転換体では、ツボカビＦＡＳに対する反応性を持つ抗体を用いて、ウエスタンブロットによって、ＦＡＳタンパク質の発現についてスクリーニングした。図３１には、形質転換体が、野生型蛍光ピークに対してシフトした１つの蛍光ピークを示したことから、完全浸透度を有することが分かった６個のＤｒＦＡＳ形質転換体のフローサイトメトリーの波形が示されている。図３１には、完全浸透性の各クローンが、タンパク質の発現も示したことを見て取れるウエスタンブロットが示されている。ゲル上の非標識レーンは、完全浸透性ではないことが分かったクローンのタンパク質反応性を示している（すなわち、それらのクローンは、２つ以上のピークを示し、そのピークのうちの１つが、野生型、すなわちバックグラウンドの蛍光と一致したか、または、それらのクローンは、野生型、すなわちバックグラウンドのピークと一致した単一のピークを示した）。したがって、タンパク質レベルに関するスクリーニングのみでは、完全浸透性の株（培養物全体にわたる発現）が同定されない。図３２には、完全浸透度を示した６個のＤｒＦＡＳ株のフローサイトメトリーの波形が示されており、図３２には、これらの株の抗動物ＦＡＳ抗体によるウエスタンブロットが示されている。興味深いことに、これらの完全浸透性の株では、タンパク質レベルは、ウエスタンシグナル強度によって評価した場合、形質転換体ピークのバックグラウンド（野生型）ピークからの分離の程度に対応する。例えば、株６２００−３３及び６２００−３７は、ウエスタンバンドの強度が最大で、フローサイトメトリー蛍光ピークの野生型蛍光ピークからの分離の程度が最も大きかったことから、ＧＦＰ遺伝子の発現が、連結遺伝子の発現の程度に反映されることが示された。
完全浸透性でＣｈｙｔＦＡＳを発現した２つの株を、ウエスタンによって、ＦＡＳタンパク質の発現についても評価した（図３３）。６１６７−ＢのＧＦＰ蛍光ピークは、６１６７−ＡのＧＦＰ蛍光ピークのシフト具合よりも右側に（高い蛍光値で）シフトしていたが（図３７Ａ）、この差は、ウエスタンブロットによって検出した場合のタンパク質量には反映されなかった。しかしながら、興味深いことに、株６１６７は、下記のように、アッセイにおいて、６１６７Ａ株よりも高いＦＡＳ活性を示した。
選択した形質転換体におけるＦＡＳ活性を解析するために、ツボカビＦＡＳを発現する株である６１６７−Ａ及び６１６７−Ｂ、ならびにＤｒＦＡＳを発現する株である６２００−３３、６２００−３８、６２００−４３、６２０１−４３、及び６２０１−４８（全て、完全浸透度を示したものとして選択した）（図３３及び図３４）の細胞抽出物をアッセイした。清澄化脱塩抽出物で、ＡＢＳ ３４０ｎｍで測定したマロニル−ＣｏＡ依存性のＮＡＤＰＨの酸化をトリプリケートで割り出した。細胞培養物のアリコートをペレット化し、それらのペレット（約２００〜４００μｌの充填体積）を２ｍｌの氷冷抽出バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）（またはトリス（ｐＨ８．０））、１００ｍＭのＫＣ１、２ｍＭのＤＴＴ（新鮮な１Ｍのストック由来）、的確な濃度の１個のＲｏｃｈｅ製プロテアーゼインヒビターカクテル（例えば１０ｍｌにつき１錠）に再懸濁させた。ポジティブ対照抽出物として、同様のサイズの酵母ペレットを同じ方法で処理した。
約５００μｌのベッドボリュームのジルコニウムビーズの入った２ｍｌのスクリューキャップバイアルに、その再懸濁液を移した。予冷したブロックで、再懸濁液にビーズビーティングを３回、１分間行って、細胞を破壊した。溶解細胞を２０，０００×ｇで４℃にて２０分遠心分離し、抽出バッファー（上記）で平衡化後、Ｚｅｂａミニカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、製品８９８８２）で上清を脱塩した。Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ検出キットでタンパク質濃度を測定した。基本的にＬｙｎｅｎ（１９６９） Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４：１７−３３の手順に従って、脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）アッセイを行った。すなわち、０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．６）、２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む２×バッファーストックを用いて、０．１ＭのＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．６）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、４０μＭのアセチル−ＣｏＡ、１１０μＭのマロニル−ＣｏＡ（ネガティブ対照アッセイでは除外した）、１８０μＭのＮＡＤＰＨ及び１ｍｇ／ＬのＢＳＡからなる作業ストックアッセイを作製した。続いて、上記のように調製した抽出物由来の総可溶性タンパク質５０〜１００μｇを各反応混合物に加えた。３４０ｎｍにおける１分当たりの吸光度の変化を測定し、それを用いて、酸化したＮＡＤＰＨの１分当たりのμｍｏｌを算出した（図３４）。興味深いことに、形質転換株で示された活性量は、ＧＦＰ蛍光曲線が右側にシフトしている程度とよく相関していた（図３５Ａ）。ツボカビＦＡＳ形質転換株６１６７−Ａは、ＧＥ−６８８９という株名に、６１６７−ＢはＧＥ６８９０という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２００−３３は、ＧＥ−６９４７という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２００−３３は、ＧＥ−６９４７という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２００−３８は、ＧＥ−６９４８という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２００−４３は、ＧＥ−６９４９という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２０１−４３は、ＧＥ−６９５０という株名にし、ＤｒＦＡＳ形質転換株６２０１−４８は、ＧＥ−６９５１という株名にした。
次に、培地に１３Ｃバイカーボネートまたは１３Ｃ標識アセテートのいずれかを加えた光栄養及び混合栄養増殖条件下で、これらの株を、インビボＦＡＳ率の決定のために解析した。培養物（各培養条件において、デュプリケートで行った）を約２７５μＥの光で１６：８の明暗サイクルに適合させ（光制限増殖）、約３．０のＯＤ７３０までＡｄａｐｔｉｓチャンバーで増殖させた。明期の開始前に、培養物を遠心分離し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で緩衝したとともに、１０ｍＭの１３Ｃ酢酸ナトリウムまたは２０ｍＭの１３Ｃバイカーボネートのいずれかを含むＰＭ０７４培地に、１．０のＯＤ７３０まで再懸濁させた（終体積２５０ｍｌ）。約２７５μＥの光を一方向から供給するＬＥＤアレイの前に培養物を置き、０時間後、１時間後、２時間後及び４時間後に、５０ｍｌの培養体積からＦＡＭＥ試料を採取した。基本的に米国特許出願公開第２０１５／０１９１５１５号（参照により、本明細書に援用される）に記載されているようにして、ＦＡＭＥを解析した。図３５Ａには、無機炭素が、培養培地における実質的に唯一の炭素源であった光独立栄養条件下で、ＧＥ−６８９０株が、ツボカビＦＡＳの完全浸透度での発現を示し（図３５Ａを参照されたい）、新たに合成された脂肪酸（ＦＡＭＥとして表されている）が対照よりも多く産生されたことが示されている。新たに合成された脂肪酸は、高い標識度合を示すとともに、標識実験中にデノボ合成された脂肪酸であり、伸長した脂肪酸は、既存の１６：ｘ及び１８：ｘ脂肪酸の伸長に起因する１〜４個の標識炭素を持つＣ２０：ｘ脂肪酸である。
