CN117187274B - 2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因及其表达蛋白和应用，属于基因工程技术领域。本发明的2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建了2,4‑二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体，将所构建的重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)‑T 7 ‑ectB‑T 7ter ‑T 7 ‑ectAm‑T 7ter ‑ T 7 ‑ectC‑T 7ter 。重组大肠杆菌表达菌株产四氢嘧啶的浓度为67.86±1.76 g/L。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及采用基因工程合成四氢嘧啶的技术领域，更具体地说，涉及2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因及其表达蛋白和应用。
背景技术
四氢嘧啶，又称四氢甲基嘧啶羧酸，是一种氨基酸衍生物。在自然界中，它广泛存在于嗜盐细菌中，在高盐、高温、紫外线辐射等极端条件下，用于保护嗜盐菌免受伤害。鉴于四氢嘧啶具有修护皮肤屏障抵御颗粒污染物侵害、修护及抵抗UV损伤、修复敏感肌及抗刺激、减少光老化及抗衰老等功能，其被广泛应用于化妆品和药品等领域。
在微生物细胞中，四氢嘧啶通过2,4-二氨基丁酸转移酶、2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶和四氢嘧啶合成酶等途径酶共同作用催化天冬氨酸-β-半醛而形成。然而上述3种酶的匹配性问题，尤其是2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶的低底物亲和力问题是制约四氢嘧啶高效合成的关键因素，从而进一步限制了四氢嘧啶的工业化生产及其应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，用于构建2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体；本发明所要解决的另一技术问题在于提供2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白；本发明还要解决的另一技术问题在于提供2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的应用，用于促进四氢嘧啶的高效合成。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
含有所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体、宿主菌。
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用。
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白在制备四氢嘧啶中的应用。
2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，包括以下步骤：
1)构建2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体；
2)将所构建的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体转化到大肠杆菌E.coli BL21中，构建获得重组大肠杆菌表达菌株；
3)挑取重组大肠杆菌表达菌株接种于LB培养基培养获得种子液将种子液接种到发酵培养基中，培养至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导24h后，8000rpm，4℃离心5min，收集上清，获得含有四氢嘧啶的发酵液。
所述发酵培养基的配方为：
每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和10-80mL甘油；
或为：每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和20-100g葡萄糖。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
1)本发明2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因编码的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体是基于2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶的晶体结构及底物L-2,4-二氨基丁酸的化学结构，利用生物信息学软件分子对接、虚拟突变后获得；该突变体与底物L-2,4-二氨基丁酸具有较高的结合力，结果表明2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体的比酶活为1.45U/mg，比原酶的比酶活(1.17U/mg)高24％，其中U代表每分钟催化1mg 2,4-二氨基丁酸降解的酶量。
2)本发明先构建了2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体，将所构建的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体转化到大肠杆菌E.coliBL21中，构建重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter。结果表明重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter产四氢嘧啶的浓度为67.86±1.76g/L，对照样品中四氢嘧啶的浓度为55.67±2.34g/L。
附图说明
图1是2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体和2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶的活性表征图；
图2是2,4-二氨基丁酸转移酶基因表达框T7-ectB-T7ter的构建示意图；
图3是2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因表达框T7-ectAm-T7ter的构建示意图；
图4是四氢嘧啶合成酶基因表达框T7-ectC-T7ter的构建示意图；
图5是四氢嘧啶表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter的构建示意图(A为、B为、C为、D为)；
图6是四氢嘧啶产量检测结果图；
图7是发酵培养基配方1为培养基组分时的四氢嘧啶产量图；
图8是发酵培养基配方2为培养基组分时的四氢嘧啶产量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所述的T7启动子基因片段和T7终止子基因片段表达相同，但5’端的同源臂不同，所以扩增基因片段使用的引物序列不同。
