JP6944697B2 - 糸状菌におけるゲノム編集を用いる多段階による多重変異株の製造方法 - Google Patents
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Description
[態様1]
糸状菌用のゲノム編集プラスミドベクターであって、
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNAをコードする遺伝子、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)ネガティブ選択マーカー遺伝子、
を含む前記プラスミドベクター。
[態様2]
ポジティブ選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、態様1記載のプラスミドベクター。
[態様3]
ネガティブ選択マーカー遺伝子が転写因子をコードする遺伝子であって、該遺伝子の過剰発現によって該遺伝子を保持する形質転換体の生育が阻害される作用を有することを特徴とする、態様1又は2記載のプラスミドベクター。
[態様4]
ネガティブ選択マーカー遺伝子が誘導性プロモーターと作動可能に連結されている、態様3記載のベクター。
[態様5]
ネガティブ選択マーカー遺伝子がAoace2であり、誘導性プロモーターがamyBプロモーターである、態様4記載のベクター。
[態様6]
糸状菌が麹菌である、態様1〜5のいずれか一項に記載のベクター。
[態様7]
麹菌が実用株である、態様6に記載のベクター。
[態様8]
糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法であって、
(A)態様1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAをコードする遺伝子が含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法。
[態様9]
態様8に記載の糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法に於いて、一連の繰り返し工程(C)に於ける最後の工程(C−2)は実施されないことを特徴とする、前記製造方法。
[態様10]
前記繰り返し工程(C)の一連の繰り返しにおける最後の工程(C−1)に於いて、態様1〜7のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターを用いる、態様9記載の製造方法。
[態様11]
全ての工程を通じて、使用されるゲノム編集プラスミドベクターに含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子及びネガティブ選択マーカー遺伝子は夫々一種類である、態様8〜10のいずれか一項に記載の方法。
[態様12]
工程(A)及び工程(C−1)に於ける選択培地がピリチアミンを含む、態様8〜11のいずれか一項に記載の方法。
[態様13]
工程(B)及び工程(C−2)に於ける選択培地がデキストリンを含む、請求項8〜12のいずれか一項記載の方法。
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNAをコードする遺伝子、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)ネガティブ選択マーカー遺伝子。
(A)本発明のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAをコードする遺伝子が含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法に係る。
即ち、該製造方法は、工程(A)→(B)→((C−1)→(C−2))n(nは1以上の整数)の順に実施される。
即ち、該製造方法は、工程(A)→(B)→((C−1)→(C−2))n →(C−1)(nは0以上の整数)の順に実施される。
1. 使用菌株、培地および形質転換
1-1使用菌株
大腸菌Escherichia coli
大腸菌組換えプラスミドの取得にはE. coli DH5α(F-, Φ80dlacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK -, mK +), phoA, supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1)を用いた。
麹菌Aspergillus oryzae
本発明で使用したA. oryzae菌株一覧を表1に示した。
E. coli DH5α用
LB培地: 1% Bacto tryptone、0.5% Yeast Extract、0.5% NaCl(プレート用寒天培地には2.0% Agarを含む。また必要に応じてampicillinを終濃度50 μg/mlとなるように添加した。)
形質転換体を選択するために、0.1 μg/mlのピリチアミン臭化水素酸塩を添加した。
CD(Glc)培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Glucose (pH 5.5)
CD(Dex)培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Dextrin (pH 5.5)
CD+Sorbitol培地:0.3% NaNO3, 0.2% KCl, 0.1% KH2PO4, 0.05% MgSO4・7H2O, 0.002% FeSO4・7H2O, 2% Glucose, 1.2 M sorbitol (pH 5.5)
