CN110592073A - 一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体,并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9,定向遗传改造米曲霉基因的方法,该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响,提高了基因编辑效率,并且能够产生无标记(Marker‑Free)的米曲霉工程菌,免除对转基因的担忧,提高转基因改造米曲霉的实用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术的基因工程领域,具体涉及利用CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法。
背景技术
米曲霉用于酱油、米酒等食品发酵已有悠久的历史,因此被认为是国际公认的食品安全级的真菌。2005年米曲霉基因组测序工作的完成,为加快遗传改造米曲霉,使其成为高效生产酶制剂、真菌代谢产物的理想菌株奠定了基础。但由于米曲霉多核,表型多变,对常用筛选标记药物不敏感,导致遗传改造米曲霉进展缓慢,工业生产应用受限。
当前米曲霉遗传操作的成功与否依赖于两个因素:第一个是筛选标记的选择;第二个是同源同组的效率问题。由于米曲霉对多种抗性药物不敏感,使得米曲霉遗传转化筛选主要依赖于营养缺陷型菌株的构建,而营养缺陷型菌株的构建费时,工作量大,其效率取决于同源重组的效率。目前研究表明,敲除参与非同源重组途径的基因能够促进同源重组效率,这些基因主要有ku70,ku80,LigD。因此,为了提高米曲霉遗传操作,常常需要构建ku70,ku80,LigD和营养双缺陷菌株。而且,对于工业应用中常需要转化多个基因,这样就需要构建包含多个营养缺陷的菌株,这无疑加大了遗传改造米曲霉的难度。此外,多个营养缺陷筛选标记的构建势必造成宿主菌株表型和代谢的改变,这对于后续利用该遗传改造的菌株造成影响。
利用CRISPR-Cas系统在真菌中进行基因编辑,能够很好的解决上述问题。首先CRISPR-Cas系统敲除基因的效率不依赖于同源同组,这样免去了敲除ku70,ku80,LigD的繁琐;其二,CRISPR-Cas系统可利用一个营养缺陷筛选标记完成对多个基因的遗传改造。这些恰好解决了上述传统的同源重组改造米曲霉的困难。但CRISPR-Cas系统也有一些弊端。例如CRISPR-Cas表达盒若插入到异染色质上,引起Cas9表达量低,造成基因编辑效率低;在米曲霉中常利用α淀粉酶诱导型启动子amyB启动表达Cas9,该启动子受培养基中碳源类型诱导表达,而碳源类型对米曲霉的生长影响大,从而影响后续转基因表型鉴定;无法形成无标记(Marker-Free)的工程菌株,引起人们对转基因的担忧。为了解决上述CRISPR-Cas系统的问题,本发明通过利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体,并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9,使cas9的表达不受插入位点及培养基组分影响,提高基因编辑效率,并能够形成Marker-Free工程菌株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何高效的遗传改造米曲霉基因。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了一种基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法。
本发明所提供的基于CRISPR技术定向突变米曲霉基因的方法中,所包括的步骤如下:
1)以cas9序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)为参考,人工合成cas9基因,其核苷酸序列为序列1所示的DNA分子;以上述人工合成的cas9基因为模板,以序列SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得的cas9 DNA分子重组连接到载体pEX1上(该载体出自于Nguyen等人(2016)World J Microbiol Biotechnol,32:204)。所述重组载体为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体pEX1-cas9。pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA,序列1所示的cas9基因,trpC基因终止子(TtrpC)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒,即PgpdA-cas9-TtrpC。
2)以上述cas9蛋白表达盒PgpdA-cas9-TtrpC为模板,以序列SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得的cas9蛋白表达盒重组连接到载体pPTR II上(日本TaKaRa公司,Code No.3622)。所述重组载体为在载体pPTR II的HindIII多克隆位点上插入PgpdA-cas9-TtrpC表达盒,得到重组载体pPTR II-cas9,其中载体pPTR II是一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体。
3)以米曲霉RIB40基因组DNA为模板,以序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得序列3所示的U6启动子(U6 promoter)融合靶基因向导序列(guide sequence),其中SEQ ID NO:6的DNA片段含有靶基因的向导序列(20个碱基),从而在该融合DNA分子3’端融合了靶基因的向导序列,形成U6 promoter+guide sequence的融合DNA分子;以人工合成向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)和U6终止子序列(Katayama等人(2016)Biotechnol Lett 38:637–642)为参考,人工合成sgRNA融合U6终止子(U6terminator)的融合DNA分子,其核苷酸序列为序列4所示的DNA分子,并以此为模板,以SEQID NO:7,SEQ ID NO:8的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子,其中SEQ ID NO:7的DNA片段含有靶基因的向导序列(20个碱基),从而在该融合DNA分子5’端融合了靶基因的向导序列,形成guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子;以上述扩增的U6 promoter+guide sequence,guide sequence+sgRNA+U6 terminator融合DNA分子为模板,以SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8的DNA片段为引物,执行重叠PCR扩增获得的U6 promoter+guide sequence+sgRNA+U6terminator表达盒重组连接到载体pPTR II上。所述重组载体为在载体pPTR II的SmalI多克隆位点上插入U6 promoter+guidesequence+sgRNA+U6terminator表达盒,得到重组载体pPTR II-cas9-guide sequence。
