CN114045293B - 提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用 - Google Patents

提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明通过敲除Aokap1基因可以提高米曲霉曲酸产量，这对于构建米曲霉曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。

Description

提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。
背景技术
曲酸，化学名称为5-羟基-2-羟甲基-1，4-吡喃酮，是一种由微生物发酵产生的有机酸，广泛存在于酒类、酱油及豆瓣酱等酿造产品中。由于具有抑菌功效、抗氧化活性、螯合金属离子和抑制酪氨酸酶活性等性质，曲酸常用作抗菌剂、防腐剂、保鲜剂和美白剂等，被广泛应用在医药、农业、食品和化妆品等各个产业。目前，国内外曲酸的生产主要通过米曲霉菌株发酵而成。由于直接从自然界获得的米曲霉菌株产生的曲酸产量并不高，通常需要对菌株进行诱变处理，之后通过筛选得到曲酸高产菌株，但目前研究表明利用诱变提高米曲霉曲酸产量的效果已明显降低，不能满足日益增长的曲酸市场需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了特异性靶向基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供了含有上述sgRNA的CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体。
本发明还提供了提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除基因Aokap1实现。
优选地，上述方法包括将CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
优选地，上述方法包括以下步骤：
1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6-Aokap1片段；
2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1-sgRNA-TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得Aokap1-sgRNA-TU6片段；
3)将PU6-Aokap1和Aokap1-sgRNA-TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6-Aokap1-sgRNA-TU6；
4)将线性化的CRISPR-Cas9载体与PU6-Aokap1-sgRNA-TU6重组连接获得pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体；
5)利用原生质体转化法将pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
更优选地，步骤1)中，正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物分别为：
PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；
PU6-Aokap1-R：CGGTGGGCCTGATTGTAGGTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
步骤2)中，
TU6-Aokap1-F：CACCTACAATCAGGCCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-R：AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG。
优选地，还包括利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，测序分析突变情况，从而获得Aokap1敲除菌株。
更优选地，以CRISPR-S-Aokap1-F/R为引物，利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，其中：
CRISPR-S-Aokap1-F：GGCTTCAACAGTTCTCCCGA；
CRISPR-S-Aokap1-R：CTTGGTCACGAAGCAGGAGT。
本发明又提供了基因Aokap1在制备米曲霉Aokap1敲除菌株中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一个提高米曲霉曲酸含量的新基因：Aokap1基因。通过敲除Aokap1基因可以提高米曲霉曲酸产量，这对于构建米曲霉曲酸高产菌株提供了新靶点和新途径。
附图说明
图1CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体构建示意图。
图2Aokap1敲除菌株ΔAokap1的测序鉴定以及敲除Aokap1对米曲霉曲酸合成的影响，A.Aokap1敲除菌株ΔAokap1靶向位点突变情况；B.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)在含有FeCl3的固体CD曲酸发酵培养基上的曲酸合成情况；C.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)曲酸发酵液对比；D.野生型3.042(WT)和Aokap1敲除菌株(ΔAokap1)在液体CD曲酸发酵培养基中发酵7天后曲酸含量的测定。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例
以下用到的相关引物见表1。
表1.引物信息
Figure BDA0003325364230000031
本实施例的主要步骤如下：
一、利用CRISPR技术构建米曲霉Aokap1敲除菌株