ＧＥ−６８９０株は、図３３における浸透度プロファイルにおいて、野生型に対して右側にシフトした単一のピークが見られるＣｈｙｔＦＡＳ形質転換体株６１６７−Ｂである。ＧＥ−６８８９株（ＣｈｙｔＦＡＳ形質転換体株６１６７−Ａである）も、完全浸透度を示したが、図３３におけるＧＥ−６８８９（６１６７−Ａ）の浸透度プロファイルにおいては、ＧＥ−６８９０の蛍光ピークほどは、野生型に対して右側にシフトしていない単一のピークが現れている。無機炭素源のみを用いて、それらの株を培養する放射線標識実験においては、ＧＥ−６８８９株は、野生型を上回るＦＡＭＥ産生のいずれの増加も示さない。しかしながら、培養物が有機炭素源（１０ｍＭのアセテート）を含む混合栄養条件下で培養すると、ＧＥ−６８８９株は、野生型細胞よりも脂肪酸合成が向上し、これにより、この完全浸透性の株は、形質転換体ＧＥ−６８９０よりも活性が低いものの、混合栄養条件においてはＦＡＳ活性が向上することが示された（図３５Ｂ）。
ＤｒＦＡＳを発現する形質転換株に対して、ＦＡＳ活性について、１３Ｃバイカーボネートまたは１３Ｃ標識アセテートのいずれかを培地に加えた光栄養及び混合栄養増殖条件を用いて、それぞれ、完全浸透性の株ＧＥ−６９４７（形質転換株６２００−３３）、完全浸透性の株ＧＥ−６９４９（形質転換株６２００−４３）及び完全浸透性の株ＧＥ−６９５０（形質転換株６２０１−４３）の培養物で、同じ培養アッセイを行った。これらのアッセイは、上に詳述されているとおりに、各株においてデュプリケートの培養で行った。図３６Ａには、細胞質で発現するタイプＩ ＦＡＳが、脂肪酸の光独立栄養での産生を増加させなかったことが示されているが、異種のタイプＩ ＦＡＳコンストラクトを完全浸透度で発現する３個の株の全てが、野生型細胞よりも多くの脂肪酸（ＦＡＭＥとして測定）を産生した（図３６Ｂ）。

Claims (110)

  1. 以下の工程を含む、目的の外因性遺伝子を完全浸透度で発現する細胞株の生成方法：
    目的の遺伝子および検出可能マーカー遺伝子を含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、前記非天然の核酸分子を含む１つ以上の形質転換細胞株を得る工程；
    前記１つ以上の形質転換細胞株の少なくとも１つを培養して、少なくとも１つの形質転換細胞株の培養物をもたらす工程；ならびに
    前記目的の外因性遺伝子の完全浸透度での発現を同定するために、フローサイトメトリーを用いて、培養物において、前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する少なくとも１つの形質転換細胞株を同定する工程。
  2. 前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する形質転換細胞株を同定する工程が、前記少なくとも１つの形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形を、前記検出可能マーカーを発現しない対照培養物のフローサイトメトリーの波形と比較することを含み、形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形が、前記対照培養物の前記フローサイトメトリーの波形よりも高い蛍光レベルにシフトしている単一のピークを示すことによって、前記目的の遺伝子を完全浸透度で発現する形質転換細胞株が同定される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記非天然の核酸分子が、選択可能マーカー遺伝子を更に含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記選択可能マーカー遺伝子が、抗生物質耐性を付与する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記非天然の核酸分子を含む１つ以上の形質転換細胞株を得る工程が、選択培地上の形質転換コロニーを選択することによる、請求項３に記載の方法。
  6. 目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記検出可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、請求項１に記載の方法。
  7. 目的の遺伝子をコードする前記遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子が、別々のプロモーターに機能的に連結している、請求項１に記載の方法。
  8. 目的の遺伝子が、機能的なＲＮＡまたはポリペプチドをコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 目的の遺伝子が、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、シングルガイドＲＮＡ、キメラガイドＲＮＡ、ＲＮＡｉコンストラクト、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ配列、リボザイム、またはマイクロＲＮＡからなる群より選択される機能的なＲＮＡをコードする、請求項８に記載の方法。
  10. 目的の遺伝子が、酵素、リボソームタンパク質、構造タンパク質、分泌系の成分、トランスポーター、ポーリン、膜レセプター、ＤＮＡ結合タンパク質、リコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、転写因子、または細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択されるポリペプチドをコードする、請求項８に記載の方法。
  11. 前記検出可能マーカーが、蛍光タンパク質である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記検出可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項１に記載の方法。
  13. 前記選択可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項２に記載の方法。
  14. 前記選択可能マーカー遺伝子および前記検出可能マーカー遺伝子を含む配列が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項２に記載の方法。
  15. 前記非天然の核酸分子が、目的の遺伝子を２つ以上含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 目的の遺伝子を３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれより多く含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 少なくとも１つの目的の遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼをコードする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記部位特異的リコンビナーゼが、誘導性プロモーターに機能的に連結している、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記部位特異的リコンビナーゼが、ｃｒｅ、ｆｌｐ、またはＤｒｅである、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記検出可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記部位特異的リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記検出可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から切除する、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記核酸分子が選択可能マーカー遺伝子を含み、更に、前記選択可能マーカー遺伝子が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記部位特異的リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記選択可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から組み換え切除する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記核酸分子が選択可能マーカー遺伝子を含み、前記検出可能マーカー遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子を含む前記核酸配列が、部位特異的リコンビナーゼによって認識される部位に隣接している、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記リコンビナーゼの発現を誘発する工程を更に含み、それによって、前記検出可能マーカー遺伝子および前記選択可能マーカー遺伝子を前記核酸分子から切除する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記宿主細胞が真核宿主細胞である、請求項１に記載の方法。