4)米曲霉(RIB40或3.042)孢子接种到液体DPY培养基中,培养16-20h后收集菌丝,并用无菌水洗2次。用Yatalase酶法裂解上述菌丝,获取原生质体。将提取好的重组载体与原生质体混匀,加上60%PEG 4000进行原生质体转化,室温静置20min后,离心收集原生质体,并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素,0.8%琼脂的MM培养基混匀,平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素,1.5%琼脂MM培养基平板上,30℃培养3-4天。
5)挑取上述MM培养基长出的菌丝,转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上,进行二次筛选。
6)选取上述长满菌丝的的CD平板,挑取菌丝,以SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,比对测序结果看是否在靶基因的向导序列上发生突变。
7)为获得无标记(Marker-Free)的阳性菌株,将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培养基上再连续培养四轮,挑取菌丝,以SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12的DNA片段为引物执行PCR扩增,检测米曲霉是否还含有pPTR II-cas9载体,并再次对靶基因的向导序列进行测序。
作为优选,步骤1)中cas9由组成型启动子PgpdA启动表达。
作为优选,步骤2)利用pPTR II载体中的AMA1基因,实现在Aspergillus属真菌内进行自主复制。
作为优选,步骤3)中序列SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7含有互补的20bp重叠序列,该序列恰好为靶基因向导序列。
作为优选,步骤3)中的重叠PCR具体程序为:取PCR产物各2μl,加上Buffer、dNTPs、酶,退火温度为50℃,扩增5次后,再添加引物和补充0.5μl酶,退火温度改为60℃,继续扩增30个循环。
作为优选,步骤4)中的MM培养基的组分为:0.2%NH4Cl,0.1%(NH4)2SO4,0.05%KCl,0.05%NaCl,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.002%FeSO4·7H2O,2%glucose,0.15%methionine,l.2M sorbitol,pH 5.5
作为优选,步骤4)中液体DPY培养孢子,最好不要超过20h,否则影响后续的原生质体转化效率。
作为优选,步骤4)中提取的质粒(重组载体)必须用去内毒素的方法提取纯化,这样有利于提高原生质体转化效率。
作为优选,步骤7)通过多轮筛选,获得无标记(Marker-Free)的米曲霉工程菌。
本发明的有益效果
本发明提供了利用一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体,并通过组成型启动子PgpdA启动表达cas9,定向遗传改造米曲霉基因的方法,该方法消除了载体插入位点和培养基组分对cas9表达的影响,提高了基因编辑效率,并且能够产生无标记(Marker-Free)的米曲霉工程菌,免除对转基因的担忧,提高转基因改造米曲霉的实用性。
附图说明
图1为PgpdA-cas9-TtrpC表达盒的构建过程。
图2为pPTR II-cas9载体构建过程。
图3为pPTR II-cas9-AozfpB载体构建过程。
图4筛选培养基生长的转化子。
图5为转化子的鉴定。
图6为无标记(Marker-Free)CRISPR-AozfpB工程菌的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
利用pPTR II-cas9自主复制载体定向敲除米曲霉基因AozfpB
1、自主复制载体pPTR II-cas9-AozfpB的构建
将载体pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的片段替换为序列1所示的DNA分子,得到重组载体,将该重组载体命名为pEX1-cas9。pEX1-cas9与pEX1的差别仅在于:pEX1-cas9为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体。pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA,序列1所示的cas9基因,trpC基因终止子(TtrpC)三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒,即PgpdA-cas9-TtrpC表达盒(图1)。
在自主复制的穿梭载体载体pPTR II的HindIII多克隆位点上插入序列2所示的cas9蛋白表达盒(PgpdA-cas9-TtrpC表达盒),得到重组载体pPTR II-cas9(图2)。
以米曲霉RIB40基因组DNA为模板,利用引物PU6-F:CTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA、PU6-AozfpB-R:TTGCATCTCTGGATCCACTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA,扩增获得序列3所示的U6启动子融合AozfpB的向导序列(U6promoter+AozfpB guidesequence)(图3A);以序列4所示的DNA分子为模板,利用引物TU6-AozfpB–F:CAGTGGATCCAGAGATGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA、TU6-R:GAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子的DNA分子,并在该融合DNA分子5’端融合了AozfpB的向导序列,形成AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子(图3A);以上述扩增的U6 promoter+AozfpB guide sequence,AozfpB guide sequence+sgRNA+U6terminator融合DNA分子为模板,以PU6-F,TU6-R为引物,进行重叠PCR扩增,获得U6 promoter+AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒(图3B)。在自主复制的穿梭载体载体pPTR II的SmalI多克隆位点上插入U6 promoter+AozfpB guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒,得到重组载体pPTR II-cas9-AozfpB(图3C)。
2、米曲霉的原生质体转化
将步骤1的pPTR II-cas9-AozfpB质粒转化米曲霉RIB40,具体方法为:
(1)将米曲霉RIB40的孢子接种到100ml的液体DPY培养基中,200rpm,30℃培养16-20小时;
(2)用灭菌的双层擦镜纸过滤收集上述DPY培养基培养的菌球,并用无菌水洗涤2次,沥干;
(3)将步骤(2)洗涤沥干后的菌丝转移至过滤除菌的10ml Yatalase酶裂解液(Solution I)中,50rpm,30℃裂解3小时;
Yatalase酶裂解液组分:50mM maleic acid(pH 5.5),1%Yatalase
(TaKaRa),0.6M(NH4)2SO4;
(4)裂解完毕后,加入等体积的Solution II到步骤(3)的酶裂解中,用手摇晃数次,将上述酶液通过灭菌的双层擦镜纸过滤,用圆底管收集过滤液,1000rpm,8min,4℃,收集沉淀。用Solution II溶液洗涤沉淀一次,再离心收集,放在冰上,备用(图4A);
Solution II组分:1.2M sorbitol,50mM CaCl2·2H2O,35mM NaCl,10mM Tris–HCl(pH 7.5);
(5)将~3μg质粒与200μl原生质体混匀,放在冰上静置30min;
(6)向上述混合液中依次加入250,250,850μl新鲜制备的PEG溶液,每次加入后都轻轻混匀,最后黑暗条件下室温孵育20min;
PEG溶液组分:60%(W/V)PEG 4000,50mM CaCl2·2H2O,10mM Tris–HCl(pH 7.5)
(7)孵育后,缓慢的加入5–10ml Solution II溶液,并轻轻的上下颠倒离心管混匀以终止反应,1000rpm,8min,4℃,收集原生质体;
(8)加入1ml Solution II溶液重悬原生质体,并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素,0.8%琼脂的MM培养基混匀,平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素,1.5%琼脂MM培养基平板上,30℃培养3-4天(图4B)。
MM培养基的组分:0.2%NH4Cl,0.1%(NH4)2SO4,0.05%KCl,0.05%NaCl,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.002%FeSO4·7H2O,2%glucose,0.15%methionine,l.2Msorbitol,pH 5.5
(9)挑取上述MM培养基长出的菌丝,转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上,进行二次筛选(图4C)。
3、转化子的鉴定
选取上述长有菌丝的CD平板,挑取菌丝,转到50μl的水中,混匀;微波炉高火加热4min,冰中放置2min;吸取2μl作为模板,以SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,比对测序结果看是否在向导序列上发生突变,结果如图5所示,米曲霉基因AozfpB的向导序列出现了一个碱基的缺失,该缺失位点恰好位于PAM序列前3bp的位置。
为获得无标记(Marker-Free)的阳性菌株,将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培养基上再连续培养四轮,挑取菌丝,以SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12的DNA片段为引物执行PCR扩增,检测CRISPR-AozfpB工程菌是否还含有pPTR II-cas9-AozfpB载体(是否能够扩增出载体上面的PU6_AozfpB_sgRNA_TU6片段,并以pPTR II-cas9-AozfpB载体为对照),并再次对AozfpB的向导序列进行测序。结果显示:经过总共六轮的筛选,CRISPR-AozfpB米曲霉工程菌中的pPTR II-cas9-AozfpB载体已检测不到(图6),而AozfpB的向导序列依然出现了一个碱基缺失(图5),因此成功获得了Marker-Free的阳性菌株。
序列表
<110> 江西科技师范大学
<120> 一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4218
<212> DNA
<213> 序列1(xulie1)
<400> 1
atggattaca aggatgacga cgataagatc atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt 60
atccacggag tcccagcagc cgacaagaag tactccatcg gtctcgacat cggtaccaac 120
tccgtcggtt gggccgtcat caccgacgag tacaaggtcc cctccaagaa gttcaaggtc 180
ctcggtaaca ccgaccgtca ctccatcaag aagaacctca tcggtgccct cctcttcgac 240
tccggtgaga ccgccgaggc cacccgtctc aagcgtaccg cccgtcgtcg ttacacccgt 300
cgtaagaacc gtatctgcta cctccaggag atcttctcca acgagatggc taaggtcgat 360
gactccttct tccaccgtct cgaggagtcc ttcctcgtcg aggaggataa gaagcacgag 420
cgtcacccca tcttcggtaa catcgtcgac gaggtcgcct accacgagaa gtaccccacc 480
atctaccacc tccgtaagaa gcttgtcgac tctactgata aggctgacct tcgtctcatc 540
tacctcgccc tcgcccacat gatcaagttc cgtggtcact tcctcatcga gggtgacctc 600
aaccctgaca actccgatgt cgacaagctc ttcatccagc tcgttcagac ttacaaccag 660
ctcttcgaag agaaccccat caacgcttcc ggtgttgacg ccaaggccat cctctccgct 720
cgtctctcca agtcccgtcg tctcgagaac ctcatcgctc agctccctgg tgagaagaag 780
aacggtctct tcggtaacct tatcgccctc tctctcggtc tcacccccaa cttcaagtcc 840
aacttcgacc tcgccgagga tgccaagctt cagctctcca aggacaccta cgatgacgat 900
ctcgacaacc tcctcgccca gatcggtgac cagtacgctg acctcttcct tgccgctaag 960
aacctctccg acgccatcct cctctccgat atcctccgtg tcaacaccga gatcaccaag 1020
gctcccctct ccgcttctat gatcaagcgt tacgatgagc accaccagga cctcactctt 1080
ctcaaggccc ttgtccgtca gcagctccct gagaagtaca aggagatctt cttcgatcag 1140