实施例1
1、根据2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶(GenBank:WP_010928263.1)的晶体结构(PDB:3D3S)及底物L-2,4-二氨基丁酸的化学结构，利用生物信息学软件DiscoveryStudio进行分子对接、虚拟突变后，获得与底物L-2,4-二氨基丁酸结合力提高的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体(ectAm)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；用于表达ectAm的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(上海生工生物工程有限公司合成)所示。
2、设计引物F1、R1，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR分别以SEQ ID NO.1和GenBank:CP032412.1为模版，扩增ectAm和ectA基因片段；经Gibbson将ectAm基因和ectA基因组装整合到表达载体pET28a(+)质粒(Invitrogen)的BamH Ⅰ和Sac I位点，获得ectAm和ectA的重组表达载体pET28a(+)-ectAm和pET28a(+)-ectA；将重组表达载体pET28a(+)-ectAm和pET28a(+)-ectA分别与大肠杆菌E.coli BL21感受态冰上孵育30min后，于42℃热击90s转化E.coli BL21获得表达ectAm基因和ectA基因的重组大肠杆菌表达菌株E.coliBL21pET28a(+)-ectAm和E.coli BL21 pET28a(+)-ectA。
3、分别挑取重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-ectAm和E.coliBL21 pET28a(+)-ectA单菌落，接种至含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养后，按10％(V/V)的比例转接至50mL含有50mg/L卡那霉素的LB培养基中，待菌体培养至OD600nm＝0.6～0.8后，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导ectAm和ectA的表达；诱导培养5h后8000rpm，4℃离心5min，收集菌体；用预冷的Tris-HCl(pH7.0)清洗、重悬菌体至50mL，冰浴超声，条件为：400W，工作2s，间歇3s，200个循环至菌液澄清，14000rpm，4℃离心20min，收集上清，即为粗酶液。
4、将获得的ectAm粗酶液和ectA粗酶液经镍柱纯化后，获得ectAm和ectA的纯品(原酶)。纯化程序如下：用Buffer A(20mM Tris-HCl，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH7.4)平衡Ni-NTA Agarose Fast Flow柱子后，将ectAm粗酶液和ectA粗酶液分别透过0.22μm滤膜后，上清液以3mL/min的速度通过Ni-NTA Agarose Fast Flow柱子，结合10min后，Buffer B(20mMTris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4)洗脱收集酶活性部分，浓缩，冷冻干燥，即得到ectAm(2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体)和ectA(原酶)的纯品。
5、将获得的1mg 2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体和原酶的纯品，分别加入10mg2,4-二氨基丁酸的1mL Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，37℃，反应2min后，加入等体积的甲醇溶液终止反应。利用HPLC测定2,4-二氨基丁酸的残留量，进行2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体和原酶活性表征。
结果如图1所示，2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体的比酶活为1.45U/mg，比原酶的比酶活(1.17U/mg)高24％，其中U代表每分钟催化1mg 2,4-二氨基丁酸降解的酶量。
实施例2
1、设计引物F2、R2，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以GenBank:FN869568.2为模版扩增获得ectB的基因片段；
设计引物F3、R3，序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段；
设计引物F4、R4，序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段；
将ectB的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得2,4-二氨基丁酸转移酶基因的表达框T7-ectB-T7ter(图2)。
2、设计引物F5、R5，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以SEQ ID NO.1为模版扩增获得ectAm的基因片段；
设计引物F6、R6，序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段；
设计引物F7、R7，序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段；
将ectAm的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达框T7-ectAm-T7ter(图3)。
3、设计引物F8、R8，序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以GenBank:FN869568.2为模版扩增获得ectC的基因片段；
设计引物F9、R9，序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7启动子的基因片段；
设计引物F10、R10，序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得T7终止子的基因片段；
将ectC的基因片段、T7启动子的基因片段、T7终止子的基因片段使用Gibbson组装，获得四氢嘧啶合成酶基因的表达框T7-ectC-T7ter(图4)。
4、设计引物F11、R11，序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，利用高保真PCR聚合酶PrimeSTAR，以pET28a(+)质粒为模版扩增获得pET28a(+)质粒片段，将pET28a(+)质粒片段与T7-ectB-T7ter经Gibbson组装，获得表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter。