2-1 PCR反応
各DNA断片の増幅には、ポリメラーゼとしてPrimeSTAR (TaKaRa)を用いた。また、A. oryzaeのコロニーPCRにはKOD FX Neo (TOYOBO)を用いた。反応液の組成は全て添付の説明書に従った。
98℃ 30 sec, {94℃ 15 sec, 55℃ 15 sec, 72℃ 1 kb/min; 30 cycle}, 16℃
KOD FX Neo温度条件
94℃ 2 min, {94℃ 15 sec, 68℃ 2 kb/min; 35 cycle}, 16℃
テンプレートには、20 μlスケールあたり50 μl TEに白金耳懸濁した溶液2 μlを用いた。
本発明で使用したプライマーは表2、プラスミドは表3に示した。
遺伝子をamyB遺伝子のプロモーター(PamyB)制御下で発現するためのベクターpUtNANは、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーpUC19-niaD3_FとniaD3-PaB_Rを用いて増幅したniaD遺伝子ORFの一部とその下流を含む1.8 kbのDNA断片、プライマーniaDd-TaB_FとpUC19nDAADnD_Rを用いて増幅したniaD遺伝子下流の1.6 kbのDNA断片、プライマーTaB-PaB_FとTaB-niaDd_Rを用いて増幅したamyB遺伝子のターミネーター(TamyB)からなる0.3 kbのDNA断片、pUNA (Wada et al., 2014)をテンプレートとしプライマーPaB-niaD3_FとPaB-TaB_Rを用いて増幅したPamyBからなる0.6 kbのDNA断片の4つのDNA断片をプライマーpUC19-niaD3_FとpUC19nDAADnD_Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit (Clontech)を用いてBamHI消化したpUC19 (TaKaRa)と連結することで作製した。
PamyB制御下でAoace2を発現するためのプラスミドpUtNAa2Nは、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーpUNA′Aoace2ORF_FとpUNA′Aoace2ORF_Rを用いて増幅したAoace2のORFからなる2.3 kbのDNA断片を、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したpUtNANと連結することで作製した。
pPTRIIをテンプレートとしプライマー19IF-ptrA-Fと19IF-mAMA1-Rを用いてPCRにより増幅したプラスミドの自律複製を可能とするA. nidulans由来のDNA断片AMA1の約半分とピリチアミン耐性遺伝子ptrAを含む5.0 kbのDNA断片をIn-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてBamHI消化したpUC19と連結し、ppAsAを作製した。次に、A. oryzae RIB40株の染色体DNAをテンプレートとしプライマーIF-Ptef1FとPtef1Rを用いて増幅したtef1遺伝子のプロモーターからなる1.3 kbのDNA断片とpUNAFNcas9 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーPtef1-FNC9FとTamyBRで増幅したcas9とamyB遺伝子のターミネーターからなる4.4 kbのDNA断片をプライマーIF-Ptef1FとTamyBRを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いて連結したDNA断片をHindIII消化したppAsAと連結することでppAsATC9を作製した。さらに、pUtNAa2NをテンプレートとしプライマーsApAIF-PamyBとace2mRを用いて増幅したPamyBとAoace2の前半を含む1.8 kbのDNA断片とプライマーace2mFとsApAIF-TamyBRを用いて増幅したAoace2の後半とTamyBを含む1.3 kbのDNA断片をプライマーsApAIF-PamyBとsApAIF-TamyBRを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9と連結することでppAsATC9a2(図1)を作製した。
ゲノム編集によってmelB遺伝子(固体培養特異的に発現するチロシナーゼ遺伝子、尚、チロシナーゼはメラニン合成に関わる酵素であり、酒粕の褐変化の原因である)に変異を導入するためのプラスミドベクターppAsATC9a2gmB(図2)は、pUNAFNC9gwA1 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーSmaIIF1-PU6FとgmB-PU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のプロモーターからなる0.6 kbのDNA断片とプライマーgmB-TU6-FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のターミネーターからなる0.2 kbのDNA断片をプライマーSmaIIF1-PU6FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9a2と連結することで作製した。
