CN115894639B - 一种辅助侵染蛋白残基突变体蛋白、其重组体及在外泌酶固定化工艺中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辅助侵染蛋白残基突变体蛋白、其重组体及在外泌酶固定化工艺中的应用，所述突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该辅助侵染蛋白残基突变体蛋白与酶基因的融合表达后能够外泌到培养基中，在温度和偏中性的pH下与其生产细胞结合。本发明利用其与自身生产细胞一步纯化‑固定化的功能，获得稳定性提高的活性酶，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域宽，解决了原始蛋白残基与活性酶融合表达最适pH不匹配的难点，且融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力，具有广泛的工业化应用场景。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物酶固定化技术领域，特别涉及一种辅助侵染蛋白残基突变体蛋白、其重组体及在外泌酶固定化工艺中的应用。
背景技术
催化剂的发现为工业化生产加速，生物酶作为一种天然高分子催化剂，具有催化效率高、特异性强，反应条件温和、无有机试剂污染的特点。然而，由于游离生物酶的物理化学性质不稳定，导致在实际应用过程中生物酶无法长期保持催化活性，也就无法发挥其最大的催化性能。生物酶固定化技术的出现不仅实现了酶的重复利用，而且可以改善酶的催化性能及活性。
多种固定化酶手段被开发出来，最早的是借助载体与酶之间的相互作用力或形成共价键来固定化酶，后期随着技术的发展，包埋法和微囊化的固定化技术被广泛用于酶的固定化。微生物表面展示技术是近年来应用极为广泛的一种基因工程技术，通过锚定蛋白和外源蛋白的基因序列共表达，使表达的外源蛋白以融合蛋白的形式展现于微生物细胞表面，并保持相对独立的空间结构和生物活性。将外源蛋白表面展示于微生物细胞表面，提高酶的稳定性并且实现了酶的固定化。而整个微生物细胞可以直接作为全细胞催化剂，减少了底物和产物的胞内运输过程，克服了跨膜阻力的影响，提高了反应速率；此外，与胞内酶相比，一方面避免了胞内蛋白酶和肽酶的水解作用，有利于维持酶活力的稳定和产物的积累；然而，一般所选择的锚定蛋白都是外膜蛋白或转运蛋白，在细胞外表面上的位点有限，且表达后过多的结合，富集于细胞表面，不利于细胞摄取营养物质进行生长和代谢。另一方面，锚定蛋白本身作为蛋白质，其组成氨基酸，与酶催化所需要的最适条件匹配的概率并不高，表面展示后用于催化反应，与细胞固定化的结合力可能大打折扣。这也是现有的细胞固定化体系不能应用于所有酶的原因之一。
病原菌单核细胞增生李斯特菌的辅助侵染蛋白IAP可外泌表达，具有水解细菌细胞壁和阻碍细胞壁合成的功能，对细菌来说是致命的，在其侵染其他细菌过程中具有重要的作用。但如何能将其更好的在酶生产技术领域更好的应用，则现有技术中并未见报道；本领域亟需一种能够降低生产成本、提高经济效益、实现酶的重复利用，还能解决酶回收难、成本高等问题的新技术。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明通过辅助侵染蛋白残基及其突变体与酶基因的融合表达，构建出外泌的固定化酶，该酶可在合适的pH和温度下与其生产细胞结合，完成一步纯化-固定化过程，形成稳定性提高的酶以及连续催化生产，为酶法工业化生产提供有效途径。该突变体耐受的pH域广，与活性酶进行融合表达，融合表达后的酶同时具有催化活性域与固定化能力。
本发明第一方面提供了一种辅助侵染蛋白残基突变体蛋白，所述辅助侵染蛋白残基突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明第二方面提供了所述辅助侵染蛋白残基突变体蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明第三方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒包含前文所述的辅助侵染蛋白残基突变体核苷酸序列的基因片段。
本发明第四方面提供了一种含辅助侵染蛋白残基突变体的重组菌体，所述重组菌包含序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
进一步地，所述含辅助侵染蛋白残基突变体的重组菌体，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌等革兰氏阳性菌中的一种。
本发明第五方面提供了一种含辅助侵染蛋白残基突变体的外泌活性酶重组菌体，所述外泌活性酶重组菌体包含序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与酶蛋白融合表达。所述酶蛋白能够在重组菌发酵过程中外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；且突变体与酶蛋白融合表达后的菌体相对于原始的具有更宽的pH稳定条件(pH 6.0-8.5)；更进一步优选pH 7.0-8.0。
进一步地，所述的酶蛋白选自：谷氨酸脱羧酶gadB、谷胱甘肽合成酶gshF、多聚磷酸激酶ppk、γ-谷氨酰胺合成酶gmas、精氨酸脱亚胺酶ADI、精氨酸酶、葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶FDH中的一种。
进一步地，所述的谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；谷胱甘肽合成酶gshF的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；多聚磷酸激酶ppk的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；γ-谷氨酰胺合成酶gmas的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；精氨酸脱亚胺酶ADI的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；精氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；甲酸脱氢酶FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