tccaagaacg gttacgccgg ttacatcgac ggcggtgctt cccaggagga gttctacaag 1200
ttcatcaagc ccatcctcga gaagatggac ggtaccgagg agctcctcgt caagctcaac 1260
cgtgaggatc tcctccgtaa gcagcgtact ttcgacaacg gttccatccc ccaccagatc 1320
caccttggcg aactccacgc tatcctccgt cgtcaggagg acttctaccc cttcctcaag 1380
gacaaccgtg agaagatcga gaagatcctc accttccgta tcccctacta cgttggcccc 1440
ctcgcccgtg gtaactcccg tttcgcctgg atgactcgta agtccgaaga gaccatcact 1500
ccctggaact tcgaggaagt cgtcgataag ggtgcctctg cccagtcctt catcgagcgt 1560
atgactaact tcgacaagaa cctccctaac gagaaggtcc ttcctaagca ctctctcctt 1620
tacgagtact tcactgttta caacgagctc accaaggtca agtacgtcac cgaaggtatg 1680
cgtaagcccg ccttcctctc tggtgagcag aagaaggcta tcgtcgacct cctcttcaag 1740
accaaccgta aggttaccgt caagcagctc aaggaagact acttcaagaa gatcgagtgc 1800
ttcgactccg ttgagatctc cggtgtcgag gatcgtttca acgcttccct cggtacctac 1860
cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag gacttcctcg acaacgagga gaacgaggac 1920
atccttgagg acatcgtcct cacccttacc ctcttcgagg atcgtgagat gatcgaagaa 1980
cgtctcaaga cttacgctca cctcttcgac gacaaggtca tgaagcagct caagcgtcgt 2040
cgttacactg gttggggccg tctctcccgt aagctgatca acggcatccg tgacaagcag 2100
tctggtaaga ctatcctcga cttccttaag tccgatggtt tcgccaaccg taacttcatg 2160
cagctcatcc acgacgactc tctcaccttc aaggaggaca tccagaaggc tcaggtttcc 2220
ggtcagggtg actcccttca cgagcacatc gctaacctcg ccggttcccc cgctatcaag 2280
aagggtatcc tccagaccgt taaggtcgtc gatgagctcg tcaaggttat gggtcgtcac 2340
aagcccgaga acatcgttat cgagatggcc cgtgagaacc agactaccca gaagggtcag 2400
aagaactctc gtgaacgtat gaagcgtatc gaggagggta tcaaggaact cggctcccag 2460
atccttaagg agcaccccgt cgagaacacc cagcttcaga acgagaagct ctacctctac 2520
tacctccaga acggccgtga catgtacgtt gatcaggagc tcgacatcaa ccgtctctcc 2580
gactacgacg tcgatcacat cgtcccccag tccttcctca aggatgactc tatcgacaac 2640
aaggtcctca cccgttccga taagaaccgt ggcaagtctg acaacgtccc ctccgaagag 2700
gttgtcaaga agatgaagaa ctactggcgt cagcttctca acgccaagct catcacccag 2760
cgtaagttcg ataacctcac taaggctgaa cgtggtggcc tctctgagct cgacaaggcc 2820
ggcttcatca agcgtcagct tgttgagact cgtcagatca ccaagcacgt cgcccagatt 2880
ctcgactctc gcatgaacac caagtacgat gagaacgaca agctcatccg tgaggtcaag 2940
gttatcactc tcaagtctaa gctcgtctcc gacttccgta aggacttcca gttctacaag 3000
gtccgtgaga tcaacaacta ccaccacgcc cacgatgcct acctcaacgc tgtcgttggc 3060
actgctctta tcaagaagta ccccaagctt gagtccgagt tcgtctacgg tgactacaag 3120
gtctacgatg ttcgtaagat gatcgctaag tccgagcagg agatcggtaa ggccaccgct 3180
aagtacttct tctactccaa catcatgaac ttcttcaaga ccgagatcac cctcgccaac 3240
ggtgagatcc gtaagcgtcc cctcatcgag accaacggtg agactggtga gatcgtctgg 3300
gacaagggtc gtgacttcgc cactgtccgt aaggtcctct ccatgcccca ggtcaacatc 3360
gtcaagaaga ccgaggtcca gaccggtggc ttctccaagg aatctatcct ccccaagcgt 3420
aactccgaca agctcatcgc tcgcaagaag gactgggacc ccaagaagta cggcggtttc 3480
gactctccca ctgtcgctta ctccgtcctc gttgtcgcca aggtcgagaa gggtaagtct 3540
aagaagctca agtccgtcaa ggagctcctc ggcatcacca tcatggagcg ttcctccttc 3600
gagaagaacc ccatcgactt cctcgaggcc aagggttaca aggaggtcaa gaaggacctc 3660
atcatcaagc ttcccaagta ctccctcttc gagcttgaga acggtcgtaa gcgtatgctc 3720
gcttccgccg gtgagctcca gaagggtaac gagctcgctc tcccctccaa gtacgtcaac 3780
ttcctctacc tcgcctccca ctacgagaag ctcaagggtt ctcccgaaga caacgagcag 3840