1.米曲霉Aokap1基因的克隆
Aokap1基因位于米曲霉基因组一号染色体，由3个外显子组成，编码306个氨基酸。Aokap1基因的基因组序列由1059个核苷酸组成，如SEQ ID NO：1所示，序列1的第1-236位、第307-606位、第675-1059位分别为Aokap1基因的三个外显子的序列，序列1中Aokap1基因的三个外显子的序列依次连接得到SEQ ID NO：2。
2.利用CRISPR技术敲除Aokap1靶点的设计
根据CRISPR/Cas9技术原理，在Aokap1编码区上，设计了一条21bp特异性较好的sgRNA靶向序列CACCTACAATCAGGCCCACCG(SEQ ID NO：3)，其位于SEQ ID NO：2的第418-438位，含有该sgRNA靶向序列的CRISPR/Cas9载体可以在Aokap1上引入突变。
3.CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体的构建
3.1含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒的构建
以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物PU6-F和反向引物PU6-Aokap1-R(反向引物含有Aokap1的靶向序列)扩增U6启动子(PU6)，获得PU6-Aokap1片段。
用基因合成法直接合成sgRNA和U6终止子序列(sgRNA-TU6，见SEQ ID NO：4)，以此为模板，以TU6-Aokap1-F(将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头)和TU6-R为引物，PCR扩增(扩增条件同前述扩增U6启动子序列的扩增条件)获得Aokap1-sgRNA-TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端。
表2.U6启动子的50μl扩增体系
Figure BDA0003325364230000041
扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
将上述两个片段，PU6-Aokap1和Aokap1-sgRNA-TU6(这两个片段都含有Aokap1靶向序列)进行重叠PCR：
表3.重叠PCR扩增体系
Figure BDA0003325364230000051
扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，5个循环，再添加引物(PU6-F和TU6-R混合物(10μM))4μl，继续扩增30个循环，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6-Aokap1-sgRNA-TU6，见图1。
3.2 CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体的重组连接
3.2.1 CRISPR-Cas9载体的线性化
表4.CRISPR-Cas9载体酶切体系
Figure BDA0003325364230000052
37℃孵育1小时。
3.2.2线性化载体与PCR产物的重组连接
表5.重组连接反应体系
Figure BDA0003325364230000053
37℃反应30min，反应完后降至4℃或立即置于冰上冷却。
通过以上方法重组连接，获得pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体，见图1。
4.利用原生质体转化法将pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株
(1)将米曲霉3.042孢子接种到100ml DPY液体培养基(2％glucose，1％peptone，0.5％yeast extract，0.5％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，pH 5.5)，培养16-20h后收集菌丝，并用酶缓冲液(50mM马来酸，0.6M(NH4)2SO4，pH 5.5)洗涤一次；
(2)用1％Yatalase(TaKaRa)和1.5％细胞裂解酶(Sigma)裂解上述菌丝，制备原生质体；
(3)用洗涤缓冲液(1.2M山梨醇，50mM CaCl2·2H2O，35mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5)重悬原生质体，1,000rpm离心8min收集原生质体；
(4)将重组载体(10μg)与200μl原生质体混匀，冰上孵育30min。然后加入PEG缓冲液(60％PEG 4000，50mM CaCl2·2H2O，10mM Tris-HCl，pH 7.5)中混合，室温下静置10-20min；
(5)用洗涤缓冲液稀释经PEG处理的原生质体，离心收集原生质体(1,000rpm，8min，4℃)，并与含1.2M山梨醇和0.5％琼脂的M+Met培养基(0.2％NH4Cl，0.1％(NH4)2SO4，0.05％KCl，0.05％NaCl，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.002％FeSO4·7H2O，2％glucose，0.15％methionine，l.2M sorbitol，pH 5.5)混匀，平铺在含1.2M山梨醇和1.5％琼脂的M+Met培养基平板上，30℃培养3-5天。
5.阳性转化子目标靶序列分析
挑取上述MM培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上(2％glucose，0.2％NaNO3，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4，0.05％KCl，0.05％NaCl，0.002％FeSO4，pH5.5)，进行二次筛选。然后挑取二次筛选后的菌丝置于1.5ml的离心管中，加入50μl的水，微波高火加热8min，冰上冷却2min，以此上清为模板，以CRISPR-S-Aokap1-F/R为引物，利用KOD DNA聚合酶(TOYOBO)扩增Aokap1靶向序列，测序分析突变情况，从而获得Aokap1敲除菌株。Aokap1敲除菌株中Aokap1靶向序列突变情况如图2A所示。