5、以重组表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter为模版，经BamH I和EcoRⅠ37℃酶切2小时后回收线性化的重组表达载体，将线性化的重组表达载体与基因表达框T7-ectAm-T7ter利用T4连接酶16℃过夜连接获得表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter。
以pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter为模版，经SalⅠ和HindⅢ酶切后，与基因表达框T7-ectC-T7ter经SalⅠ和HindⅢ酶切后的片段，利用T4连接酶进行连接获得重组表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter(图5)。
利用同样的酶切连接方法获得2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶未突变的表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectA-T7ter-T7-ectC-T7ter。
实施例3
1、将表达载体pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter与pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectA-T7ter-T7-ectC-T7ter分别冰上孵育30min后，42℃热击90s，转化大肠杆菌E.coli BL21获得积累四氢嘧啶的重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter和对照菌株大肠杆菌E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectA-T7ter-T7-ectC-T7ter，以备后续四氢嘧啶的生产。
2、挑取重组大肠杆菌表达菌株大肠杆菌E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter和对照菌株大肠杆菌E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectA-T7ter-T7-ectC-T7ter单菌落，分别接种于3mL LB培养基(加入终浓度为50mg/L的卡那霉素)中，37℃，200rpm培养过夜。按1％(v/v)的比例转接50mL发酵培养基(加入终浓度为50mg/L的卡那霉素)中，37℃，培养至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导24h后8000rpm，4℃离心5min，收集上清，备测四氢嘧啶含量。
发酵培养基的配方为：每升培养基中含23.6g酵母粉，11.8g蛋白胨，9.4g磷酸氢二钾，2.2g磷酸二氢钾和80g葡萄糖。
3、利用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)检测发酵液上清中的四氢嘧啶含量。所用HPLC-MS的高效液相色谱条件为色谱柱：ZORBAX StableBond Aq 4.6×150mm；流动相：2％的甲醇水溶液等度洗脱；流速：1mL/min。检测波长：230nm；其对应的所用质谱条件：离子源：ESI；雾化器流速：1.5L/min；干燥气流速：5L/min；离子源温度：200℃；传输线温度：250℃。
结果如图6所示，以目前的色谱条件，四氢嘧啶的出峰时间为3.5min，本发明重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter产四氢嘧啶的浓度为67.86±1.76g/L，对照样品中四氢嘧啶的浓度为55.67±2.34g/L(图6)。
实施例4
重组大肠杆菌表达菌株及发酵和检测方法同实施例3，不同在于：
发酵培养基的配方1为：每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和10-80mL甘油。
发酵培养基的配方2为：每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和20-100g葡萄糖。
采用上述发酵培养基，在诱导培养时，将大肠杆菌工程菌株活化后，转接到发酵培养基中，于20-37℃条件下进行发酵培养，培养至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.01-1mM的IPTG，4℃离心5min，收集上清，备测四氢嘧啶含量。
本发明重组大肠杆菌表达菌株E.coli BL21 pET28a(+)-T7-ectB-T7ter-T7-ectAm-T7ter-T7-ectC-T7ter以葡萄糖为底物时四氢嘧啶的产量为16.96±1.45～84.82±2.37g/L，对照样品中四氢嘧啶的浓度为13.92±1.04～69.59±1.52g/L(图7)；以甘油为底物时四氢嘧啶的产量为7.44±0.42g/L～59.87±1.85g/L，对照样品中四氢嘧啶的浓度为6.36±0.34～51.27±1.38g/L(图8)。
Claims (6)
1.2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.含有权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体、宿主菌。
4.权利要求1所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因或权利要求2所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的表达蛋白在制备四氢嘧啶中的应用。
5.根据权利要求4所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体；
2）将所构建的2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因的重组表达载体转化到大肠杆菌E. coli BL21中，构建获得重组大肠杆菌表达菌株；
3）挑取重组大肠杆菌表达菌株接种于LB培养基培养获得种子液将种子液接种到发酵培养基中，培养至OD 600 nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃，诱导24h后，8000rpm，4℃离心5min，收集上清，获得含有四氢嘧啶的发酵液。
6.根据权利要求5所述2,4-二氨基丁酸乙酰转移酶突变体基因在制备四氢嘧啶中的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：
每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和10-80mL甘油；
或为：每升培养基中含5-40g酵母粉，5-20g蛋白胨，2-15g磷酸氢二钾，0.5-6g磷酸二氢钾和20-100g葡萄糖。
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