本发明第六方面提供了一种上文所述含辅助侵染蛋白残基突变体的外泌活性酶重组菌体在固定化工艺中的应用；包括利用所述重组菌体发酵所得的外泌活性酶在其生产菌株上的自固定化过程。
进一步地，所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的外泌活性酶在其生产菌株上自固定化后进行发酵培养，发酵培养结束后，通过调节温度为25-30℃，pH 6.0-8.5条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物作为外泌活性酶再与其生产细胞固定化并进行下一个循环的发酵培养，如此循环发酵。这是一种纯化-固定化的连续催化工艺，其适用范围广，具有良好的工业应用价值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.一种辅助侵染蛋白IAP残基突变体与酶蛋白融合表达的设计方案，能够同时实现外泌酶的纯化固定化；
2.该突变体具有较广的pH稳定范围(pH 6.0-8.5)，相对于突变前，能够应用于活性酶最适pH偏酸的反应环境；
3.与表面展示不同，培养过程中酶外泌表达，分布于发酵液中，大量生产后不会影响细胞营养的摄入和代谢空间；
4.催化反应在酶的最适条件下进行(根据酶的性质不同，最适温度也不同)，固定化载体为生产细胞，反应结束后调节至特定的温度(25-30℃左右，近常温)和pH(pH 6.0-8.5)，固定化酶损失率低；
5.所述固定化酶的催化工艺可放大和循环，其能够在20次以上的循环次数下仍保持催化活性；
6.通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的外泌蛋白能够在特定的环境下(在pH 7.5附近结合、室温)固定化到无/有活性的基质上，所述基质来源于生产蛋白的基因工程细胞——实施例为外泌蛋白的宿主细胞。
附图说明
图1不同pH下固定化酶结合效果比较；
图2不同温度下固定化酶结合效果比较。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本发明中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。
实施例1
1.质粒和菌株构建
将密码子优化后的来源于单核细胞增生李斯特菌的基因IAP残基(SEQ ID NO:1)以及绿色荧光蛋白基因(SEQ ID NO:2)送生工合成并在两端引入XbaI和EcoRI酶切位点，连入pXMJ19质粒，获得pXMJ-iap-eGFP质粒。
质粒经菌落PCR和测序验证正确后转入到谷氨酸棒杆菌中，得到C.g-pXMJ-iap-eGFP工程菌。
PCR扩增条件：98℃变性7min，33个循环(95℃30s，56℃30s，72℃110s)，72℃延伸5min。
2.辅助侵染蛋白IAP残基突变体的构建
所述突变体以pXMJ-iap-eGFP质粒为模板，进行随机突变：
①按照QuickMutationTM基因随机突变试剂盒设计引物和随机突变，引物序列为：
random-F：GCTCTAGAatgaaaaaagcaactatcgc；SEQ ID NO.14；
random-R：GGAATTCCcttgtacagctcgtccatg；SEQ ID NO.15；
②随机突变PCR反应
随机突变PCR反应参考下表设置随机突变PCR反应体系：
表1
按照如下参数设置PCR仪：
表2
③转化感受态细胞
取4μL的PCR产物，1％的琼脂糖电泳检测条带浓度和特异性。剩余的PCR产物电泳，切胶回收目标DNA片段。酶切、连接、转化到大肠杆菌菌株感受态细胞中，混匀后冰浴30min，之后42℃水浴热击45s，立即放于冰上2-5min。之后加入250μL的LB培养基，200rpm，37℃培养1h，取100-200μL菌液于氯霉素抗性的平板上过夜培养。得到多个突变体，提取其中质粒后分别转入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中，其中性质突出的突变体命名为C.g-pXMJ-iapV69H-eGFP，其中：iapV69H蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，核苷酸序列为SEQ ID NO:3；eGFP蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
④蛋白的分泌表达
将C.g-pXMJ-iap-eGFP、C.g-pXMJ-iapV69H-eGFP工程菌接入含有20mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时等比例重悬于添加0.5％葡萄糖的M9培养基中，加入0.2mM IPTG进行诱导，用氨水维持pH6.8，加入0.2mM IPTG进行诱导，诱导12h后分别收集不溶物和上清。
⑤融合酶的纯化固定化
将收集的不溶物与发酵液上清在30℃，pH 5-9下结合1h，洗涤一次后即为固定于细胞表面的纯酶，亦为固定化酶。
实施例2
不同pH对结合效果的影响
用30％盐酸调节发酵液pH＝5-9，将收集的不溶物与发酵液上清在30℃下结合1h，8000rpm离心10min分离上清和沉淀，沉淀重悬后稀释100倍，在484nm下激发，507nm下观测荧光值，计算发酵液和沉淀的相对荧光强度。
在不同pH下结合的相对荧光值分布如图1中所示，可以看出，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的pH范围更大，分析如下：
C.g-pXMJ-iap-eGFP在pH7.5附近结合，沉淀中相对荧光达到90％，说明大部分酶被固定化在细胞上，此pH下结合效果最佳，在pH7-8下沉淀中的荧光比例大于85％；
C.g-pXMJ-iapV69H-eGFP在pH7.5附近，沉淀中相对荧光达到95％，此pH下结合效果最佳，在pH6.0-8.5下固定化最为高效，沉淀中的比例超过90％，在pH5.5-9.0范围内，沉淀中荧光比例大于80％。
实施例3
不同温度对结合效果的影响
用30％盐酸调节发酵液pH＝7.5，在20～40℃下结合1h，8000rpm离心10min分离上清和沉淀，在484nm下激发，507nm下观测荧光值，计算发酵液和沉淀的相对荧光强度。