ゲノム編集によってmelO遺伝子(液体培養特異的に発現するチロシナーゼ遺伝子)に変異を導入するためのプラスミドppAsATC9a2gmO(図5)は、pUNAFNC9gwA1 (Katayama et al., 2016)をテンプレートとしプライマーSmaIIF1-PU6FとgmO-PU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のプロモーターからなる0.6 kbのDNA断片とプライマーgmO-TU6-FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて増幅したU6遺伝子のターミネーターからなる0.2 kbのDNA断片をプライマーSmaIIF1-PU6FとpAsATC9a2-TU6-Rを用いて連結後、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kitを用いてSmaI消化したppAsATC9a2と連結することで作製した。
大腸菌プラスミドDNAの調製は、アルカリSDS法により行った。
ファスマック社による受注シークエンスを行った。
大腸菌の形質転換はInoueら(Inoue et al., 1990)の方法に従った。
A. oryzaeの形質転換はプロトプラストPEG法を用い、以下のように行った。
親株を20 mlのCD(Glc) 液体培地を用いて30℃で18〜20時間振盪培養し、ミラクロス(EMD Millipore)を用いて菌体を回収した。
回収した菌体を滅菌水で洗浄後、5 ml TF Solution 1 (1% Yatalase (TaKaRa), 0.6 M (NH4)2SO4, 50 mM Maleate buffer (pH 5.5))により30℃で3時間処理してプロトプラスト化した。
ミラクロスを用いてプロトプラストを回収して5 ml TF Solution 2 (1.2 M Sorbitol, 50 mM CaCl2, 35 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、遠心して沈殿を回収する。同様の操作でプロトプラストをさらに2回洗い、1.0-5.0×107個/ mlとなるようにTF Solution 2 に懸濁した。
200 μlのプロトプラスト懸濁液に数ng/μlの形質転換用DNAを10 μl加えて、氷中に30分間静置する。
500、850 μlと2回に分けてTF Solution 3 (60% PEG4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5))を加え、室温で25分間静置した。
懸濁液をあらかじめ45℃で保温しておいたTop agar (1.2 M Sorbitol, 0.8% Agar入り選択培地)と混和して下層培地 (1.2 M Sorbitol, 1.5% Agar入り選択培地)に重層する。30℃で3-7日間培養して形質転換体を取得し、選択培地で2回植え継ぐことにより、形質を安定させた。
対象とするA. oryzae株の全DNAを0.6%アガロースゲルで電気泳動を行った。必要に応じて全DNAは一晩制限酵素処理することにより断片化した。その後の操作は、AlkPhos Direct Labelling and Detection system(GEヘルスケア)及びを用いて、説明書に従って行った。また、バンドの検出には、ルミノイメージアナライザーLAS-4000mini (Fujiflim)を用いた。トランスファーは一晩、メンブレンの乾熱固定は80℃で 1時間、プレハイブリダイゼーション1時間そしてハイブリダイゼーション 8時間もしくは一晩で行った。
(1)ゲノム編集ベクターの構築
条件依存的に菌体からの脱落が可能なベクターppAsATC9a2を構築した(図1)。CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集に必要とされるCas9ヌクレアーゼは、A. oryzaeの翻訳伸長因子EF-1-alphaをコードするtef1のプロモーター制御下で発現させた。Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子はA. oryzaeで発現させるためにコドンを改変した。さらに、Cas9ヌクレアーゼを核に局在させるためにcas9遺伝子の5′-、3′-両末端にシミアンウイルス40に由来する核局在シグナル(SV40NLS)をコードする配列を付加したものを用いた。また、条件依存的にプラスミドを脱落させるため、その高発現により生育が著しく悪化するAoace2遺伝子を炭素源の違いにより誘導、抑制が可能なamyBプロモーターの制御下で発現させた。さらに形質転換用の選択マーカーにはピリチアミン耐性遺伝子ptrAを用い、プラスミドの自律複製を可能とするA. nidulans由来のDNA断片AMA1の約半分をプラスミドに挿入した。
melB遺伝子に変異を導入するため、melB遺伝子のコード領域内から21塩基の標的配列(配列番号1:GCATGGACACGACAATACCCA)を選択し、この配列にCas9ヌクレアーゼを標的配列に誘導するためのガイドRNAを、核内低分子RNAをコードするU6遺伝子のプロモーターとターミネーターの制御下で発現するゲノム編集プラスミドベクターppAsATC9a2gmBを設計した(図2)。
A. oryzae RIB128株にppAsATC9a2gmBを形質転換によって導入した。得られた形質転換体を、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地で2回植え継ぐことによって形質を安定させた。コロニーPCRによって標的配列を含むDNA断片を増幅し、シークエンス解析することによって、得られた形質転換体2株のいずれのmelB遺伝子にも変異(塩基配列の欠損)が確認された。更に、それら変異株の一つについてはmelB遺伝子中に22塩基の欠損を持つ株(RIB128mBC9)であることを確認した(図3)。