aagcagctct tcgtcgagca gcacaagcac taccttgatg agatcatcga gcagatctcc 3900
gagttctcca agcgtgtcat cctcgccgac gctaacctcg ataaggtcct ctccgcttac 3960
aacaagcacc gtgacaagcc catccgtgag caggctgaga acatcatcca cctcttcact 4020
ctcaccaacc ttggtgcccc tgctgccttc aagtacttcg acaccaccat cgaccgtaag 4080
cgttacacct ctaccaagga ggtcctcgac gccactctca tccaccagtc cattaccggt 4140
ctctacgaga ctcgtatcga cctctctcag ctcggtggtg actcccgtgc tgaccccaag 4200
aagaagcgta aggtctga 4218
<210> 2
<211> 5919
<212> DNA
<213> 序列2(xulie2)
<400> 2
gtgaccggtg actctttctg gcatgcggag agacggacgg acgcagagag aagggctgag 60
taataagcgc cactgcgcca gacagctctg gcggctctga ggtgcagtgg atgattatta 120
atccgggacc ggccgcccct ccgccccgaa gtggaaaggc tggtgtgccc ctcgttgacc 180
aagaatctat tgcatcatcg gagaatatgg agcttcatcg aatcaccggc agtaagcgaa 240
ggagaatgtg aagccagggg tgtatagccg tcggcgaaat agcatgccat taacctaggt 300
acagaagtcc aattgcttcc gatctggtaa aagattcacg agatagtacc ttggtgtata 360
gccgtcggcg aatagcatgc cattaaccta ggtacagaag tccaattgct tccgatctgg 420
taaaagattc acgagatagt accttctccg aagtaggtag agcgagtacc cggcgcgtaa 480
gctccctaat tggcccatcc ggcatctgta gggcgtccaa atatcgtgcc tctcctgctt 540
tgcccggtgt atgaaaccgg aaaggccgct caggagctgg ccagcggcgc agaccgggaa 600
cacaagctgg cagtcgaccc atccggtgct ctgcactcga cctgctgagg tccctcagtc 660
cctggtaggc agctttgccc cgtctgtccg cccggtgtgt cggcggggtt gacaaggtcg 720
ttgcgtcagt ccaacatttg ttgccatatt ttcctgctct ccccaccagc tgctcttttc 780
ttttctcttt cttttcccat cttcagtata ttcatcttcc catccaagaa cctttatttc 840
ccctaagtaa gtactttgct acatccatac tccatccttc ccatccctta ttcctttgaa 900
cctttcagtt cgagctttcc cacttcatcg cagcttgact aacagctacc ccgcttgagc 960
agacatcacc ctcgagatgg attacaagga tgacgacgat aagatcatgg ccccaaagaa 1020
gaagcggaag gtcggtatcc acggagtccc agcagccgac aagaagtact ccatcggtct 1080
cgacatcggt accaactccg tcggttgggc cgtcatcacc gacgagtaca aggtcccctc 1140
caagaagttc aaggtcctcg gtaacaccga ccgtcactcc atcaagaaga acctcatcgg 1200
tgccctcctc ttcgactccg gtgagaccgc cgaggccacc cgtctcaagc gtaccgcccg 1260
tcgtcgttac acccgtcgta agaaccgtat ctgctacctc caggagatct tctccaacga 1320
gatggctaag gtcgatgact ccttcttcca ccgtctcgag gagtccttcc tcgtcgagga 1380
ggataagaag cacgagcgtc accccatctt cggtaacatc gtcgacgagg tcgcctacca 1440
cgagaagtac cccaccatct accacctccg taagaagctt gtcgactcta ctgataaggc 1500
tgaccttcgt ctcatctacc tcgccctcgc ccacatgatc aagttccgtg gtcacttcct 1560
catcgagggt gacctcaacc ctgacaactc cgatgtcgac aagctcttca tccagctcgt 1620
tcagacttac aaccagctct tcgaagagaa ccccatcaac gcttccggtg ttgacgccaa 1680
ggccatcctc tccgctcgtc tctccaagtc ccgtcgtctc gagaacctca tcgctcagct 1740
ccctggtgag aagaagaacg gtctcttcgg taaccttatc gccctctctc tcggtctcac 1800
ccccaacttc aagtccaact tcgacctcgc cgaggatgcc aagcttcagc tctccaagga 1860
cacctacgat gacgatctcg acaacctcct cgcccagatc ggtgaccagt acgctgacct 1920
cttccttgcc gctaagaacc tctccgacgc catcctcctc tccgatatcc tccgtgtcaa 1980
caccgagatc accaaggctc ccctctccgc ttctatgatc aagcgttacg atgagcacca 2040
ccaggacctc actcttctca aggcccttgt ccgtcagcag ctccctgaga agtacaagga 2100
gatcttcttc gatcagtcca agaacggtta cgccggttac atcgacggcg gtgcttccca 2160
ggaggagttc tacaagttca tcaagcccat cctcgagaag atggacggta ccgaggagct 2220
cctcgtcaag ctcaaccgtg aggatctcct ccgtaagcag cgtactttcg acaacggttc 2280
