CN118086265A - 一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体及其应用，通过将野生型L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶氨基酸序列第12位和/或第104位进行点突变获得高活性的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶突变体，将该突变体、编码该突变体的核酸分子、含该核酸分子的表达盒、重组载体或基因工程菌用于生产β‑丙氨酸，β‑丙氨酸产量显著提高，为β‑丙氨酸大规模工业生产奠定了良好的基础。

Description

一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用。

背景技术

β-丙氨酸是自然界中天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，在生物体内，β-丙氨酸不参与蛋白质和酶的合成，对于哺乳动物需从外界环境中摄取。但β-氨基酸是一种潜在性的功能性氦基酸，在工业上，是一种非常重要的前体物质，随着对β-丙氨酸及其衍生物的研究日益成熟，β-丙氨酸在医药、食品、饲料和化工产品等领域均有广泛应用。

目前，国内外生产β-丙氨酸的方法主要有化学合成法和生物合成法。化学法合成β-丙氨酸研究较早，工艺成熟，β-丙氨酸的产率较高，所以仍是国内外主要采用的生产方法。但是化学合成法要求高温、高压等条件，工艺条件要求高，能量消耗较大，且反应过程中需要用到强酸、强碱和腈类物质，对环境污染严重，特别采用含腈原料。对环境及生物体都有极大的毒性；该工艺生产过程中还会产生大量副产物，为后续分离纯化带来了很大困难。因此，寻求绿色环保、可持续发展的生产工艺是大势所趋。与传统化学法相比，β-丙氨酸的生物合成法具有工艺条件温和、环境友好、特异性强、副产物少等优势，而且随着现代基因工程与酶工程技术的飞速发展，生物合成法产β-丙氨酸具有很好的前景以及研究价值。

β-丙氨酸的生物法合成法主要有酶法和代谢法。其中酶法主要是利用微生物酶转化底物生成β-丙氨酸。例如，以L-天冬氨酸为底物，利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶（L-aspartateα-decarboxylase, PanD）催化L-天冬氨酸脱去α位羧基生成β-丙氨酸，该方法目前被广泛运用于工业合成β-丙氨酸。目前，真核生物来源的PanD其催化机理尚无明确报道，而原核生物中PanD通过对其来源、结构和催化机理等方面的深入研究，发现其表达可以显著影响β-丙氨酸的合成。例如，张潇潇等人通过将钝齿棒杆菌来源的 PanD在大肠杆菌细胞中过表达，β-丙氮酸的最终产量为76.47mg/L；华东理工大学范海洋等优化大肠杆菌来源PanD 重组菌，将产量提高至130 mg/L；可见，虽然L-天冬氨酸-α-脱羧酶同源或异源表达均可催化合成β-丙氨酸，但是其催化生成的β-丙氮酸产量不高，主要原因在于发酵液中L-天冬氨酸-α-脱羧酶酶活较低。因此，筛选一株高酶活的L-天冬氨酸-α-脱羧酶是实现生物酶转化法工业化生产β-丙氨酸的关键。

发明内容

本发明的目的在于对L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定点突变，获得高活性的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，以提升L-天冬氨酸-α-脱羧酶在生物法生产β-丙氨酸中的应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了下述技术方案：

第一方面，本发明提供了一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体是将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位和/或第104位进行点突变获得的。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列任一种：

（1）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位精氨酸突变为组氨酸；

（2）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第104位赖氨酸突变为丝氨酸；

（3）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位精氨酸突变为组氨酸、且第104位赖氨酸突变为丝氨酸，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体（氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示）酶活高于野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶（氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）。

在本发明的一种实施方式中，相较于野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体酶活提高了140%。

第二方面，本发明提供了一种编码所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的核酸分子。

在本发明的一种实施方式中，所述编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的核酸分子是将SEQ ID NO:3所示的野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶的核苷酸序列进行如下点突变：第35位碱基g突变为a、第36位碱基a突变为c、第311位碱基a突变为g、第312位碱基g突变为c，突变后的所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

第三方面，本发明提供了一种含有所述核酸分子的表达盒。

第四方面，本发明提供了一种含有所述核酸分子的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种表达所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，含有权利要求3或4所述核酸分子、权利要求5所述表达盒，权利要求1或2所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体、或权利要求6所述重组载体。

第六方面，本发明提供了所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体、编码所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达盒、含有所述核酸分子的重组载体、或表达所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌在生产β-丙氨酸和/或制备L-天冬氨酸-α-脫羧酶中的应用。

第七方面，本发明提供了一种β-丙氨酸的生产方法，其特征在于：所述生产方法为下述任一种：

（1）发酵培养权利要求7或8所述基因工程菌，得到β-丙氨酸；

（2）利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸；

所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶包含所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体。