表6.Aokap1靶向序列50μl扩增体系
Figure BDA0003325364230000071
二、米曲霉Aokap1敲除菌株曲酸含量测定
由于曲酸能够与FeCl3反应，形成红色，可用于曲酸的定性观察。因此，我们首先利用含有FeCl3的固体CD曲酸发酵培养基观察Aokap1敲除菌株的曲酸合成情况。将获得的Aokap1敲除菌株和野生型3.042菌株接种在含有FeCl3的固体CD曲酸发酵培养基(10％soluble starch，0.2％NaNO3，0.1％K2HPO4，0.05％MgSO4，0.05％KCl，0.001％FeSO4，yeastextract 0.1％，3mM FeCl3，1.5％agar，pH 5.5)，30℃培养4天。结果如图2B所示：Aokap1敲除菌株显示出明显的红色，而野生型3.042菌株显示出浅黄色，表明敲除Aokap1促进米曲霉曲酸的合成。为了测定米曲霉曲酸含量，将野生型3.042菌株和Aokap1敲除菌接种在液体CD曲酸发酵培养基中，30℃培养7天，然后收集发酵液，利用FeCl3显色法测定曲酸含量。结果如图2C所示，FeCl3显色法显示出野生型3.042菌株发酵液有红色，Aokap1敲除菌发酵液显示出更深的红色，曲酸含量测定显示Aokap1敲除菌曲酸产量是野生型3.042菌的4.5倍，达到2.17mg/ml，如图2D所示。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 江西省农业科学院园艺研究所
江西科技师范大学
<120> 提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1、方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1059
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 1
atggtttact taacacgaaa ctggcgcaaa cacaaccttt tttatattct gatggccatt 60
gagcttccca ttactattgt cattctcaca ttcactggga ttgcttctca cgatctatac 120
cggaccaaat tatggcaaga tggagcagat aatggcttca acagttctcc cgatgaggtt 180
ctctatgctg ctgcgaacca tagaccctat aaagttccta tggtctgggg ctctttgtat 240
gtattcattt tttgccccac aatgtttagt tctcaatcat acgacaattc actaacagca 300
ttatagcata acgaactaca atctagtcct tggcgttttg agcatcttca tcttaataac 360
caaacttcct gtccatatcc tgcggatatt ctacccgcct gtgtcagtat tcgtccacgt 420
gggattgttc atagtgtaca tcgtgtcggc cagctatcaa gctggttctg acaagtcgga 480
tcctaagcac ctacaatcag gcccaccgtg gtatattacg aagtcatgca gtgttgcttc 540
gaataaagat aacatcggct attgtcaaca agccaaggcg ctctttggtt ttactatcat 600
tatcatgtgg gtggcaccta acattataat gattctttcc ccttaaaccc tggtaactga 660
catcgtattc atagtgttct ttatttcgtc gaaattatcg tgagcgtcca ctcctgcttc 720
gtgaccaagg aggaaaaggc agagcgcgat gaactccgcg aagaaaagag aactatgaag 780
gagtacgaag atatggttct caggaccccc agaacgttcc ccatgatgag ccccgcgctg 840
ccttcagggg gtactacgca gatgatgcct accatgtcgt cacggagccc tgagttcagt 900
acattcggac atggatcgtc agatcttccg ctccgggacc atttcagcac accaaaccct 960
cgtccgccag cacagcaaga gtcatcggaa accttggcac cggggaacca gcctcagatg 1020
tactttccgc cgccccctaa gaaggcagcg aaggtgtga 1059
<210> 2
<211> 921
<212> DNA
<213> 米曲霉(Aspergillus oryzae)
<400> 2
atggtttact taacacgaaa ctggcgcaaa cacaaccttt tttatattct gatggccatt 60
gagcttccca ttactattgt cattctcaca ttcactggga ttgcttctca cgatctatac 120
cggaccaaat tatggcaaga tggagcagat aatggcttca acagttctcc cgatgaggtt 180
ctctatgctg ctgcgaacca tagaccctat aaagttccta tggtctgggg ctctttcata 240
acgaactaca atctagtcct tggcgttttg agcatcttca tcttaataac caaacttcct 300
gtccatatcc tgcggatatt ctacccgcct gtgtcagtat tcgtccacgt gggattgttc 360