catcccccac cagatccacc ttggcgaact ccacgctatc ctccgtcgtc aggaggactt 2340
ctaccccttc ctcaaggaca accgtgagaa gatcgagaag atcctcacct tccgtatccc 2400
ctactacgtt ggccccctcg cccgtggtaa ctcccgtttc gcctggatga ctcgtaagtc 2460
cgaagagacc atcactccct ggaacttcga ggaagtcgtc gataagggtg cctctgccca 2520
gtccttcatc gagcgtatga ctaacttcga caagaacctc cctaacgaga aggtccttcc 2580
taagcactct ctcctttacg agtacttcac tgtttacaac gagctcacca aggtcaagta 2640
cgtcaccgaa ggtatgcgta agcccgcctt cctctctggt gagcagaaga aggctatcgt 2700
cgacctcctc ttcaagacca accgtaaggt taccgtcaag cagctcaagg aagactactt 2760
caagaagatc gagtgcttcg actccgttga gatctccggt gtcgaggatc gtttcaacgc 2820
ttccctcggt acctaccacg atctcctcaa gatcatcaag gacaaggact tcctcgacaa 2880
cgaggagaac gaggacatcc ttgaggacat cgtcctcacc cttaccctct tcgaggatcg 2940
tgagatgatc gaagaacgtc tcaagactta cgctcacctc ttcgacgaca aggtcatgaa 3000
gcagctcaag cgtcgtcgtt acactggttg gggccgtctc tcccgtaagc tgatcaacgg 3060
catccgtgac aagcagtctg gtaagactat cctcgacttc cttaagtccg atggtttcgc 3120
caaccgtaac ttcatgcagc tcatccacga cgactctctc accttcaagg aggacatcca 3180
gaaggctcag gtttccggtc agggtgactc ccttcacgag cacatcgcta acctcgccgg 3240
ttcccccgct atcaagaagg gtatcctcca gaccgttaag gtcgtcgatg agctcgtcaa 3300
ggttatgggt cgtcacaagc ccgagaacat cgttatcgag atggcccgtg agaaccagac 3360
tacccagaag ggtcagaaga actctcgtga acgtatgaag cgtatcgagg agggtatcaa 3420
ggaactcggc tcccagatcc ttaaggagca ccccgtcgag aacacccagc ttcagaacga 3480
gaagctctac ctctactacc tccagaacgg ccgtgacatg tacgttgatc aggagctcga 3540
catcaaccgt ctctccgact acgacgtcga tcacatcgtc ccccagtcct tcctcaagga 3600
tgactctatc gacaacaagg tcctcacccg ttccgataag aaccgtggca agtctgacaa 3660
cgtcccctcc gaagaggttg tcaagaagat gaagaactac tggcgtcagc ttctcaacgc 3720
caagctcatc acccagcgta agttcgataa cctcactaag gctgaacgtg gtggcctctc 3780
tgagctcgac aaggccggct tcatcaagcg tcagcttgtt gagactcgtc agatcaccaa 3840
gcacgtcgcc cagattctcg actctcgcat gaacaccaag tacgatgaga acgacaagct 3900
catccgtgag gtcaaggtta tcactctcaa gtctaagctc gtctccgact tccgtaagga 3960
cttccagttc tacaaggtcc gtgagatcaa caactaccac cacgcccacg atgcctacct 4020
caacgctgtc gttggcactg ctcttatcaa gaagtacccc aagcttgagt ccgagttcgt 4080
ctacggtgac tacaaggtct acgatgttcg taagatgatc gctaagtccg agcaggagat 4140
cggtaaggcc accgctaagt acttcttcta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga 4200
gatcaccctc gccaacggtg agatccgtaa gcgtcccctc atcgagacca acggtgagac 4260
tggtgagatc gtctgggaca agggtcgtga cttcgccact gtccgtaagg tcctctccat 4320
gccccaggtc aacatcgtca agaagaccga ggtccagacc ggtggcttct ccaaggaatc 4380
tatcctcccc aagcgtaact ccgacaagct catcgctcgc aagaaggact gggaccccaa 4440
gaagtacggc ggtttcgact ctcccactgt cgcttactcc gtcctcgttg tcgccaaggt 4500
cgagaagggt aagtctaaga agctcaagtc cgtcaaggag ctcctcggca tcaccatcat 4560
ggagcgttcc tccttcgaga agaaccccat cgacttcctc gaggccaagg gttacaagga 4620
ggtcaagaag gacctcatca tcaagcttcc caagtactcc ctcttcgagc ttgagaacgg 4680
tcgtaagcgt atgctcgctt ccgccggtga gctccagaag ggtaacgagc tcgctctccc 4740
ctccaagtac gtcaacttcc tctacctcgc ctcccactac gagaagctca agggttctcc 4800
cgaagacaac gagcagaagc agctcttcgt cgagcagcac aagcactacc ttgatgagat 4860
catcgagcag atctccgagt tctccaagcg tgtcatcctc gccgacgcta acctcgataa 4920
ggtcctctcc gcttacaaca agcaccgtga caagcccatc cgtgagcagg ctgagaacat 4980
catccacctc ttcactctca ccaaccttgg tgcccctgct gccttcaagt acttcgacac 5040