在不同温度下结合的相对荧光值分布如图2中所示，原始蛋白C.g-pXMJ-iap-eGFP和突变体C.g-pXMJ-iapV69H-eGFP的最佳结合温度基本相同，为30℃。在25-30℃下结合，沉淀中的荧光比例接近大于90％，说明大部分酶被固定化在细胞上，此温度下结合效果最宜。效果较佳的温度为20-35℃，沉淀中的荧光比例高于85％。还可观察到突变体在高温下性能相对好，推测突变对于蛋白结构稳定性的提升是有帮助的。并且，对于结合温度在上述接近室温的情况而言，更有利于生产中多次循环过程的实施，也就是在固定化酶前一轮的反应结束后，通过简单的操作，包括调节溶液pH(中性/7.5)，降低温度(室温/30℃)，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入下一个循环中使用；这种温和的反应条件，非常有利于规模化生产。
实施例4
IAP残基固定化谷氨酸脱羧酶gadB的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将谷氨酸脱羧酶编码基因gadB与辅助侵染蛋白IAP残基融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iap-gadB，谷氨酸脱羧酶氨基酸序列为SEQ IDNO.5，IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在1L的反应体系中投入2g固定化酶，额外加入0.1g/L的5-磷酸吡哆醛，在pH5～5.5，45℃下催化50g/L的L-谷氨酸经0.5h反应生成10±0.8g/L的γ-氨基丁酸。
取80g固定化酶，投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸中，额外加入0.5g/L的5-磷酸吡哆醛，反应体积为50L，在45℃下反应12h可生成665±5g/L的γ-氨基丁酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸溶液中，反应体积为50L，在45℃最适温度下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环13次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在10-18h内。
对比例4-1
按照与实施例1相似的手段，将谷氨酸脱羧酶编码基因gadB在谷氨酸棒杆菌中表达，谷氨酸脱羧酶氨基酸序列为SEQ ID NO:5，得到C.g-pXMJ-gadB，在1L的反应体系中投入20mg纯化酶(基本相当于2g固定化酶中的酶量)，在pH 5～5.5，45℃下催化50g/L的L-谷氨酸经0.5h反应生成10±0.8g/L的γ-氨基丁酸。但并不能循环催化。
对比例4-2
取80g实施例4所述固定化酶，投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸中，额外加入0.5g/L的5-磷酸吡哆醛，反应体积为50L，在45℃下反应12h可生成665±5g/L的γ-氨基丁酸。反应结束后，不将温度和pH调节至固定化酶的最佳结合条件，直接离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸溶液中，反应体积为50L，在45℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环8次后，在相同时长内，γ-氨基丁酸产量降低，不延长时间的情况下，产量仅能达到第一轮的65％甚至更低，一旦将每个循环延长2-3小时，前几次循环其产量也仅仅能达到首轮的85％，随循环次数增加(极限循环8次)，产量会急剧降低，这样则会大大增加能耗；则生产上，无实际的循环价值。
实施例5
IAP残基突变体固定化谷氨酸脱羧酶gadB的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将谷氨酸脱羧酶编码基因gadB与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gadB，谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；在1L的反应体系中投入0.1g固定化酶，在pH5～5.5，45℃下催化50g/L的L-谷氨酸经0.5h反应生成10±0.5g/L的γ-氨基丁酸。
取80g固定化酶，投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸中，额外加入0.5g/L的5-磷酸吡哆醛，反应体积为50L，在45℃下反应12h可生成665±5g/L的γ-氨基丁酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸溶液中，反应体积为50L，在45℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环20次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在10-16h内。
对比例5-1
按照与实施例1相似的手段，将谷氨酸脱羧酶编码基因gadB在谷氨酸棒杆菌中表达(gadB氨基酸序列为SEQ ID NO:5)，得到C.g-pXMJ-gadB，在1L的反应体系中投入0.1g细胞，在pH5-5.5，45℃下催化50g/L的L-谷氨酸经0.5h反应生成10±0.8g/L的γ-氨基丁酸。但并不能循环催化。
对比例5-2
取80g实施例5所述的固定化酶，投入到1000g/L，pH＝5～5.5的L-谷氨酸中，额外加入0.5g/L的5-磷酸吡哆醛，反应体积为50L，在45℃下反应12h可生成665±5g/L的γ-氨基丁酸。反应结束后，不将温度和pH调节至固定化酶的最佳结合条件，直接离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到1000g/L，pH＝5-5.5的L-谷氨酸溶液中，反应体积为50L，在45℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环12次，相同时长γ-氨基丁酸产量降低，不延长时间的情况下，产量仅能达到第一轮的75％甚至更低，一旦将每个循环延长2-3小时，前几次循环其产量也仅仅能达到首轮的95％，随循环次数增加(极限循环12次)，产量会急剧降低，这样则会大大增加能耗；则生产上，无实际的循环价值。