  27. 前記宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記宿主細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記宿主細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記宿主細胞が藻類細胞である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記藻類細胞が、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（ＰｓｅｕｄｏＣｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記藻類細胞が、珪藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、及びタラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記藻類細胞が、ユースティグマトファイト細胞、任意で、エリプソイジオン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、及びヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記宿主細胞が、ラビリンチュラ類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項２９に記載の方法。
  35. 以下の工程を含む、高効率ゲノム編集用細胞株の生成方法：
    ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列と、検出可能マーカーをコードする核酸配列とを含む非天然の核酸分子を宿主細胞の集団に導入して、前記非天然の核酸分子を含む１つ以上のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株を得る工程；
    前記１つ以上のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の少なくとも１つを培養して、少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物をもたらす工程；
    フローサイトメトリーを用いて、前記少なくとも１つのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物を、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株の培養物の細胞における前記検出可能マーカーの発現について評価する工程；ならびに
    高効率ゲノム編集用細胞株を同定するために、前記細胞株の培養物において前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現するＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ形質転換細胞株を同定する工程。
  36. 前記検出可能マーカーを完全浸透度で発現する形質転換細胞株を同定する工程が、前記検出可能マーカーを発現しない対照培養物のフローサイトメトリーの波形を、前記少なくとも１つの形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形と比較することを含み、形質転換細胞株の培養物のフローサイトメトリーの波形が、前記対照培養物の前記フローサイトメトリーの波形よりも高い蛍光レベルにシフトしている単一のピークを示すことによって、前記目的の遺伝子を完全浸透度で発現する形質転換細胞株が同定される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、前記宿主細胞に対して異種である、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓタンパク質である、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩまたはタイプＶ Ｃａｓタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｂｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、これらのホモログ、及びこれらの改変型からなる群より選択されている、請求項３５に記載の方法。
  41. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、またはナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して少なくとも１つの変異を含む、請求項４２に記載の方法。
  45. 少なくとも１つの変異が、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａからなる群より選択されている、請求項４４に記載の方法。
  46. ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする前記核酸配列が、前記宿主菌株における発現用にコドン最適化されている、請求項３５に記載の方法。
  47. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含む、請求項３５に記載の方法。
  48. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、少なくともエピトープタグを含む、請求項３５に記載の方法。
  49. 前記エピトープタグが、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、またはＭｙｃタグである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記非天然の核酸分子が、選択可能マーカーを更に含む、請求項３５に記載の方法。
  51. 前記選択可能マーカーが、抗生物質または毒素に対する耐性を付与する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記検出可能マーカーをコードする前記核酸配列が、前記微生物株における発現用にコドン最適化されている、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記検出可能マーカーが、蛍光タンパク質である、請求項３５に記載の方法。
  54. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、Ｔｏｍａｔｏ、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、またはこれらのうちいずれかのバリアントであり、前記バリアントとしては、単量体バリアントが挙げられるが、これに限らない、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記検出可能マーカーおよび前記Ｃａｓ９タンパク質が、別々のタンパク質として産生される、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記選択可能マーカーをコードする前記遺伝子、および前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする前記遺伝子が、異なるプロモーターに機能的に連結されている、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記宿主細胞が、原核生物の宿主細胞である、請求項３５に記載の方法。