atagtgtaca tcgtgtcggc cagctatcaa gctggttctg acaagtcgga tcctaagcac 420
ctacaatcag gcccaccgtg gtatattacg aagtcatgca gtgttgcttc gaataaagat 480
aacatcggct attgtcaaca agccaaggcg ctctttggtt ttactatcat tatcattgtt 540
ctttatttcg tcgaaattat cgtgagcgtc cactcctgct tcgtgaccaa ggaggaaaag 600
gcagagcgcg atgaactccg cgaagaaaag agaactatga aggagtacga agatatggtt 660
ctcaggaccc ccagaacgtt ccccatgatg agccccgcgc tgccttcagg gggtactacg 720
cagatgatgc ctaccatgtc gtcacggagc cctgagttca gtacattcgg acatggatcg 780
tcagatcttc cgctccggga ccatttcagc acaccaaacc ctcgtccgcc agcacagcaa 840
gagtcatcgg aaaccttggc accggggaac cagcctcaga tgtactttcc gccgccccct 900
aagaaggcag cgaaggtgtg a 921
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacctacaat caggcccacc g 21
<210> 4
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt 120
atggaggtgc agaatggcta ttttgttatt ggagcgggtt cgaaacggag ggcaggagac 180
tttttctaaa tacgtcacgt gatatagagc tgct 214

Claims (10)

1.提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1，Aokap1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.特异性靶向权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.含有权利要求2所述的sgRNA的CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体。
4.提高米曲霉曲酸产量的方法，通过敲除权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1实现。
5.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括将CRISPR-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
6.根据权利要求4所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物扩增U6启动子，获得PU6-Aokap1片段；
2)以sgRNA和U6终止子序列为模板，将Aokap1靶基因的靶向序列作为引物接头，PCR扩增获得Aokap1-sgRNA-TU6，从而将Aokap1靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得Aokap1-sgRNA-TU6片段；
3)将PU6-Aokap1和Aokap1-sgRNA-TU6进行重叠PCR，获得含有Aokap1基因靶向序列的sgRNA表达盒PU6-Aokap1-sgRNA-TU6；
4)将线性化的CRISPR-Cas9载体与PU6-Aokap1-sgRNA-TU6重组连接获得pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体；
5)利用原生质体转化法将pPTRII-Cas9-Aokap1敲除载体转入米曲霉3.042菌株。
7.根据权利要求6所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，步骤1)中，正向引物和含有Aokap1的靶向序列的反向引物分别为：
PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；
PU6-Aokap1-R：CGGTGGGCCTGATTGTAGGTGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
步骤2)中，
TU6-Aokap1-F：CACCTACAATCAGGCCCACCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-R：AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG。
8.根据权利要求6所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，还包括利用KODDNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，测序分析突变情况，从而获得Aokap1敲除菌株。
9.根据权利要求8所述的提高米曲霉曲酸产量的方法，其特征在于，以CRISPR-S-Aokap1-F/R为引物，利用KOD DNA聚合酶扩增Aokap1靶向序列，其中：
CRISPR-S-Aokap1-F：GGCTTCAACAGTTCTCCCGA；
CRISPR-S-Aokap1-R：CTTGGTCACGAAGCAGGAGT。
10.权利要求1所述的提高米曲霉曲酸产量的基因Aokap1在制备米曲霉Aokap1敲除菌株中的应用。
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