实施例6
谷胱甘肽合成酶gshF的固定化和循环
按照与实施例1相似的手段将谷胱甘肽合成酶gshF基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，gshF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gshF，在1L的反应体系中投入0.2g固定化酶，在42℃，pH＝7条件下与L-甘氨酸160mM、L-谷氨酸钠160mM、MgSO4·7H2O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐140mM、ATP 150mM进行反应，3h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在40±1g/L的范围内。
扩大反应
取100g固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gshF，在42℃，pH＝7.5条件下与L-甘氨酸800mM、L-谷氨酸钠800mM、MgSO4·7H2O 350mM、L-半胱氨酸盐酸盐700mM、50L去离子水，与ATP 750mM进行反应，6h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在200±1g/L的范围内。反应结束后，调节溶液pH＝7，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到上述反应体系中，反应体积为50L，在最佳反应温度42℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环25次产物浓度不降低，反应时间在6～10h内完成。
对比例6-1
按照与实施例1相似的手段，将谷胱甘肽合成酶gshF基因在谷氨酸棒杆菌中表达(gshF蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:6)，得到固定化酶C.g-pXMJ-gshF，在1L的反应体系中投入0.2g细胞，在42℃，pH＝7条件下与L-甘氨酸160mM、L-谷氨酸钠160mM、MgSO4·7H2O70mM、L-半胱氨酸盐酸盐140mM、ATP 150mM进行反应，3h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在41.5±0.6g/L的范围内。但并不能循环催化。
对比例6-2
取100g的C.g-pXMJ-gshF固定化酶，在42℃，pH＝7条件下与L-甘氨酸800mM、L-谷氨酸钠800mM、MgSO4·7H2O 350mM、L-半胱氨酸盐酸盐700mM、50L去离子水，与ATP 750mM进行反应，6h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在200±1g/L的范围内。反应结束后，不将温度和pH调节至固定化酶的最佳结合条件，直接离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到上述反应体系中，反应体积为50L，在42℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；。
不延长时间的情况下，产量仅能达到第一轮的90％甚至更低，一旦将每个循环延长1-2小时，前几次循环其产量也仅仅能达到首轮的95％，随循环次数增加(极限循环18次)，产量会急剧降低，这样则会大大增加能耗。
实施例7
多聚磷酸激酶ppk的固定化和循环
按照与实施例1相似的手段将多聚磷酸激酶ppk基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，ppk蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO:4并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-ppk，在1L的反应体系中投入0.15g固定化酶和20mg谷胱甘肽合成酶gshF的纯化酶，在42℃，pH＝7条件下与L-甘氨酸160mM、L-谷氨酸钠160mM、MgSO4·7H2O 70mM、L-半胱氨酸盐酸盐140mM、ATP 2mM、40mM六偏磷酸钠进行反应，3h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在40±1g/L的范围内。
取75g实施例7中的固定化酶和2g谷胱甘肽合成酶gshF的纯化酶，在42℃，pH＝7条件下与L-甘氨酸800mM、L-谷氨酸钠800mM、MgSO4·7H2O 350mM、L-半胱氨酸盐酸盐700mM、50L去离子水，与ATP 8mM、200mM六偏磷酸钠进行反应，6h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测谷胱甘肽的产量，谷胱甘肽产量在200±1g/L的范围内。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到上述反应体系中，反应体积为50L，在最佳反应温度42℃下反应，每隔2h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环30次产物浓度不降低，反应时间在6～10h内完成。
对比例7-1
按照实施例7的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-ppk，并分别进行和实施例7相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-ppk相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ppk的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ppk的产物浓度降低至90％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ppk组极限循环次数也降低至21次。
实施例8
γ-谷氨酰胺合成酶gmas的固定化和循环