  58. 前記宿主細胞が、古細菌、シアノバクテリア、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、もしくは紅色非硫黄細菌の群のいずれか；または、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリア（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）属、デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）属、ジェオトガリコッカス（Ｊｅｏｔｇａｌｉｃｏｃｃｕｓ）属、キネオコッカス（Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ）属、ロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、もしくはザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属のいずれか；に属する種の細胞である、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記宿主細胞が、真核宿主細胞である、請求項３５に記載の方法。
  60. 前記宿主細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記宿主細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、またはＰＣ１２細胞である、請求項５９に記載の方法。
  62. 前記宿主細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項５９に記載の方法。
  63. 前記宿主細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、請求項５９に記載の方法。
  64. 前記宿主細胞が、藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記宿主細胞が、不等毛類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項６３に記載の方法。
  66. 完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  67. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項６６に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  68. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項６７に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  69. ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、少なくとも１０％である、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  70. ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、少なくとも２５％である、請求項６９に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  71. ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約５０％以上である、請求項７０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  72. ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約８０％以上である、請求項７１に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  73. ｇＲＮＡと、選択可能マーカーを含むドナーフラグメントとを用いたときの、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株の標的変異率が、約９０％以上である、請求項７２に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  74. 微生物株である、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  75. 前記微生物株が、真菌、メソミセトゾア、不等毛類、または藻類である、請求項７４に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  76. 前記微生物株が、真菌株、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の株である、請求項７４に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  77. 前記微生物株が、藻類株、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の株である、請求項７４に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  78. 前記微生物株が、不等毛類株、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の株である、請求項７４に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  79. 外因性の選択可能マーカー遺伝子を含まない、請求項６６〜７８のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  80. 外因性の検出可能マーカー遺伝子を含まない、請求項６６〜７９のいずれか一項に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  81. 部位特異的リコンビナーゼをコードする外因性遺伝子を含む、請求項７９または８０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  82. 前記部位特異的リコンビナーゼが、ｃｒｅ、ｆｒｔ、またはｄｒｅである、請求項７９または８０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  83. 前記部位特異的リコンビナーゼがｃｒｅである、請求項７９または８０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  84. 部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、宿主生物における発現用にコドン最適化されている、請求項７９または８０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  85. 部位特異的リコンビナーゼをコードする前記外因性遺伝子が、誘導性プロモーターに機能的に連結されている、請求項７９または８０に記載の完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株。
  86. 以下の工程を含む、細胞のゲノムのインビボ改変方法：
    少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡを発現させるための少なくとも１つのコンストラクトを、完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現細胞株または微生物株に導入する工程であって、前記ガイドＲＮＡが、前記細胞のゲノム内の部位を標的とする、工程；および
    前記ガイドＲＮＡで形質転換した細胞を、前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングする工程。