RIB128mBC9株をCD(Dex)培地で培養することでAoace2の発現を誘導し、ppAsATC9a2gmBが脱落した株を選択した。CD(Dex)培地での培養は植え継ぎにより2回行った。CD(Dex)培地で生育した株を単離し、RIB128mBと命名した。RIB128mB株ではRIB128mBC9株の持つmelB遺伝子内の変異が保持されていることもシークエンス解析によって確認された(図3)。RIB128mB株ではサザン解析によりプラスミド由来のDNA断片のバンドが検出されないこと(図4b)、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地では生育できないことを確認した(図4c)。これらの結果から、RIB128mB株ではゲノム編集プラスミドベクターppAsATC9a2mBが脱落していることが示された。
melO遺伝子に変異を導入するため、melO遺伝子のコード領域内から21塩基の標的配列(配列番号2:GATTCAAGACCCCGCGAGAAC)を選択し、この配列にCas9ヌクレアーゼを標的配列に誘導するためのガイドRNAをU6プロモーターとターミネーターの制御下で発現するゲノム編集プラスミドppAsATC9a2gmOを設計した(図5)。
RIB128mB株にppAsATC9a2gmOを形質転換によって導入した。得られた形質転換体を、ピリチアミンを含むCD+Sorbitol培地で2回植え継ぐことによって形質を安定させた。コロニーPCRによって標的配列を含むDNA断片を増幅し、シークエンス解析することによって、得られた形質転換体6株のいずれのmelO遺伝子にも変異(塩基配列の欠損)確認された。更に、それら変異株の一つがmelO遺伝子中に2塩基の欠損を持つ株(RIB128mBmOC9)であることを確認した(図6)。又、RIB128mBmOC9株はmelB遺伝子内の変異も保持されている多重変異株であることもシークエンス解析によって確認された(図3)。
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Claims (12)
- 糸状菌用のゲノム編集プラスミドベクターであって、
(1)Cas9ヌクレアーゼをコードする遺伝子、
(2)1つ又は複数の異なるゲノム標的部位の夫々に対するガイドRNAをコードする遺伝子、
(3)ポジティブ選択マーカー遺伝子、及び
(4)Aoace2であるネガティブ選択マーカー遺伝子、
を含む前記プラスミドベクター。 - ポジティブ選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子である、請求項1記載のプラスミドベクター。
- ネガティブ選択マーカー遺伝子が誘導性プロモーターと作動可能に連結されている、請求項1又は2記載のベクター。
- 誘導性プロモーターがamyBプロモーターである、請求項3記載のベクター。
- 糸状菌が麹菌である、請求項1〜4のいずれか一項に記載のベクター。
- 麹菌が実用株である、請求項5に記載のベクター。
- 糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法であって、
(A)請求項1〜6のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターにより糸状菌を形質転換し、得られた形質転換体をポジティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって形質を安定させ、該ゲノム編集プラスミドベクターに含まれるCas9ヌクレアーゼ及びガイドRNAの作用によって該形質転換体の1つ以上のゲノム標的部位に変異を導入する工程;
(B)前の工程で得られた変異株をネガティブ選択マーカー遺伝子用の条件下で培養することによって、該変異株から前記ゲノム編集プラスミドベクターを脱落させる工程;並びに
(C)以下の工程から成る繰り返し工程:
(C−1)工程(B)で得られた変異株を用いて工程(A)を実施することによって、新たなゲノム標的部位に変異を導入する工程であって、ゲノム編集プラスミドベクターには、以前の工程で用いられたいずれのガイドRNAとも異なるゲノム標的部位に対する1つ以上のガイドRNAをコードする遺伝子が含まれる、前記工程;及び
(C−2)工程(B)を実施することによって、工程(C−1)で用いたゲノム編集プラスミドベクターが脱落した多重変異株を得る、前記工程;
を含む前記製造方法。 - 請求項7に記載の糸状菌におけるゲノム編集を用いた多段階による多重変異株の製造方法に於いて、一連の繰り返し工程(C)に於ける最後の工程(C−2)は実施されないことを特徴とする、前記製造方法。
- 前記繰り返し工程(C)の一連の繰り返しにおける最後の工程(C−1)に於いて、請求項1〜6のいずれか一項に記載のゲノム編集プラスミドベクターを用いる、請求項8記載の製造方法。
- 全ての工程を通じて、使用されるゲノム編集プラスミドベクターに含まれるポジティブ選択マーカー遺伝子は一種類である、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(A)及び工程(C−1)に於ける選択培地がピリチアミンを含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(B)及び工程(C−2)に於ける選択培地がデキストリンを含む、請求項7〜11のいずれか一項記載の方法。
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