按照与实施例1相似的手段将gmas基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，gmas蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gmas，在1L的反应体系中投入0.2g固定化酶，在35℃，pH＝6.5条件下与L-谷氨酸钠200mM、乙胺盐酸盐250mM、MgSO4·7H2O 200mM、ATP 150mM进行反应，3h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测L-茶氨酸的产量，茶氨酸的产量在33±1g/L的范围内。
取100g实施例8中所述的固定化酶，在35℃，pH＝6.5条件下与L-谷氨酸钠1000mM、乙胺盐酸盐1000mM、MgSO4·7H2O 250mM、50L去离子水，与ATP 750mM进行反应，16h后取样，8000rmp离心5min后，将上清液用HPLC检测茶氨酸的产量，茶氨酸产量在110±5g/L的范围内。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到上述反应体系中，反应体积为50L，在最佳反应温度35℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环20次产物浓度不降低，反应时间在16～20h内完成。
对应对比例
按照实施例8的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-gmas，并分别进行和实施例8相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gmas相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-gmas的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-gmas的产物浓度降低至85％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-gmas组每一轮循环的产量仅能达到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-gmas组的90％甚至更低，其极限循环次数也降低至15次。
实施例9
IAP残基突变体固定化精氨酸脱亚胺酶ADI的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将精氨酸脱亚胺酶ADI的编码基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-ADI，ADI蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；在1L的反应体系中投入0.05g固定化酶，在pH6-6.5，40℃下催化50g/L的L-精氨酸经0.5h反应生成50±0.5g/L的L-瓜氨酸。
取40g实施例9中所述的固定化酶，投入到500g/L，pH＝6-6.5的L-精氨酸中，反应体积为50L，在40℃下反应12h可生成500±5g/L的L-瓜氨酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到500g/L，pH＝6-6.5的L-精氨酸溶液中，反应体积为50L，在40℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环22次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在10-16h内。
对应对比例
按照实施例9的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-ADI，并分别进行和实施例9相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-ADI相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ADI的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ADI的产物浓度降低至70％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-ADI组每一轮循环的产量仅能达到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-ADI组的91％甚至更低，其极限循环次数也降低至12次。
实施例10
IAP残基突变体固定化精氨酸酶arginase的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将精氨酸酶编码基因arginase与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-arginase，精氨酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:10，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；在1L的反应体系中投入0.05g固定化酶，在pH8，45℃下催化50g/L的L-精氨酸和2mM硫酸锰，经0.5h反应生成36±0.5g/L的L-鸟氨酸。
取40g实施例10中所述的固定化酶，投入到600g/L，pH＝8的L-精氨酸中，额外添加10mM硫酸锰，反应体积为50L，在45℃下反应12h可生成430±5g/L的L-鸟氨酸。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至25℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600g/L，pH＝8的L-精氨酸溶液中，额外添加10mM硫酸锰，反应体积为50L，在45℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环20次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在10-16h内。
对应对比例