caccatcgac cgtaagcgtt acacctctac caaggaggtc ctcgacgcca ctctcatcca 5100
ccagtccatt accggtctct acgagactcg tatcgacctc tctcagctcg gtggtgactc 5160
ccgtgctgac cccaagaaga agcgtaaggt ctgaggatcc acttaacgtt actgaaatca 5220
tcaaacagct tgacgaatct ggatataaga tcgttggtgt cgatgtcagc tccggagttg 5280
agacaaatgg tgttcaggat ctcgataaga tacgttcatt tgtccaagca gcaaagagtg 5340
ccttctagtg atttaatagc tccatgtcaa caagaataaa acgcgtttcg ggtttacctc 5400
ttccagatac agctcatctg caatgcatta atgcattgga cctcgcaacc ctagtacgcc 5460
cttcaggctc cggcgaagca gaagaatagc ttagcagagt ctattttcat tttcgggaga 5520
cgagatcaag cagatcaacg gtcgtcaaga gacctacgag actgaggaat ccgctcttgg 5580
ctccacgcga ctatatattt gtctctaatt gtactttgac atgctcctct tctttactct 5640
gatagcttga ctatgaaaat tccgtcacca gcccctgggt tcgcaaagat aattgcactg 5700
tttcttcctt gaactctcaa gcctacagga cacacattca tcgtaggtat aaacctcgaa 5760
aatcattcct actaagatgg gtatacaata gtaaccatgc atggttgcct agtgaatgct 5820
ccgtaacacc caatacgccg gccgaaactt ttttacaact ctcctatgag tcgtttaccc 5880
agaatgcaca ggtacacttg tttagaggta atccttctt 5919
<210> 3
<211> 568
<212> DNA
<213> 序列3(xulie3)
<400> 3
taatgccggc tcattcaaac ggaaatacga gggaccactt ggaccacact ttagatttgc 60
tggttcactt ctctttagaa atcaactgtg ggttttgctt tttgcttcat tctctttgtc 120
ttctccatct ttgatcaaat cctggacttt ctcaatcccc agctaattca atcatagtca 180
gttttctatt tttattattt ctttttcttt tgaaatgtga ttaacaacca gtccgttata 240
tatcttgtac ccagattacg cccaactcgt gctcctcagc cacaaagata ctcaattgat 300
agccaagata catacatacc acaaagtaag gactccatgc attgagtatt actcatcgta 360
ttctagacta ctccaaaact cagcacatag acaaacaata cgaacctcgt ctaggggtga 420
ttcagaggcg gcaaagcggg gttttcgcat ttgatgttcc tggcacttat gtaagcccac 480
gcttcccgct caactaaacc atcagccaat cagactgctc agatttatct tttgaagggt 540
aaataaatca ttgtaaagaa gaacaagt 568
<210> 4
<211> 214
<212> DNA
<213> 序列4(xulie4)
<400> 4
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt 120
atggaggtgc agaatggcta ttttgttatt ggagcgggtt cgaaacggag ggcaggagac 180
tttttctaaa tacgtcacgt gatatagagc tgct 214
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:1)
<400> 5
agacatcacc ctcgagatgg attacaagga tgacgacg 38
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:2)
<400> 6
aacgttaagt ggatcctcag accttacgct tcttcttgg 39
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:3(SEQ ID NO:3)
<400> 7
tgattacgcc aagctttgtg acgaactcgt gtgctc 36
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:4)
<400> 8
gcaggcatgc aagcttaaga aggattacct ctaaacaagt gt 42
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:5(SEQ ID NO:5)
<400> 9
cgactctaga ggatccccgg gtaatgccgg ctcattcaaa 40
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:6(SEQ ID NO:6)
<400> 10
ttgcatctct ggatccactg acttgttctt ctttacaatg atttattta 49
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:7)
<400> 11
cagtggatcc agagatgcaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaa 48
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:8)
<400> 12
aattcgagct cggtacccgg gagcagctct atatcacgtg acg 43
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:9)
<400> 13
accccatagt taccaagcgc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:10(SEQ ID NO:10)
<400> 14
tcggtggtgg ttgtacaagg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:11(SEQ ID NO:11)