上述“包含所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体”表示酶法生产β-丙氨酸过程中使用的L-天冬氨酸-α-脱羧酶可以全部是上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，也可以部分是上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：本发明在野生型L-天冬氨酸-α-脱羧酶基础上，通过定点突变技术获得L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体酶的纯酶液酶活比野生型提高了140%；通过全细胞转化，突变株发酵产β-丙氨酸产量可达5.36g/L，比野生型在同样培养条件下提高了2.53倍，为β-丙氨酸大规模工业生产奠定了良好的基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明保护范围或实施方式的限制。本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京∶科学出版社，2002）；所用的试剂和材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所涉及的培养基及其配方如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH为7；

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L，溶剂为去离子水，pH为7；

发酵培养基（TB液体培养基，购自生物风）：11.8g/L胰蛋白胨、23.6g/L酵母提取物、9.4 g/L K₂HPO₄、2.2g/L KH₂PO₄、4 ml/L甘油，溶剂为去离子水。

下述实施例所涉及的菌株、质粒及引物信息如下：

BL21感受态细胞，购自生工生物工程(上海)股份有限公司，产品货号NO.B528419：

质粒pET28a，购自Novagen公司，产品货号HG-VYN0168；

质粒pET28a-PanD，合成于擎科生物，通过载体pET28a上连接PanD基因获得，重组质粒pET28a-PanD的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

引物信息如表1：

表1：本发明所用的引物

引物名称	序列
		PanD1F	CTCGGAAGTAAGATTCACCACGCCACTGTCACTCAAGCTGATCTAGATTA
PanD1R	CAGCTTGAGTGACAGTGGCGTGGTGAATCTTACTTCCGAGGATGGTGCGC
		PanD2F	AGCCAAGGCGTATGAGCCAAGCATTGTGCACGTGGACGCCGACAACCGCA
PanD2R	GGCGTCCACGTGCACAATGCTTGGCTCATACGCCTTGGCTTCCGCATCAG

实施例1：含panD的重组菌panD-1的构建

通过全基因合成野生型panD基因（核苷酸序列为SEQ ID NO:3）；将panD基因与质粒pET28a用NdeI和XhoI双酶切，纯化后用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，获得质粒pET28a-PanD，经测序验证，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，以上质粒pET28a-PanD合成于擎科生物。将质粒pET28a-PanD电转化BL21感受态细胞，将转化液经测序验证，获得含L-天冬氨酸-α-脱羧酶panD的菌株，将测序正确的菌株经过LB固体培养基活化，菌株命名为PanD-1。

实施例2：含panD突变体panD-R12H的重组菌PanD-2的构建

（1）将全基因合成的野生型panD基因（核苷酸序列为SEQ ID NO:3）通过overlapPCR技术进行基因改造，使野生型panD基因的第35位碱基g突变为a、第36位碱基a突变为c，获得L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变基因panD2，具体步骤如下：

以pET28a-PanD质粒为模板，PanD1F/PanD1R为引物，进行PCR扩增，获得panB突变基因。

具体地，扩增体系和扩增程序如下：

PCR反应体系（相关试剂购自TaKaRa公司，总体积50μL）为：10×Buffer (Mg²⁺) 5μL、dNTP (2.5mM each) 4μL、引物PanD1F (10μM) 2μL、引物PanD1R (10μM) 2μL、模板pET28a-PanD 2μL、Pyrobest DNA polymerase 0.5μL、ddH₂O 34.5μL；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min（30个循环）；72℃延伸10min。

（2）将上步PCR扩增产物（L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变基因）用1μl DpnI消化1h，取10μl消化产物直接转化BL21感受态细胞。将转化液送外测序验证，获得含L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体panD-R12H的菌株，将测序正确的菌株经过LB固体培养基活化，菌株命名为PanD-2；从菌株PanD-2中提取质粒，获得质粒pET28a-PanD-R12H。

实施例3：含panD突变体panD-R12H-K104S的基因工程菌PanD-2的构建

（1）以质粒pET28a-PanD-R12H为模板，PanD2F/PanD2R为引物，进行PCR扩增，使L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变基因panD2的第311位碱基a突变为g、第312位碱基g突变为c，获得L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变基因panD3（核苷酸序列为SEQ ID NO:4）。

具体地，扩增体系和扩增程序如下：

PCR反应体系（相关试剂购自TaKaRa公司，总体积50μL）为：10×Buffer (Mg²⁺) 5μL、dNTP (2.5mM each) 4μL、引物PanD2F (10μM) 2μL、引物PanD2R (10μM) 2μL、模板PanD-1 2μL、Pyrobest DNA polymerase 0.5μL、ddH₂O 34.5μL；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min（30个循环）。

（2）将上步PCR扩增产物用1μl DpnI消化1h，取10μl消化产物直接转化BL21感受态细胞。将转化液送外测序验证，获得含L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体panD-R12H-K104S的菌株，将测序正确的菌株经过LB固体培养基活化，菌株命名为PanD-3。