按照实施例10的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-arginase，并分别进行和实施例10相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-arginase相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-arginase的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-arginase的产物浓度降低至90％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-arginase组每一轮循环的产量仅能达到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-arginase组的92％甚至更低，其极限循环次数也降低至13次。
实施例11
IAP残基突变体固定化葡萄糖脱氢酶GDH的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将葡萄糖脱氢酶GDH的编码基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-GDH，GDH蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:11，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；在1L的反应体系中投入0.1g固定化酶和20mg醇脱氢酶的SceCPR1(GenBank No.:EGA59421.1)的纯化酶，在pH6，35℃下催化100mM的酮泛内酯和150mM葡萄糖经10min反应生成99mM D-泛解酸内酯。
取80g实施例11中的固定化酶和2g醇脱氢酶的SceCPR1(GenBankNo.:EGA59421.1)的纯化酶，投入到600mM，pH＝6的酮泛内酯中，额外加入800mM葡萄糖，反应体积为50L，在35℃下反应6h可生成725mM的D-泛解酸内酯。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600mM，pH＝6的酮泛内酯中，额外加入800mM葡萄糖中，反应体积为50L，在35℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环20次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在6-8h内。
对应对比例
按照实施例11的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-GDH，并分别进行和实施例7相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-GDH相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-GDH的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-GDH的产物浓度降低至85％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-GDH组每一轮循环的产量仅能达到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-GDH组的90％甚至更低，其极限循环次数也降低至15次。
实施例12
IAP残基突变体固定化甲酸脱氢酶FDH的构建和应用
按照与实施例1相似的手段将甲酸脱氢酶FDH的编码基因与辅助侵染蛋白IAP残基突变体融合表达，并得到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-FDH，FDH蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:12，辅助侵染蛋白IAP残基突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；在1L的反应体系中投入0.1g固定化酶和20mg醇脱氢酶的SceCPR1(GenBankNo.:EGA59421.1)的纯化酶，在pH6，35℃下催化100mM的酮泛内酯和150mM甲酸铵经10min反应生成99mM D-泛解酸内酯。
取80g实施例12中的固定化酶和2g醇脱氢酶的SceCPR1(GenBankNo.:EGA59421.1)的纯化酶，投入到600mM，pH＝6的酮泛内酯中，额外加入800Mm甲酸铵，反应体积为50L，在35℃下反应5h可生成725mM的D-泛解酸内酯。反应结束后，调节溶液pH＝7.5，降低温度至30℃，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物重新投入到600mM，pH＝6的酮泛内酯中，额外加入800mM甲酸铵中，反应体积为50L，在35℃下反应，每隔4h取样检测产物浓度及底物剩余；如此循环22次产物浓度不降低，且能保证每次反应时间在6-8h内。
对应对比例
按照实施例12的方法，构建固定化酶C.g-pXMJ-iap-FDH，并分别进行和实施例12相同的1L体系，和50L体系的反应；
结果显示：与固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-FDH相比，固定化酶C.g-pXMJ-iap-FDH的生产效率明显降低，具体如下：
在1L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-FDH的产物浓度降低至85％左右；
在50L体系中，固定化酶C.g-pXMJ-iap-FDH组每一轮循环的产量仅能达到固定化酶C.g-pXMJ-iapV69H-FDH组的90％甚至更低，其极限循环次数也降低至14次。
实施例13
按照常规操作在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌中表达iapV69H-eGFP的融合酶，培养结束后将发酵液调至25-30℃，pH 7.5，洗涤一次后，在484nm下激发，507nm下观测荧光值。沉淀中的荧光比例接近大于90％，上清中荧光不明显。并且在相同的生物量下，总荧光强度为枯草芽孢杆菌>大肠杆菌>谷氨酸棒杆菌>乳酸菌所形成的不溶物。
对比例1
游离酶
按照同实施例1中相同的方法将eGFP基因连入pXMJ19载体，构建C.g-pXMJ-eGFP工程菌(eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)接入含有100mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，35℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时离心收集细胞，等比例重悬于添加0.5％葡萄糖的M9培养基中，加入0.2mM IPTG进行诱导，用氨水维持pH6.8，诱导12h后破碎，在484nm下激发，507nm下观测荧光值。
上清液具有荧光值，沉淀经洗涤后无明显荧光。
对比例2
细胞表面展示
构建以C末端截短NCgl1221蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示)作为锚定蛋白，与eGFP基因融合表达，连接于pXMJ19质粒上，转入谷氨酸棒杆菌，构建菌株命名为C.g-pXMJ-NCgl1221-eGFP，接入含有100mg/L氯霉素的BHI培养基中，35℃，200rpm过夜培养后按照10％的接种量转接入新鲜的含有50mg/L的BHI培养基中，37℃，200rpm培养至OD562＝0.6～0.8时离心收集细胞，等比例重悬于添加0.5％葡萄糖的M9培养基中，加入0.2mM IPTG进行诱导，用氨水维持pH6.8，诱导12h后收集上清和沉淀，在484nm下激发，507nm下观测荧光值。
同样培养条件下，细胞量低于将酶分泌于培养液中；荧光主要分布于沉淀中，荧光强度是同样细胞量的固定化酶的74.2％，说明细胞表面展示的位点可能并不能完全分布于细胞表面，或者布满表面后不利于细菌物质代谢，影响了生长。
对比例3
包埋法固定化
1)海藻酸钠载体制备：将海藻酸钠用15g甘油浸润，然后加入约75mL去离子水，搅拌溶解后，加入1％聚乙二醇辛基苯基醚、0.8％聚乙二醇、0.5mM二硫苏糖醇，搅拌溶解，得到终浓度为4.5％海藻酸钠溶液；2)培养C.g-pXMJ-eGFP细胞，收集后破碎，破碎酶液加入步骤1)制备的海藻酸钠溶液，二者混合均匀，得到海藻酸钠酶溶液；3)用恒流泵外接注射器针头将海藻酸钠酶匀速滴入到5％的CaCl2溶液中搅拌固定；4)过滤，PBS缓冲液反复洗涤凝胶沉淀，干燥，得到粒状固定化绿色荧光蛋白。
取上述固定化产物，检测荧光值。但由于上述固定化产物的颗粒较大，无法用原设备进行检测；仅从其实验步骤的对比来看可知，该包埋法确实更为繁复，且包埋法所需材料成本可见增加，包括上文提到的海藻酸钠、甘油、聚乙二醇辛基苯基醚、聚乙二醇、二硫苏糖醇等，以及用于细胞破碎的设备。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (8)
1.一种辅助侵染蛋白残基突变体蛋白，其特征在于，所述辅助侵染蛋白残基突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求1所述的辅助侵染蛋白残基突变体核苷酸序列的基因。
3.一种含辅助侵染蛋白残基突变体的重组菌体，其特征在于，所述重组菌体包含如SEQID NO.4所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的含辅助侵染蛋白残基突变体的重组菌体，其特征在于，所述重组菌体的宿主选自谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或乳酸菌中的一种。
5.一种含辅助侵染蛋白残基突变体的外泌活性酶重组菌体，其特征在于，所述外泌活性酶重组菌体包含序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列与酶蛋白融合表达；所述的酶蛋白选自：谷氨酸脱羧酶gadB、谷胱甘肽合成酶gshF、多聚磷酸激酶ppk、γ-谷氨酰胺合成酶gmas、精氨酸脱亚胺酶ADI、精氨酸酶、葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶FDH中的一种。
6.根据权利要求5所述的含辅助侵染蛋白残基突变体的外泌活性酶重组菌体，其特征在于，所述的谷氨酸脱羧酶gadB氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；谷胱甘肽合成酶gshF的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；多聚磷酸激酶ppk的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；γ-谷氨酰胺合成酶gmas的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；精氨酸脱亚胺酶ADI的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；精氨酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；葡萄糖脱氢酶GDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；甲酸脱氢酶FDH的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
7.一种含辅助侵染蛋白残基突变体的外泌活性酶重组菌体在固定化工艺中的应用，其特征在于：包括利用权利要求6所述的重组菌体发酵所得的外泌活性酶在其生产菌株上的自固定化过程。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述自固定化过程还包括：所述重组菌体发酵所得的外泌活性酶在其生产菌株上自固定化后进行发酵培养，发酵培养结束后，通过调节温度为25-30℃，pH 6.0-8.5条件下，离心分离不溶物与反应溶液，将不溶物作为外泌活性酶再与其生产细胞固定化并进行下一个循环的发酵培养，如此循环发酵。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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