  87. ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列と、検出可能マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列とを含む少なくとも１つの非天然の核酸分子を細胞に導入して、前記少なくとも１つの非天然の核酸分子を含む形質転換体を得ること；
    少なくとも１つの形質転換体を培養すること；ならびに
    少なくとも１つの形質転換体の培養物についてフローサイトメトリーを行って、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現コンストラクトに関して完全浸透性の細胞株を同定すること；
    によって、前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株を得る、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、キメラガイドＲＮＡである、請求項８６または８７に記載の方法。
  89. 前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡである、請求項８６または８７に記載の方法。
  90. 前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株が、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするコンストラクトを更に含む、請求項８６に記載の方法。
  91. ｔｒａｃｒＲＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に導入する工程を更に含む、請求項８６に記載の方法。
  92. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記スクリーニングする工程が、ＰＣＲを行って、前記標的部位における変異を検出することを含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記スクリーニングする工程が、表現型スクリーニングを用いることを含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記標的部位への挿入のために、ドナーＤＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に形質転換する工程を更に含む、請求項８６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記ドナーＤＮＡ分子が、選択可能マーカーを含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための１つ以上の相同領域を含む、請求項９５に記載の方法。
  98. 前記ドナーＤＮＡ分子が、前記標的部位への組み換えのための相同領域を含まない、請求項９５に記載の方法。
  99. 前記ゲノム内の前記標的部位の改変についてスクリーニングする工程が、前記ドナーＤＮＡ分子の前記選択可能マーカーを発現する形質転換体を同定することを含む、請求項９５に記載の方法。
  100. ｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡを前記完全浸透性のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ発現株に導入する前に、前記ｔｒａｃｒＲＮＡと前記ｃｒＲＮＡをアニーリングさせる、請求項９１または９２に記載の方法。
  101. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項８６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、タイプＩＩまたはタイプＶ Ｃａｓエンドヌクレアーゼである、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｂｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、これらのホモログ、及びこれらの改変型からなる群より選択されている、請求項１０２のいずれか一項に記載の方法。
  104. 前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項１０３に記載の方法。
  105. 前記細胞が、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、クモ形類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞、両生動物細胞、鳥類細胞、甲殻類細胞、または原生動物細胞である、請求項８６〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃｖｌ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、またはＰＣ１２細胞である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記細胞が、真菌細胞、任意で、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、及びヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項１０５に記載の方法。
  108. 前記細胞が、メソミセトゾア細胞、不等毛類細胞、または藻類細胞である、請求項１０５に記載の方法。
  109. 前記細胞が、藻類細胞、任意で、アクナンテス（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）属、アンフィプローラ（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）属、アンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）属、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）属、アステロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、ボエケロビア（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）属、ボリドモナス（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）属、ボロジネラ（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）属、フウセンモ（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）属、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブラクテオコッカス（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、キートケロス（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）属、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）属、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）属、クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）属、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）属、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、クロオモナス（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）属、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリコスフェラ（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）属、クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属、キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）属、デスモデスムス（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）属、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）属、エリプソイドン（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）属、エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）属、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）属、エルノデスミウス（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）属、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属、ユースチグマトス（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）属、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）属、フラジラリア（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）属、フラジラリオプシス（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）属、グロエオサムニオン（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハンチア（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）属、ヘテロシグマ（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）属、ヒメノモナス（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）属、イソクリシス（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、レポシンクリス（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）属、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）属、モノダス（Ｍｏｎｏｄｕｓ）属、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）属、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）属、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロクロリス（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、ネフロセルミス（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）属、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）属、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属、サヤミドロ（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）属、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）属、オストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）属、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、パリエトクロリス（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、パスケリア（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）属、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）属、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）属、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）属、ファガス（Ｐｈａｇｕｓ）属、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）属、プラチモナス（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）属、プレウロクリシス（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）属、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）属、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）属、シュードスタウラストルム（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）属、ピラミモナス（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）属、ピロボトリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、シゾクラミデラ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）属、スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）属、スピロギラ（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）属、スチココッカス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）属、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）属、タラシオシラ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）属、トリボネマ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）属、フシナシミドロ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）属、ビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）属、ヴィシェリア（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）属、及びボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記細胞が、不等毛類細胞、任意で、ラビリンチュラ（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌａ）属、ラビリンチュロイデス（Ｌａｂｒｙｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）属、トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、アウランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ジャポノキトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ディプロフリス（Ｄｉｐｌｏｐｈｒｙｓ）属、及びウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属からなる群より選択される属の細胞である、請求項１０８に記載の方法。
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