实施例4：L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体酶高效表达及酶活测定

将实施例1-3构建的重组菌PanD-1、PanD-2和PanD-3分别接入5mL含卡那霉素（50mg/L）的LB培养基中，37℃振荡培养6～8h后，以1%的接种量转接到50mL含卡那霉素（50mg/L）的LB培养基中，至OD600＝0 .5～0 .6时，加入0 .5mmol异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃摇床培养10h后，4℃、6000rpm离心5min，收集菌体细胞。使用PBS分别菌株细胞两次，最后用PBS重悬、超声破胞，4℃、10000rpm离心5min，收集菌体细胞。用50mM的pH8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，超声破碎（超声2s，间隔2s，有效超声时间10min），离心去除细胞碎片，收集上清液，即为粗酶液，然后使用Ni柱（Ni-TED 6FF His标签蛋白纯化试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司）纯化粗酶液得到纯酶液，用于酶活测定；用BCA蛋白质定量检测试剂盒（购自生工生物工程（上海）股份有限公司）测panD纯酶液浓度。

结果表明，重组菌PanD-1（表达PanD蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）、PanD-2（表达panD-R12H突变蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示）和PanD-3（表达panD-R12H-K104S 突变蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO:2）的蛋白浓度分别约为3.93μg/μL、4.11μg/μL、5.36μg/μL。

将上述纯酶液进行催化，催化反应体系（1mL）为：纯酶液100μL、终浓度为80g/L的L-天冬氨酸溶液(用NaOH预先调pH至7.0)、200mM PBS缓冲液。37℃、150rpm下反应20min，取样，进行检测，计算PanD酶活。结果表明：野生型菌株PanD-1酶活为130.2252U/mL，突变株PanD-2酶活为193.65U/mL，突变株PanD-3酶活为312.3325U/mL；与野生型相比，两个突变株PanD酶活性分别提高了48.7%、140%。

实施例5：菌株PanD-1、PanD-2、PanD-3发酵生产β-丙氨酸

1、从LB固体培养基上分别挑取单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素抗性的5mL LB液体培养基中，37℃培养6～8h，以1%的接种量转接到含有50mg/L卡那霉素抗性50mL LB液体培养基中，培养至OD600达0.5～0.6，加入0 .5mmoL IPTG，37℃摇床培养，诱导10h后离心收集菌。

2、将步骤1中所得到的菌体用PBS洗涤两次重悬，控制L-天冬氨酸在初始反应体系中的浓度为80g/L，按重悬液和L-天冬氨酸的体积比1:1添加到发酵培养基中进行全细胞发酵，37℃、180rpm条件下反应24h，制备β-丙氨酸。突变株PanD-3的β-丙氨酸产量达到5.36g/L，转化率可为99.3%，突变株PanD-2的β-丙氨酸产量达到2.68 g/L，野生型菌株PanD-1的β-丙氨酸产量达到1.52g/L，比野生型菌株PanD-1在同样培养条件下分别提高了2.53倍和0.76倍，为进一步β-丙氨酸大规模工业生产奠定了良好的基础。

本发明利用基因工程技术，将全基因合成的野生型panD基因通过overlap PCR技术进行基因改造，将突变后L-天冬氨酸-α-脫羧酶基因克隆到pET-28a表达载体，并将相应的表达质粒转化到大肠杆菌表达目的蛋白，然后对表达蛋白进行瓜氨酸生成活性测定。结果显示，本发明的panD可高效催化底物L-天冬氨酸反应生成β-丙氨酸，具有非常高的转化率。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体是将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位和/或第104位进行点突变获得的。

2.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于：所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列任一种：

（1）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位精氨酸突变为组氨酸；

（2）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第104位赖氨酸突变为丝氨酸；

（3）将SEQ ID NO:1所示L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列第12位精氨酸突变为组氨酸、且第104位赖氨酸突变为丝氨酸。

3.一种编码权利要求1或2所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列为SEQ IDNO:4。

5.一种含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒。

6.一种含有权利要求3或4所述核酸分子的重组载体。

7.一种表达权利要求1或2所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于：含有权利要求3或4所述核酸分子、权利要求5所述表达盒，权利要求1或2所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体、或权利要求6所述重组载体。

9.权利要求1-2任一项所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体、权利要求3-4任一项所述核酸分子、权利要求5所述表达盒、权利要求6所述重组载体、或权利要求7-8任一项所述基因工程菌在生产β-丙氨酸和/或制备L-天冬氨酸-α-脫羧酶中的应用。

10.一种β-丙氨酸的生产方法，其特征在于：所述生产方法为下述任一种：

（1）发酵培养权利要求7或8所述基因工程菌，得到β-丙氨酸；

（2）利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸；

所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶包含权利要求1或2所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体。