<400> 15
taatgccggc tcattcaaac 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> SEQ ID NO:12(SEQ ID NO:12)
<400> 16
agcagctcta tatcacgtga cgta 24
Claims (9)
1.一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)以cas9序列为参考,人工合成cas9基因,其核苷酸序列为序列1所示的DNA分子;以上述人工合成的cas9基因为模板,以序列SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得的cas9 DNA分子重组连接到载体pEX1上,所述重组载体为将pEX1的XhoI和BamHI识别序列间的DNA替换为序列1所示的DNA分子得到的重组载体pEX1-cas9,pEX1-cas9重组载体含有由构巢曲霉基因gpdA基因启动子PgpdA,序列1所示的cas9基因,trpC基因终止子三部分组成的序列2所示的cas9蛋白表达盒,即PgpdA-cas9-TtrpC;
2)以上述cas9蛋白表达盒PgpdA-cas9-TtrpC为模板,以序列SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得的cas9蛋白表达盒重组连接到载体pPTR II上。所述重组载体为在载体pPTR II的HindIII多克隆位点上插入PgpdA-cas9-TtrpC表达盒,得到重组载体pPTR II-cas9,其中载体pPTR II是一种可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体;
3)以米曲霉RIB40基因组DNA为模板,以序列SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得序列3所示的U6启动子U6 promoter融合靶基因的向导序列,其中SEQID NO:6的DNA片段含有靶基因的向导序列,从而在该融合DNA分子3’端融合了靶基因的向导序列,形成U6 promoter+guide sequence的融合DNA分子;以向导RNA和U6终止子序列为参考,人工合成sgRNA融合U6终止子,其核苷酸序列为序列4所示的DNA分子,并以此为模板,以SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8的DNA片段为引物,执行PCR扩增获得序列4所示的sgRNA融合U6终止子,其中SEQ ID NO:7的DNA片段含有靶基因的向导序列,从而在该融合DNA分子5’端融合了靶基因的向导序列,形成guide sequence+sgRNA+U6 terminator的融合DNA分子;以上述扩增的U6promoter+guide sequence,guide sequence+sgRNA+U6 terminator融合DNA分子为模板,以SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8的DNA片段为引物执行重叠PCR扩增,获得的U6promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒重组连接到载体pPTR II中,所述重组载体为在载体pPTR II的SmalI多克隆位点上插入U6 promoter+guide sequence+sgRNA+U6 terminator表达盒,得到重组载体pPTR II-cas9-guide sequence;
4)米曲霉RIB40或3.042孢子接种到液体DPY培养基中,培养16-20h后收集菌丝,并用无菌水洗2次,用Yatalase酶法裂解上述菌丝,获取原生质体,将提取好的重组载体与原生质体混匀,加上60%PEG 4000进行原生质体转化,室温静置20min后,离心收集原生质体,并与含0.1μg/ml吡啶硫胺素,0.8%琼脂的MM培养基混匀,平铺在含0.1μg/ml吡啶硫胺素,1.5%琼脂MM培养基平板上,30℃培养3-4天;
5)挑取上述MM培养基长出的菌丝,转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上,进行二次筛选;
6)选取上述长满菌丝的的CD平板,挑取菌丝,以SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10的DNA片段为引物执行PCR扩增,并对扩增产物进行测序,比对测序结果看是否在靶基因向导序列上发生突变;
7)为获得无标记(Marker-Free)的阳性菌株,将获得的二轮筛选出的阳性菌株在不含吡啶硫胺素的CD培养基上再连续培养四轮,挑取菌丝,以SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12的DNA片段为引物执行PCR扩增,检测米曲霉是否还含有pPTR II-cas9载体,并再次对靶基因向导序列进行测序。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤1)中cas9由组成型启动子PgpdA启动表达。
3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤2)利用pPTR II载体中的AMA1基因,实现在Aspergillus属真菌内进行自主复制。
4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤3)中序列SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7含有互补的20bp重叠序列,该序列恰好为靶基因向导序列。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤3)中的重叠PCR具体程序为:取PCR产物各2μl,加上Buffer、dNTPs、酶,退火温度为50℃,扩增5次后,再添加引物和补充0.5μl酶,退火温度改为60℃,继续扩增30个循环。
6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤4)中的MM培养基的组分为:0.2%NH4Cl,0.1%(NH4)2SO4,0.05%KCl,0.05%NaCl,0.1%KH2PO4,0.05%MgSO4·7H2O,0.002%FeSO4·7H2O,2%glucose,0.15%methionine,l.2M sorbitol,pH 5.5。
7.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤4)中液体DPY培养孢子,不超过20h。
8.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤4)中提取的质粒、重组载体必须用去内毒素的方法提取纯化。
9.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR技术定向遗传改造米曲霉基因的方法,其特征在于:
步骤7)通过多轮筛选,获得无标记的米曲霉工程菌。
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